專利名稱：：具有肝素結(jié)合活性的新的抗微生物肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有肝素結(jié)合活性的抗微生物肽，其來(lái)源于基本無(wú)抗微生物活性的內(nèi)源哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)并且具有10到36個(gè)氨基酸殘基，其中所述蛋白質(zhì)選自層粘連蛋白同種型(lamininisoforms)、補(bǔ)體因子C3(complementfactorC3)、富含組氨酸的糖蛋白和激肽原，其中抗微生物肽包含至少4個(gè)選自K、R和H的氨基酸殘基。本發(fā)明也涉及包含所述抗微生物肽的藥物組合物和抗微生物肽和/或抗微生物/藥物組合物的用途。
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物諸如人類的免疫系統(tǒng)成功地戰(zhàn)勝了幾種感染。然而，在一些情況下，細(xì)菌、真菌或病毒并不總是能被清除，而這可以引起局部或全身性急性感染。在圍產(chǎn)期、燒傷或重病特護(hù)室和在無(wú)免疫應(yīng)答個(gè)體中，這是需要重要關(guān)注的問(wèn)題。在其它情況下，上皮表面連續(xù)的細(xì)菌存留可以引起或加重慢性病。人類中，可以例舉的是慢性皮膚潰瘍、特應(yīng)性皮炎和其它類型的濕療、痤瘡或泌尿生殖器感染。可以用各種藥物治療有癥狀的感染。也可以通過(guò)例如疫苗與一些疾病斗爭(zhēng)。然而，疫苗不總是最好的治療選擇，并且對(duì)于一些微生物沒(méi)有可用的疫苗。當(dāng)無(wú)法獲得保護(hù)時(shí)，就要尋求疾病的治療。通常，通過(guò)使用殺死微生物的抗生素進(jìn)行治療。然而，在過(guò)去的許多年期間，幾種微生物已經(jīng)開(kāi)始抵抗抗生素了。最可能地，抗性問(wèn)題在不久的將來(lái)將會(huì)增加。此外，幾種個(gè)體已經(jīng)對(duì)抗生素產(chǎn)生變應(yīng)反應(yīng)，因此減少了有效地使用一些抗生素的可能性。各種生物體的上皮表面連續(xù)地暴露于細(xì)菌。最近幾年期間，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到基于抗細(xì)菌肽的天然免疫系統(tǒng)在易感染的生物學(xué)邊界處的最初細(xì)菌清除中起重要作用(Lehrer，R.I.，和Ganz，T.(1999)O/rr//zm7mo/11:23-27，Boman，H.G.(2000)/邁歷Mo7.Aer.173，5-16)?？刮⑸镫耐ㄟ^(guò)滲透細(xì)菌膜殺死細(xì)菌，因此特異性分子微生物靶的缺少最小化了抗性發(fā)展。本領(lǐng)域已知幾種與這里所述肽不相關(guān)的抗微生物肽和蛋白質(zhì)。US6，503，881乂>開(kāi)了是indolicidin類似物的用i故抗孩t生物肽的陽(yáng)離子肽。該陽(yáng)離子肽來(lái)源于不同物種，包括動(dòng)物和植物。US5，912，230公開(kāi)了抗真菌和抗細(xì)菌的基于組氨酸的肽。該肽是基于天然人類histatin的氨基酸序列的確定部分，以及公開(kāi)了真菌和細(xì)菌感染治療的方法。US5，717,064公開(kāi)了曱基化富含賴氨酸的裂解肽。該裂解肽抗胰蛋白酶消化，并且是非天然的。該裂解肽適于體內(nèi)給藥。US5，646，014公開(kāi)了抗微生物肽。該肽是從來(lái)源于蠶血淋巴的抗微生物部分分離的。該肽顯示了抗幾種微生物抹系諸如大腸桿菌(^c力er/c力/aco//)，金黃色葡萄球菌(iSYa/jAy/ococc"-si/re〃s)和蠟狀芽孢桿菌(A3C/77i/scere^)的優(yōu)良的抗孩i生物活性。McCabe等，J.Biol.Chem.277巻27477-27488，2002描述了3了kDa抗微生物的趨化蛋白質(zhì)-azurocidin，其含有肝素結(jié)合共有基序XBBXBX和XBBBXXBX。WO20040166537>開(kāi)了基于azurocidin20-44序列的肽。該肽含有通過(guò)二硫鍵連接的環(huán)結(jié)構(gòu)。.US6495516和相關(guān)的專利公開(kāi)了基于殺細(xì)菌55kDa蛋白質(zhì)一殺菌/滲透性增加蛋白質(zhì)(BPI)的肽。該肽發(fā)揮了抗微生物作用及具有肝素和LPS中和能力。W001/81578公開(kāi)了編碼G偶聯(lián)蛋白質(zhì)-受體相關(guān)多肽的大量序列，它們可以用于大量疾病。W000/27415公開(kāi)了適于抑制血管生成的肽。該肽是高分子量激肽原5的類似物。BLASTp檢索顯示在不同物種中保守的或具有相似性的序列諸如激肽原，沒(méi)有說(shuō)明這種保守性區(qū)域的功能或者它們作為小肽是否究竟具有功能。目前，已知700多種不同的抗微生物肽序列(www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/search.htm)，包括殺菌肽、防衛(wèi)素爪蟾抗菌肽和cathelicidins。盡管今天有巨大數(shù)量的抗微生物肽可用，但是還存在對(duì)新改進(jìn)的抗微生物肽的日益增加的需要?？刮⑸镫目梢杂糜诳箵艨够蚰褪芸股睾?或其它抗微生物劑的微生物。此外，需要新的抗微生物肽，當(dāng)將其引入到哺乳動(dòng)物諸如人類中時(shí)，它是非變應(yīng)原性的。細(xì)菌在進(jìn)化期間已經(jīng)遇到過(guò)內(nèi)源產(chǎn)生的抗微生物肽，而未出現(xiàn)顯著的抗性誘導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及具有肝素結(jié)合活性的抗微生物肽，其來(lái)源于基本無(wú)抗微生物活性的內(nèi)源哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)并且具有10到36個(gè)氨基酸殘基，所述蛋白質(zhì)選自層粘連蛋白同種型、補(bǔ)體因子C3、富含組氨酸的糖蛋白和激肽原，其中該抗微生物肽包含至少4個(gè)選自K、R和H的氨基酸殘基。通過(guò)提供這種抗微生物肽，由于該肽來(lái)源于內(nèi)源蛋白質(zhì)和/或肽的事實(shí)，可以減少對(duì)此抗微生物肽產(chǎn)生變應(yīng)性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。與較長(zhǎng)的肽和蛋白質(zhì)比較，通過(guò)使用短肽，可以增加肽的穩(wěn)定性和減少生產(chǎn)花費(fèi)，因此本發(fā)明在經(jīng)濟(jì)上是有利的。如本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)日后公開(kāi)的Andersson等，塒"/ocAe邁，2004，271:1219-1226所述，本發(fā)明來(lái)源于下面的發(fā)現(xiàn)具有來(lái)源于非抗微生物的內(nèi)源蛋白質(zhì)的肝素結(jié)合基序的肽顯示了抗微生物活性。一般地，文獻(xiàn)已詳細(xì)地記載了各種蛋白質(zhì)中肝素結(jié)合和肝素結(jié)合基序存在的結(jié)構(gòu)前提條件。這組分子包括各種層粘連蛋白同種型、纖連蛋白、凝固因子(coagulationfactor)、生長(zhǎng)因子、趨化因子、富含組氨酸的糖蛋白、激肽原和許多其它分子(參見(jiàn)，Andersson等，(2004)"/oc力e邁271;271:1219-26和其中引用的參考文獻(xiàn))，它們中沒(méi)有一種是天然抗微生物的。本發(fā)明的抗微生物肽和相應(yīng)的抗微生物/藥物組合物提供了利于有效地預(yù)防、減少或消除孩史生物的肽和組合物。因此可以增加抗擊才氐抗或耐受抗生素的微生物的可能性。而且，可以治療對(duì)商購(gòu)抗微生物劑具變應(yīng)性的哺乳動(dòng)物。通過(guò)提供來(lái)源于內(nèi)源蛋白質(zhì)的抗微生物/藥物組合物，可以減少甚至排除哺乳動(dòng)物出現(xiàn)針對(duì)這些特定肽的變態(tài)反應(yīng)的可能性。這使得本發(fā)明抗微生物/藥物組合物可以用于幾種應(yīng)用，其中抗微生物/藥物組合物做為藥物或者做為添加劑接觸哺乳動(dòng)物以防止感染。此外，短肽的使用改進(jìn)了生物利用率。而且，對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或真菌具有特異性或優(yōu)先作用的結(jié)構(gòu)不同的肝素結(jié)合性抗微生物肽的應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)各種微生物的特異性靶向，由此使得抗性的發(fā)生和生態(tài)學(xué)問(wèn)題得以最小化。通過(guò)補(bǔ)加哺乳動(dòng)物中已經(jīng)存在的肽，進(jìn)一步減少了由新抗生素造成另外生態(tài)學(xué)壓力的風(fēng)險(xiǎn)。最后，這些制劑也可以增強(qiáng)內(nèi)源抗微生物肽的作用。根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及抗微生物/藥物組合物，其包含上述的一種或多種抗微生物肽和藥物學(xué)可接受的緩沖液、稀釋劑、載體、助劑或賦形劑。根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及此后所述抗微生物肽和/或抗微生物/藥物組合物的用途。本發(fā)明的抗微生物肽增加了抗微生物劑的列表，這有助于針對(duì)各種應(yīng)用進(jìn)行選擇以預(yù)防、減少或消除微生物，包括但不限于侵襲或感染哺乳動(dòng)物諸如人類的微生物。圖1A-C是證明肽對(duì)糞腸球菌(衡erocoCaec"/s)的抗菌作用的圖。圖2A和B是說(shuō)明利用一組高活性肽進(jìn)行的徑向擴(kuò)散測(cè)定的培養(yǎng)皿。圖3A-C是描述富含組氨酸的肽的抗細(xì)菌作用的圖和表格。圖4A-H是電子顯微鏡照片，顯示了對(duì)受到抗微生物肽處理的銅綠假單月包菌(/^ei/do/wooasae77/^//70^)的分才斤。圖5A-C是表示來(lái)源于補(bǔ)體C3，富含組氨酸的糖蛋白和激肽原的肽的肝素結(jié)合活性的照片。圖6是說(shuō)明在鎳-瓊脂糖凝膠上純化含組氨酸的抗微生物片段的照片。發(fā)明詳述定義在本申請(qǐng)和發(fā)明的范圍中，應(yīng)用了下列定義術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"意指具有兩個(gè)或兩個(gè)以上核苷酸的序列。核苷酸可以是基因組DNA、cDNA、RNA來(lái)源的、半合成或合成來(lái)源的或其混合物。該術(shù)語(yǔ)包含單鏈和雙鏈形式的DNA或RNA。術(shù)語(yǔ)"抗微生物肽"意指這樣一種肽，該肽包含約10到約36個(gè)氨基酸殘基，具有抗微生物和肝素結(jié)合活性，并且來(lái)源于天然沒(méi)有抗微生物作用的內(nèi)源哺乳動(dòng)物。"抗微生物肽"防止、抑制、減少或破壞微生物。通過(guò)例如，實(shí)施例2,4或5中的方法可以測(cè)定抗微生物活性。術(shù)語(yǔ)"肝素結(jié)合親和性"意指直接或間接地結(jié)合肝素的肽。例如，通過(guò)實(shí)施例7中的方法可以測(cè)定肝素結(jié)合活性。顯示了對(duì)肝素具有親和性的本發(fā)明抗微生物肽也結(jié)合硫酸皮膚素。因此，肝素結(jié)合性抗微生物肽也與內(nèi)源糖胺聚糖硫酸皮膚素相互作用。術(shù)語(yǔ)"兩親性的"意指沿著ct-螺旋結(jié)構(gòu)、p-鏈、線型、環(huán)型或其它二級(jí)構(gòu)象的相對(duì)面分布親水性和疏水性氨基酸殘基，其引起分子的一個(gè)面主要是帶電荷的，另一面主要是親水性的?？梢酝ㄟ^(guò)各種基于web的算法，例如在http://us.expasy.org/cgi-Hn/protscale.pl上發(fā)現(xiàn)的算法，對(duì)氨基酸殘基序列進(jìn)行作圖來(lái)評(píng)估肽的兩親性程度?？梢酝ㄟ^(guò)螺旋輪圖(helicalwheeldiagr詣)觀察疏水性殘基的分布。可以在www.expasy.com.發(fā)現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法，諸如G0RIV。術(shù)語(yǔ)"陽(yáng)離子"意指在pH約4到約12范圍內(nèi)具有凈正電荷的分子。術(shù)語(yǔ)"微生物"意指任何活的微生物。微生物的例子是細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)和酵母。術(shù)語(yǔ)"抗微生物劑"意指任何防止、抑制或破壞微生物的藥劑。在TheSanfordGuidetoAntimicrobialTherapy(32版，AntimicrobialTherapy,Inc，US)中可以發(fā)現(xiàn)抗微生物劑的例子。在本發(fā)明范圍中，基于IUPAC命名法(氨基酸和肽的IUPAC命名法和符號(hào)(殘基名稱，原子名稱等)，EurJBiochem.，138，9-37(1984)以及EurJBiochem.，152，1(1985)中的修正)，如ProteinDataBank(PNB)(www.pdb.org)所定義，使用氨基酸名稱和原子名稱。術(shù)語(yǔ)"氨基酸"意指選自丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或1)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲石克氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gin或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)或其衍生物的氨基酸。詳述抗微生物肽本發(fā)明涉及具有肝素結(jié)合活性的抗微生物肽，其來(lái)源于基本無(wú)抗微生物活性的內(nèi)源哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)并且具有10到36個(gè)氨基酸殘基，其中該抗微生物肽包含至少4個(gè)選自K、R和H的氨基酸殘基。這些氨基酸殘基中的兩個(gè)殘基可以鄰接。如Margalit等，19"/A/o/C力e/z268，19228-31所報(bào)道，B氨基酸殘基之間約20A的距離構(gòu)成了肝素結(jié)合的前提條件，而與肽構(gòu)象無(wú)關(guān)。與較長(zhǎng)的肽或蛋白質(zhì)比較，使用短肽增加了生物利用率(例如通過(guò)增加皮膚滲透能力)及減少生產(chǎn)和純化花費(fèi)。本發(fā)明抗微生物肽是對(duì)今天可商購(gòu)獲得的抗微生物肽的補(bǔ)充，并且增加了抗擊耐受和/或抗現(xiàn)有抗微生物劑的微生物的可能性。于的哺乳動(dòng)物而言不是變應(yīng)原性的新肽。而且，利用日益增加的肽作用及對(duì)各種鹽和離子環(huán)境的依賴性的知識(shí)能夠設(shè)計(jì)出增強(qiáng)和控制肽作用的特定組合物。經(jīng)剪裁而作用于真菌的肽將更有利于靶向特定疾病諸如粘膜上的酵母感染，而不顯著地影響這些位點(diǎn)的細(xì)菌生態(tài)學(xué)?？刮⑸镫淖饔糜诩?xì)菌細(xì)胞膜的事實(shí)表明它們可以與抗生素協(xié)同作用。因此，抗生素和肽的聯(lián)合可以具有治療優(yōu)勢(shì)。最后，也需要低成本的非變應(yīng)原性抗微生物劑，以便用在需要防止微生物生長(zhǎng)的不同種類產(chǎn)品中。此外，對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或真菌具有特異性或優(yōu)先作用的結(jié)構(gòu)不同的肝素結(jié)合性短抗微生物肽的應(yīng)用，也使得能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)各種微生物的特異性靶向，由此最小化抗性問(wèn)題和生態(tài)學(xué)問(wèn)題。通過(guò)補(bǔ)加生物體中已經(jīng)存在的肽，進(jìn)一步減少了由新抗生素造成另外生態(tài)學(xué)壓力的風(fēng)險(xiǎn)。引入能增加肽作用的制劑可以使外源提供的肽限于局部并得以加強(qiáng)，這可以進(jìn)一步最小化治療區(qū)域外肽副作用的風(fēng)險(xiǎn)，諸如抗性誘導(dǎo)的風(fēng)險(xiǎn)。最后，這些制劑也可以增強(qiáng)內(nèi)源抗微生物肽的作用。如果抗微生物肽被開(kāi)發(fā)用于抗擊人類中微生物，那么內(nèi)源抗微生物肽來(lái)源于人類內(nèi)源蛋白質(zhì)。同樣的原則適用于其它動(dòng)物，諸如馬、牛、豬或家禽?？刮⑸镫目梢曰谘獫{、血液、結(jié)締組織和組成細(xì)胞中存在的肽和/或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并且可以從肝素結(jié)合蛋白質(zhì)；層粘連蛋白同種型，vonWillebrand因子，玻連蛋白、蛋白質(zhì)C抑制劑、纖連蛋白、凝固因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、富含組氨酸的糖蛋白、激肽原或補(bǔ)體因子C3中進(jìn)行選擇。本發(fā)明的抗微生物肽對(duì)肝素具有約10nM到約20jiM的結(jié)合親和性(Kd)。肽可以具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個(gè)氨基酸殘基大小。肽的長(zhǎng)度和序列取決于抗微生物肽的來(lái)源和要抗擊的微生物、以及是否肽要用于防止、抑制、減少或破壞微生物和微生物存在于何種環(huán)境中、給藥后抗微生物肽將遇到何種環(huán)境。根據(jù)第一實(shí)施方式，本發(fā)明涉及基于激肽原蛋白質(zhì)或富含組氨酸的糖蛋白的抗微生物肽，其中至少20。/。的氨基酸殘基是H。抗微生物肽可以包含超過(guò)30，40或甚至50。/。的H，R和/或K氨基酸殘基。在具體例子中，1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸殘基是H。例如，抗微生物肽可以選自SEQIDN0:1、2、3和4。這些肽分別來(lái)源于非抗微生物的蛋白質(zhì)激肽原和富含組氨酸的糖蛋白的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且富含H殘基。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明涉及基于補(bǔ)體因子蛋白質(zhì)的抗微生物肽。例如，抗微生物肽可以選自SEQIDN0:5、6和7。SEQIDN0:5、6和7肽來(lái)源于補(bǔ)體因子C3分子中明確的螺旋片段。如Hugli和同事(Chazin等，(1988)飾c力e/i7/"/y27，9139-48，Hugli，Cwrre/^fo//cs//7#/cro6/.o/o^7/腳w7o/o^y，1989，153，181-208)所證明的，由片段19-28(用SEQIDNO:5表示)和47-70(用SEQIDNO:6和7表示)限定C3來(lái)源的C3a分子的螺旋區(qū)域。全蛋白質(zhì)C3不發(fā)揮抗微生物作用。最近已經(jīng)公開(kāi)了來(lái)源于C3的肽片段的肝素結(jié)合和抗孩吏生物能力(Andersson等，/S/oc力e邁，2004，271;271:1219-1226)。根據(jù)第三實(shí)施方式，本發(fā)明涉及來(lái)源于層粘連蛋白的抗微生物肽。例如，抗孩l生物肽可以選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、14、15和16。層粘連蛋白a鏈LG結(jié)構(gòu)域由已經(jīng)被鑒定為肝素和其它細(xì)胞表面受體的結(jié)合位點(diǎn)的5個(gè)(1-5)LG模塊組成(Timpl.，等，5/o/，2000，19，309-317)。這些模塊蛋白質(zhì)是在發(fā)育過(guò)程諸如傷口愈合期間被合成的，并且已經(jīng)描述在這些事件期間出現(xiàn)LG模塊的蛋白酶解加工。最近描述了以前未公開(kāi)的LG模塊的肝素結(jié)合表位的抗微生物功能(Andersson等，/A/oc力eiZ7，2004，271;271:1219-1226)。盡管肽來(lái)源于內(nèi)源蛋白質(zhì)，但是可以以半合成或合成肽形式及在微生物中產(chǎn)生它們?？梢杂靡粋€(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，諸如1-100個(gè)氨基酸殘基，5-50個(gè)氨基酸殘基或6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個(gè)氨基酸殘基延伸抗微生物肽。這種添加的氨基酸可以復(fù)制來(lái)源于非抗微生物蛋白質(zhì)的鄰接抗微生物肽序列的序列。所添加的數(shù)量取決于將要對(duì)抗哪種微生物，肽的穩(wěn)定性、毒性，待要治療的哺乳動(dòng)物或肽應(yīng)該在哪種產(chǎn)品中和抗微生物肽基于哪種肽結(jié)構(gòu)。待要添加給肽的氨基酸殘基數(shù)也取決于生產(chǎn)的選擇，例如表達(dá)載體和表達(dá)宿主，及制備抗微生物/藥物組合物的選擇。可以在抗微生物肽的N-或C-末端部分延伸或者在兩個(gè)末端部分同時(shí)延伸，只要該延伸不破壞肽的抗微生物作用即可?？刮⑸镫囊部梢允侨诤系鞍?，其中抗微生物肽與另一肽融合。此外，抗微生物肽可以可操作地連接其它已知的抗微生物肽或其它物質(zhì)，諸如其它肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖、其它有機(jī)化合物或無(wú)機(jī)物質(zhì)。例如抗微生物肽可以與在抗微生物肽抑制、防止或破壞微生物生命前防止抗微生物肽在哺乳動(dòng)物中降解的物質(zhì)偶聯(lián)。因此，可以通過(guò)在抗微生物肽C-末端部分酰胺化或酯化和在N-末端部分?；⒁阴；EG化、烷基化等，^f務(wù)飾抗微生物肽。做為可替代的方案，可以通過(guò)1到6個(gè)氨基酸的置換修飾來(lái)源于非抗微生物全蛋白質(zhì)的功能性抗微生物片段的肽。被抗微生物肽抑制、防止或破壞的微生物的例子是細(xì)菌，包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌，諸如糞腸球菌(f/^erococc"j尸aec"/s)、大腸桿菌(^c力er/c/sco//)、銅綠假單胞菌(i^e油邁o/2ssaerug/"057)、奇異變形菌(尸r"eus邁/ra6/"s)、肺炎鏈球菌(S"e/^ococcwsj3/e"邁o//ae)、酉良膿鏈球菌(5Yr一ococcws/^oge"e51)、金黃色葡萄球菌(5^aMr/ococciASawre)，病毒、寄生蟲(chóng)、真菌和酵母諸如白色念珠菌(a/6/ca/7S)和近平滑念珠菌(Ca/2d油/7ar<3/7<s//os/s)?？刮⑸镫目梢詮奶烊粊?lái)源，諸如從人類細(xì)胞，c-DNA，基因組克隆獲得、或者化學(xué)合成，或者通過(guò)重組DNA技術(shù)從細(xì)胞來(lái)源以表達(dá)產(chǎn)物形式獲得。可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法，包括通過(guò)自動(dòng)程序合成的方法合成抗微生物肽。一般地，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相Fmoc保護(hù)策略，用HATU(N-[二曱基氨基-1H-1，2,3-三唑并[4，5-B]吡啶-l-基亞曱基]-N-曱基甲銨六氟代磷酸鹽N-氧化物)做為偶聯(lián)劑或者用其它偶聯(lián)劑諸如H0At-l-羥基-7-氮雜苯并三唑合成肽類似物。用也可脫保護(hù)側(cè)鏈官能團(tuán)的含有適合清除劑的三氟乙酸從固相樹(shù)脂切割肽。利用制備型反相層析進(jìn)一步純化粗肽?？梢允褂闷渌募兓椒ㄖT如分配層析、凝膠過(guò)濾、凝膠電泳或離子交換層析。可以利用本領(lǐng)域已知的其它合成技術(shù)諸如tBoc保護(hù)策略，或者不同偶聯(lián)試劑等以產(chǎn)生等同的肽。做為可替代的方案，可以通過(guò)重組產(chǎn)生合成肽(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,593,866)。各種宿主系統(tǒng)均適于肽類似物的產(chǎn)生，所述宿主系統(tǒng)包括細(xì)菌諸如大腸桿菌co//)，酵母諸如釀酒酵母(i^cc力aro/z7/cescerer/s/ae)或畢赤酵母(p/c力/a)，昆蟲(chóng)諸:fe口Sf9和哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如CH0或C0S-7?，F(xiàn)有許多表達(dá)載體可以用于每種宿主，并且只要載體和宿主能產(chǎn)生抗微生物肽，本發(fā)明不限于它們中任何一種?？梢栽诶纾琒ambrook等((MolecularCloning.:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1987)和A證bel等.(CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingCo.,1995)中發(fā)現(xiàn)用于在大腸桿菌(Aco//)中克隆和表達(dá)的載體和方法。最后，可以從血漿、血液、各種組織等純化肽。肽可以是內(nèi)源的，或者是酶促或化學(xué)消化純化蛋白質(zhì)后產(chǎn)生的。例如，可以用胰蛋白酶消化肝素結(jié)合蛋白質(zhì)，并且更大規(guī)模地進(jìn)一步分離所得到的抗細(xì)菌肽。編碼抗微生物肽的DNA序列被引入到適于宿主的適合表達(dá)載體中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將基因克隆到載體中以產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。為了有利于肽序列的分離，使用易于化學(xué)切割(例如CNBr)或酶促切割(例如V8蛋白酶、胰蛋白酶)的氨基酸連接肽和融合配偶體。為了在大腸桿菌co7/)中表達(dá)，優(yōu)選地，融合配偶體是引導(dǎo)表達(dá)形成包涵體的正常的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。在這種情況下，切割釋放終產(chǎn)物后，不需要肽的復(fù)性。在本發(fā)明中，包含融合配偶體和肽基因的DNA盒可以被插入到表達(dá)載體中。優(yōu)選地，表達(dá)載體是含有誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子以利于插入的DM序列在宿主中有效轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)化技術(shù)諸如通過(guò)4丐介導(dǎo)的技術(shù)、電穿孔或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其它方法將表達(dá)載體引入到宿主中。編碼抗微生物肽的序列可以來(lái)源于天然來(lái)源諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、現(xiàn)有cDNA或基因組克隆，或者可以合成。可以使用的一種方法是利用擴(kuò)增引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增抗微生物肽，所述引物來(lái)源于抗微生物DM模板的5，和3，末端，并且通常摻入了相對(duì)于載體克隆位點(diǎn)選定的限制位點(diǎn)。如果必要，可以將翻譯起始和終止密碼子引入到引物序列中。只要考慮待要處理的最終哺乳動(dòng)物來(lái)選擇密碼子，編碼抗微生物肽的序列可以經(jīng)密碼子優(yōu)化而便于在特定宿主中表達(dá)。例如，如果在細(xì)菌中表達(dá)抗微生物肽，那么針對(duì)細(xì)菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化。如果必要，也可以包含調(diào)節(jié)序列，諸如一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列、分泌信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記等。調(diào)節(jié)序列可操作地互相連接在一起以允許轉(zhuǎn)錄和隨后的翻譯。如果要在細(xì)菌中表達(dá)抗微生物肽，調(diào)節(jié)序列是被設(shè)計(jì)的在細(xì)菌中使用的調(diào)節(jié)序列，并且這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。適合的啟動(dòng)子諸如組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是可廣泛獲得的，并且包括來(lái)源于T5、T7、T3、SP6噬菌體和trp、lpp和lac操縱子的啟動(dòng)子。如果含有抗微生物肽的載體將要在細(xì)菌中表達(dá)，復(fù)制起點(diǎn)的例子是產(chǎn)生高拷貝數(shù)的復(fù)制起點(diǎn)或產(chǎn)生低拷貝數(shù)的復(fù)制起點(diǎn)，例如fl-ori和colElori。優(yōu)選地，質(zhì)粒包含至少一種在宿主中起作用的選擇性標(biāo)記，該選擇性標(biāo)記允許鑒定和/或選擇性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于細(xì)菌宿主的適合的選擇性標(biāo)記基因包括氨千青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因和本領(lǐng)域已知的其它選擇性標(biāo)記基因。用于在細(xì)菌中表達(dá)的質(zhì)粒的例子包括pET表達(dá)載體pET3a、pETlla、pET12a-c和pET15b(獲自Novagen，Madison,Wis.)。低拷貝數(shù)的載體(例如pPD100)可以用于有效地超量產(chǎn)生對(duì)大腸桿菌(Aco//)宿主有害的肽(Dersch等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.123:19，1994)。適合宿主的例子是細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。然而，常常使用的是細(xì)菌諸如大腸桿菌(Aco7/)。用常規(guī)分離技術(shù)諸如親和、大小排阻或離子交換層析、HPLC等分離表達(dá)的抗微生物肽。在ABiologist'sGuidetoPrinciplesandTechniquesofPracticalBiochemistry(Wilson和Golding編輯，EdwardArnold,London,或CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,Inc)中可以發(fā)現(xiàn)不同的純化技術(shù)?？刮⑸锝M合物/藥物組合物此外，本發(fā)明涉及抗微生物組合物/藥物組合物，其包含上述抗微生物肽和藥物學(xué)可接受的緩沖液、稀釋劑、載體、助劑或賦形劑。組合物中可以包含另外的化合物。這些另外的化合物包括，例如螯合劑諸如EDTA、EGTA或谷胱甘肽?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法制備具有足夠的貯藏穩(wěn)定性并且適于向人類和動(dòng)物給藥的抗微生物/藥物組合物。例如，通過(guò)冷凍干燥、噴霧干燥或噴霧冷卻，可以凍干藥物組合物。"藥物學(xué)可接受"意指不干擾活性組分，即抗微生物肽的生物學(xué)活性有效性的非毒性物質(zhì)。這種藥物學(xué)可接受的緩沖液、載體或賦形齊'j是本領(lǐng)域所熟知的(參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版，A.RGennaro編輯，MackPublishingCompany(1990)和handbookofPharmaceuticalExcipients，第3版，A.Kibbe編輯，PharmaceuticalPress(2000))。術(shù)語(yǔ)"緩沖液"意指含有酸堿混合物的水溶液，其目的是穩(wěn)定pH。緩沖液的例子是Trizma、Bicine、Tricine、M0PS、M0PS0、M0BS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、羥乙酸鹽、乳酸鹽、硼酸鹽、ACES、ADA、酒石酸鹽、AMP、AMPD、AMPS0、BES、CABS、二曱砷酸鹽、CHES、DIPS0、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPS0、咪哇、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、P0PS0、TAPS、TABS、TAPS0、TES和tricine。術(shù)語(yǔ)"稀釋劑，，意指水或非水溶液，目的是稀釋藥物制劑中的肽。稀釋劑可以是鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(諸如紅花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中的一種或多種。術(shù)語(yǔ)"助劑，，意指添加到制劑中以增加肽的生物學(xué)作用的任何化合物。助劑可以是一種或多種具有不同陰離子的鋅、銅或銀鹽，例如但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸鹽、亞硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、羥乙酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、酒石酸鹽和具有不同酰基組成的醋酸鹽。賦形劑可以是一種或多種碳水化合物、聚合物、脂質(zhì)和礦物質(zhì)。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和環(huán)糊精，它們被添加到組合物中以^更例如利于凍干。聚合物的例子是淀粉、纖維素醚、纖維素羧曱基纖維素、藻酸鹽、角叉菜膠、透明質(zhì)酸、聚丙烯酸、聚磺酸酯、聚乙二醇/聚環(huán)氧乙烷、不同程度水解的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮(所有這些聚合物的不同分子量的分子)，向組合物中添加它們例如用于粘度控制，用于實(shí)現(xiàn)生物吸附，或者用于保護(hù)脂質(zhì)免受化學(xué)和蛋白酶解降解。脂質(zhì)的例子是有不同的?；滈L(zhǎng)度和飽和度的脂肪酸、磷脂、單、二和三甘油酯、神經(jīng)酰胺、鞘脂和糖脂，卵的卵磷酯、大豆卵磷脂、氫化的卵的卵磷脂和大豆卵磷脂，它們以與聚合物相似的原因被添加到組合物中。礦物質(zhì)的例子是滑石、氧化鎂、氧化鋅和氧化鈦，將它們添加到組合物中以獲得利益諸如減少液體積累或有利的著色特性。載體的特征取決于給藥途徑。一種給藥途徑是局部給藥。例如，對(duì)于局部給藥，優(yōu)選的載體是包含活性肽的乳化青，但是可以使用其它常用的載體諸如一些基于礦脂/礦物和基于植物的軟骨，及聚合物凝膠、液晶體相和微乳?？刮⑸?藥物組合物可以包含一種或多種肽，諸如在抗微生物/藥物組合物中包含l、2、3或4種不同肽。通過(guò)使用不同肽的聯(lián)合，:性上/或耐受性的可能'ii:、'、基于富含組氨酸的蛋白質(zhì)和/或激肽原的肽，特別是短肽具有有限的抗微生物活性。然而，如果這些肽處于包含鹽和/或pH從約5.0到約7.0的組合物中，該肽就變得有活性，即通過(guò)添加鹽和/或選定特定pH范圍獲得增強(qiáng)的作用。鹽形式的肽可以是與無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的酸加成物，所述無(wú)機(jī)酸是諸如鹽酸、硫酸、硝酸、氫溴酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸等，所述有機(jī)酸是諸如曱酸、乙酸、卣代乙酸、丙酸、乙醇酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、葡糖酸、乳酸、丙二酸、延胡索酸、鄰氨基苯曱酸、苯曱酸、肉桂酸、對(duì)-曱苯磺酸、萘磺酸、對(duì)氨基苯磺酸等。可以添加無(wú)機(jī)鹽諸如一價(jià)鈉、鉀或二價(jià)鋅、鎂、銅、鈣等，及相應(yīng)的陰離子，以改進(jìn)抗微生物組合物的生物學(xué)活性?？梢栽诖_定和控制pH(例如，pH5.5-6.O)的確定溶液，諸如凝膠中使用基于激肽原和富含組氨酸的糖蛋白的抗微生物的富H肽，以增加所添加的抗^:生物肽的作用。例如，在有或無(wú)離子環(huán)境下具有約5.0到約7.0，諸如約5.5到約6.0的確定pH的凝膠、軟膏或繃帶將增強(qiáng)、控制抗^L生物肽的功能和4吏之局部化。本發(fā)明的抗微生物/藥物組合物也可以是脂質(zhì)體形式，其中除了其它藥物學(xué)可接受的載體外，肽還與兩親性試劑諸如脂質(zhì)混合，該兩親性試劑以聚集形式作為微團(tuán)、不溶單層和液晶存在。用于脂質(zhì)體制劑的適合脂質(zhì)非限制性地包括甘油單酯、甘油二酯、硫腦苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽酸等。例如，可以在US4，235，871中發(fā)現(xiàn)這種脂質(zhì)體制劑的制備。本發(fā)明的抗微生物/藥物學(xué)組合物也可以是生物可降解的微球體形式。在微球體生產(chǎn)中已經(jīng)廣泛使用脂族聚酯諸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或者聚(己內(nèi)酯)(PLC)和聚(酐)做為生物可降解的聚合物。在US5，851，451和EP0213303中可以發(fā)現(xiàn)這種微球體的制備。做為可替代的方案，抗微生物肽可以溶解在鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(諸如紅花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黃蓍膠和/或各種緩沖液中。藥物學(xué)組合物也可以包含離子和確定的pH以增強(qiáng)抗微生物肽的作用。也可以對(duì)抗微生物/藥物組合物進(jìn)行常規(guī)藥物學(xué)操作諸如滅菌，和/或所述組合物可以含有例如，如這里以外其它地方所公開(kāi)的常規(guī)助劑諸如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、緩沖液和填充劑等?？梢跃植炕蛉斫o藥本發(fā)明的抗微生物/藥物組合物。給藥途徑包括局部、眼睛、鼻子、肺、口腔、非腸道(靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi))、口服、腸胃外、陰道和直腸給藥。也可以從植入物給藥。例如，適合的抗微生物制劑形式是顆粒、粉末、片劑、包衣片劑(微)膠嚢、栓劑、糖漿劑、乳劑、微乳劑(定義為由水、油和表面活性劑組成的光學(xué)各向同性的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng))，液晶相(定義為特征在于長(zhǎng)程有序但是短程無(wú)序的系統(tǒng)(例子包括水或油連續(xù)的層狀、六角形和立方相))，或者它們分散的對(duì)應(yīng)物、凝膠、軟膏、分散體、懸浮液、乳骨、氣溶膠、滴劑或安瓿形式的可注射溶液，還有活性化合物持久釋放的制劑，其中在這些制劑中常規(guī)地使用上述賦形劑、稀釋劑、助劑或載體。在繃帶或石骨等中也可以提供本發(fā)明藥物組合物。以藥物學(xué)有效劑量向患者給藥藥物組合物。用"藥物學(xué)有效劑量"意指相對(duì)于給藥的病癥而言足以產(chǎn)生期望效果的劑量。確切的劑量取決于化合物活性、給藥方式、疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性、患者年齡和體重，可能需要不同劑量。可以通過(guò)以單個(gè)劑量單位或幾個(gè)較小劑量單位形式一次給藥，并可以通過(guò)以特定間隔分劑量地多次給藥進(jìn)行劑量的施用。本發(fā)明的藥物組合物可以被單獨(dú)給藥，或者聯(lián)合其它治療劑諸如抗生素或防腐劑(antisepticagent)諸如抗細(xì)菌劑、殺真菌劑、抗病毒劑和抗寄生蟲(chóng)劑給藥。例子是青霉素類、頭孢菌素類、碳頭孢烯類、頭霉素類、碳青霉烯類、單菌霉素類、氨基糖苷類、糖肽、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氟會(huì)諾酮類。防腐劑包括碘、銀、銅、clorhexidine、聚己縮胍和其它雙胍、脫乙酰殼多糖、乙酸和過(guò)氧化氫。這些藥劑可以并入為相同藥物組合物的部分，或者可以4皮單獨(dú)給藥。本發(fā)明涉及人類和其它哺乳動(dòng)物諸如馬、狗、貓、牛、豬、駱駝等。因此該方法可應(yīng)用于人類治療和獸醫(yī)應(yīng)用?？梢酝ㄟ^(guò)已成熟建立的感染標(biāo)志諸如發(fā)熱、puls、生物體培養(yǎng)等鑒定適于這種治療的目標(biāo)。可以用抗微生物肽治療的感染包括由或因微生物引起的感染。微生物的例子包括細(xì)菌(例如，革蘭氏陽(yáng)性，革蘭氏陰性)、真菌(例如酵母和霉菌)、寄生蟲(chóng)(例如，原生動(dòng)物、線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)和吸蟲(chóng))、病毒和朊病毒。熟知這些類別中具體的生物體(參見(jiàn)，例如Davis等，Microbiology,第3次增補(bǔ)版本，Harper&Row,1980)。感染包括但不限于慢性皮膚潰瘍、感染的急性傷口和燒傷傷口、感染的皮膚濕滲、膿皰病、特應(yīng)性皮炎、痤瘡、外耳炎、陰道感染、皮脂溢性皮炎、口腔感染和牙周炎、念珠菌性擦爛、結(jié)膜炎和其它眼睛感染和肺炎。因此，抗微生物/藥物組合物可以用于外科手術(shù)后、皮膚損傷后及燒傷傷口的預(yù)防性治療。藥物組合物也可以被包含在旨在用以貯存和處理與人體接觸的外部物質(zhì)諸如隱形目艮鏡、矯形移植物和導(dǎo)管的溶液中。此外，抗微生物/藥物組合物可以用于特應(yīng)性皮炎、膿皰病、慢性皮膚潰瘍、感染的急性傷口和燒傷傷口、痤瘡、外耳炎、真菌感染、肺炎、皮脂溢性皮炎、念珠菌性擦爛、念珠菌性陰道炎、口咽念珠菌病、眼睛感染(細(xì)菌性結(jié)膜炎)和鼻子感染(包括攜帶MRSA)的治療。在洗液，諸如鏡片消毒劑和貯存溶液中也可以使用抗微生物/藥物組合物，或者抗微生物/藥物組合物可以用于預(yù)防與尿?qū)Ч苁褂没蛑醒腱o脈導(dǎo)管使用有關(guān)的細(xì)菌感染。此外，抗微生物組合物可以用于預(yù)防骨劑(plasters)、粘合劑、縫線中的手術(shù)后感染或者可以被摻入到傷口敷料中。也可以在聚合物、織物等中使用抗微生物肽以產(chǎn)生抗細(xì)菌表面或者化妝品和個(gè)人護(hù)理品(肥皂、洗發(fā)劑、牙骨、抗痤瘡劑、防曬霜、衛(wèi)生棉條、尿布)中可以補(bǔ)加抗微生物/藥物組合物。鑒定抗微生物人類肽和/或蛋白質(zhì)的方法本發(fā)明也涉及鑒定一種或多種新的抗微生物肽的方法，這使得可以提供給哺乳動(dòng)物諸如人類一組新的抗微生物肽，該組抗微生物肽具有低變應(yīng)原性并可以有效低抗侵襲該哺乳動(dòng)物的微生物。通過(guò)這種方法，將可以獲得新改進(jìn)的抗微生物肽，從而提供大量抗微生物劑，由此減少或甚至消除目前普遍遇到的針對(duì)市場(chǎng)上商購(gòu)的抗生素出現(xiàn)的抗性和/或耐受性問(wèn)題。該方法包括下面的步驟提供內(nèi)源肽和/或蛋白質(zhì)，提供肝素，混合內(nèi)源肽和/或蛋白質(zhì)與肝素以產(chǎn)生肽和/或蛋白質(zhì)肝素復(fù)合物，檢測(cè)肽和/或蛋白質(zhì)肝素復(fù)合物，并且鑒定抗微生物人類內(nèi)源肽和/或蛋白質(zhì)。此外，可以使用鎳如鎳瓊脂糖代替肝素。肝素可以存在于溶液中，或者與基質(zhì)連接。在后一種情況下，這適于分離目的(h.p.l.c或f.p.l.c)或Biocore分析。對(duì)于分離目的，可以使用肝素瓊脂糖凝膠或相似的介質(zhì)。因?yàn)榭刮⑸镫囊才c其它糖胺聚糖相互作用，所以可以將這些分子，諸如硫酸皮膚素或硫酸乙酰肝素用于新抗微生物肽的純化。肝素硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素含有散布和空間確定的磺基或羧基基團(tuán)。原則上，任何與這些糖胺聚糖具有相似相互作用能力的其它聚合化合物都可以用于抗微生物肽的特異性結(jié)合。此外，可以單獨(dú)在鎳-瓊脂糖凝膠或相似介質(zhì)上或進(jìn)一步與肝素層析聯(lián)合，純化富含H的肽。下面的實(shí)施例意欲示例本發(fā)明，但不是以任何方法、形式或方式明確或隱含地限制本發(fā)明。實(shí)施例微生物在實(shí)驗(yàn)中使用原始獲自慢性靜脈潰瘍的糞腸球菌(&^rococc^尸aeca/h)2374、大腸桿菌(^yc/eWcA/aco7/)37.4、銅綠假單胞菌(戶，d歸/7asaerz/g//7,)27.4,和獲自特應(yīng)性濕滲患者的白色念珠菌("6/c譜)BM4435。實(shí)施例1抗微生物肽由I畫(huà)vagenAB，Ideon，SE-22370，Lund，Sweden合成序歹'J表和下面表l中所示的抗微生物肽。通過(guò)質(zhì)語(yǔ)分析(MALDI.TOFVoyager)證實(shí)這些肽的純度和分子量。表1來(lái)源肽代碼C3aLRKCCEDGMRENPM鵬CQRRTRFISUUC26C3aLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHARAS乙GE27C3aCNYITELRRQHARASHLGLARCNY21層粘連蛋白-alSRNLSEIKLLISQARKSRN16層粘連蛋白-alSRNLSE虹LISQARKQAASI&VAVSADRSRN29層粘連蛋白-alKDFLS正LFRGRVKVKDF15層粘連蛋白-alSAVRKKLSVELS1RTSAV15層粘連蛋白-a5LGTRLRAQSHQRSRPGRWHKVSVRWLGT25層粘連蛋白-a5PPPPLTSASKAIQVFLLGGSRKRVLPPP25層粘連蛋白-a5RLRAQSRQRSRPGRWHKVSVRWRLR22層粘連蛋白-alPGRWHKVSVRWPGR11層粘連蛋白-plRIQNLLKTTNLRIKFVKLRIQ18纖連蛋白QPPRARTTGYUKYEKPGQPP18VonWillebrand因子YIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAYIG23玻連蛋白AKKQRFRHRNRKGYRAKK15蛋白質(zhì)C抑制劑SEKTLRKWLKMFKKRQI^LYSEK20富含組氨酸的糖蛋白G鵬HGHHPHG鵬HGHHPHG鵬O激肽原KHNLGHGHKHERDQOHGHQRKHN20激舦原GGHVLDHKHGHGHGKHKNKGGG咖激肽原HKHGHGHGKHKNKGKKNGKHHKH20合成的序列AKKARAAKKARAAKKARAAKKARAAKK24合成的序列AKKARAAKKARAAKKARAAKK18合成的凈列AKKARAAKKARAAKK12合成的岸列ARKKAAKAARKKAAKAARKKAAKAARK24合成的序列ARKKAAKAARKKAAKAARK16:合成的K-〉H序列AHHAHAAHHAHAAHHAHAAHHAHAAHKi24:l合成的K->H序列AHHHAAHAAHHHAAHAAHHHAAHAAHH24:2實(shí)施例2富含精氨酸和賴氨酸的肽的抗細(xì)菌效應(yīng)圖1描述了富含精氨酸和賴氨酸的肽(序列表)對(duì)糞腸球菌(艇er歸c譜Aeca/2、)的殺細(xì)菌作用。在Todd-Hewitt(TH)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)中期。用含有5mM葡萄糖的10mMTris，pH7.4洗滌和稀釋細(xì)菌。在37X:與合成肽一起溫育細(xì)菌(50^1;2x106cfu/ml)2小時(shí)，其中合成肽為0.03到60nM濃度。為了定量殺細(xì)菌活性，在TH瓊脂平板上涂系列稀釋度的溫育混合物，接著在37。C溫育過(guò)夜，并且測(cè)定菌落形成單位的數(shù)量。)xmf的糞腸球菌(A尸aeca/h)(分離抹2374)與0.03到6(VM濃度的肽在5(Vl中溫育。(A)來(lái)源于層粘連蛋白的合成的肽。示出了來(lái)源于a5鏈(PPP25:SEQIDNO:13，LGT25:SEQIDNO:12,RLR22:SEQIDNO:14，PGR11:SEQIDNO:15)和al鏈(SRN16:SEQIDNO:8，SRN29:SEQIDNO:9,KDF15:SEQIDNO:10，SAV15:SEQIDNO:11)的LG結(jié)構(gòu)域的肽的作用。一種肽(RIQ18:SEQIDNO:16)來(lái)源于pi鏈。(B)三種肽來(lái)源于補(bǔ)體因子C3(LRK26:SEQIDNO:5，LGE27:SEQIDNO:6和CNY21:SEQIDNO:7),AKK15來(lái)源于玻連蛋白，SEK20:SEQIDNO:19來(lái)源于蛋白質(zhì)C抑制劑，QPP18:SEQIDNO:17來(lái)源于纖連蛋白和YIG23:SEQIDNO:18來(lái)源于vonWillebrand因子。(C)肝素結(jié)合共有序列(AKKARA)n(n=1-4)和(ARKKAAKAh(n=1-3)的抗細(xì)菌作用。n=l肽不發(fā)揮抗微生物作用。不與肝素相互作用的肽GHRPLDKKREEAPSLRPA、LVTSKGDKELRTGKEKVTS和KNNQKSEPLIGRKKT(Andersson等，EurJBiochem，2004，271;271:1219-1226)是不抗微生物的。實(shí)施例3抗微生物肽的徑向擴(kuò)散測(cè)定法分析(表2)基本^口以前(Andersson等，/"/ocAejz，2004，271:1219-1226)所述進(jìn)行徑向擴(kuò)散測(cè)定(RDA)。簡(jiǎn)而言之，在10ml全強(qiáng)度(3%w/v)胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中培養(yǎng)細(xì)菌(大腸桿菌(^coh'))或真菌(白色念珠菌(a76/ca/3")達(dá)到對(duì)數(shù)中期。用10mMTris，pH7.4洗微生物1次。向5ml由0.03%(w/v)TSB、1%(w/v)低電滲型(Low-EEO)瓊脂糖(Sigma，StLouiseMO)和終濃度0.02%(v/v)Tween20(Sigma)組成的下層瓊脂糖凝膠添加4x1()6細(xì)菌cfu或lx1()5真菌cfu。向085mm培養(yǎng)皿中傾倒入該下層瓊脂糖凝膠。瓊脂糖固化后，打出4mm直徑的孔，并且向每個(gè)孔添加6jxl待測(cè)樣品。在37。C溫育平板3小時(shí)以允許肽擴(kuò)散。然后用5ml熔化的覆蓋層(dH20中6。/。TSB和l。/。Low-EE0瓊脂糖)覆蓋下層凝膠。37。C溫育18-24小時(shí)后，通過(guò)每個(gè)孔周圍的清亮區(qū)觀察肽的抗微生物活性。檢測(cè)100iuM濃度的合成肽以確定相對(duì)于已知肽LL-37的抗細(xì)菌作用。為了最小化實(shí)驗(yàn)之間的差異，在每個(gè)板上都包含LL-37標(biāo)準(zhǔn)(100^iM)。以徑向擴(kuò)散單位(以毫米為單位的清亮區(qū)的直徑-孔直徑)xlO)表示肽的活性。結(jié)果如下面表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例4肽抗大腸桿菌(Aco//)和白色念珠菌(C.a/6/ca/^)的徑向擴(kuò)散測(cè)定(圖2)圖2表示利用一組抗微生物肽進(jìn)行的徑向擴(kuò)散測(cè)定。如上所述進(jìn)行該測(cè)定。在37。C溫育糞腸球菌(A尸aeca/")細(xì)菌(圖A)和在28。C溫育白色念珠菌(Ca/^/cTaa76/ca""(圖B)18-24小時(shí)后，通過(guò)每個(gè)孔周圍的清亮區(qū)觀察肽的抗微生物活性。實(shí)施例5富含組氨酸的肽的抗細(xì)菌作用圖3描述了富含組氨酸的肽的殺細(xì)菌作用。在Todd-Hewitt(TH)培養(yǎng)基中將糞腸球菌尸aeca/")細(xì)菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)中期。在含有5raM葡萄糖，有或無(wú)50pMZnCl的10mMTris，pH7.4中或者在10mMMES緩沖液，5mM葡萄糖，pH5.5中洗滌和稀釋細(xì)菌。在37"C溫育細(xì)菌(50pl;2xl0、fu/ml)和合成肽2小時(shí)，合成肽的濃度為0.03到60pM(Tris緩沖液，有或無(wú)鋅)或者為30和60(Tris和MES緩沖液)。為了定量殺細(xì)菌活性，在TH瓊脂平板上涂系列稀釋度的溫育混合物，接著在37。C溫育過(guò)夜，并且測(cè)定菌落形成單位的數(shù)量。(A)顯示在有或無(wú)50jiMZnCl的情況下，來(lái)源于富含組氨酸的糖蛋白(GHH20:SEQIDNO:4)和激肽原(KHN20:SEQIDNO:3，GGH20:SEQIDNO:2和HKH20:SEQIDNO:1)的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽的作用。(B):在含有5mM葡萄糖的10mMTris，pH7.4中或者在10mMMES緩沖液，5mM葡萄糖，pH5.5中肽(30和60pM)的作用。數(shù)字表示％存活率，其中100%是對(duì)照(無(wú)肽)。(C):在固定肽/鋅摩爾比(l:100)的情況下，肽AHH2tl和AHH24:2對(duì)糞腸球菌(A/aeca/2)的作用。沒(méi)有鋅的情況下肽不發(fā)揮抗微生物活性。實(shí)施例6肽作用的電子顯微鏡分析圖4顯示經(jīng)過(guò)抗微生物肽作用的銅綠假單胞菌(Pse"(/咖o/2asser^2'/3o^s)細(xì)菌的電子顯孩史鏡分析。(A):對(duì)照。(B-H)對(duì)用約50%所需殺細(xì)菌濃度的肽處理過(guò)的細(xì)菌的分析。也分析了200%的HKH20。(B)LL-37、(C)ARK24、(D)SEK20、(E)AKK24、(F)LGT25、(G)HKH20和(H)200。/。殺細(xì)菌濃度的HKH20。除了G和H(0.5罔)外，棒條表示l|um。肽處理的細(xì)菌的電子顯微鏡分析證明了與對(duì)照比較，處理過(guò)的細(xì)菌在形態(tài)學(xué)上有明顯的差異。CathelicidinLL-37沿著銅綠假單胞菌(尸.aeri^//70^)細(xì)菌細(xì)胞膜引起局部微擾及破壞，并且偶爾地在細(xì)胞外發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，并且用這里所公開(kāi)的內(nèi)源抗微生物肽獲得了相似的觀察結(jié)果。實(shí)施例7內(nèi)源抗微生物肽的肝素結(jié)合(圖5)檢測(cè)肽的肝素結(jié)合活性。肽被施加在硝酸纖維素膜(Hybond，AmershamBiosciences)上。封閉膜(PBS，pH7.4,0.25%Tween20，3%牛血清白蛋白)1小時(shí)，并且在相同的緩沖液中與放射性標(biāo)記的肝素溫育1小時(shí)。在有或無(wú)50j^MZnCl的情況下檢測(cè)富含組氨酸的肽的肝素結(jié)合。如前述進(jìn)行肝素的放射性碘化(Andersson等，Aw/飾c細(xì)，2004，271;271:1219-1226)。添加未標(biāo)記的多糖(2mg/ml)用于竟?fàn)幮越Y(jié)合。洗膜(PBS，pH7.4，0.25%Tween20中3x10min)。使用Bas2000放射成像系統(tǒng)(Fuji)觀察放射性。未標(biāo)記的肝素(6mg/ml)抑制1251-肝素與C3來(lái)源的肽LRK26和LGE27和LL-37的結(jié)合(上部分)。實(shí)施例8在鎳-瓊脂糖凝膠上純化含組氨酸的抗微生物片段(圖6)在大腸桿菌(Aco")抹系(BL21DE3)中表達(dá)人類激肽原的結(jié)構(gòu)域D5，其含有肽表位KHN20、GGH20和HKH20。通過(guò)向指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)菌添加lmM異丙基-硫代-半乳糖苷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。3h溫育后，通過(guò)離心收集細(xì)菌。在50mM磷酸鹽、300mMNaCl，pH8.0(緩沖液A)中重懸浮沉淀，并且通過(guò)重復(fù)冷凍-融化循環(huán)裂解細(xì)菌。然后，以"000g離心裂解物30分鐘。上清液與加載有鎳和用緩沖液A平衡的2mlNiNTA-瓊脂糖混合。將瓊脂糖加到柱子中，用含有0.1%TritonX-100的10ml緩沖液A、10ml緩沖液A、含有1MNaCl的5ml緩沖液A、5ml緩沖液A、10ml20%乙醇、含有5mM咪唑的10ml緩沖液A和含有30raM咪唑的緩沖液A洗滌。在500mM咪唑中洗脫蛋白質(zhì)(箭頭)。在徑向擴(kuò)散測(cè)定中該結(jié)構(gòu)域發(fā)揮了抵抗大腸桿菌(Aco//)的抗細(xì)菌作用。序列表<110>DermagenAB<120>具有肝素結(jié)合活性的新的抗微生物肽<130>xxxxx<160>22<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)6激肽原<400>1HisLysHisGlyHisGlyHisGlyLysHisLysAsnLysGlyLysLys151015AsnGlyl_ysHis20<210>2<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自激肽原<400>2GlyGlyHisvalLeuAspHisLysHisGlyHisGlyHisGlyHisLys1510ISAsnl_ysGly<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自激肽原<400>3LysHisAsnLeuGlyHisGlyHisLysHisGluArgAspGinGlyHis151015GlyHisGinArg20<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自富含組氨酸的糖蛋白<400>4GlyHisHisProHisGlyHisHisProHisGlyHism'sProHisGly151015<210>5<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自補(bǔ)體因子C3<400>5LeuArgLyscysCysGluAspGlyMetArgGluAsnProMetArgphe151015HisHisProsH2SerCysG，nArgArgThrArgPhelieSer202S<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自補(bǔ)體因子C3<400>6LeuGlyGluAlaCysLysLysvalPheLeuAspcysCysAsnTyrlie151015ThrGluLeuArgArgGinHisAlaArgAlaSer2025<210>7<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自補(bǔ)體因子C3<400>7CysAsnTyrlieThrGluLeuArgArgGinHisAlaArgAlaSerHis1510ISLeuGlyLeuAlaArg20<210>8<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自層粘連蛋白<40O>8SerArgAsnLeuSerGlulieLysLeuLeulieSerGinAlaArgLys1015<210>9<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自層粘連蛋白<400>9SerArqAsnLeuSerGlulieLysLeuLeulieSerGinAlaArgLysIS1015GinAlaAlaserlieLysValAlaValserAlaAspArg2025<210>10<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自層粘連蛋白<400>10<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自層粘連蛋白<400>11SerAlaValArgLysLysLeuServalLeuserlieArg工gr<210>12<211>25sygyGro0JLI6psAyLI<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自層粘連蛋白<400>12LeuGlyThrArgLeuArgAlaGinSerArgGinArgSerArgProGly1510ISArgT卬HisLysValSerValArgTrp2025<210>13<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自層粘連蛋白<400>13ProProProProLeuThrserAlaSerLysAlalieGinValPheLeu151015l_euGlyGlySerArgl_ysArgvall_eu2025.<210>14<211>22c212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自層粘連蛋白<400>14ArgLeuArgAlaGinserArgGinArgSerArgProGlyArgTrpHis1.51015LysvalServalArgTrp20<210>15<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula><212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自Willebrand因子<400>18TyrlieGlyLeuLysAspArgLysArg;『SerGluLeuArgileAlaSerGinValLysTyrAla20<210>19<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自C蛋白<400>19SerGluLysThrLeuArgLysTrpLeuLysMetPheLysLysArgGin1510ISLeuGluLeuTyr20<210>20<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的序列<400>20AlaArgLysLysAlaAlaLysAlaAlaArgLysLysAlaAlaLysAla151015AlaArgLysLysAlaAlaLysAla20<210>21<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的序列<400>21AlaLysLysAlaArgAlaAlaLysLysAlaArgAlaAlaLysLysAla151015ArgAlaAlaLysLysAlaArgAla20<210>22<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>來(lái)自玻連蛋白<400>22AlaLysLysGinArgPheArgHisArgAsnArgLysGlyTyrArg一—*ai廠權(quán)利要求1、具有肝素結(jié)合活性、來(lái)源于C3a、并具有10到36個(gè)氨基酸殘基的肽用于制備抗微生物組合物的用途，其中所述肽包含至少4個(gè)選自K、R和H的氨基酸殘基。2、根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述肽包含IO、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個(gè)氨基酸殘基。3、根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中該肽選自SEQIDN0:5、6和7。4、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該肽是內(nèi)源的、合成的或半合成的。5、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該肽與一種或多種其它抗微生物肽或其它物質(zhì)連接。6、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該肽被延長(zhǎng)1-100個(gè)氨基酸殘基。7、根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中該肽被延長(zhǎng)5-50個(gè)氨基酸殘基。8、根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中該肽被延長(zhǎng)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)氨基酸殘基。9、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該肽通過(guò)1-6個(gè)氨基酸的置換而被修飾。10、根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中該肽通過(guò)酰胺化、酯化、?；?、乙?；EG化或烷基化而被修飾。11、根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述組合物是包含所述肽和藥物學(xué)可接受的緩沖液、稀釋劑、載體、助劑或賦形劑的藥物組合物。12、根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中該組合物包含2、3或4種肽之間的混合物。13、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該組合物包含一種或多種抗生素和/或防腐劑。14、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中組合物是顆粒、粉末、片劑、包衣片劑、膠嚢、栓劑、糖漿劑、乳劑、凝膠、軟膏、懸浮液、乳膏、氣溶膠、滴劑形式或可注射形式。15、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述抗微生物組合物用于預(yù)防、抑制、減少或破壞選自細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌和酵母的微生物。16、根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所迷抗微生物組合物用在治療或診斷中。17、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所迷抗微生物組合物用于治療由微生物引起的抗微生物疾病，所述微生物選自細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌和酵母。18、根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所迷抗微生物組合物用于治療由微生物引起的疾病，所述孩t生物選自糞腸J求菌(^^erococc"s尸aeca/is)、大腸軒菌(fscAer2'c/aco7/)、銅i錄假單月包菌(尸5"ewdo/ho/zasse_rw^7/7osa)、奇異變形菌(辺/ra6/7/s)、肺炎鏈球菌(Sfre/^ococct^p/ew/Z70/2/ae)、酉良腺鏈球菌(Sfre/^ococcys;7yo^nes)和金黃色葡萄球菌(57sMf/ococcz/sawre"s)。19、根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所述抗微生物組合物用于治療由微生物引起的疾病，所述微生物選自白色念珠菌(Ca/3&Vaa^ica/2S)和近平滑念珠菌(Ca/7ff油psra;"'/o".s)。20、根據(jù)權(quán)利要求1的組合物在骨劑、粘合劑、縫線或者傷口敷料中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及具有肝素結(jié)合活性的抗微生物肽，其來(lái)源于基本無(wú)抗微生物活性的內(nèi)源哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)并且具有10到36個(gè)氨基酸殘基，所述蛋白質(zhì)選自層粘連蛋白同種型、補(bǔ)體因子C3、富含組氨酸的糖蛋白和激肽原，其中抗微生物肽包含至少4個(gè)選自K、R和H的氨基酸殘基。本發(fā)明也涉及包含所述抗微生物肽的藥物組合物和抗微生物肽和/或抗微生物/藥物組合物的用途。文檔編號(hào)C07KGK101161284SQ20071014818公開(kāi)日2008年4月16日申請(qǐng)日期2004年5月19日優(yōu)先權(quán)日2003年5月19日發(fā)明者A·施米特興,M·馬爾姆斯滕申請(qǐng)人:德瑪根股份公司