專利名稱：由Phaffia制備玉米黃素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葉黃素-類胡蘿卜素的生產，特別涉及玉米黃素和β-隱黃素(cryptoxanthin)通過Phaffia屬微生物進行生產。
更特別地，本發(fā)明提供了一種葉黃素-類胡蘿卜素的生產方法，特別是提供了一種玉米黃素和β-隱黃素通過遺傳工程修飾的重組Phaffia屬微生物進行生產的方法。
用本發(fā)明的方法，可以在重組Phaffia屬微生物中，生產有用的除蝦青素以外的其它葉黃素-類胡蘿卜素，如是主要葉黃素-類胡蘿卜素的玉米黃素和β-隱黃素。
能生產β-胡蘿卜素的任何菌株都適合用作宿主菌。當選擇的宿主菌是常規(guī)能從β-胡蘿卜素生產蝦青素的Phaffia菌株時，在導入和表達編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因后，就可以進行蝦青素和其它葉黃素-類胡蘿卜素混合物的生產了。另一方面，當選擇不能生產蝦青素但可以積累β-胡蘿卜素的菌株用作宿主菌時，希望可以生產最大量水平的葉黃素-類胡蘿卜素，如玉米黃素和β-隱黃素，而且最好還沒有蝦青素的積累。這種可以積累β-胡蘿卜素的宿主菌，可以通過積累蝦青素的P.rhodozyma突變而獲得?？蛇x擇的方法之一是，例如，這種積累β-胡蘿卜素的宿主菌可以通過滅活蝦青素合成酶而獲得。蝦青素合成酶是參與蝦青素從β-胡蘿卜素進行生物合成的酶，該酶在US 6,365,386中有記載。使蝦青素合成酶的基因斷裂，將是滅活該酶最簡便的方法之一。
而且，這種可以積累β-胡蘿卜素的宿主菌，也可以從公共典型培養(yǎng)物收集中心獲得，例如積累β-胡蘿卜素的P.rhodozyma菌ATCC96815，可以從美國典型微生物培養(yǎng)收集中心購買(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)。從自然界分離新的可積累β-胡蘿卜素的P.rhodozyma菌株，則是另一制備本發(fā)明宿主菌的方法。需要說明的是，該分離菌株可以是蝦青素生產菌的衍生物或自發(fā)突變株。
本發(fā)明的一個方面是玉米黃素和β-隱黃素的生產方法，包括培養(yǎng)表達β-胡蘿卜素羥化酶的重組Phaffia菌株。
所述β-胡蘿卜素羥化酶，在β-紫羅酮環(huán)3，3’位點催化β-胡蘿卜素使其羥基化，經由β-隱黃素而可以生產出葉黃素玉米黃素。編碼此酶的基因已經從多個物種分離得到，例如，來自黃桿菌屬的(Flavobacterium)種的crtZ基因(US 6,124,113)，來自噬夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)的crtZ基因，來自草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)的crtZs基因，來自海洋細菌Agrobacterium aurantiacum種以及產堿菌屬(Alcaligenes)種，或海洋細菌Paracoccus marcusii(GenBank accession No.Y15112，1997)的crtZ基因，而且Paracoccus carotinifaciens種nov.的β-胡蘿卜素羥化酶基因也可以從植物獲得。
本發(fā)明可以使用任何可編碼有β-胡蘿卜素羥化酶活性的基因。
優(yōu)選地，所述β-胡蘿卜素羥化酶基因可以從有β-胡蘿卜素羥化酶基因的微生物中獲得，這些微生物可以選自黃桿菌屬，歐文氏菌屬(Erwinia)，土壤桿菌屬(Agrobacterium)，產堿菌屬，和副球菌屬(Paracoccus)屬微生物。
更優(yōu)選地，所述β-胡蘿卜素羥化酶基因可以從有β-胡蘿卜素羥化酶基因的黃桿菌屬的種R1534 WT(ATCC21588)(GenBank accession No.U62808)，噬夏孢歐文氏菌ATCC19321(GenBank accession No.D90087)，草生歐文氏菌ATCC39368(GenBank accession No.M87280)，Agrobacteriumaurantiacum(GenBank accession No.D58420)，產堿菌屬PC-1(GenBankaccession No.D58422)，Paracoccus marcusii MH1(GenBank accession No.Y15112)，或者革蘭氏陰性菌E-396(FERM BP-4283)(JP-A Hei 10-155497)獲得。
更優(yōu)選地，所述β-胡蘿卜素羥化酶基因可以從黃桿菌屬的種R1534WT(ATCC21588)(GenBank accession No.U62808)獲得，或者該酶也可以從基本上同源的DNA序列獲得。
術語“基本上同源的DNA序列”，對編碼β-胡蘿卜素羥化酶的DNA序列來說，是指編碼氨基酸序列的DNA序列，其氨基酸序列與黃桿菌屬的種R1534 WT(ATCC21588)crtZ基因的氨基酸序列相比時，有大于60％，優(yōu)選大于70％，更優(yōu)選大于80％，最優(yōu)選大于90％的相同氨基酸，而且該氨基酸顯示出與黃桿菌屬(Flavobacterium)種R1534 WT(ATCC21588)crtZ基因編碼酶有相同性能酶活性。
使用β-胡蘿卜素羥化酶基因，可以使Phaffia屬微生物產生玉米黃素和β-隱黃素。表達β-胡蘿卜素羥化酶基因的Phaffia重組微生物，可以通過已知的重組技術制備。
分離和克隆編碼本發(fā)明β-胡蘿卜素羥化酶DNA的技術，是本領域已知的，包括從基因組DNA分離。從基因組DNA克隆本發(fā)明DNA序列，可能會受聚合酶鏈反應(下文中稱為PCR)影響。
分離或克隆編碼β-胡蘿卜素羥化酶的DNA，優(yōu)選克隆在合適表達載體之后，用于在宿主微生物Phaffia中表達該酶。
“表達載體”包括能表達包含其中DNA序列的載體，該序列可操作性地連接至其它序列，如調控序列。所述調控序列，能影響所述DNA序列在Phaffia微生物中表達。術語“可操作性地連接”是指，它們處于并排(juxtaposition)位置，其中所描述的成分處在這樣一種關系中，即允許它們以預期的方式作用。術語“調控序列”，可以認為，至少應該包括對表達目的基因必需的那些成分，當然也可以包括其它的有益成分。一般來說，調控序列包括啟動子，終止子，在某些情況下，還可以包括增強子，反式作用因子，或轉錄因子。組成型啟動子，如來自P.rhodozyma甘油醛-3-脫氫酶(GAP)基因的啟動子(WO 97/23,633)，可以用于獲得組成型表達。也可以使用誘導型啟動子，它能對表達精確調控。誘導性啟動子的例子是，編碼熱休克蛋白或淀粉酶基因，以及類似基因的啟動子。
可以使用本領域普通技術人員熟知的方法，構建所述表達載體。
雖然未明確陳述，但是本文已經暗示表達載體必須可以在宿主生物體中復制，它或者以游離基因(episome)形式進行復制，或者以染色體DNA整合的一部分進行復制。一般來說，基因的高穩(wěn)定性，可以從后續(xù)事件中判斷。要通過同源重組將表達載體整合進入宿主微生物染色體，那必須制備包含至少一部分與宿主基因組DNA同源的DNA片段的載體。為了達到上述目的，rDNA基因片段可以有效用在Phaffia微生物中。rDNA是一種衛(wèi)星DNAs，在基因組中以多拷貝形式存在。將rDNA片段用作表達載體重組的靶向DNA，這樣，表達在所述載體上的目標DNA，才能夠整合進入宿主基因組，并且也以多拷貝的形式存在。多拷貝可以產生基因劑量效應，從而使目標酶過表達。在本發(fā)明的實施例中，這種rDNA片段可以方便地達到上述目的?？梢哉J為，本發(fā)明也包括其它形式的表達載體。這些載體是上述載體的功能等價物，而且它們是已知的，或者說將來會知道。
分離的編碼β-胡蘿卜素羥化酶的DNA序列，可以用多種方法進行操作，以使多肽順利表達。對編碼所述β-胡蘿卜素羥化酶的核苷酸序列在它插入至表達載體之前進行的操作，希望取決于或必須取決于該表達載體。利用克隆方法修飾核苷酸序列的技術，是本領域技術人員熟知的。
包含所述β-胡蘿卜素羥化酶基因被克隆進表達載體的重組DNA，將會被轉導至宿主微生物。轉導外源DNA至真菌細胞，包括Phaffia微生物的方法，是本領域技術人員熟知的。這些方法包括，例如，LiCl轉化法，原生質融合法，電穿孔轉導法，用DNAs包被粒子轟擊的粒子槍轉導法，以及本領域已知的其它方法。在本發(fā)明實施例中，使用粒子槍轉導法用于P.rhodozmal轉化。
這樣獲得的重組微生物，可以使編碼β-胡蘿卜素羥化酶的DNA序列過表達。因此，本發(fā)明的重組微生物，可以在葉黃素-類胡蘿卜素，特別是在玉米黃素和β-隱黃素的生產過程中使用。
本發(fā)明的又一個方面是，生產玉米黃素和β-隱黃素的生物學方法，包括將重組Phaffia微生物，在用于生產類胡蘿卜素底物存在的情況下，在需氧條件，水性(aqueous)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以及從所述重組微生物細胞或者從所述肉湯培養(yǎng)基中分離所要的類胡蘿卜素。
類胡蘿卜素包括葉黃素，它通常通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Phaffia株而生產。培養(yǎng)基可以包括對細胞合適的大量和微量營養(yǎng)成分，例如用作碳源促進細胞生長的，同時也用作生產類胡蘿卜素底物的糖蜜，蔗糖，或葡萄糖；氮源，如玉米浸漬提取物，酵母提取物，硫酸銨，磷酸銨，氫氧化銨，或尿素；磷源，如磷酸銨，磷酸；以及添加的微量營養(yǎng)元素或礦物質鹽，如硫酸鎂，硫酸鋅，生物素，或去硫生物素。
優(yōu)選的培養(yǎng)條件是，pH在4-8的范圍內，溫度在15-26℃之間，培養(yǎng)24-500小時。
更優(yōu)選的培養(yǎng)條件是，pH在5-7的范圍內，溫度在18-22℃之間，培養(yǎng)48-350小時。
在培養(yǎng)中，進行通氣和攪拌通常能使生產類胡蘿卜素得到有利的結果。
如果通過使用本發(fā)明的方法培養(yǎng)重組Phaffia株生產類胡蘿卜素，那么類胡蘿卜素，可以從培養(yǎng)基中分離，這出現在類胡蘿卜素被分泌在培養(yǎng)基中的情況中，或者也可以從微生物細胞中分離；另外，如果有必要，希望本申請類胡蘿卜素與其它類胡蘿卜素分離，那么，可以使用本領域已知的各種方法，這可能出現在只需要一種特定類胡蘿卜素的例子中。
本發(fā)明生產的類胡蘿卜素，可以用在食品或飼料的制備過程中。本領域的技術人員熟知這些制備過程。這些復合食品或飼料，可以進一步包括添加劑，或通常用于這些目的的成分，以及其它本領域范圍內已知的物質。
下面實施例是對本發(fā)明的進一步解釋，而并不是對本發(fā)明范圍進一步的限制。
下列材料和方法將在下文記載的實施例中使用菌株P.rhodozvma ATCC96594(根據布達佩斯條約進行了重新保藏，保藏號為No.ATCC 74438，保藏日期為4月8日，1998)P.rhodozvma ATCC96815(根據布達佩斯條約進行了保藏，保藏號為No.ATCC 74486，保藏日期為2月18日，1999)E.coli TOP10F-，mcrA，delta(mrr-hsdRMS-mcrBC)，phi80，delta(lacZ M15)，delta(lacX74)，recAl，deoR，arnD 139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endAl，nupG(Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)pGEM-T(Promega Corporation，USA)方法限制性酶和T4DNA連接酶購自Takara Shuzo(Ohtsu，Japan).
聚合酶鏈反應(PCR)用Perkin Elmer 2400型熱循環(huán)儀進行。PCR各個條件在實施例中有記載。PCR引物自商業(yè)途徑購買。用于DNA測序的熒光DNA引物購自Pharmacia。DNA測序使用自動熒光DNA測序儀進行(ALFred，Pharmacia)。
玉米黃素和β-胡蘿卜素可靠樣品，分別購自EXTRASYN-THESE S.A.(Genay Cedex，France)和WAKO(Osaka，Japan)。β-隱黃素購自RocheVitamins AG(Basle，Switzerland)。
實施例1來自黃桿菌屬的菌種ATCC21588基因組DNA β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)的克隆首先，制備基因組DNA。將黃桿菌屬的菌種R1534 WT細胞(ATCC21588)(US 6,124,113)接種至50ml含有下列成分的培養(yǎng)基中，即接種至含有1％葡萄糖，1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)，1％酵母提取物(Difco)，0.5％MgSO4，和3％NaCI的培養(yǎng)基中，在27℃需氧條件下培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)物(50ml)在10,000g下離心10min。將離心沉淀物用10ml裂解緩沖液(50mM EDTA，0.1M NaCl，pH 7.5)稍微沖洗，然后將其在補加了10mg裂解酶的上述緩沖液中重懸，37℃溫育15min。在補加0.3ml N-月桂肌氨酸(Lauroyl Sarcosine)(20％)之后，再37℃溫育15min，之后用苯酚，苯酚/氯仿，氯仿對DNA進行抽提。所獲DNA在室溫下用0.3M醋酸鈉(pH 5.2)進行20min乙醇沉淀，之后10,000g離心15min。所獲沉淀物用70％乙醇洗滌，涼干，重懸至1ml TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)中。這樣所獲得的基因組DNA，先用火膠棉軟件包(collodium bags)(Sartorius，Germany)進行48小時抗水性分析，然后在0.3M醋酸鈉中用乙醇進行沉淀，接著再重懸至水中。以所制備基因組DNA為模板，使用熱循環(huán)儀(Perkin elmer 2400，USA)通過PCR擴增，獲得β-胡蘿卜素羥化酶基因的不含冗余側翼區(qū)編碼全長序列。所用合成引物為PZ1(SEQ ID NO1)(有Sma I位點CCCGGG)，PZ2(SEQ ID NO2)(有BamH I位點GGATCC)。
用Advantage-HF PCR試劑盒(CLONTECH Laboratories，Inc.，USA)進行PCR。PCR混合液可以根據制造商提供的用戶手冊制備。初始模板變性在94℃進行1min。擴增循環(huán)，94℃30秒，68℃4分，循環(huán)進行25次。在68℃再反應3分鐘之后，將反應混合物在15℃下保溫。通過該反應，擴增得到了β-胡蘿卜素羥化酶基因的全長ORF DNA片段。將此擴增得到的β-胡蘿卜素羥化酶基因連接至pCR2.1-TOPO載體，然后根據制造商提供的構建手冊，通過TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，USA)，將該載體轉導至E.coli TOP 10細胞。選擇幾個克隆進行序列分析。檢測每一個β-胡蘿卜素羥化酶基因的候選克隆序列。將其中一個顯示出與黃桿菌屬的菌種ATCC21588(GenBank accession No.U62808)β-胡蘿卜素羥化酶序列完全相同的DNA克隆命名為pTOPO-PZ #23N。將來自pTOPO-PZ #23N的522bp Smal/BamHI酶切片段，用作黃桿菌屬的菌種的crtZ基因序列盒。
實施例2來自草生歐文氏菌ATCC39368基因組DNA β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)的克隆將草生歐文氏菌(Escherichia v.ulneris)ATCC39368細胞接種至10ml含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)，0.5％酵母提取物(Difco)，0.5％NaCl的培養(yǎng)基中，在26℃需氧條件下培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)物(10ml)在10,000g下離心10min。所獲沉淀物，根據制造商提供的方法，使用QIAGEN Blood& Cell Culture DNA Midi試劑盒(QIAGEN，Germany)，進行基因組DNA的制備。以所制備基因組DNA為模板，使用熱循環(huán)儀(Perkin elmer 2400，USA)，通過PCR擴增，可獲得β-胡蘿卜素羥化酶基因不含冗余側翼區(qū)的全長編碼序列。所用兩合成引物為EZ1(SEQ ID NO3)(有Sma I位點CCCGGG)，EZ2(SEQ ID NO4)(有SalI位點GTCGAC)。
PCR用Advantage-HF PCR試劑盒(CLONTECH Laboratories，Inc.，USA)進行。PCR合劑可以根據制造商提供的用戶手冊制備。初始模板變性94℃1min。擴增循環(huán)，94℃30秒，68℃4分，循環(huán)25次。在68℃再反應3分鐘之后，將反應混合物15℃保溫。經過該反應，β-胡蘿卜素羥化酶基因全長ORF DNA片段(543bp)就擴增得到了。將此擴增得到的β-胡蘿卜素羥化酶基因連接至pCR2.1-TOPO載體，然后根據制造商提供的構建手冊，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，USA)將該載體轉導至E.coli TOP 10細胞。選擇幾個細胞克隆進行序列分析。檢測了每一個β-胡蘿卜素羥化酶基因的候選克隆序列。將其中一個與草生歐文氏菌ATCC39368(GenBank accession No.M87280)β-胡蘿卜素羥化酶序列完全相同的DNA克隆命名為pTOPO-EZ #2。將來自pTOPO-EZ #2的543bp SmaI/Sal I酶切片段，用作草生歐文氏菌的crtZ基因序列盒。
實施例3表達載體成分的制備對表達載體的各種成分G418抗性基因，P.rhodozyma甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(本文稱為GAP)啟動子和終止位點，P.rhodozyma rDNA片段，進行制備。G418抗性基因序列盒制備如下將Sac I接頭連接至含有G418抗性基因序列盒pUC-G418載體(US Patent No.6,365,386B1)的單一Hind III位點，所得載體命名為pG418Sa512。來自pG418Sa512的1.7kb Kpn I/Sac I片段，用作G418抗性基因序列盒。
GAP基因每一啟動子和終止位點以及rDNA片段，可以用P.rhodozymaATCC 96594基因組DNA作為模板，通過PCR獲得。要獲得基因組DNA，可以對P.rhodozyma ATCC 96594細胞在YPD(Difco Laboratories)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，使用QIAGEN Blood & Cell Culture DNA Midi試劑盒獲得(QIAGEN，Germany)。
以所制備基因組DNA為模板，使用Advantage-HF PCR試劑盒(CLONTECH Laboratories，Inc.，USA)，熱循環(huán)儀(Perkin elmer 2400，USA)，進行PCR。
用于擴增GAP啟動子序列的兩合成引物為GA#1(SEQ ID NO5)(有Not I位點GCGGCCGC)，GAP#5(SEQ ID NO6)(有Sma I位點CCCGGGG)。
初始模板變性94℃5min。擴增循環(huán)，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分，循環(huán)25次。在72℃延伸10分鐘之后，將反應混合物4℃保溫。經過該反應，GAP啟動子DNA片段(398bp)就擴增得到了。將此擴增得到的GAP啟動子連接至pCR2.1-TOPO載體，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，USA)將該其轉導至E.coli TOP 10細胞。選擇幾個細胞克隆進行序列分析。檢測了每一個GAP啟動子候選克隆的序列。其中一個與P.rhodozyma(GenBank accession No.Y08366)GAP啟動子完全相同的DNA克隆，被命名為pTOPO-pGAP2 #1。將來自pTOPO-pGAP2 #1的398bp Not I/Sma I酶切片段，用作GAP啟動子序列盒。
用于擴增GAP終止子序列的合成引物為GAP#33(SEQ ID NO7)(有BamHl-Sal I位點GGATCCGTCGAC)，GAP#4(SEQ ID NO8)(有Kpn I位點GGTACC)。
PCR條件與上述GAP啟動子所用的條件相同。經過該反應，GAP終止子DNA片段(302bp)就擴增得到了。將此擴增得到的GAP終止子連接至pCR2.1-TOPO載體，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，USA)將該其轉導至E.coli TOP 10細胞。選擇幾個細胞克隆進行序列分析。檢測了每一個GAP終止子候選克隆的序列。其中一個與P.rhodozyma(GenBankaccession No.Y08366)GAP終止子完全相同的DNA克隆，被命名為pTOPO-tGAP #1。將來自pTOPO-tGAP #1的302bp Bam H I/Kpn I酶切片段或296bp SalI/Kpn I酶切片段，用作GAP終止子序列框。
用于擴增rDNA片段的兩合成引物為R#1(SEQ ID NO9)(有Sac I位點GAGCTC)，R#2(SEQ ID NO10)(有NotI-Sac I位點GCGGCCGCGAGCTC)。
PCR條件與上述GAP啟動子所用的條件相同。經過該反應，包含rDNA的DNA片段(3126bp)就擴增得到了。將此擴增得到的rDNA連接至pCR2.1-TOPO載體，用TOPO TA克隆試劑盒將該其轉導至E.coli TOP 10細胞。選擇幾個細胞克隆進行序列分析。檢測了每一個rDNA候選克隆的序列。其中一個與P.rhodozyma(GenBank accession No.D31656，AF139632)rDNA序列完全相同的DNA克隆，命名為pTOPO-rDNA #1。將來自pTOPO-rDNA #1的1960bp SacII/Not I酶切片段，用作rDNA序列框。
實施例4攜帶獲自黃桿菌屬的菌種或草生歐文氏菌β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)表達載體的構建要構建攜帶黃桿菌屬的菌種crtZ的表達載體，需要用pGEM-T作骨架，將rDNA序列框、GAP啟動子序列框(獲自實施例3)，黃桿菌屬的sp.crtZ基因序列框(獲自實施例1)，GAP終止子序列框、G418抗性基因序列框的BamHI/Kpn I片段(獲自實施例3)，按順序依次連接。所獲表達載體命名為pRPZG-ptGAP2。
要構建攜帶草生歐文氏菌crtZ的表達載體，需要用pGEM-T作骨架，將rDNA序列框、GAP啟動子序列框(獲自實施例3)，草生歐文氏菌crtZ基因序列框(獲自實施例2)，GAP終止子序列框、G418抗性基因序列框SalI/Kpn I片段(獲自實施例3)，按順序依次連接。所獲表達載體命名為pREZG-ptGAP2。
實施例5將攜帶黃桿菌屬的菌種或草生歐文氏菌β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)的表達載體導入P.rhodozyma實施例4中所獲的每一表達載體，pRPZG-ptGAP2，pREZG-ptGAP2，都分別攜帶有黃桿菌屬的菌種或草生歐文氏菌crtZ基因。用EP 1,158,051中描述的粒子槍法，將上述表達載體轉化β-胡蘿卜素主要生產突變株，P.rhodozyma ATCC 96815。使用含有0.75M D-山梨醇、D-甘露醇，0.1mg/ml慶大霉素的YPD-瓊脂培養(yǎng)基，對重組菌株進行直接篩選。
作為結果，每種pRPZG-ptGAP2，pREZG-ptGAP2中，獲得了幾百個有0.1mg/ml慶大霉素抗性的轉化株。隨機選取每種轉化株35株，作進一步定性分析。
實施例6P.rhodozyma crtZ重組菌株的特征表征通過上述方法獲得的crtZ重組菌株P.rhodozyma ATCC 96815，用500mlErlenmeyer搖瓶，培養(yǎng)在50ml生產培養(yǎng)基中，20℃震蕩7天。在這之前，用種培養(yǎng)物接種，該種培養(yǎng)物是在7ml種培養(yǎng)基試管(直徑21mm)中20℃震蕩培養(yǎng)3天制備的。取出合適體積的培養(yǎng)肉湯，用于分析細胞生長和類胡蘿卜素產量。
培養(yǎng)基組合物如下種培養(yǎng)基葡萄糖30.0g/l，NH4Cl 4.83g/l，KH2PO41.0g/l，MgSO4-7H2O0.88g/l，NaCl 0.06g/l，CaCl2-2H2O 0.2g/l，KH苯二甲酸鹽(phtalate)20.0g/l，FeSO4-7H2O 28mg/l，痕量元素溶液0.3ml，維他命貯存液1.5ml，(pH調整至5.4-5.6)。
痕量元素溶液4N-H2SO4100ml/l，檸檬酸-H2O 50.0g/l，ZnSO4-7H2O 16.7g/l，CuSO4-5H2O 2.5g/l，MnSO4-4，5H2O 2.0g/l，H3BO32.0g/l，Na2MoO42.0g/l，KI 0.5g/l。
用于種培養(yǎng)基的維他命貯存液4N-H2SO417.5ml/l，內消旋肌醇40.0g/l，尼克酸(Nicotinic acid)2.0g/l，Ca-D-泛酸鹽2.0g/l，維他命B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-氨基苯甲酸(aminobenzoic)1.2g/l，維他命B6(吡多辛HCl)0.2g/l，生物素貯存液8.0ml.
生物素貯存液制備如下將4N-H2SO4加入至50ml乙醇中，調整溶液體積至100ml，然后再加入400mg D-生物素。
生產培養(yǎng)基葡萄糖22.0g/l，KH2PO414.25g/l，MgSO4-7H2O 2.1g/l，CaCl2-2H2O0.865g/l，(NH4)2SO43.7g/l，FeSO4-7H2O 0.28g/l，痕量元素溶液4.2ml，維他命貯存液9.35ml，(pH調整至5.5)。
用于生產培養(yǎng)基的維他命貯存液4N-H2SO417.5ml/l，尼克酸2.0g/l，Ca-D-泛酸鹽3.0g/l，維他命B，(硫胺HCl)2.0g/l，p-氨基苯甲酸1.2g/l，維他命B6(吡多辛HCl)0.2g/l，生物素貯存液30.0ml將一部分種培養(yǎng)基(seed culture)種子培養(yǎng)基一種培養(yǎng)基肉湯(2.5ml)，轉移至500ml Erlenmeyer搖瓶47.5ml生產培養(yǎng)基中。然后，20℃開始以200rpm旋震培養(yǎng)。培養(yǎng)第二天，培養(yǎng)基加入5ml 50％葡萄糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)第四天，取2ml培養(yǎng)肉湯，再在培養(yǎng)基中加入5ml 50％葡萄糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。第七天，取出一份培養(yǎng)物，分析類胡蘿卜素產量和細胞生長。
分析細胞生長，可以用UV-1200光度計(Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)測量600nm處光密度。
為了分析β-胡蘿卜素、β-隱黃素、玉米黃素含量，將取出肉湯與溶劑混合物(乙醇，己烷，乙酸乙酯)混合，然后玻璃珠劇烈震蕩，從P.rhodozyma細胞和肉湯中提取類胡蘿卜素。提取后，離心除去破碎細胞、玻璃珠，所得上清液進行HPLC分析，測出類胡蘿卜素含量。所用HPLC條件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)；溫度室溫；洗脫丙酮/己烷(18/82)，1ml/l水加入至洗脫液中；注入體積10ul，流速2.0ml/min；檢測UV 450nm結果發(fā)現，所有重組株(兩種crtZ表達載體，pRPZG-ptGAP2和pREZG-ptGAP2，每種35株轉化株)都生產玉米黃素和β-隱黃素并且沒有蝦青素積累。
選自表達黃桿菌屬的菌種crtZ基因或草生歐文氏菌crtZ基因的每種3株典型重組株及其宿主細胞(P.rhodozyma ATCC 96815)的生長情況，分別見下表。
表搖瓶培養(yǎng)物重組株的胡蘿卜素產生和生長情況
CAROss-胡蘿卜素；CRYPTOβ-隱黃素；ZEA玉米黃素；ASTA蝦青素如表所示，β-胡蘿卜素向β-隱黃素、玉米黃素的轉化，在所有表達黃桿菌屬的種crtZ基因或草生歐文氏菌crtZ基因的Phaffia重組株中都得到了例證。
序列表<110>羅奇維生素股份公司(Roche Vitamins AG)<120>由Phaffia制備玉米黃質<130>NDR5225<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>26<212>DNA<213>人工的<400>1cccgggatga gcacttgggc cgcaat 26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工的<400>2ggatcctcat gtattgcgat ccgccc 26<210>3<211>26<212>DNA<213>人工的<400>3cccgggatgc tagtaaatag tttaat 26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工的<400>4gtcgacttat tcgggcgaag acgacg 26<210>5<211>28<212>DNA<213>人工的<400>5gcggccgctg gtgggtgcat gtatgtac 28<210>6<211>26<212>DNA<213>人工的
<400>6cccggggatg gtaagagtgt tagaga 26<210>7<211>33<212>DNA<213>人工的<400>7ggatccgtcg actaaacggt tctctccaaa ccc 33<210>8<211>28<212>DNA<213>人工的<400>8ggtaccttga tcagataaag atagagat 28<210>9<211>20<212>DNA<213>人工的<400>9gagctctcga gtggacggtg20<210>10<211>28<212>DNA<213>人工的<400>10gcggccgcga gctcatcccg cttcactc 28
權利要求
1.一種生產玉米黃素和β-隱黃素的方法，包括在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基、需氧條件下，培養(yǎng)能表達β-胡蘿卜素羥化酶基因并且屬于Xanthophyllomyces屬(Phaffia)的重組微生物，以及從所述重組微生物細胞或培養(yǎng)液中，分離所獲得的類胡蘿卜素。
2.權利要求1的方法，其中重組微生物來自Xanthophyllomycesdendrorhous(Phaffia rhodozyma)ATCC96815，或其突變體。
3.權利要求1或2的方法，其中β-胡蘿卜素羥化酶基因源于選自下列的微生物黃桿菌屬，歐文氏菌屬，土壤桿菌屬，產堿菌屬，或副球菌屬，它們都含有β-胡蘿卜素羥化酶基因。
4.權利要求1或2的方法，其中β-胡蘿卜素羥化酶基因源于選自下列的微生物黃桿菌屬的種R1534 WT(ATCC21588)，噬夏孢歐文氏菌ATCC19321，草生歐文氏菌ATCC39368，Agrobacterium aurantiacum，產堿菌屬PC-1，Paracoccus marcusii MH1，或革蘭氏陰性菌E-396(FERMBP-4283)，它們都含有β-胡蘿卜素羥化酶基因。
5.權利要求1或2的方法，其中β-胡蘿卜素羥化酶基因源于黃桿菌屬菌種R1534 WT(ATCC21588)，或β-胡蘿卜素羥化酶基因的DNA序列基本上與之同源。
6.權利要求1-5中任意一項的方法，其中β-胡蘿卜素羥化酶基因，通過調控序列在重組微生物中表達。
7.權利要求1-6中任意一項的方法，其中培養(yǎng)是在pH4-8，溫度15-26℃下，培養(yǎng)24-500小時。
8.權利要求7的方法，其中培養(yǎng)是在pH5-7，溫度18-22℃下，培養(yǎng)48-350小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了玉米黃素和β－隱黃素的生產方法，包括在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中，需氧條件下培養(yǎng)表達β－胡蘿卜素羥化酶基因并且屬于Xanthophyllomyces屬(Phaffia)的重組微生物，和從所述重組微生物的細胞或培養(yǎng)液分離所得的類胡蘿卜素。
文檔編號C12P23/00GK1692160SQ03823180
公開日2005年11月2日 申請日期2003年9月23日 優(yōu)先權日2002年9月27日
發(fā)明者星野達雄, 尾島和之, 瀨戶口豐 申請人:Dsm Ip資產公司