專利名稱：地衣芽孢桿菌t1菌株的構(gòu)建,及其粗酶提取物的發(fā)酵生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)T399D菌株(″下文中為T1菌株″)的構(gòu)建，以及利用這種地衣芽孢桿菌T1菌株發(fā)酵生產(chǎn)，更準(zhǔn)確地說大規(guī)模生產(chǎn)包含角蛋白酶的粗酶提取物。
相關(guān)技術(shù)的說明角蛋白酶，是能特異降解家禽羽毛中的角蛋白的絲氨酸蛋白酶，其已經(jīng)從降解羽毛的細(xì)菌，地衣芽孢桿菌PWD-1中成功制備和分離出來。除促進(jìn)羽毛角蛋白的水解外，角蛋白酶還能夠水解廣譜的蛋白質(zhì)底物，包括酪蛋白、膠原、彈性蛋白等，并且它比本領(lǐng)域已知的大多數(shù)其他蛋白酶顯示更高的蛋白水解活性。
在許多其它應(yīng)用中，角蛋白酶的一個(gè)重要的潛在商業(yè)應(yīng)用是使用來自產(chǎn)生角蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株的、粗制的干燥無細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)物作為飼料添加劑來補(bǔ)充家禽飼料，以改善這種飼料的可消化性和營養(yǎng)價(jià)值。
然而，使角蛋白酶商品化的主要問題是這種酶的生產(chǎn)成本很高。
目前采取2種方法來解決這個(gè)問題(1)改良菌株，以開發(fā)具有改善的角蛋白酶產(chǎn)率的菌株；以及(2)改良工藝過程，以設(shè)計(jì)有效的生產(chǎn)策略用于發(fā)酵和提取角蛋白酶。
因此本發(fā)明的目的是提供過量生產(chǎn)角蛋白酶，并且證明其中的酶產(chǎn)量顯著高于野生型地衣芽孢桿菌PWD-1菌株的重組地衣芽孢桿菌菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可在商業(yè)上應(yīng)用的批量生產(chǎn)角蛋白酶的方法，該酶適合將粗制的發(fā)酵產(chǎn)品用作飼料添加劑，并且破壞感染性的朊病毒，并且純化的發(fā)酵產(chǎn)品適用于生物醫(yī)學(xué)的研究應(yīng)用。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面是在其染色體中插入了至少一個(gè)異源kerA編碼節(jié)段的重組芽胞桿菌，該重組的芽胞桿菌比未在染色體中插入至少一個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段的相應(yīng)野生型芽胞桿菌產(chǎn)生更大量的角蛋白酶。該芽胞桿菌可以是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌，并且該kerA編碼節(jié)段可以是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的kerA編碼節(jié)段。相應(yīng)的野生型芽胞桿菌是地衣芽孢桿菌PWD-1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組芽胞桿菌在其染色體中插入了多個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中插入了3至5個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組芽胞桿菌是蛋白酶缺失的芽胞桿菌。該kerA編碼節(jié)段是可操作地與啟動(dòng)子相連的，優(yōu)選組成型啟動(dòng)子，例如P43啟動(dòng)子。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是包括在培養(yǎng)基中的、在此所描述的重組芽胞桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)物。該培養(yǎng)基優(yōu)選包括不多于3％的蛋白質(zhì)底物，以及在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中該培養(yǎng)基包括1％的大豆和1％的羽毛粉。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是制備在此所述的重組芽胞桿菌的方法，包括下列步驟(a)將kerA編碼節(jié)段插入整合型的芽胞桿菌表達(dá)載體，該kerA編碼節(jié)段可操作地與啟動(dòng)子相連，該啟動(dòng)子在芽胞桿菌中起作用；然后(b)用該整合型的芽胞桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化芽胞桿菌。優(yōu)選地，該整合型的芽胞桿菌表達(dá)載體包括α-淀粉酶的5′-和3′-側(cè)翼DNA片段，并且將kerA編碼節(jié)段插入α-淀粉酶的5′-和3′-側(cè)翼片段之間。特別優(yōu)選的是pLAT10載體。
本發(fā)明的第四個(gè)方面是制備角蛋白酶的方法，包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)在此所描述的重組芽胞桿菌；然后(b)從該培養(yǎng)基收集角蛋白酶。優(yōu)選地該培養(yǎng)基包括不多于3％的蛋白質(zhì)底物，以及在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中該培養(yǎng)基包括1％的大豆和1％的羽毛粉。本發(fā)明的上述和其他目的和方面將在此處的附圖和下列陳述的說明書中更詳細(xì)地加以說明。
附圖簡述

圖1.從地衣芽孢桿菌PWD-1分離kerA。
圖2.培養(yǎng)基對從新的轉(zhuǎn)化體PJT-3生產(chǎn)角蛋白酶的影響。通過偶氮酪蛋白(azocasein)分析來確定蛋白酶活性。
發(fā)明詳述及其優(yōu)選的實(shí)施方案本發(fā)明可根據(jù)在此所描述的公開的內(nèi)容，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的認(rèn)識，以及根據(jù)美國專利號5,712,147、美國專利號5,525,229、美國專利號5,186,961、美國專利號5,171,682、美國專利號5,063、161、美國專利號4,959、311，美國專利號4,908、220、美國專利申請?zhí)?0030108991(題目為″用于蛋白水解和角蛋白水解的角蛋白酶的固定)；美國專利申請?zhí)?0020192731(題目為″用于消毒手術(shù)器械的方法和組合物″)和美國專利申請?zhí)?0020172989(題目為″用于破壞感染性朊病毒蛋白質(zhì)的組合物和方法″)所闡明的信息加以實(shí)施，其中所有公開的內(nèi)容在此全部引入作為參考。
重組地衣芽孢桿菌T399D菌株的構(gòu)建。為了開發(fā)能過量生產(chǎn)角蛋白酶的更好菌株，已經(jīng)使用2種方法過量生產(chǎn)該酶1)通過包含質(zhì)粒的菌株在芽胞桿菌中增加基因的拷貝數(shù)或2)在菌株的染色體中產(chǎn)生多基因拷貝。
已經(jīng)從枯草芽孢桿菌(Lin，X.，S.L Wong，E.S.Miller，andJ.C.H.Shih.(1997)，Expression of the Bacilluslicheniformis PWD-1 keratinase genein B.subtilis，J Ind.Microb.Biotech，19134-138)和大腸桿菌(Wang，J.J.andJ.C.H.Shih(1999)，F(xiàn)ermentation production of kerAtinasefrom Bacillus licheniformis PWD-1 and a recombinant B.subtilis，J Ind.Microb.Biotech.22608-616)中克隆和表達(dá)kerA基因。然而，由于發(fā)酵期間分離的不穩(wěn)定性，在芽胞桿菌中基于質(zhì)粒的酶表達(dá)不是穩(wěn)定的。原-角蛋白酶的包涵體形成和復(fù)雜的體外再折疊在大腸桿菌系統(tǒng)中影響角蛋白酶的表達(dá)，并導(dǎo)致有限的酶產(chǎn)率。盡管染色體整合經(jīng)常被用于改善基因表達(dá)，但是已經(jīng)報(bào)道了串聯(lián)擴(kuò)增的染色體基因的不穩(wěn)定性(Albertini，A.M.and A.Galizzi(1985)，Amplification of chromosomal region in Bacillussubtilis，J.Bacteriol.1631203-1211；Young，M.(1984)，Gene amplification in Bacillus subtilis，J.Gen.Microbiol.1301913-1921)。
本發(fā)明構(gòu)建攜帶kerA基因的整合型載體，然后將這種載體轉(zhuǎn)化并整合到蛋白酶缺失的不產(chǎn)孢子的宿主菌株地衣芽孢桿菌T399D中。經(jīng)過單交換Campbell重組，將多重整合拷貝的kerA基因?qū)氲降匾卵挎邨U菌T399D的染色體中。所得到的重組地衣芽孢桿菌T399D菌株表明，與野生型地衣芽孢桿菌PWD-1菌株相比，酶生產(chǎn)率顯著增加。
將地衣芽孢桿菌PWD-1(ATCC 53575)用于本發(fā)明以分離如圖1.B.所示的kerA基因。將地衣芽孢桿菌(DSM提供，NV，Het Overloon1，6411 TE Heerlen，荷蘭，并在下列專利參考文獻(xiàn)中有描述PCTWo85/0038；PCT WO88/0662；PCT WO91/1315；EP 0572088；EP0635574)用作克隆和表達(dá)研究的宿主。質(zhì)粒pLB29，攜帶P43啟動(dòng)子(Wang and Doi，1987)和kerA，被用作克隆的基因來源。整合型的芽胞桿菌表達(dá)載體pLAT10，來源于pLAT8(DSM提供，NV，荷蘭)，包含α-淀粉酶的5′和3′側(cè)翼區(qū)域，被用來幫助完整載體整合到宿主染色體中。PWD-1于50℃生長在羽毛、大豆、或Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中。地衣芽孢桿菌T399D菌株于37℃生長在含有20-50μg/mL新霉素的LB培養(yǎng)基中，來用于常規(guī)轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)。
DNA操作。通過快速堿性的十二烷基磺酸鈉方法從芽胞桿菌制備質(zhì)粒(Rodriguez and Tait，1983)。利用Doi(1983)所描述的方法分離PWD-1的染色體DNA。從Promega和Boehringer-Mannheim購買限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，并依照制造商的建議使用。用Pfu(Boehringer-Mannheim)或Taq(Promega)DNA聚合酶，在下列條件下進(jìn)行PCR94℃ 1min，56℃ 1.5min，72℃ 2min(30個(gè)循環(huán))以及72℃ 5min。通過0.8至1.2％的瓊脂糖凝膠分離DNA片段。分別通過QIAquick凝膠提取試劑盒和QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen Inc，CA)回收和純化所需要的DNA片段和PCR產(chǎn)物。
地衣芽孢桿菌DB104中的基因克隆、轉(zhuǎn)化和整合。利用如下列表1所描述的引物，通過PCR從pLB29質(zhì)粒擴(kuò)增kerA(1.4kb)和P43-kerA(1.7kb)
表1用于將kerA基因亞克隆到pLAT10的PCR引物
如圖1所示，將包含kerA或P43-kerA的擴(kuò)增的DNA片段連接到經(jīng)消化的質(zhì)粒載體中α-淀粉酶的5′-和3′-側(cè)翼DNA序列之間，替換全部的α-淀粉酶DNA序列。
將如上所述新構(gòu)建的質(zhì)粒(pNKERl、PNKER2和pNKER43)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌DB104中。通過如先前所述的(Lin等，1997)感受態(tài)細(xì)胞的方法進(jìn)行枯草芽孢桿菌DB 104的轉(zhuǎn)化。通過限制性內(nèi)切酶消化分析檢驗(yàn)kerA插入載體的精確度。
使陽性轉(zhuǎn)化子在包含20mg/L新霉素的LB培養(yǎng)基中生長后，從轉(zhuǎn)化子pNKER1/DB104、PNKER2/DB104和pNKER43/DB104檢測角蛋白酶活性，如表2所示表2來自枯草芽孢桿菌DB104的角蛋白酶表達(dá)
*所有的菌株于37℃在LB培養(yǎng)基中生長24小時(shí)。
地衣芽孢桿菌T399D中的轉(zhuǎn)化、整合和表達(dá)。從地衣芽孢桿菌DB104分離新構(gòu)建的整合質(zhì)粒pNKER1和pNKER43，并通過改進(jìn)的原生質(zhì)體方法(Sanders等1997；van der Lann等，1991)轉(zhuǎn)化入地衣芽孢桿菌T399D。通過限制性消化和PCR擴(kuò)增進(jìn)一步確證所有可能的轉(zhuǎn)化候選體中的基因插入。通過單交換Campbell重組整合；完整的質(zhì)粒整合到宿主染色體的互補(bǔ)的5′-或3′-α-淀粉酶側(cè)翼區(qū)域。通過Southern印跡分析大致確定所獲得的最終穩(wěn)定的拷貝數(shù)。
轉(zhuǎn)化體的篩選和穩(wěn)定化。將來自再生瓊脂平板的轉(zhuǎn)化體于37℃在牛奶瓊脂平板上生長過夜。根據(jù)暈環(huán)形成將產(chǎn)生角蛋白酶的新克隆接種到包含不同水平的新霉素(10-100μg/mL)作為選擇標(biāo)記的LB培養(yǎng)基中。于37℃在LB培養(yǎng)基中生長過夜后，將培養(yǎng)物在45℃培養(yǎng)4-6小時(shí)以處理游離的質(zhì)粒。隨后，通過將這些轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到非選擇性的1％大豆培養(yǎng)基并于37℃培養(yǎng)2天而進(jìn)行穩(wěn)定化處理。通過偶氮酪蛋白/偶氮角蛋白(azokeratin)測試分析培養(yǎng)物上清液的蛋白酶活性。將過表達(dá)角蛋白酶的候選菌株進(jìn)一步轉(zhuǎn)入新鮮的非選擇性培養(yǎng)基，至少培養(yǎng)7代以確證新菌株的穩(wěn)定性。
在包含各種水平新霉素(0至100μg/ml)的固體和液體培養(yǎng)基上篩選500個(gè)以上的陽性轉(zhuǎn)化子(根據(jù)牛奶瓊脂平板上的暈環(huán)形成)。超過10代后，根據(jù)角蛋白酶產(chǎn)率選擇出18個(gè)T399D轉(zhuǎn)化子(PJT1至PJT18，如下列表3所示)
表3過表達(dá)角蛋白酶的轉(zhuǎn)化子的篩選
1.所有的菌株于37℃生長在1％大豆培養(yǎng)基中。
2.通過偶氮酪蛋白分析來確定酶活性。
使用集落PCR鑒定這些轉(zhuǎn)化子中kerA基因的整合。所有的入選菌株均包含1.4kb的kerA基因，并且在細(xì)胞中沒有檢測到游離的質(zhì)粒。
與在相同生長條件下的野生型地衣芽孢桿菌PWD-1相比，由這些新轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蛋白酶活性增加高達(dá)2.7倍。通過Western印跡進(jìn)一步分析3個(gè)轉(zhuǎn)化子(PJT16、PJT3和PJT4)的角蛋白酶產(chǎn)率(數(shù)據(jù)未顯示)。
結(jié)果表明新克隆表達(dá)的蛋白酶可通過抗角蛋白酶的抗血清來特異地探測。通過測量凝膠條帶密度對酶表達(dá)定量后可知PJT16、PJT3和PJT4產(chǎn)生的角蛋白酶分別增加了1.6、2.9和2.1倍。
基因和蛋白質(zhì)分析。通過Southern雜交技術(shù)(Sambrook等，1989)分析轉(zhuǎn)化的DNA的整合基因拷貝數(shù)。分離總的游離染色體DNA并用限制性內(nèi)切酶消化。電泳后，將DNA轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Sigma)上。利用PCR DIG標(biāo)記混合物(Boehringer-Mannheim，曼海姆，德國)，通過PCR從pLB 29擴(kuò)增用于檢測kerA基因的地高辛標(biāo)記的探針。利用制造商推薦的雜交緩沖液，在雜交恒溫箱中于42℃進(jìn)行雜交。
收集轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基并分析蛋白水解和角蛋白水解活性(Lin等，1992)。經(jīng)5％TCA沉淀，通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE(Laemmli，1970)來分析濃縮的蛋白質(zhì)。改進(jìn)Western印跡如Towbin等人(1979)所描述。從SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，并且用抗角蛋白酶的兔抗血清探測。
利用ChemilmagerTM4400凝膠記錄系統(tǒng)和PhaEaseTM圖像分析軟件(Alpha Innotech Corp，CA)對來自Southern和Western印跡的DNA和蛋白質(zhì)濃縮物進(jìn)行定量。
通過先前所描述的(Lin等，1992)偶氮角蛋白水解來測量角蛋白酶活性。改進(jìn)偶氮酪蛋白的水解并用于確定總的蛋白酶活性(Sarath等，1989)。通過Bio-Rad微分析方法(Bradford，1976)確定蛋白質(zhì)濃度。
來自多重染色體整合的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過Southern印跡分析確證多基因染色體整合。選擇5個(gè)新菌株用于分析。結(jié)果表明通過將多基因拷貝整合到染色體中增加酶的生產(chǎn)，但是蛋白質(zhì)分泌與基因拷貝數(shù)不成線性比例的。具有大于6個(gè)整合拷貝的kerA基因的菌株顯示酶產(chǎn)率降低。在染色體中用于增加角蛋白酶表達(dá)的最佳數(shù)目是3-5個(gè)基因拷貝。
組成型啟動(dòng)子P43和培養(yǎng)基對角蛋白酶生產(chǎn)的影響。將組成型啟動(dòng)子P43克隆到kerA前面，導(dǎo)致T399D中角蛋白酶表達(dá)提高，如表4所示
表4通過P43啟動(dòng)子增加角蛋白酶產(chǎn)率
1所有的菌株于37℃生長在1％的大豆和1％FM的培養(yǎng)基中。
2通過偶氮角蛋白分析測量角蛋白酶活性。
當(dāng)從表達(dá)載體除去P43啟動(dòng)子，角蛋白酶表達(dá)水平降至低于PWD-1。沒有P43啟動(dòng)子的pNKER轉(zhuǎn)化的所有陽性克隆具有比PWD-1還低的角蛋白酶產(chǎn)率。最好的克隆PWN339只產(chǎn)生PWD-1的80％的酶活性，即使這個(gè)克隆包含多基因拷貝。這個(gè)結(jié)果表明P43啟動(dòng)子顯著改善枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中kerA的轉(zhuǎn)錄效率。
為了鑒定培養(yǎng)基對經(jīng)分離的整合體的角蛋白酶生產(chǎn)的影響，使用高濃度的底物。如圖2所示，當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中包含高濃度的大豆或羽毛粉時(shí)，總的蛋白酶活性增加。當(dāng)使用超過3％的蛋白質(zhì)底物時(shí)發(fā)現(xiàn)酶產(chǎn)率下降。最佳的培養(yǎng)基條件包含與1％羽毛粉混合的1％大豆，在這個(gè)培養(yǎng)基中與PWD-1相比，角蛋白酶活性增加大約4倍。
本發(fā)明中，構(gòu)建了在染色體中攜帶多重整合kerA的穩(wěn)定的地衣芽孢桿菌菌株以過量生產(chǎn)角蛋白酶。通過在選擇培養(yǎng)基中摻入某一水平的新霉素而成功分離了染色體中有1至8個(gè)范圍內(nèi)的不同基因拷貝數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。與枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，開發(fā)了生產(chǎn)更高酶活性的穩(wěn)定整合體。不同于枯草芽孢桿菌中包含質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)，地衣芽孢桿菌中kerA的染色體整合避免了為復(fù)制型質(zhì)粒所共有的分離和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性(Bron和Luxen，1985；Harington等，1988；Primroseand Ehrlich，1981)。
也證明染色體中超過某一拷貝數(shù)的多基因拷貝(數(shù)據(jù)未顯示)對于角蛋白酶的高產(chǎn)量是有害的。在染色體中具有大約16個(gè)基因拷貝的轉(zhuǎn)化子比較低拷貝數(shù)的菌株顯示更低的角蛋白酶活性。已證明了每個(gè)染色體具有3至5個(gè)拷貝數(shù)的菌株對于角蛋白酶生產(chǎn)是最佳的。
當(dāng)將P43啟動(dòng)子導(dǎo)入表達(dá)盒并整合到菌株T399D中時(shí)，與只有天然啟動(dòng)子的整合體相比，角蛋白酶產(chǎn)率顯著增加。這些結(jié)果表明這個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子對改善轉(zhuǎn)錄效率是有用的，并且對于從T399D表達(dá)角蛋白酶起重要作用。
新菌株可在包含高達(dá)3％的大豆或羽毛粉的培養(yǎng)基上生長，并且在該培養(yǎng)基中顯示加倍的酶活性(如圖2所示)。相比之下，當(dāng)PWD-1在高于2％的大豆或羽毛粉水平的相同培養(yǎng)基生長時(shí)，酶生產(chǎn)受到抑制(Wang and Shih，1999)。這個(gè)結(jié)果便于在培養(yǎng)基中利用高濃度的蛋白質(zhì)底物在大規(guī)模的發(fā)酵中改善角蛋白酶的生產(chǎn)。
總之，本發(fā)明開發(fā)出了在地衣芽孢桿菌T399D的染色體中整合了多拷貝的kerA的新菌株。分別通過Southern和Western印跡確定整合體中基因的拷貝的數(shù)目和表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)化菌株在1％大豆和1％羽毛粉(FM)的培養(yǎng)基條件下生長時(shí)，角蛋白酶活性增加了大約4-6倍(如圖2所示)。
利用重組地衣芽孢桿菌T399D菌株發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶粗酶。利用重組的地衣芽孢桿菌T399D菌株(在下文中為″地衣芽孢桿菌T1菌株″)，設(shè)計(jì)擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模的策略來用于生產(chǎn)角蛋白酶。
LB培養(yǎng)基中的搖瓶培養(yǎng)。在根據(jù)制造商提供的說明書制備的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含1.0L的蒸餾水、15g細(xì)菌用瓊脂、10gNaCl、10g細(xì)菌用胰化蛋白胨、和5.0g酵母提取物。將地衣芽孢桿菌菌株T1從甘油儲備物中劃線接種到LB平板上，并于37℃生長18小時(shí)。然后將地衣芽孢桿菌T1的單個(gè)集落從LB平板轉(zhuǎn)移到包含500ml LB培養(yǎng)基的燒瓶中，并且于37℃生長6小時(shí)，同時(shí)通過測量660nm處的吸光度來監(jiān)測細(xì)胞生長，(Beckman DU Series660 Spectrophotometer，F(xiàn)ullerton，CA)。生長6小時(shí)后，測量的0D660超過1.0。
種子培養(yǎng)物。將地衣芽孢桿菌T1菌株的種子培養(yǎng)物生長在培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含0.7g/L KH2PO4、1.4g/L K2HPO4、0.1g/LMgSO4·7H2O、10g/L脫脂的NUTRISOY大豆細(xì)粉(來自Archer DanielsMidland Co.，Decatur，IL)、和0.1g/L Antifoam 204或289(來自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。通過加入1M HCl或NaOH將初始種子培養(yǎng)物的pH調(diào)節(jié)至7.0。
將500ml的玻瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到包含種子培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的大約10L至20L的第一級種子發(fā)酵罐中，并且于37℃生長8小時(shí)至達(dá)到2.5％至5％的接種量。然后將第一級的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入100L、250L或800L的第二級種子發(fā)酵罐，并且于37℃生長8小時(shí)。
生產(chǎn)培養(yǎng)基。用于地衣芽孢桿菌T1菌株的生產(chǎn)培養(yǎng)基包含0.7g/LKH2PO4、1.4g/L K2HPO4、0.1g/L MgSO4·7H2O、13g/L脫脂的NUTRISOY大豆細(xì)粉(來自Archer Daniels Midland Co.，Decatur，IL，美國)、40g/L Lodex5(商品化為C*dry MD01960，來自Cerestar美國，Hammond，IN)、13g/L羽毛粉、和0.1g/L Antifoam 204或289(來自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO，美國)。通過加入1M HCl或NaOH將初始生產(chǎn)培養(yǎng)物的pH調(diào)節(jié)至7.0。
將第二級種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入包含生產(chǎn)培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐用于最后階段的培養(yǎng)。最后階段的培養(yǎng)在37℃進(jìn)行26小時(shí)，在收獲前總的培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48小時(shí)。
在上述培養(yǎng)步驟期間，將培養(yǎng)基的起始pH調(diào)節(jié)至7.0，但是不提供pH對照。對于地衣芽孢桿菌T1菌株，最佳的溶解氧水平是大約30％。接種量是大約2.5至5％，以及接種物壽命是大約12小時(shí)。
回收和下游加工過程。在收獲前檢驗(yàn)生產(chǎn)培養(yǎng)物中的酶活性。通過離心從細(xì)胞團(tuán)塊分離培養(yǎng)物上清液，然后通過超濾作用或蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。然后噴霧干燥濃縮的液體酶。
備選地，在從細(xì)胞團(tuán)塊分離后直接噴霧干燥培養(yǎng)物上清液而不進(jìn)行濃縮。
酶產(chǎn)率和酶活性。對于100L的生產(chǎn)培養(yǎng)物，在收獲前通過偶氮酪蛋白分析測量酶活性為30,000至35,000U/mL，以及細(xì)胞數(shù)目是6×109CFU/mL。100L生產(chǎn)培養(yǎng)物的總干重是40g/L，包括15g/L不溶物干重和25g/L溶解物干重。
來自直接干燥的培養(yǎng)物上清液的粗酶產(chǎn)率是20g/L，同時(shí)通過用10kDa分子量截點(diǎn)(molecular weight cut)的Pellicon過濾而獲得的來自培養(yǎng)物濃縮物的粗酶產(chǎn)率是16g/L。如偶氮酪蛋白分析所測量的，干燥粗酶的酶活性大于1,000,000U/g。
根據(jù)上文中描述的方法所生產(chǎn)的干燥角蛋白酶的粗酶提取物可被補(bǔ)充到家禽飼料中來作為飼料添加劑，從而改善這種飼料的可消化性和營養(yǎng)價(jià)值。
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盡管本發(fā)明已經(jīng)就各種例證性的實(shí)施方案、特性和方面進(jìn)行了描述，然而可以認(rèn)識到本發(fā)明的用途不只限于此，還可以延伸并包括各種其他改進(jìn)、變化和其他實(shí)施方案，根據(jù)在此所公開的內(nèi)容，這對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此本發(fā)明可視為是廣泛性地，其包括在隨后的權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的所有這些改進(jìn)、變化和其他實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種制備角蛋白酶的方法，包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組的芽胞桿菌，所述的重組芽胞桿菌的染色體中插入了至少一個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段，從而所述的重組芽胞桿菌比染色體中未插入所述的至少一個(gè)異源kerA編碼節(jié)段的相應(yīng)野生型芽胞桿菌產(chǎn)生更大量的角蛋白酶；然后(b)從所述的培養(yǎng)基收集所述的角蛋白酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)基包括不多于3％的蛋白質(zhì)底物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)基包括1％的大豆和1％的羽毛粉。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的芽胞桿菌選自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的芽胞桿菌是地衣芽孢桿菌。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述kerA編碼節(jié)段是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的kerA編碼節(jié)段。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的kerA編碼節(jié)段是地衣芽孢桿菌的kerA編碼節(jié)段。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的相應(yīng)野生型芽胞桿菌是地衣芽孢桿菌PWD-1。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的重組芽胞桿菌的染色體中插入了多個(gè)所述的異源kerA編碼節(jié)段。
10.權(quán)利要求1的方法，所述的重組芽胞桿菌的染色體中插入了3至5個(gè)所述的異源kerA編碼節(jié)段。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的重組芽胞桿菌是蛋白酶缺失的芽胞桿菌。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的kerA編碼節(jié)段可操作地與組成型啟動(dòng)子相連。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的kerA編碼節(jié)段可操作地與P43啟動(dòng)子相連。
14.一種在其染色體中插入了至少一個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段的重組芽胞桿菌，從而所述的重組芽胞桿菌比染色體中未插入所述的至少一個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段的相應(yīng)野生型芽胞桿菌產(chǎn)生更大量的角蛋白酶。
15.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的芽胞桿菌選自地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。
16.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的芽胞桿菌是地衣芽孢桿菌。
17.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的kerA編碼節(jié)段是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的kerA編碼節(jié)段。
18.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的kerA編碼節(jié)段是地衣芽孢桿菌的kerA編碼節(jié)段。
19.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的相應(yīng)的野生型芽胞桿菌是地衣芽孢桿菌PWD-1。
20.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中，所述芽胞桿菌的染色體中插入了多個(gè)所述的異源kerA編碼節(jié)段。
21.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述芽胞桿菌的染色體中插入了3至5個(gè)所述的異源kerA編碼節(jié)段。
22.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的重組芽胞桿菌是蛋白酶缺失的芽胞桿菌。
23.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的kerA編碼節(jié)段可操作地與組成型啟動(dòng)子相連。
24.權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌，其中所述的kerA編碼節(jié)段操作地與P43啟動(dòng)子相連。
25.一種細(xì)菌培養(yǎng)物，其包括在培養(yǎng)基中的權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌。
26.權(quán)利要求25的細(xì)菌培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)基包括不多于3％的蛋白質(zhì)底物。
27.權(quán)利要求25的細(xì)菌培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)基包括1％的大豆和1％的羽毛粉。
28.一種制備權(quán)利要求14的重組芽胞桿菌的方法，包括下列步驟(a)將kerA編碼節(jié)段插入整合型芽胞桿菌表達(dá)載體，所述的kerA可操作地與啟動(dòng)子相連，所述的啟動(dòng)子在芽胞桿菌細(xì)菌中起作用；然后(b)用所述的整合型芽胞桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化芽胞桿菌。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的整合型芽胞桿菌表達(dá)載體包括α-淀粉酶的5′-和3′-側(cè)翼的DNA節(jié)段，并且其中將所述的kerA編碼節(jié)段插入所述的α-淀粉酶的5′-和3′-側(cè)翼節(jié)段之間。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述的整合型芽胞桿菌表達(dá)載體是質(zhì)粒載體。
全文摘要
提供重組細(xì)菌和制備及利用該細(xì)菌的方法。該重組細(xì)菌是重組的芽胞桿菌，在其染色體中插入了至少一個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段，從而該重組的芽胞桿菌比未其染色體中插入至少一個(gè)異源的kerA編碼節(jié)段的相應(yīng)野生型芽胞桿菌產(chǎn)生更大量的角蛋白酶。該芽胞桿菌可以是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)或枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，并且該kerA編碼節(jié)段可以是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的kerA編碼節(jié)段。
文檔編號C12N15/57GK1694970SQ03825126
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者J·C·H·施 申請人:北卡羅萊納州立大學(xué)