專利名稱：非序列互補(bǔ)的抗病毒寡核苷酸的制作方法
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本發(fā)明涉及具有抗病毒活性的寡核苷酸和它們?cè)诓《靖腥尽┌Y和病原學(xué)是以病毒為基礎(chǔ)的其它疾病中作為治療劑的應(yīng)用，所述的病毒感染由人和動(dòng)物病毒造成，所述癌癥由癌基因病毒造成。
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人類患有的許多重要傳染病都是由病毒造成的。這些疾病包括狂犬病、天花、脊髓灰質(zhì)炎、肝炎、黃熱病、免疫缺陷和各種腦炎病，它們中的許多常常是致命的。其它的是突出的，因?yàn)樗鼈兪歉叨葌魅拘缘那耶a(chǎn)生急性不適，例如流感、麻疹、腮腺炎和水痘，以及呼吸道病或胃腸病。其它的例如風(fēng)疹和巨細(xì)胞病毒會(huì)造成先天畸形。最后，已知有些病毒是腫瘤病毒，它們會(huì)在人類和動(dòng)物中引起癌癥。
在病毒中，非常感興趣的是皰疹病毒科家族。皰疹病毒科是一類普遍存在的二十面體(icoshedral)、雙鏈DNA病毒。在皰疹病毒科(HHV)的超過100種表征的成員中，僅有8種能感染人類。其中最為熟知的是I型單純皰疹(HSV-1)、II型單純皰疹(HSV-2)、水痘帶狀皰疹(水痘或帶狀皰疹)、巨細(xì)胞病毒(CMV)和EB病毒(EBV)。皰疹病毒在人類中的發(fā)病率是較高的，影響世界人口的至少三分之一；在美國(guó)，70-80％的人口有某種類型的皰疹感染。盡管皰疹感染的病理學(xué)通常不是危險(xiǎn)的，如HSV-1通常僅僅造成嘴和面部周圍的短期病變，還已知這些病毒是許多更嚴(yán)重癥狀的起因，這些癥狀從生殖器潰瘍和障礙到能引起腦炎(15％死亡率)或彌散性傳染(40％死亡率)的胎兒感染。
皰疹病毒在性質(zhì)上是彌散，且對(duì)人是高度致病的。例如，已知EB病毒(EBV)會(huì)在童年晚期或青春期或青壯年時(shí)引起傳染性單核細(xì)胞增多癥。急性傳染性單核細(xì)胞增多癥的特點(diǎn)是喉嚨痛、發(fā)燒、頭痛、淋巴結(jié)病、扁桃腺肥大和在外周血液中的非典型的分散淋巴細(xì)胞。其它的表現(xiàn)經(jīng)常包括輕度肝炎、脾大和腦炎。EBV還與兩種形式的癌癥有關(guān)伯基特淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)。在近赤道的非洲的流行地，BL是最常見的兒童惡性腫瘤，占兒童癌癥的約80％。盡管適度地在北美高加索觀察到，NPC是在中國(guó)南部最常見的癌癥之一，發(fā)病年齡為25～55歲。與巨細(xì)胞病毒類似，EBV也與移植后的淋巴組織增生病有關(guān)，該病是實(shí)質(zhì)器官或骨髓移植后的慢性免疫抑制的潛在的致命并發(fā)癥。
其它疾病也與HSV有關(guān)，包括皮膚和眼睛感染，例如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎或角膜結(jié)膜炎。在美國(guó)，每年診斷出約300,000例HSV眼睛感染。
AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)由人免疫缺陷病毒(HIV)引起。通過殺死或破壞身體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，HIV逐漸地摧毀身體抗感染和某些癌癥的能力。目前，世界上約有4200萬人患有HIV/AIDS。在2002年，共有310萬人死于與HIV/AIDS有關(guān)的原因?？?HIV藥物療法的最終目標(biāo)是阻止病毒復(fù)制和破壞免疫系統(tǒng)。盡管在過去的15年中已經(jīng)在抗擊HIV的斗爭(zhēng)中取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)步，但醫(yī)學(xué)科學(xué)上仍然難以治愈。目前，醫(yī)生可以用3種不同藥物類型中的多余一打的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物來控制疾病。典型地，將兩種或三種類型的藥物以各種的組合開出處方，稱作HAART(高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療)。HAART療法典型地包括2種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物和第三種藥物，該第三種藥物是蛋白酶抑制劑或非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。臨床研究已經(jīng)證實(shí)，HAART是減少病毒負(fù)載和使抗藥性的可能最小化的最有效的方法。
盡管已經(jīng)證實(shí)HAART能減少體內(nèi)的HIV的量(通常稱作病毒負(fù)載)，千分之十的患者使用該療法會(huì)出現(xiàn)顯著的問題。一些副作用是嚴(yán)重的，包括異常的脂代謝、腎結(jié)石和心臟病。其它的副作用例如惡心、嘔吐和失眠不太嚴(yán)重，但是對(duì)于終生需要長(zhǎng)期藥物治療的HIV患者而言仍然是問題。
目前批準(zhǔn)的抗-HIV藥物通過進(jìn)入感染了HIV的CD4+T細(xì)胞并阻斷病毒酶(逆轉(zhuǎn)錄酶或蛋白酶)的作用來發(fā)揮作用。為了進(jìn)行復(fù)制，HIV需要這些酶。但是，HIV經(jīng)常發(fā)生突變并變成抗性的，使逆轉(zhuǎn)錄酶或蛋白酶抑制劑藥物無效。一旦產(chǎn)生抗性，病毒負(fù)載就會(huì)升高，并指示需要將無效的藥物換成另一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物。不幸的是，當(dāng)病毒變得對(duì)一類藥物中的一種有抗性時(shí)，該類中的其它藥物也可能變得不太有效。該現(xiàn)象稱作交叉抗藥性，其原因是許多抗-HIV的藥物以類似的方式發(fā)揮作用。藥物交叉抗性的發(fā)生是非常不希望有的，因?yàn)樗鼫p少了患者可獲得的治療選擇的數(shù)量。
因此，非常需要開發(fā)對(duì)HIV有效的其它抗病毒藥物，其通過其它的作用機(jī)理發(fā)揮作用，病毒尚未對(duì)其產(chǎn)生抗性。這正在變得特別重要，因?yàn)樽罱臄?shù)據(jù)表明，歐洲有十分之一的最近被確診的攜帶HIV的患者所感染的HIV株已經(jīng)對(duì)至少一種批準(zhǔn)的市售藥物產(chǎn)生了抗性。
呼吸道合胞病毒(RSV)會(huì)造成上和下呼吸道感染。它是一種負(fù)義的、包膜的RNA病毒，且是高傳染性的。它通常感染幼齡兒童，且通常是嬰兒下呼吸道疾病的最常見的原因。RSV感染通常伴有中度至嚴(yán)重感冒樣的癥狀。但是，嚴(yán)重的下呼吸道疾病會(huì)發(fā)生在任何年齡，特別是在老年的或免疫損害的患者中。重度感染的兒童可能需要氧治療，且在某些情況下需要機(jī)械通風(fēng)。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)，越來越多的兒童因?yàn)榧?xì)支氣管炎住院，該病通常由RSV感染造成。RSV感染還占骨髓移植中心中的患者的群體相關(guān)的呼吸道病毒感染的約三分之一。在年老的人群中，近來已經(jīng)認(rèn)為RSV感染的嚴(yán)重性與流感病毒感染非常相似。
流行性感冒(INF)也稱作流感，是由流感病毒造成的傳染性疾病。它攻擊人類的呼吸道(鼻、喉和肺)。在美國(guó)，平均每年有約36,000人死于流感，且每年有114,000人需要因流感而住院。
在所有的傳染病中，給定的療法的功效經(jīng)常取決于宿主的免疫反應(yīng)。對(duì)于皰疹病毒更是如此，因?yàn)檫@時(shí)所有皰疹病毒的造成潛伏感染的能力會(huì)在免疫損害的患者中造成非常高的再激活感染的發(fā)生率。在腎移植的受體中，40％～70％會(huì)再激活潛伏的HSV感染，80％～100％會(huì)再激活CMV感染。在AIDS患者中也已經(jīng)觀察到了這樣的病毒再激活。
乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒，它屬于嗜肝DNA病毒科病毒家族。HBV在人類中造成乙型肝炎。估計(jì)世界上有20億人已經(jīng)受到感染(3人中有1人)。約3.5億人是慢性感染的，估計(jì)每年有100萬人死于乙型肝炎及其并發(fā)癥。HBV會(huì)造成終生感染、肝硬化、肝癌、肝功能衰竭和死亡。該病毒通過血液和體液傳播。這可以通過直接的血液至血液接觸、無防護(hù)的性行為、使用未消毒的針頭的和在分娩過程中從感染的婦女向其嬰兒的傳播發(fā)生。大多數(shù)健康的受到感染的成年人(90％)能夠恢復(fù)，并產(chǎn)生對(duì)將來的乙肝病毒感染的保護(hù)性抗體。少數(shù)(5-10％)不能清除該病毒且會(huì)發(fā)展成慢性感染，當(dāng)感染了該病毒時(shí)，有90％的嬰兒和高達(dá)50％的幼齡兒童會(huì)發(fā)展成慢性感染。α-干擾素是最常見的采用的治療類型。該治療伴有顯著的副作用，包括流感樣癥狀、抑郁、皮疹、其它的反應(yīng)和異常的血細(xì)胞計(jì)數(shù)。其它的治療選擇包括3TC，其也有許多與其應(yīng)用有關(guān)的副作用。在過去的幾年中，已經(jīng)有越來越多的報(bào)道表明，用3TC治療的患者會(huì)產(chǎn)生HBV抗性株。對(duì)于同時(shí)感染了HBV和HIV的患者群體而言，這是特別成問題的。顯然，迫切需要開發(fā)能抗該病毒的新的抗病毒療法。
丙型肝炎病毒(HCV)感染是美國(guó)最常見的慢性的通過血液的感染，在美國(guó)受感染的患者數(shù)目有可能超過了400萬。在美國(guó)，該常見的病毒感染是肝硬化和肝癌的主要原因，現(xiàn)在也是肝移植的主要原因。感染后恢復(fù)是不常見的，約85％受感染的患者會(huì)變成該病毒的慢性攜帶者，且10～20％發(fā)展成肝硬化。估計(jì)目前世界上有1.7億人是慢性攜帶者。根據(jù)疾病控制和預(yù)防中心，僅僅在美國(guó)，慢性丙型肝炎每年造成8,000～10,000人死亡，并導(dǎo)致約1,000例肝移植。沒有可以用于丙型肝炎的疫苗。長(zhǎng)時(shí)間的干擾素α、或干擾素與利巴韋林組合治療僅僅在約40％患者中有效，且產(chǎn)生顯著的副作用。
現(xiàn)在，病毒感染的治療前景總體上并不樂觀。通常，病毒的治療具有普通功效，并伴有強(qiáng)烈的副作用，其阻止了有效劑量的施用或阻止了長(zhǎng)期治療。能說明這些問題的3種臨床情形是皰疹病毒科、HIV和RSV感染。
在皰疹病毒科的情況中，目前主要有5種治療被批準(zhǔn)用于臨床碘苷、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷、膦甲酸和更昔洛韋。盡管功效有限，這些治療還具有副作用。已經(jīng)報(bào)道35％的用碘苷治療的患者有過敏反應(yīng)，阿糖腺苷會(huì)在15％的患者中造成胃腸紊亂，核苷酸類似物無環(huán)鳥苷、膦甲酸和更昔洛韋會(huì)影響宿主細(xì)胞的DNA復(fù)制。在40％的用更昔洛韋治療的AIDS患者中，報(bào)道有中性白細(xì)胞減少癥和血小板減少癥。
盡管目前有許多不同的藥物可以用于治療HIV感染，但是它們都伴有相當(dāng)明顯的副作用，需要廣泛地補(bǔ)充藥物來給患者提供合理的生活質(zhì)量。HIV的抗藥性株的其它問題(該問題還會(huì)出現(xiàn)在皰疹病毒科感染中)通常需要周期性地改變雞尾酒治療，并在有些情況下使得感染非常難以治療。
治療幼齡嬰兒的RSV感染是迫切需要開發(fā)新藥物的另一個(gè)實(shí)例。在該情況中，通常的治療方法是使用隔離袋中的小顆粒氣霧劑通過吸入輸送利巴韋林。不但利巴韋林只是略微有效，而且它的應(yīng)用伴有顯著的副作用。另外，藥物的潛在釋放已經(jīng)引起了醫(yī)療人員的高度重視，因?yàn)橐阎睦晚f林的致畸性。
顯然，對(duì)于任何新出現(xiàn)的開發(fā)出的抗病毒藥物，非常理想的是具有下述3個(gè)特征1-提高的功效；2-降低的副作用風(fēng)險(xiǎn)，和3-病毒難以通過突變克服的作用機(jī)制。
已經(jīng)進(jìn)行了通過各種反義方法抑制具體病毒的許多嘗試。
Zamecnik等已經(jīng)使用了特異性地靶向逆轉(zhuǎn)錄酶引物位點(diǎn)和剪接供體/受體位點(diǎn)的ON(Zamecnik，等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-)(Goodchild和Zamecnik(1989)美國(guó)專利4,806,463)。
Crooke和Coworkers.(Crooke等(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36527-532)描述了一種抗HSV-1的反義。
Draper等(1993)(美國(guó)專利5,248,670)已經(jīng)報(bào)道了具有抗-HSV活性、含有Cat序列且能與HSV-1基因UL13、UL39和UL40雜交的反義寡核苷酸。
Kean等(Biochemistry(1995)3414617-14620)已經(jīng)測(cè)試了作為抗-HSV試劑的反義甲基膦酸酯寡聚物。
Peyman等(Biol Chem Hoppe Seyler(1995)Mar；376195-198)已經(jīng)報(bào)道了對(duì)指向IE110的特異性反義寡核苷酸的測(cè)試，和對(duì)HSV-1的UL30mRNA的抗病毒性質(zhì)的測(cè)試。
Anderson等(1997)(美國(guó)專利5,591,720)報(bào)道了指向編碼IE1、IE2或DNA聚合酶的CMV mRNA的寡核苷酸或寡核苷酸類似物。
Hanecak等(1999)(美國(guó)專利5,952,490)已經(jīng)記載了修飾的寡核苷酸，其具有保守的G四合體序列(G quartet sequence)和足夠數(shù)量的側(cè)翼核苷酸，以顯著抑制病毒如HSV-1的活性。
Jairath等(Antiviral Res.(1997)33201-213)已經(jīng)報(bào)道了抗RSV的反義寡核苷酸。
Torrence等(1999)(美國(guó)專利5,998,602)已經(jīng)報(bào)道了含有與RSV反基因組鏈(mRNA鏈)的單鏈部分互補(bǔ)的反義組分、連接物和核糖核酸酶L的寡核苷酸激活劑的化合物。
Qi等(Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi(2000)14253-256)已經(jīng)報(bào)道了對(duì)柯薩奇病毒B3中的反義PS-ODN的測(cè)試。
國(guó)際公開WO9203051(Roizman和Maxwell)記載了甲基膦酸酯反義寡聚物，其與HSV病毒基因組的關(guān)鍵區(qū)或其mRNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)，其表現(xiàn)出抗病毒活性。
已經(jīng)報(bào)道鳥嘌呤核苷/胸腺嘧啶核苷或富含鳥嘌呤核苷的硫代磷酸酯(phophorothioate)寡脫氧核苷酸(GT-PS-ODN)具有抗病毒活性。該文章講述，“26或27個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度的幾種不同的含有PS的GT-豐富的ODN(B106-140、I100-12和G106-57)在減少HIV-2效價(jià)方面與由36(B106-96，B106-97)或45個(gè)核苷酸組成的GT-豐富的ODN一樣有效(表4)”(Fennewald等，Antiviral Res.(1995)2637-54)。
在美國(guó)專利6,184,369中，記載了含有高百分比的鳥嘌呤核苷堿基的抗-HIV、抗-HSV和抗-CMV的寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該寡核苷酸具有三維結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)由鳥嘌呤核苷四合體穩(wěn)定化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該發(fā)明的寡核苷酸組合物含有2個(gè)或更多個(gè)(two or more runs)的2個(gè)相鄰的脫氧鳥苷。該專利要求保護(hù)G-豐富的ODN，其包括在至少2個(gè)位置的至少2個(gè)G殘基。
Cohen等(美國(guó)專利5,264,423和5,276,019)記載了對(duì)HIV復(fù)制的抑制，更具體地記載了PS-ODN類似物，其可以用于阻止外來核酸在正常肝細(xì)胞中的復(fù)制。Cohen等描述了對(duì)病毒序列特異性的反義PS-ODN的抗病毒活性。他們還描述了對(duì)14、18、21和28-mer的polyA、polyT和polyC的PS-ODN序列的測(cè)試，并證實(shí)了這些PS-ODN的抗病毒作用。
Matsukura等(Matsukura等(1987)Proc Natl Acad Sci USA 847706-7710)稍后公開了Cohen等在上面的美國(guó)專利中所述的結(jié)果。
Gao等(Gao等(1989)J Biol Chem 26411521-11526)描述了通過測(cè)試大小為7、15、21和28個(gè)核苷酸的PolyA、polyT和polyC PS-ODN序列，PS-ODN對(duì)HSV-2復(fù)制的抑制。
Archambault、Stein和Cohen(Archambault等(1994)Arch Virol 13997109)報(bào)道，28個(gè)核苷酸的PS-ODN polyC對(duì)HSV-1是無效的。
Stein等(Stein等(1989)AIDS Res Hum Retrovir 5639-646)公開了關(guān)于抗-HIV ODN的其它數(shù)據(jù)的結(jié)果，其通常是21-28個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
Marshal等(Marshal等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8962656269)描述了硫代磷酸酯和長(zhǎng)度為4-28個(gè)核苷酸的硫代磷酸酯poly-C寡聚物的抗-HIV-1作用。
Stein和Cheng(Stein等(1993)Science 2611004-1012)在一篇綜述中提到了28個(gè)核苷酸的非特異性的ODN的抗病毒活性，講述了“非序列特異性的作用顯著影響了PS寡聚物的抗-HIV性質(zhì)，也就是說，抑制作用獨(dú)立于堿基序列”。
在一篇綜述中，Lebedeva和Stein(Lebedeva等(2001)Annul RevPharmacol 41403-419)報(bào)道了多種PS-ODN的非特異性的蛋白結(jié)合活性，包括病毒蛋白。他們聲稱，“這些分子是高生物活性的，經(jīng)常相對(duì)容易地錯(cuò)將人工產(chǎn)物當(dāng)作反義”。
Rein等(美國(guó)專利6,316,190)報(bào)道了連接到融合配偶體且結(jié)合到HIV核殼的GT豐富的ON假目標(biāo)，其可以用作抗病毒的化合物。類似地，Campbell等(Campbell等(1999)J.Virol.732270-2279)報(bào)道了具有TGTGT基序的PO-ODN，該基序能特異性地結(jié)合到HIV的核殼，但是沒有抗病毒活性。
Feng等(Feng等(2002)J.Virol.7611757-11762)描述了結(jié)合到重組HIV的核殼的A(n)和TG(n)PO-ODN，但是沒有數(shù)據(jù)表明其有抗-HIV活性。
被開發(fā)作抗癌劑、抗病毒劑或者用于治療其它疾病的反義ODN典型地長(zhǎng)為約20個(gè)核苷酸。一篇綜述(Stein，CA，(2001)J.Clin Invest 108641-644)證實(shí)，“必須優(yōu)化反義寡核苷酸的長(zhǎng)度如果反義寡核苷酸太長(zhǎng)或太短，會(huì)缺失特異性元件。目前，反義寡核苷酸的最佳長(zhǎng)度好像是約16-20個(gè)核苷酸”。類似地，另一篇綜述(Crooke，ST(2000)Methods Enzymol3133-45)聲稱，“與RNA和RNA雙鏈體的形成相比，硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸具有Tm約-2.2°降低/單位。這意味著，為了體外有效，硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸必須典型地是17至20-mer的長(zhǎng)度……”。
Caruthers和同事(Marshall等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896265-6269)報(bào)道了12mer多胞嘧啶核苷-PS2-ODN和14mer PS2-ODN的二硫代磷酸酯ODN(PS2-ODN)的抗-HIV活性。沒有測(cè)試其它大小的抗-HIV活性。他們還報(bào)道了12、14、20和28mer多胞嘧啶核苷-PS2-ODN對(duì)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的抑制。后來，(Marshal等(1993)Science 2591564-1570)報(bào)道的結(jié)果證實(shí)了HIV RT的序列特異性的抑制。相同的組在幾個(gè)專利中公開了PS2-ODN的數(shù)據(jù)。在美國(guó)專利5218103和5684148中，記載了PS2-ODN的結(jié)構(gòu)和合成。在美國(guó)專利號(hào)5,452,496，5,278,302和5,695,979中，記載了不超過15個(gè)堿基的PS2-ODN對(duì)HIV RT的抑制。在美國(guó)專利號(hào)5,750,666和5,602,244中，記載了PS2-ODN的反義活性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，即寡核苷酸(ON)、例如寡脫氧核苷酸(ODN)可以具有廣泛應(yīng)用的非序列互補(bǔ)性的抗病毒活性。因而，該寡核苷酸無需與任何病毒序列互補(bǔ)或者具有特定的核苷酸分布，即可具有抗病毒活性。這樣的寡核苷酸甚至可以作為隨機(jī)物而制備，使得在制備時(shí)至多只有少數(shù)拷貝的任意特定序列，例如在15μmol的隨機(jī)物制備中，長(zhǎng)度為32個(gè)或更多的核苷酸。
另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不同長(zhǎng)度的寡核苷酸具有不同的抗病毒作用，還發(fā)現(xiàn)，能生成最大抗病毒作用的抗病毒寡核苷酸的長(zhǎng)度是在40-120個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)?？紤]到本發(fā)明的關(guān)于寡核苷酸的抗病毒性質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了寡核苷酸抗病毒劑，其可以具有抗多種不同病毒的活性，且甚至可以選作廣譜抗病毒劑?？紤]到目前可以獲得的有限的抗病毒治療選擇，這樣的抗病毒劑是特別有益的。
因此，本發(fā)明的ON(例如ODN)可以用于治療或預(yù)防病毒感染、或治療或預(yù)防病毒、例如腫瘤病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、乳頭瘤病毒和皰疹病毒)誘導(dǎo)的腫瘤或癌癥、和治療或預(yù)防其它病原學(xué)是基于病毒的疾病的療法。這種治療可以用于許多類型的患者，治療包括例如預(yù)防或治療免疫損害的人或動(dòng)物患者的病毒感染。
第一方面，本發(fā)明提供了抗病毒的寡核苷酸制劑，其包括至少一種適用作抗病毒劑的抗病毒寡核苷酸，例如至少6個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，其中寡核苷酸的抗病毒活性主要是通過非序列互補(bǔ)的作用方式來產(chǎn)生。該制劑可以包括不同寡核苷酸(例如至少2、3、5、10、50、100或更多)的混合物。
如這里關(guān)于寡核苷酸或其它物質(zhì)所使用的，術(shù)語“抗病毒的”是指寡核苷酸或其它物質(zhì)存在抑制病毒顆粒的生成的作用，即在否則會(huì)適合感染性病毒顆粒的形成的系統(tǒng)中減少形成的感染性病毒顆粒的數(shù)目。
術(shù)語“抗病毒的寡核苷酸制劑”是指包含至少一種適用作抗病毒劑的抗病毒寡核苷酸的制品。該制劑包括一種或多種寡核苷酸，且可以含有不會(huì)干擾作為抗病毒劑在體內(nèi)應(yīng)用的其它物質(zhì)。這樣的其它物質(zhì)可以包括但不限于稀釋劑、賦形劑、載體物質(zhì)和/或其它的抗病毒物質(zhì)。
如本文所使用的，術(shù)語“藥物組合物”是指抗病毒的寡核苷酸制劑，其包括生理上或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。該組合物還可以包括其它組分，其不會(huì)使該組合物不適于對(duì)需要的受試者(例如人)施用。
在本發(fā)明的上下文中，除非特別說明，術(shù)語“寡核苷酸(ON)”指寡脫氧核苷酸(ODN)或寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸。因而，“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其類似物的寡聚物或聚合物。該術(shù)語包括由天然存在的核堿基、糖和共價(jià)的核苷間(主鏈)鍵合組成的寡核苷酸、和具有功能類似的非天然存在的部分的寡核苷酸。這種修飾的或取代的寡核苷酸經(jīng)常優(yōu)于天然形式，因?yàn)槔硐氲男再|(zhì)，例如增強(qiáng)的細(xì)胞攝入、增強(qiáng)的向核酸靶位點(diǎn)的親和力、提高的在核酸酶存在下的穩(wěn)定性。本文描述了可以使用的修飾的實(shí)例。包括主鏈和/或其它修飾的寡核苷酸也可以稱作寡核苷。
如關(guān)于抗病毒制劑、藥物組合物或其它物質(zhì)所使用的，短語“適用作抗病毒劑”是指該物質(zhì)表現(xiàn)出抗病毒作用，且不包括會(huì)使其不適用于在體內(nèi)系統(tǒng)中抑制病毒復(fù)制(例如對(duì)受試者例如人受試者給藥)的任何組分或物質(zhì)。
如本文關(guān)于物質(zhì)的抗病毒作用所使用的，短語“非序列互補(bǔ)的作用方式”是指該物質(zhì)表現(xiàn)出抗病毒作用的機(jī)理不是由于互補(bǔ)的核酸序列的雜交，例如反義作用。相反地，“序列互補(bǔ)的作用方式”是指物質(zhì)的抗病毒作用涉及互補(bǔ)的核酸序列的雜交。因而，物質(zhì)的抗病毒活性“不是主要由于序列互補(bǔ)的作用方式”是指，寡核苷酸的活性滿足本文提供的4項(xiàng)試驗(yàn)(參見實(shí)施例10)中的至少一項(xiàng)，所述試驗(yàn)用于檢測(cè)該抗病毒活性是否“非主要由于序列互補(bǔ)的作用方式”。在具體的實(shí)施方案中，寡核苷酸滿足試驗(yàn)1、試驗(yàn)2、試驗(yàn)3或試驗(yàn)4；寡核苷酸滿足2項(xiàng)試驗(yàn)的組合，即試驗(yàn)1和2；試驗(yàn)1和3；試驗(yàn)1和4，試驗(yàn)2和3，試驗(yàn)2和4，或試驗(yàn)3和4；寡核苷酸滿足3項(xiàng)試驗(yàn)的組合，即試驗(yàn)1、2和3，試驗(yàn)1、2和4，試驗(yàn)1、3和4，或試驗(yàn)2、3和4；寡核苷酸滿足全部試驗(yàn)1、2、3和4。
如這里關(guān)于抗病毒物質(zhì)的施用所使用的，術(shù)語“受試者”是指活的高等生物，包括，例如，動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，例如人、非人的靈長(zhǎng)類、牛、豬、綿羊、馬、狗和貓；鳥類；和植物，例如果樹。
一個(gè)相關(guān)的方面涉及抗病毒的寡核苷酸隨機(jī)物制劑，其中該隨機(jī)物的抗病毒活性主要是通過非序列互補(bǔ)的作用方式產(chǎn)生。這種隨機(jī)物制劑可以例如包括不同長(zhǎng)度的隨機(jī)物的混合物，例如至少2、3、5、10或更多的不同長(zhǎng)度。
如這里關(guān)于寡核苷酸序列所使用的，術(shù)語“隨機(jī)”表征了不與病毒mRNA互補(bǔ)的序列或ON，其不會(huì)形成發(fā)夾且不具有包含于其中的回文序列。當(dāng)術(shù)語“隨機(jī)”用在指向具體病毒的寡核苷酸的抗病毒活性的上下文中時(shí)，是指缺少與該具體病毒的病毒mRNA的互補(bǔ)性?；パa(bǔ)性的缺少可以是廣義的，例如對(duì)于多種病毒、對(duì)于來自具體病毒家族的病毒或?qū)τ诟腥拘缘娜瞬《尽?br> 在本申請(qǐng)中，術(shù)語“隨機(jī)物”意指在每個(gè)位置都有擺動(dòng)(N)、例如NNNNNNNNNN的單鏈DNA。每個(gè)堿基都作為擺動(dòng)合成，所以該ON實(shí)際上是作為一群不同的隨機(jī)產(chǎn)生的相同大小的序列存在。
在另一方面，本發(fā)明提供了具有抗目標(biāo)病毒的抗病毒活性的寡核苷酸，其中該寡核苷酸是至少29個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度(或者在具體實(shí)施方案中，至少30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度)，且該寡核苷酸的序列不與目標(biāo)病毒的基因組序列的任何部分互補(bǔ)。
在另一方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸制劑，其包含至少一種具有抗目標(biāo)病毒的抗病毒活性的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少6個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度(在具體實(shí)施方案中，至少29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度)，且寡核苷酸的序列與目標(biāo)病毒的基因組核酸序列的任何部分的互補(bǔ)性低于70％，且基本上不是由polyA、polyC、polyG、polyT、G四合體或TG-豐富的序列組成。在具體實(shí)施方案中，該寡核苷酸與目標(biāo)病毒的基因組核酸序列的任何部分的互補(bǔ)性低于65％、60％、55％、50％、80％、90％、95％或100％。
如關(guān)于本發(fā)明的寡聚物所使用的，術(shù)語“TG-豐富的”是指抗病毒的寡核苷酸序列由至少70％的T和G核苷酸組成，或者如果特別說明，是至少80、90或95％的T和G，或者甚至100％組成。
相關(guān)方面涉及分離的、純化的或富集的如本文所述的抗病毒的寡核苷酸，例如對(duì)抗病毒的寡核苷酸制劑和其它寡核苷酸制品(例如適合體外使用的制品)所述的。
用于本發(fā)明的抗病毒的寡核苷酸可以是各種長(zhǎng)度，例如至少6、10、14、15、20、25、28、29、30、35、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110、120、140、160或更多個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。類似地，該寡核苷酸可以在一定的范圍內(nèi)，例如通過取任意2個(gè)前述值作為范圍的包含性端點(diǎn)所定義的范圍，例如10-20、20-40、30-50、40-60、40-80、60-120和80-120個(gè)核苷酸。在具體實(shí)施方案中，最小長(zhǎng)度或長(zhǎng)度范圍與本文為本發(fā)明的抗病毒的寡核苷酸所列出的任何其它寡核苷酸說明相組合。
抗病毒的核苷酸可以包括各種修飾，例如穩(wěn)定化修飾，因而可以包括磷酸二酯鍵中的和/或糖上的、和/或堿基上的至少一個(gè)修飾。例如，該寡核苷酸可以包括一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵和/或甲基膦酸酯鍵；在糖的2′-位置的修飾，例如2′-O-甲基修飾、2′-氨基修飾、2′-鹵代修飾例如2′-氟代；非環(huán)的核苷酸類似物，也可以包括至少一個(gè)磷酸二酯鍵。其它修飾也是本領(lǐng)域已知的，也可以使用。在含有2′-O-甲基修飾的寡聚物中，該寡聚物不應(yīng)當(dāng)具有遍布的2′-O-甲基修飾，因?yàn)槟壳暗慕Y(jié)果表明，該寡聚物不具有穩(wěn)定的活性。在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸具有遍布的修飾鍵，例如硫代磷酸酯；具有3′-和/或5′-帽；包括末端的3′-5′鍵；寡核苷酸是或包括由兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸序列通過連接物連接形成的多聯(lián)體。
在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸能結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)病毒蛋白上；寡核苷酸(或其一部分，例如至少1/2)的序列是源自病毒基因組；具有來自病毒基因組的序列的寡核苷酸的活性不優(yōu)于相同長(zhǎng)度的隨機(jī)物寡核苷酸或隨機(jī)寡核苷酸；寡核苷酸包括與病毒序列互補(bǔ)的的部分和不與病毒序列互補(bǔ)的部分；寡核苷酸序列是源自病毒包裝序列或參與相似(aptameric)相互作用的其它病毒序列；除非另有說明，寡核苷酸序列包括A(x)、C(x)、G(x)、T(x)、AC(x)、AG(x)、AT(x)、CG(x)、CT(x)或GT(x)，其中x是2、3、4、5、6，...60...120(在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸是至少29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，或者具體的重復(fù)序列的長(zhǎng)度是至少具體的長(zhǎng)度)；寡核苷酸是單鏈的(RNA或DNA)；寡核苷酸是雙鏈(RNA或DNA)；寡核苷酸包括至少一個(gè)G四合體或CpG部分；寡核苷酸包括與病毒mRNA互補(bǔ)的部分，且是至少29、37或38個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度(或者如上所述的其它長(zhǎng)度)；寡核苷酸包括至少一個(gè)非沃森-克里克寡核苷酸和/或至少一個(gè)參與非沃森-克里克與另一個(gè)核苷酸相結(jié)合的核苷酸；寡核苷酸是隨機(jī)寡核苷酸，寡核苷酸是隨機(jī)物或者包括隨機(jī)物部分，例如具有上面所述寡核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)度的隨機(jī)物部分；寡核苷酸在一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基處連接或結(jié)合到分子上，所述分子修飾寡核苷酸的特征，所述的修飾例如為了提供更高的穩(wěn)定性(例如在血清中的穩(wěn)定性或在特定溶液中的穩(wěn)定性)、更低的血清相互作用、更高的細(xì)胞攝入、更高的病毒蛋白相互作用、改善的輸送制劑的能力、可檢測(cè)出的信號(hào)、提高的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、特異性的組織分布和/或更低的毒性。
寡核苷酸還可以組合使用，例如作為混合物。這樣的組合或混合物可以包括例如至少2、4、10、100、1000、10000、100,000、1,00,000或更多個(gè)不同寡核苷酸。這樣的組合或混合物可以例如是不同的序列和/或不同的長(zhǎng)度和/或不同的修飾和/或不同的連接或結(jié)合的分子。在這種組合或混合物的具體實(shí)施方案中，許多寡核苷酸具有最小長(zhǎng)度，且在如上為寡核苷酸所述的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。在這種組合或混合物的具體實(shí)施方案中，至少一個(gè)、許多或每個(gè)寡核苷酸可以具有本文為各個(gè)抗病毒寡核苷酸所述的任何其它性質(zhì)(其也可以是任何一致的組合)。
短語“源自病毒基因組”是指特定序列具有的核苷酸堿基序列與病毒基因組核苷酸序列或其互補(bǔ)序列(例如與該病毒基因組序列相同或互補(bǔ))具有至少70％的同一性，或者是相應(yīng)的RNA序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，該術(shù)語表明，序列與特定病毒的病毒基因組序列(寡核苷酸指向它)或其互補(bǔ)序列具有至少70％的同一性。在具體實(shí)施方案中，同一性是至少80、90、95、98、99或100％。
本發(fā)明還提供了抗病毒的藥物組合物，其包括治療有效量的藥理學(xué)上可接受的抗病毒的寡核苷酸和藥用載體，所述寡核苷酸至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(或本文列出的其它長(zhǎng)度)，其中寡核苷酸的抗病毒活性主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式產(chǎn)生。在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸的組合或混合物如上面為各個(gè)寡核苷酸或寡核苷酸的組合或混合物所說明的。在具體實(shí)施方案中，藥物組合物被批準(zhǔn)施用給人或非人的動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類。
在具體實(shí)施方案中，藥物組合物是用于治療、控制或預(yù)防病毒病原學(xué)疾病；用于治療、控制或預(yù)防朊病毒疾??；是用于通過眼內(nèi)施用、經(jīng)口攝入、腸施用、吸入、經(jīng)皮的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鞘內(nèi)的、氣管內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射或局部施用來輸送。在具體實(shí)施方案中，該組合物包括輸送系統(tǒng)，例如靶向特定的細(xì)胞或組織；脂質(zhì)體制劑，另一種抗病毒藥物，例如非核苷酸抗病毒的聚合物、反義分子、siRNA或小分子藥物。
在具體實(shí)施方案中，抗病毒的寡核苷酸、寡核苷酸制品、寡核苷酸制劑、或抗病毒的藥物組合物對(duì)靶病毒(例如任何具體病毒或如本文所述的病毒組中的病毒)的IC50為0.50、0.20、0.10、0.09.0.08、0.07、0.75、0.06、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015或0.01μM或更少。
在制劑、藥物組合物和預(yù)防或治療方法的具體實(shí)施方案中，該組合物或制劑是用于治療、控制或預(yù)防病毒病原學(xué)疾??；用于治療、控制或預(yù)防朊病毒疾??；是用于通過選自下述的方式輸送眼內(nèi)的、經(jīng)口的攝入、腸的、吸入或經(jīng)皮的、皮下的、肌肉內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射輸送；還包括輸送系統(tǒng)，其可以包含能增強(qiáng)與特定細(xì)胞的親和力的分子或與其相關(guān)；還包含至少一種組合的其它抗病毒藥物；和/或還包含組合的抗病毒的聚合物。
如本文關(guān)于抗病毒的寡核苷酸和制劑等所使用的，當(dāng)提及具體病毒或病毒組時(shí)，術(shù)語“靶向的”是指寡核苷酸被選擇以抑制該病毒或病毒組。如關(guān)于具體組織或細(xì)胞類型所使用的，該術(shù)語表示選擇的寡核苷酸、制劑或輸送系統(tǒng)能使寡核苷酸在具體組織或細(xì)胞類型中或周圍優(yōu)選地存在和/或優(yōu)選地表現(xiàn)出抗病毒作用。
如本文所使用的，術(shù)語″輸送系統(tǒng)″是指一種或多種組分，當(dāng)與本文所述的寡核苷酸組合時(shí)，與沒有該輸送系統(tǒng)時(shí)的量和/或持續(xù)時(shí)間相比，其能增加接觸到體內(nèi)目標(biāo)位置的寡核苷酸的量、和/或延長(zhǎng)其在靶位存在時(shí)間，例如至少20、50或100％或更多，和/或預(yù)防或減少會(huì)造成副作用的相互作用。
如本文關(guān)于抗病毒劑和其它藥物或測(cè)試化合物所使用的，術(shù)語“小分子”是指該分子的分子量為1500道爾頓或更少。在有些情況下，分子量是1000、800、600、500或400道爾頓或更少。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含在帶標(biāo)簽的包裝中的至少一種抗病毒的寡核苷酸或寡核苷酸制劑，其中寡核苷酸的抗病毒活性主要通過非序列互補(bǔ)性的作用方式產(chǎn)生，且包裝上的標(biāo)簽說明了抗病毒的寡核苷酸可以用于抵抗至少一種病毒。
在具體實(shí)施方案中，試劑盒包含藥物組合物，其包含至少一種本文所述的抗病毒的寡核苷酸；該抗病毒的寡核苷酸適合體內(nèi)地用于動(dòng)物，和/或標(biāo)簽說明了該寡核苷酸或組合物是可接受的和/或被批準(zhǔn)用于動(dòng)物；動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，例如人或非人的哺乳動(dòng)物，例如牛、豬、反芻動(dòng)物、綿羊或馬；動(dòng)物是非人的動(dòng)物；試劑盒被管理機(jī)構(gòu)例如美國(guó)食品藥品管理局或等同機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于動(dòng)物，例如人。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其可以篩選用作抗病毒劑的抗病毒的寡核苷酸，例如非序列互補(bǔ)的抗病毒的寡核苷酸。該方法涉及合成許多不同的隨機(jī)寡核苷酸，測(cè)試寡核苷酸的抑制病毒產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力的活性，和選擇具有藥學(xué)上可接受水平的活性的寡核苷酸用作抗病毒劑。
在具體實(shí)施方案中，不同的隨機(jī)寡核苷酸包含不同長(zhǎng)度的隨機(jī)物；隨機(jī)寡核苷酸可以具有不同的序列或可以具有共同的序列，例如大多數(shù)最短寡聚物的序列；和/或不同的隨機(jī)寡核苷酸包含許多寡核苷酸，其包含至少5個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的隨機(jī)物片段，或者該不同的隨機(jī)寡核苷酸包括許多不同長(zhǎng)度的隨機(jī)物?？梢栽谔囟ㄏ到y(tǒng)中測(cè)試其它寡核苷酸，例如本文中為抗病毒的寡核苷酸所述的。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種在受試者中預(yù)防或治療病毒感染的方法，其通過給需要該治療的受試者施用治療有效量的至少一種藥理學(xué)上可接受的如本文所述的寡核苷酸，例如至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非序列互補(bǔ)性的寡核苷酸，或含有這種寡核苷酸的抗病毒的藥物組合物或制劑進(jìn)行。在具體實(shí)施方案中，該病毒可以是本文列出的適用于利用本發(fā)明抑制的那些中的任一種；感染與本文所述的與病毒感染有關(guān)的疾病或病癥有關(guān)；受試者是本文所述的受試者類型，例如人、非人的動(dòng)物、非人的哺乳動(dòng)物、植物等；治療是針對(duì)病毒病或病毒病原學(xué)的疾病，例如本文的背景技術(shù)中所述的疾病。
在具體實(shí)施方案中，施用了本文所述的抗病毒的寡核苷酸(或寡核苷酸制劑或藥物組合物)；施用是本文所述的方法；使用了本文所述的輸送系統(tǒng)或方法；病毒感染是DNA病毒或RNA病毒的感染；病毒是細(xì)小病毒科、乳頭多瘤空泡病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科或乳頭瘤病毒科；病毒是沙粒病毒科、布尼亞病毒科(bunyaviridae)、calciviridae、冠狀病毒科、線狀病毒科、黃病毒科(flaviridae)、正粘病毒科、副粘病毒科、微小RNA病毒科、呼腸孤病毒科、彈狀病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科或披膜病毒科；皰疹病毒科病毒是EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、HHV-6、HHV-7或HHV-8；病毒是HIV-1或HIV-2；病毒是RSV；病毒是流感病毒、例如流感A；病毒是HBV；病毒是天花病毒或牛痘病毒；病毒是冠狀病毒；病毒是SARS病毒；病毒是西尼羅病毒；病毒是漢坦病毒；病毒是副流感病毒；病毒是柯薩奇病毒；病毒是鼻病毒；病毒是黃熱病毒；病毒是登革病毒；病毒是丙型肝炎病毒；病毒是埃博拉病毒；病毒是馬爾堡病毒。
類似地，在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防性治療腫瘤病毒造成的人或動(dòng)物癌癥的方法，其通過給需要該治療的人或動(dòng)物施用藥理學(xué)上可接受的、治療有效量的至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(或本文所述的其它長(zhǎng)度)的至少一種隨機(jī)寡核苷酸或含有這種寡核苷酸的制劑或藥物組合物進(jìn)行。
在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸是如本文對(duì)本發(fā)明所述，例如具有本文所述的長(zhǎng)度；使用了如本文所述的施用方法；使用了如本文所述的輸送系統(tǒng)。
術(shù)語“治療有效量”是指當(dāng)施用給意欲類型的典型受試者時(shí)足以產(chǎn)生治療上或預(yù)防上顯著降低感染性病毒顆粒的生成的作用的量。在涉及給受試者施用抗病毒的寡核苷酸的方面，寡核苷酸、制劑或組合物應(yīng)當(dāng)?shù)湫偷匾灾委熡行Я渴┯谩?br> 在另一方面，發(fā)現(xiàn)了非序列互補(bǔ)的相互作用會(huì)產(chǎn)生有效的抗病毒活性，這提供了一種篩選方法來鑒別能改變寡核苷酸向病毒組分的結(jié)合的化合物，所述的病毒組分例如一種或多種病毒蛋白(例如從感染的宿主的病毒培養(yǎng)物提取的或純化的，或通過重組方法生產(chǎn)的)。例如，該方法可以涉及，檢測(cè)測(cè)試化合物是否能減少寡核苷酸向一種或多種病毒組分的結(jié)合。
如本文所使用的，術(shù)語“篩選”是指試驗(yàn)多種化合物來確定它們是否具有理想的性質(zhì)?；衔锏臄?shù)量可以是例如至少10、100、1000、10,000或更多的測(cè)試化合物。
在具體實(shí)施方案中，多種試驗(yàn)格式和檢測(cè)方法中的任何一種都可以用來鑒別結(jié)合中的這種變化，例如通過在有或沒有要篩選的化合物存在的情況下使寡核苷酸與病毒組分接觸(例如在分開的反應(yīng)中)，和確定在有化合物存在的情況與沒有該化合物存在的情況相比，寡聚物與病毒組分的結(jié)合是否產(chǎn)生差異。這種差異的存在表明，該化合物改變了隨機(jī)寡核苷酸向病毒組分的結(jié)合?；蛘撸梢允褂酶?jìng)爭(zhēng)性置換，使寡核苷酸結(jié)合到病毒組分上，并檢測(cè)通過加入測(cè)試化合物造成的置換，或者相反地，使測(cè)試化合物結(jié)合，并檢測(cè)通過加入寡核苷酸造成的置換。
在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸是如本文所述的抗病毒的寡核苷酸；寡核苷酸是至少6、8、10、15、20、25、29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110或120個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，或者至少本文為抗病毒的寡核苷酸所述的另一種長(zhǎng)度，或者是在通過取任意2個(gè)前述值作為范圍的包含性端點(diǎn)所定義的范圍內(nèi)；測(cè)試化合物是小分子；測(cè)試化合物的分子量低于400、500、600、800、1000、1500、2000、2500或3000道爾頓，或在通過取任意2個(gè)前述值作為范圍的包含性端點(diǎn)所定義的范圍內(nèi)；病毒提取物或組分是來自本文所列的病毒；篩選了至少100、1000、10,000、20,000、50,000或100,000化合物；寡核苷酸的IC50等于或低于0.500、0.200、0.100、0.075、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015或0.01μM。
如本文所使用的，術(shù)語″病毒組分″是指由病毒編碼的產(chǎn)物，或由病毒感染引起的由受感染的宿主細(xì)胞生成的產(chǎn)物。這樣的組分可以包括蛋白和其它的生物分子。這樣的病毒組分可以例如是得自病毒培養(yǎng)物、受感染的宿主生物，例如動(dòng)物和植物，或可以在重組系統(tǒng)中(原核生物和真核生物)從病毒序列生成，以及具有與病毒編碼的蛋白相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的合成蛋白。術(shù)語“病毒培養(yǎng)物提取物”是指來自感染了病毒的細(xì)胞的提取物，其包括病毒特異性的產(chǎn)物。類似地，“病毒蛋白”是指病毒特異性的蛋白，其通常由病毒編碼，但是還可以由至少部分地由病毒感染引起的宿主序列編碼。
在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了通過前述方法鑒別出的抗病毒的化合物，例如新的抗病毒的化合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種從寡核苷酸庫中純化出能結(jié)合至少一種病毒組分的寡核苷酸的方法，其通過使寡核苷酸庫接觸至少一種病毒組分(例如結(jié)合到固定相介質(zhì))、并收集結(jié)合到該病毒組分的寡核苷酸進(jìn)行。通常，收集涉及將寡核苷酸從病毒組分置換出來。該方法還可以涉及對(duì)收集的寡核苷酸(即結(jié)合到病毒蛋白的寡核苷酸)進(jìn)行測(cè)序和/或測(cè)試其抗病毒活性。
在具體實(shí)施方案中，通過任意的合適方法將庫中結(jié)合的寡核苷酸從固定相介質(zhì)中置換出來，例如使用離子置換，并收集置換出的寡核苷酸。典型地，關(guān)于各種置換方法，可以以逐漸嚴(yán)格的方式進(jìn)行置換(例如使用濃度逐漸升高的置換劑，例如鹽的濃度，產(chǎn)生階躍的或連續(xù)的梯度)，從而通常以升高的結(jié)合親和力的次序置換出寡核苷酸。在許多情況下，會(huì)進(jìn)行低嚴(yán)格性的洗滌以除去弱結(jié)合的寡核苷酸，并收集含有置換出的、更緊密結(jié)合的寡核苷酸的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分。在一些情況下，理想的是選擇含有結(jié)合非常緊密的寡核苷酸(例如從置換條件更嚴(yán)格的置換得到的級(jí)分中的寡核苷酸)的級(jí)分備用。
類似地，本發(fā)明提供了一種從寡核苷酸庫中富集結(jié)合至少一種病毒組分的寡核苷酸的方法，其通過使寡核苷酸庫接觸一種或多種病毒蛋白、并擴(kuò)增結(jié)合到該病毒蛋白的寡核苷酸，得到富集的寡核苷酸庫。接觸和擴(kuò)增可以進(jìn)行多個(gè)回合，例如至少1、2、3、4、5、10或更多次，使用來自前一回合的富集的寡核苷酸庫作為下一回合的寡核苷酸庫。該方法還可以包括在一個(gè)或多個(gè)接觸和擴(kuò)增回合后，對(duì)富集的寡核苷酸庫中的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序和測(cè)試其抗病毒活性。
該方法可以包括以多種技術(shù)中的任一種將寡核苷酸從病毒組分(例如結(jié)合到固相介質(zhì)上的病毒蛋白)中置換出來，例如上述的那些，例如使用置換劑。如上所述，可以有利地選擇結(jié)合緊密的寡核苷酸備用，例如用于進(jìn)一步的結(jié)合和擴(kuò)增回合。該方法還可以包括選擇一種或多種富集的寡核苷酸、例如高親和力的寡核苷酸備用。在具體實(shí)施方案中，該選擇可以包括消除具有與特定目標(biāo)病毒的宿主基因組序列(例如人)互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。這樣的消除可以包括對(duì)比寡核苷酸序列與來自序列數(shù)據(jù)庫中的特定宿主的序列，例如使用序列比對(duì)程序(例如BLAST搜索)，和消除那些具有與宿主序列相同的或在一定水平上相同的序列的寡核苷酸。還可以為了本發(fā)明的其它方面來消除這樣的宿主互補(bǔ)性的序列和/或選擇一種或多種不與宿主序列互補(bǔ)的寡核苷酸。
在前述的鑒別、純化或富集寡核苷酸的方法中，該寡核苷酸可以是本文所述的類型。上述方法可以有利地用于鑒別、純化或富集高親和力的寡核苷酸，例如從寡核苷酸隨機(jī)物制品中。
在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及抗病毒的寡核苷酸制品，其包含使用任一種前述的用于從初始寡核苷酸庫中鑒別、獲取或純化出抗病毒的寡核苷酸的方法鑒別出的一種或多種寡核苷酸，其中寡核苷酸制品中的寡核苷酸表現(xiàn)出的與一種或多種病毒蛋白的平均結(jié)合親和力比初始寡核苷酸庫中的寡核苷酸的平均結(jié)合親和力更高。
在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸的平均結(jié)合親和力高于初始寡核苷酸庫中的寡核苷酸的平均結(jié)合親和力的至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更高；該結(jié)合親和力的中間值高于初始寡聚物庫的結(jié)合親和力的中間值的至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，其中該中間值是指中間的數(shù)值。
在另一方面，本發(fā)明提供了抗病毒的聚合物的混合物，其包含至少一種抗病毒的寡核苷酸和至少一種非核苷酸的抗病毒的聚合物。在具體實(shí)施方案中，該寡核苷酸是本文所述的抗病毒的寡核苷酸，和/或該抗病毒的聚合物如本文所述或是本領(lǐng)域已知的或隨后鑒別出的。
在另一方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸隨機(jī)物，其中該隨機(jī)物是至少6個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在具體實(shí)施方案中，該隨機(jī)物具有上述的關(guān)于抗病毒的寡核苷酸的長(zhǎng)度；該隨機(jī)物包含至少一種硫代磷酸酯鍵，該隨機(jī)物包含至少一種二硫代磷酸酯鍵或如本文列出的其它修飾；該隨機(jī)物寡核苷酸包括至少一種非隨機(jī)物的片段(例如與選擇的病毒核酸序列互補(bǔ)的片段)，其可以具有上述的關(guān)于寡核苷酸的長(zhǎng)度；該隨機(jī)物是在制品或制品庫中，其含有至少5、10、15、20、50、100、200、500或700μmol、1、5、7、10、20、50、100、200、500或700mmol或1mol隨機(jī)物，或在通過取任意2個(gè)不同的前述值作為包含性端點(diǎn)所定義的范圍內(nèi)，或以一種上述的數(shù)值或數(shù)值范圍合成。
同樣地，本發(fā)明提供了一種制備抗病毒的隨機(jī)物的方法，其通過合成至少一種隨機(jī)物，例如如上所述的隨機(jī)物進(jìn)行。
如上所述，關(guān)于涉及病毒感染或病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)或靶向特定病毒的任何方面，在具體實(shí)施方案中，該病毒如上所述。
表述“人和動(dòng)物病毒”通常意在包括但不限于DNA和RNA病毒。DNA病毒包括例如細(xì)小病毒科、乳頭多瘤空泡病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科和乳頭狀瘤病毒科。RNA病毒包括例如沙粒病毒科、布尼亞病毒科、calciviridae、冠狀病毒科、線狀病毒科、黃病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、微小RNA病毒科、呼腸孤病毒科、彈狀病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科或披膜病毒科。
關(guān)于通過連接或結(jié)合其它分子或部分修飾寡核苷酸的特征，特征中的修飾是相對(duì)于不含有連接或結(jié)合的分子或部分的相同寡核苷酸來評(píng)價(jià)的。
從下面的詳細(xì)說明和權(quán)利要求書，其它實(shí)施方案將是明顯的。


圖1.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度的REP 1001(a)、REP 2001(b)或REP 3007(c)處理受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖2.PS-ODN大小和抗HSV-1的IC50之間的關(guān)系。將從圖1得到的IC50值相對(duì)于圖1中測(cè)試的每種PS-ODN的具體大小作圖。
圖3.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2001(a)、REP 2002(b)或REP 3003(c)、REP 2004(d)、REP 2005(e)、REP 2006(f)和無環(huán)鳥苷(g)處理受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖4.PS-ODN大小和抗HSV-1的IC50之間的關(guān)系。將從圖3得到的IC50值相對(duì)于圖3中測(cè)試的每種表現(xiàn)出抗-HSV-1活性的PS-ODN的具體大小作圖。表示的無環(huán)鳥苷的IC50用于臨床關(guān)聯(lián)參考。
圖5.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2003(a)、REP 2009(b)、REP 2010(c)、REP 2011(d)、REP2012(e)、REP 2004(f)、REP 2006(g)、REP 2007(h)和REP 2008(i)測(cè)試了廣范圍的PS-ODN隨機(jī)物大小。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖6.通過丙烯酰胺凝膠電泳分離的在圖5中測(cè)試的PS-ODN隨機(jī)物的UV顯影。
圖7.PS-ODN隨機(jī)物大小和抗HSV-1的IC50之間的關(guān)系。將從圖5得到的IC50值相對(duì)于圖5中測(cè)試的每種表現(xiàn)出抗-HSV-1活性的PS-ODN的具體大小作圖。
圖8.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2013(a)、REP 2014(b)、REP 2015(c)、REP 2016(d)、REP 2017(e)、REP 2018(f)、REP 2019(g)、REP 2020(h)和REP 2021(i)測(cè)試了未修飾的ODN、具有隨機(jī)序列的PS-ODN和指向HSV-1 IE110的起始密碼子的PS-ODN。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖9.通過丙烯酰胺凝膠電泳分離的在圖8中測(cè)試的PS-ODN隨機(jī)物的UV顯影。
圖10.PS-ODN隨機(jī)物、PS-ODN隨機(jī)序列、PS-ODN HSV-1 IE110序列和抗HSV-1的IC50之間的關(guān)系。將從圖8得到的IC50值相對(duì)于圖8中測(cè)試的每種表現(xiàn)出抗-HSV-1活性的PS-ODN的具體大小作圖。包括了來自圖5的其它IC50值，以進(jìn)行PS-ODN隨機(jī)物的對(duì)比。
圖11.使用HSV-1(毒株KOS)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度測(cè)試了在寡聚物的每一端的4個(gè)核糖上有2-O甲基修飾的PS-ODN(REP 2024，[a])；在寡聚物的每一端的4個(gè)酯鍵上有甲基膦酸酯修飾的ODN(REP 2026[b])；和長(zhǎng)度為20個(gè)堿基(REP2059[C])和30個(gè)堿基(REP2060[d])的RNA PS-ODN。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖12.使用HSV-2(毒株MS2)在人成纖維細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度的REP 1001(a)、REP 2001(b)或REP 3007(c)處理了受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖13.PS-ODN大小和抗HSV-2的IC50之間的關(guān)系。將從圖12得到的IC50值相對(duì)于圖12中測(cè)試的每種PS-ODN的具體大小作圖。
圖14.使用HSV-2(毒株MS2)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2001(a)、REP 2002(b)或REP 2003(c)、REP 2004(d)、REP 2005(e)、REP 2006(f)和無環(huán)鳥苷(g)處理了受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖15.PS-ODN大小和抗HSV-2的IC50之間的關(guān)系。將從圖14得到的IC50值相對(duì)于圖14中測(cè)試的每種表現(xiàn)出抗-HSV-2活性的PS-ODN的具體大小作圖。無環(huán)鳥苷的IC50用于臨床關(guān)聯(lián)參考。
圖16.使用CMV(毒株AD169)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2004(a)或REP 2006(b)處理了受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。PS-ODN大小和抗CMV的IC50之間的關(guān)系作圖如(c)所示。將來自圖(a)和(b)的IC50值相對(duì)于測(cè)試的每種PS-ODN的具體大小作圖。
圖17.使用CMV(毒株AD169)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行的噬斑減少試驗(yàn)。測(cè)試了3種臨床CMV治療丙氧鳥苷(Gancyclovir)(a)、膦甲酸(b)和西多福韋(c)。還用升高濃度的REP 2003(d)、REP 2004(e)、REP 2006(f)和REP2007(g)測(cè)試了廣范圍的PS-ODN隨機(jī)物大小。最后，測(cè)試了自己合成的(h)和商業(yè)購買的(i)的REP 2036(福米韋生)。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。
圖18.PS-ODN大小和抗CMV的IC50之間的關(guān)系。將從圖17得到的IC50值相對(duì)于圖17中測(cè)試的每種表現(xiàn)出抗-CMV活性的PS-ODN的具體大小作圖。
圖19.使用HIV-1(毒株NL4-3)在MT4細(xì)胞中進(jìn)行了CPE試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2004(a)或REP 2006(b)處理了受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。未受感染的MT4細(xì)胞的細(xì)胞毒性輪廓表示為REP 2004(c)和REP 2006(d)。
圖20.PS-ODN大小和抗HIV-1的IC50之間的關(guān)系。將從圖1得到的IC50值相對(duì)于圖1中測(cè)試的每種PS-ODN的具體大小作圖。
圖21.使用HIV-1(毒株NL4-3)在MT4細(xì)胞中進(jìn)行了CPE試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2004(a)或REP 2006(b)處理了受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。表示了REP 2004(c)和REP 2006(d)對(duì)未受感染的MT4細(xì)胞的細(xì)胞毒性圖譜。
圖21.使用重組野生型HIV-1 NL4-3(毒株CNDO)在293A細(xì)胞中進(jìn)行了復(fù)制試驗(yàn)。用升高濃度的氨普奈韋(a)、茚地那韋(b)、洛匹那韋(c)、沙奎那韋(d)、REP 2003(e)、REP 2004(f)、REP 2006(g)和REP 2007(h)處理了受感染的細(xì)胞。兩條曲線(黑線和虛線)代表了菌株CNDO的劑量反應(yīng)曲線。
圖22.(a)來自圖21的IC50值，和(b)PS-ODN大小和抗重組HIV-1的IC50之間的關(guān)系。將(a)的IC50值相對(duì)于圖21中測(cè)試的每種PS-ODN的具體大小作圖。
圖23.使用重組多藥抗性的HIV-1(毒株MDRC4)在293A細(xì)胞中進(jìn)行了復(fù)制試驗(yàn)。用升高濃度的氨普奈韋(a)、茚地那韋(b)、洛匹那韋(c)、沙奎那韋(d)、REP 2003(e)、REP 2004(f)、REP 2006(g)和REP 2007(h)處理了受感染的細(xì)胞。CNDO(野生型)的劑量反應(yīng)曲線表示為虛線，MDRC4(藥物抗性)的劑量反應(yīng)曲線表示為實(shí)線。
圖24.(a)來自圖21和23的IC50值，顯示了野生型(CNDO)和重組HIV-1菌株的藥物抗性(MDRC4)之間的IC50值倍數(shù)增加，和(b)在(a)中計(jì)算出的倍數(shù)增加圖。
圖25.使用RSV(毒株A2)在Hep2細(xì)胞中進(jìn)行了CPE試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2004(a)、REP 2006(b)、REP 2007(c)或利巴韋林(d)處理了受感染的細(xì)胞。從線性回歸計(jì)算出的IC50值記載在每幅圖中。表示了REP2004(e)、REP 2006(f)、REP 2007(g)或利巴韋林(h)對(duì)未受感染的Hep2細(xì)胞的細(xì)胞毒性圖譜。
圖26.PS-ODN大小和抗RSV的IC50之間的關(guān)系。將從圖25得到的IC50值相對(duì)于圖25中測(cè)試的每種表現(xiàn)出抗-RSV活性的PS-ODN的具體大小作圖。
圖27.使用柯薩奇病毒B2(毒株Ohio-1)在LLC-MK2細(xì)胞中進(jìn)行了CPE試驗(yàn)。用升高濃度的REP 2006(a)處理了受感染的細(xì)胞。REP 2006的細(xì)胞毒性圖譜如(b)所示。
圖28.A)FP相互作用試驗(yàn)，顯示了PS-ODN隨機(jī)物(REP 2003、2004、2006和2007)從FBS競(jìng)爭(zhēng)20個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物餌物的相互作用的能力。更大的隨機(jī)物能更有效地競(jìng)爭(zhēng)。B)和C)DOTAP和細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑對(duì)293 A細(xì)胞中的REP2006的血清保護(hù)和改善的輸送。D)和E)通過FP.檢測(cè)的DOTAP或細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑包封的REP 2006的血清保護(hù)。
圖29.通過熒光偏振檢測(cè)了結(jié)合到不同大小的餌物上的病毒裂解物。測(cè)試了REP 2032-FL、REP 2003-FL和REP 2004FL在來自HSV-1(a)、HIV-1(b)或RSV(c)的裂解物中的裂解物結(jié)合。
圖30.通過熒光偏振檢測(cè)了PS-ODN隨機(jī)物對(duì)病毒裂解物的親和力。使用REP 2004-FL作為餌物，用升高濃度的REP 2003、REP 2004、REP 2006或REP 2007挑戰(zhàn)了與HSV-1裂解物(a)、HIV-1裂解物(b)或RSV裂解物(c)的復(fù)合物形成。
圖31.REP 2004-FL可以結(jié)合到HIV-1 p24gag和HIV-1 gp41。通過熒光偏振測(cè)試了REP 2004-FL與升高量的這兩種純蛋白相互作用的能力。
圖32.餌物大小對(duì)p24和gp41結(jié)合的影響。通過熒光偏振測(cè)試了增加大小的餌物結(jié)合p24gag和gp41的能力。
圖33.通過熒光偏振測(cè)試了雙鏈PS-ODN結(jié)合病毒裂解物的能力。還制備了單鏈的(ss)或雙鏈(ds)的硫代磷酸酯REP 2017(熒光標(biāo)記的)及其非硫代化的類似物(2017U)。測(cè)試了這些餌物與HSV-1和HIV-1病毒裂解物的結(jié)合。
圖34.通過在存在250nM REP 2004-FL的情況下培養(yǎng)293A細(xì)胞4小時(shí)，檢測(cè)了熒光標(biāo)記的PS-ODN向細(xì)胞中的輸送。培養(yǎng)后，裂解細(xì)胞，通過熒光測(cè)定法檢測(cè)了裂解后從細(xì)胞中釋放出的相對(duì)的熒光。
圖35.通過熒光偏振檢測(cè)了不同序列組成的20-mer PS-ODN結(jié)合病毒裂解物的能力。在存在1ug HSV-1(a)、HIV-1(b)或RSV(c)裂解物的情況下，孵育3′帶有FITC標(biāo)記的PS-ODN。這些PS-ODN的結(jié)合圖譜在所有3種病毒裂解物中相似(見圖35)。
圖36.通過檢測(cè)這些上清液在原初細(xì)胞中誘導(dǎo)的CPE，間接檢測(cè)了來自牛痘感染的VERO細(xì)胞的感染上清液中的病毒負(fù)載。在10uM測(cè)試了REP 2004、2006和2007，在50uM測(cè)試了西多福韋。
圖37.(A)使用HSV-1(菌株KOS)在VERO細(xì)胞中進(jìn)行噬斑減少試驗(yàn)產(chǎn)生的IC50值。用升高濃度的REP 2006(N40)、REP 2028(G40)、REP2029(A40)、REP 2030(T40)和REP 2031(C40)處理了受感染的細(xì)胞，以產(chǎn)生IC50值。(B)HSV-1 PRA產(chǎn)生了如下的IC50值N40(REP 2006)、AC20(REP 2055)、TC20(REP 2056)或AG20(REP 2057)。
選擇的縮寫ON寡核苷酸ODN寡脫氧核苷酸PS硫代磷酸酯PRA噬斑減少試驗(yàn)PFU噬斑形成單位INF A流感A病毒
HIV人免疫缺陷病毒(如果沒有說明，包括HIV-1和HIV2)HSV單純皰疹病毒(如果沒有說明，包括HSV-2和HSV-3)RSV呼吸道合胞病毒COX柯薩奇病毒DHBV鴨乙型肝炎病毒優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明涉及通過非序列互補(bǔ)的機(jī)理發(fā)揮作用的抗病毒的寡核苷酸的鑒別和應(yīng)用，還包括下述發(fā)現(xiàn)，對(duì)于許多病毒而言，越大的寡核苷酸的抗病毒活性越強(qiáng)，長(zhǎng)度為40或更多個(gè)核苷酸的寡核苷酸典型地是最佳的。
如在
背景技術(shù)：
中所述，已經(jīng)測(cè)試了許多反義寡核苷酸(ON)的抗病毒活性。但是，這樣的反義ON是序列特異性的，典型地是約16-20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
如通過實(shí)施例1和2的結(jié)果所證實(shí)的，隨機(jī)PS-ODN的抗病毒作用不是序列特異性的?？紤]到在那些試驗(yàn)中使用的PS-ODN的體積和濃度，理論上幾乎不可能的是，在混合物中有超過1拷貝的特定隨機(jī)序列。這意味著，這些PS-ODN隨機(jī)物沒有反義作用。在后一個(gè)實(shí)施例中，如果抗病毒作用是由PS-ODN的序列特異性造成的，那么這樣的作用因而只能是由一個(gè)分子造成的，該結(jié)果似乎是不可能的。例如，對(duì)于40個(gè)堿基長(zhǎng)度的ON隨機(jī)物，該群體中的任何特定序列在理論上僅能代表1/440或8.27×10-25的總級(jí)分。已知1mol＝6.022×1023個(gè)分子，并且事實(shí)上我們的最大合成目前是在15μmol的規(guī)模完成的，不會(huì)存在全部可能的序列，另外，每個(gè)序列最可能是僅僅作為一個(gè)拷貝存在。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)還可以使用序列特異性的ON，但是利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的非序列互補(bǔ)的活性。因此，本發(fā)明不限于非序列互補(bǔ)的ON，但是放棄在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開的關(guān)于序列特異性的反義ON用于治療病毒感染的內(nèi)容。
關(guān)于可應(yīng)用的病毒(包括，例如，本文已經(jīng)公開了其數(shù)據(jù)的那些)，隨著隨機(jī)物大小的增加，其抗病毒效力也增加。應(yīng)當(dāng)指出，由于目前基于亞磷酰胺的DNA合成的限制，更大的PS-ODN(例如80-和120-mer)具有顯著的比需要的尺寸更小的片段的污染。在更大的寡聚物(80和120個(gè)堿基對(duì))上觀察到更弱的作用(以每個(gè)堿基為基礎(chǔ))，這反映了全長(zhǎng)隨機(jī)物在這些群體中的更低濃度，還反映了向細(xì)胞中降低的攝入。如果合成或純化了合理純度(75％全長(zhǎng))的更大隨機(jī)物(＞40個(gè)堿基)、和/或如果通過輸送系統(tǒng)促進(jìn)了這些ODN中的任一種的細(xì)胞攝入，可以實(shí)現(xiàn)抗病毒活性的大的多的提高。
在本發(fā)明中，隨機(jī)物(或其它寡核苷酸)可以通過幾種機(jī)制阻斷病毒的復(fù)制，包括但不限于下列1.阻止病毒粒子的吸附或受體相互作用，從而阻止感染；2.參與病毒裝配或病毒基因組向衣殼中的包裝(與病毒DNA或RNA的包裝相競(jìng)爭(zhēng))，產(chǎn)生缺陷型病毒粒子；3.中斷和/或阻止包裝過程中的衣殼形成、或衣殼蛋白與其它結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用，導(dǎo)致抑制病毒的釋放或釋放出缺陷型病毒粒子；4.結(jié)合到關(guān)鍵病毒組分，并阻止或降低它們的活性；5.結(jié)合到病毒增殖所需要的關(guān)鍵宿主組分。
不限于能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的病毒抑制的機(jī)制，如上所述，有幾種可能的機(jī)制可以解釋和/或預(yù)測(cè)ON對(duì)病毒復(fù)制的抑制性質(zhì)。其中的第一種是，ON的總體相似的(aptameric)作用使得它們結(jié)合到細(xì)胞表面蛋白或病毒蛋白上，阻止病毒的吸附和融合。發(fā)生作用的大小閾值可以由相互作用所需要的某些累積電荷的結(jié)果。
第二種可能的機(jī)制是，ON可以通過阻止病毒的包裝和/或裝配在細(xì)胞中起作用。超過一定大小閾值的ON會(huì)競(jìng)爭(zhēng)或干擾正常的衣殼/核酸相互作用，阻止新病毒內(nèi)的功能性病毒基因組的包裝?；蛘?，ON可以阻止正常衣殼的形成，這會(huì)阻止正常的病毒的芽殖、改變病毒的穩(wěn)定性或阻止依賴于內(nèi)在化的合適的病毒粒子分解。
盡管作用機(jī)制還不完全清楚，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與臨床相關(guān)的無環(huán)鳥苷、丙氧鳥苷、利巴韋林和蛋白酶抑制劑相比，本發(fā)明的ON表現(xiàn)出了更強(qiáng)的病毒抑制功效。根據(jù)本發(fā)明的ON因此可以用于治療或預(yù)防病毒感染。治療的病毒感染可以是由人、動(dòng)物和植物病毒造成的那些。
廣譜抗病毒活性根據(jù)上面討論的結(jié)論和本文所述的數(shù)據(jù)，隨機(jī)ON和ON隨機(jī)物似乎可以對(duì)病毒具有廣譜抗病毒活性，其中病毒基因組的裝配和/或包裝和/或包殼是復(fù)制所需要的步驟。因此，為了檢驗(yàn)該假設(shè)，選擇了幾種不同大小的PS-ODN隨機(jī)物，以測(cè)試各種病毒感染的細(xì)胞模式。在本文的實(shí)施例中描述了許多這樣的試驗(yàn)，包括用CMV、HIV-1、RSV、柯薩奇病毒B2、DHBV、漢坦病毒、副流感病毒和牛痘病毒進(jìn)行的試驗(yàn)，以及在實(shí)施例1和2中所述的HSV-1和HSV-2試驗(yàn)。盡管有些測(cè)試的寡核苷酸表現(xiàn)出了高活性水平，寡聚物輸送系統(tǒng)(例如DOTAP、脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)或寡轉(zhuǎn)染胺(oligofectamine))會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的功效，特別是用較大的(≥40個(gè)堿基)隨機(jī)物。
廣譜抗病毒活性的結(jié)論不同病毒的功效研究表明，隨機(jī)ON和隨機(jī)物對(duì)多種不同病毒表現(xiàn)出了抑制性質(zhì)。而且，這些研究支持了下述結(jié)論更大隨機(jī)物比更小的隨機(jī)物表現(xiàn)出更強(qiáng)的病毒抑制功效。這證實(shí)了隨機(jī)ON或ON隨機(jī)物活性在所有包殼病毒中的依賴于共同大小和/或電荷的機(jī)制。
HSV和CMV都是皰疹病毒科家族的雙鏈DNA病毒，HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA病毒，RSV是副粘病毒科的RNA病毒。基于ON隨機(jī)物可以不限于上述的列出的機(jī)制、在多種不同病毒中產(chǎn)生抑制病毒的功能的事實(shí)，下述的機(jī)制是合理的A)ON/ON隨機(jī)物通過相似的作用抑制病毒感染，防止病毒與質(zhì)膜融合；和/或B)ON/ON隨機(jī)物阻止或參與病毒粒子的裝配或衣殼中的病毒DNA的包裝，產(chǎn)生缺陷型病毒粒子；和/或C)ON/ON隨機(jī)物干擾病毒的裝配和/或包裝和/或基因表達(dá)所需的宿主蛋白或組分。
抗病毒活性的要求由于隨機(jī)化的DNA序列似乎足以抑制病毒，令人感興趣的是要研究在沒有硫代磷酸酯修飾的情況下是否能維持抗病毒活性、和是否能通過選擇在病毒基因組中發(fā)現(xiàn)的隨機(jī)序列或特定序列來提高功效。
因此，研究了DNA和RNA修飾對(duì)隨機(jī)物的抗病毒功效的作用。由于隨機(jī)物通過非序列互補(bǔ)的機(jī)制發(fā)揮作用，這些實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試核酸構(gòu)象和電荷分布的輕微變化對(duì)抗病毒功效的影響。
為了測(cè)試具有不同核苷酸/核苷修飾的ODN是否能抑制HSV-1，在HSV-1 PRA中測(cè)試了REP 2024、2026、2059和2060，如實(shí)施例所述。REP2024(該P(yáng)S-ODN在ODN兩端的4個(gè)堿基上的核糖上有2-O-甲基修飾)、REP 2026(該P(yáng)O-ODN在ODN兩端的4個(gè)堿基之間的鍵上有甲基膦酸酯修飾)、REP 2059(長(zhǎng)為20個(gè)堿基的RNA PS-ODN隨機(jī)物)和REP 2060(長(zhǎng)為30個(gè)堿基的RNA PS-ODN隨機(jī)物)表現(xiàn)出了抗-HSV-1活性(見圖11)。
在后一實(shí)施例中，如果抗病毒作用僅僅是由DNA硫代磷酸酯主鏈組成的ON造成的，那么這樣的作用只能是由一個(gè)分子造成的。但是其它的主鏈和修飾產(chǎn)生了陽性的抗病毒活性。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)還可以使用不同的化學(xué)ON。ON的修飾(例如但不限于硫代磷酸酯修飾)似乎有利于抗病毒活性。這很可能是由于需要的ON電荷和/或DNA在介質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定的需要，它還可能是由于PS-ODN的手性。
化合物REP 2026表現(xiàn)出抗病毒活性，盡管其中心部分包含未修飾的PO-核苷酸和4個(gè)在兩端的甲基膦酸酯鍵以防止降解。這表明，PO-ODN可以用作不會(huì)被降解的抗病毒藥。該保護(hù)可以通過修飾末端的核苷酸和/或通過使用下述的合適輸送系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。
通常，使用的DNA的序列組成對(duì)總體功效具有較小的作用，無論是隨機(jī)物、隨機(jī)序列還是特異性的HSV-1序列。但是，在中間長(zhǎng)度，HSV-1序列的有效性幾乎是隨機(jī)序列的3倍(見圖10)。該數(shù)據(jù)表明，盡管特異性的HSV序列存在特異性的反義功能性，這里所述的非反義機(jī)制(非序列互補(bǔ)的機(jī)制)可以代表該活性的主要部分。實(shí)際上，當(dāng)ON增長(zhǎng)至40個(gè)堿基時(shí)，基本上所有的抗病毒活性都是由于非反義作用。
隨機(jī)物的更低毒性使用ON隨機(jī)物的一個(gè)目的是降低毒性。已知不同的序列會(huì)在動(dòng)物中引起不同的反應(yīng)，例如總體毒性、與血清蛋白的相互作用和與免疫系統(tǒng)的相互作用(Monteith等(1998)Toxicol Sci 46365-375)。ON的混合物因而可以降低毒性作用，因?yàn)槿魏翁囟ㄐ蛄械乃蕉紩?huì)非常低，所以沒有顯著的相互作用，由于序列或核苷酸組成是可能的。
藥物組合物本發(fā)明的ON可以是用于治療(或預(yù)防)病毒病的治療性組合物或制劑的形式，其可以被管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人或非人的動(dòng)物，和/或針對(duì)特定的病毒或病毒組。當(dāng)與生理學(xué)上和/或藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合時(shí)，這些ON可以用作藥物組合物的一部分。載體的特征可以取決于給藥途徑。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有其它的活性因子和/或能增強(qiáng)活性的試劑。
在藥物組合物或制劑中使用的本發(fā)明的ON的施用、或治療動(dòng)物的方法的實(shí)施可以通過多種常規(guī)途徑實(shí)現(xiàn)，例如眼內(nèi)的、經(jīng)口的攝入、腸內(nèi)的、吸入、或經(jīng)皮的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鞘內(nèi)的、氣管內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射。
本發(fā)明的藥物組合物或寡核苷酸制劑還可以含有用于治療病毒病的其它的化療藥物，例如但不限于利福平、利巴韋林、普來可那立(Pleconary)、西多福韋、無環(huán)鳥苷、噴昔洛韋(pencyclovir)、丙氧鳥苷、伐西洛韋(Valacyclovir)、泛昔洛韋、膦甲酸、阿糖腺苷、金剛烷胺、扎那米韋、奧塞米韋、Resquimod、抗蛋白酶、HIV融合抑制劑、核苷酸HIVRT抑制劑(例如AZT、拉米夫定、阿巴卡韋)、非核苷酸HIV RT抑制劑、Doconosol、干擾素、丁基化的羥基甲苯(BHT)和金絲桃素。這樣的其它因子和/或試劑可以包括在藥物組合物中，例如與本發(fā)明的ON產(chǎn)生協(xié)同作用。
本發(fā)明的藥物組合物或寡核苷酸制劑還可以含有聚合物，例如但不限于聚陰離子試劑、硫酸化多糖、肝素、葡聚糖硫酸酯、多硫酸酯戊聚糖、聚乙烯醇硫酸酯、乙?；事毒厶?acemannan)、多羥基羧酸酯、硫酸纖維素、含有磺化苯或萘環(huán)的聚合物和萘磺酸酯聚合物(naphthalenesulfonate polymer)、乙酰基鄰苯二甲酰纖維素、聚-L-賴氨酸、癸酸鈉、陽離子兩親物、膽酸。已知聚合物會(huì)影響病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞，在有些情況下是通過結(jié)合或吸附到病毒粒子本身?？共《揪酆衔锏脑撎卣骺梢杂糜谂cON競(jìng)爭(zhēng)向病毒粒子的結(jié)合或吸附，結(jié)果與其胞外活性相比提高了ON的胞內(nèi)活性。
示例性的輸送系統(tǒng)我們通過將培養(yǎng)的細(xì)胞暴露于熒光標(biāo)記的隨機(jī)物，檢測(cè)了PS-ODN隨機(jī)物的攝入，然后在洗滌2次后測(cè)定了裂解的細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。在沒有輸送且包封在一種下述的基于脂質(zhì)的輸送系統(tǒng)后脂轉(zhuǎn)染胺TM(Invitrogen)、polyfectTM(Qiagen)和寡轉(zhuǎn)染胺TM(Invitrogen)，檢測(cè)了暴露于250nM REP 2004-FL的細(xì)胞的細(xì)胞攝入。4小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，并用MPER裂解試劑(PROMEGA)裂解。圖34顯示了從等量的有和沒有輸送的暴露細(xì)胞得到的相對(duì)熒光產(chǎn)量。我們發(fā)現(xiàn)，在存在所有3種測(cè)試的輸送試劑的情況下，胞內(nèi)PS-ODN的濃度比沒有輸送時(shí)有顯著增加。
于該試驗(yàn)結(jié)果相一致，輸送系統(tǒng)的應(yīng)用可以顯著地增加ON隨機(jī)物的抗病毒效力。另外，它們可以用于保護(hù)這些化合物不受血清相互作用、減少副作用并使組織和細(xì)胞分布最大化。
雖然PS-ODN對(duì)內(nèi)源核酸酶的抗性比天然磷酸二酯更大，但是它們不是完全穩(wěn)定的，在血液和組織中會(huì)被緩慢地降解。PS寡核苷酸藥物在臨床應(yīng)用中的一個(gè)限制是，它們?cè)陟o脈內(nèi)施用后傾向于激活補(bǔ)體。通常，脂質(zhì)體和其它輸送系統(tǒng)能通過降低藥物毒性、增加在血漿中的停留時(shí)間和向疾病組織輸送(通過透過超滲透的脈管系統(tǒng)的載體外滲)更多的活性藥物來增強(qiáng)藥物(包括ON)的治療指數(shù)。而且，在PS-ODN的情況下，脂質(zhì)包封預(yù)防在循環(huán)時(shí)與潛在的蛋白結(jié)合位點(diǎn)的相互作用(KLIMUK等(2000)J Pharmacol Exp Ther 292480-488)。
根據(jù)我們的本文所述的結(jié)果，一種方法是使用能輸送本文所述的ON的輸送系統(tǒng)，例如但不限于親脂性的分子、極性脂質(zhì)、脂質(zhì)體、單分子層、雙分子層、泡囊、可設(shè)計(jì)的融合泡囊(fusogenic vesicles)、膠束、環(huán)糊精、PEG、離子電滲、粉末注射和納米微粒(例如PIBCA、PIHCA、PHCA、明膠、PEG-PLA)。使用這樣的輸送系統(tǒng)的目的是(除了其它的以外)降低活性化合物在動(dòng)物和人中的毒性、增強(qiáng)細(xì)胞輸送、降低IC50、從藥物輸送的立場(chǎng)增加作用時(shí)間和防止寡核苷酸非特異性的結(jié)合到血清蛋白。
我們已經(jīng)證實(shí)，PS-ODN隨機(jī)物的抗病毒活性隨著大小的增加而增加。而且，該活性與病毒蛋白(在病毒裂解物中)的升高的親和力相關(guān)。由于本領(lǐng)域熟知，硫代磷酸酯修飾增強(qiáng)蛋白-DNA相互作用的親和力，我們使用用于檢測(cè)與病毒裂解物的相互作用的相同的基于FP的試驗(yàn)，測(cè)試了增加的更大PS-ODN隨機(jī)物結(jié)合胎牛血清(FBS)的能力(圖28a)。在該試驗(yàn)中，在能飽和地結(jié)合(mP值)的條件下，將250ug非加熱失活的FBS與熒光標(biāo)記的20個(gè)堿基PS-ODN隨機(jī)物相絡(luò)合。增加大小的未標(biāo)記的PS-ODN隨機(jī)物(REP 2003、REP 2004、REP 2006和REP 2007)用于競(jìng)爭(zhēng)FBS與標(biāo)記的餌物的相互作用。該試驗(yàn)的結(jié)果清楚地表明，隨著PS-ODN隨機(jī)物的大小的增加，其對(duì)FBS的親和力也增加。該結(jié)果表明，抗病毒活性最高的PS-ODN與蛋白的親和力也是最高的。
本領(lǐng)域已知，硫代磷酸酯反義寡核苷酸的一個(gè)主要治療問題是它們的副作用，這主要是由于其與蛋白(具體地與血清蛋白)增加的相互作用，如由Kandimalla和同事(Kandimalla等(1998)Bioorg.Med Chem.Lett.82103-2108)所述的。我們的數(shù)據(jù)表明了實(shí)質(zhì)的益處，通過合適的輸送系統(tǒng)將抗病毒的ON輸入細(xì)胞，同時(shí)防止它們與血清蛋白的相互作用。
為了證實(shí)輸送系統(tǒng)的益處，我們?cè)囼?yàn)了2種不同的輸送技術(shù)，它們是基于脂質(zhì)體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑和DOTAP。通過熒光測(cè)定法檢測(cè)標(biāo)記的REP2006的胞內(nèi)濃度，我們檢測(cè)了在有高濃度血清(50％)存在的情況下PS-ODN隨機(jī)物REP 2006(用細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑或DOTAP包封的)向293A細(xì)胞中的輸送(圖28b、c)。這些結(jié)果表明，輸送增加REP 2006的胞內(nèi)濃度，還表明在DOTAP的情況下，在24小時(shí)后胞內(nèi)REP 2006的水平有顯著增加。最后，通過在基于FP的體外相互作用試驗(yàn)中的DOTAP(28d)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑(28e)，我們檢測(cè)了對(duì)REP 2006與血清蛋白相互作用的保護(hù)。未包封的REP 2006能夠從血清競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合熒光寡聚物，但是當(dāng)用DOTAP或細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑包封REP 2006時(shí)，其不再能競(jìng)爭(zhēng)血清結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明，包封會(huì)阻止寡聚物的血清相互作用，并會(huì)造成更有效的治療作用和更少的副作用。
使用輸送系統(tǒng)的另一潛在益處是防止ON與感染性的病毒粒子發(fā)生相互作用(例如吸附)，以通過不同的機(jī)制防止病毒感染的擴(kuò)大，例如增強(qiáng)病毒粒子的細(xì)胞穿入。
另一個(gè)方法是通過將輸送系統(tǒng)與能提高與特定細(xì)胞的親和力的分子相關(guān)聯(lián)完成細(xì)胞特異性的輸送，這樣的分子包括但不限于抗體、受體配體、維生素、激素和肽。
面提供了輸送系統(tǒng)的其它選擇。
連接的ODN在某些實(shí)施方案中，以許多方式修飾了本發(fā)明的ON，但不損害它們抑制病毒復(fù)制的能力。例如，ON是在它們的一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基處連接或結(jié)合到另一個(gè)部分。因此，本發(fā)明的寡核苷酸的修飾可以包括將一個(gè)或多個(gè)部分或結(jié)合物化學(xué)地連接到核苷酸，它們能增強(qiáng)活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝入、增強(qiáng)特異性的或非特異性的細(xì)胞膜傳遞，或者防止降解或分泌，或者提供其它的有益特征。這樣的有益特征可以(例如)包括更低的血清相互作用、更高的病毒-蛋白相互作用、被配制適于輸送的能力、可檢測(cè)的信號(hào)、改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和更低的毒性。這樣的結(jié)合物基團(tuán)可以共價(jià)地結(jié)合到功能性基團(tuán)，例如第一或第二羥基。例如，結(jié)合物部分可以包括類固醇分子、非芳族的親脂分子、肽、膽固醇、雙膽固醇、抗體、PEG、蛋白、水溶性的維生素、脂溶性的維生素、另一種ON或改善ON的活性和/或生物利用度的任何其它分子。
更具體地，本發(fā)明的示例性的結(jié)合物基團(tuán)可以包括嵌入劑、報(bào)道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、SATE、叔-丁基-SATE、增強(qiáng)寡聚物的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和增強(qiáng)寡聚物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。典型的結(jié)合物基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸(folate)、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素、熒光核酸堿基和染料。
在本發(fā)明的上下文中，增強(qiáng)藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善寡聚物的細(xì)胞攝入和/或增強(qiáng)寡聚物的抗降解性和/或防止血清相互作用的基團(tuán)。在本發(fā)明的上下文中，能增強(qiáng)藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括能改善寡聚物的攝入、分布、代謝或分泌的基團(tuán)。示例性的結(jié)合物基團(tuán)記載在1992年10月23日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US92/09196中，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考。
結(jié)合物部分可以包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)，膽酸(Manoharan等，Bioorg.Med Chem.Let.，1994，4，1053-1060)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等，Bioorg.Med Chem.Let.，1993，3，2765-2770)，硫代膽固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov等，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75，49-54)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基-銨1，2-二-O-十六烷基-rac-丙三基-3-H-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969-973)或金剛烷醋酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)，棕櫚基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)或十八胺或己基氨羰基-氧膽固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol Exp.Ther.，1996，277，923-937。
本發(fā)明的寡核苷酸還可以結(jié)合到活性藥物，例如但不限于阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二疊氮化物(benzothiadiazide)、氯噻嗪、diazepine、indomethicin、巴比妥酸鹽(酯)、頭孢菌素類、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗細(xì)菌藥或抗生素。
描述了示例性的寡核苷酸結(jié)合物的制備的示例性的美國(guó)專利包括，例如美國(guó)專利號(hào)4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，其中的每一篇全文結(jié)合于此作為參考。
另一種方法是，通過用酶促的可切割的電荷中和加合物(例如s-乙?；虼?乙基或s-pivasloyl硫代-乙基)修飾，制備作為親脂性的前寡核苷酸的抗病毒的ON(Vives等，1999，Nucl Acids Res 274071-4076)。已經(jīng)證實(shí)了這樣的修飾會(huì)增加ON向細(xì)胞中的攝入。
非特異性的ON的設(shè)計(jì)在另一個(gè)方案中，設(shè)計(jì)的抗病毒的ON表現(xiàn)出與人(或其它受試者生物體)的基因組較低的、優(yōu)選最低可能的同源性。目的是得到由于與人或動(dòng)物的基因組序列和mRNA的相互作用將會(huì)表現(xiàn)出最低毒性的ON。第一步是生產(chǎn)理想長(zhǎng)度序列的ON，例如手工地或更通常是使用計(jì)算機(jī)程序通過以隨機(jī)方式配對(duì)核苷酸A、C、G、T。第二步是將ON序列與人序列庫(例如GenBank和/或全體人基因組數(shù)據(jù)庫)比對(duì)。如果需要，可以重復(fù)進(jìn)行序列生產(chǎn)和比對(duì)，以鑒別具有與受試者基因組理想的低同源性水平的一個(gè)或多個(gè)序列。理想地，ON序列與全部基因組具有最低可能的同源性，同時(shí)還優(yōu)選地最小化自身相互作用。
具有反義活性的非特異性的ON在另一個(gè)方案中，將抗病毒的非特異性的序列部分偶聯(lián)反義序列部分，以提高最終ON的活性。本發(fā)明描述了ON的非特異性部分。反義部分與病毒mRNA互補(bǔ)。
具有G-豐富的基序活性的非特異性的ON在另一個(gè)方案中，將抗病毒的非特異性的序列部分偶聯(lián)基序部分，以提高最終ON的活性。本發(fā)明描述了ON的非特異性部分。作為非限制實(shí)例，基序部分可以包括CpG、G四合體和/或CG，它們?cè)谖墨I(xiàn)中記載為免疫系統(tǒng)的刺激物。Agrawal等(2001)Curr.Cancer Drug Targets 3197-209。
非沃森-克里克ON另一個(gè)方案是使用由一類或幾類非沃森-克里克核苷酸/核苷組成的ON。這樣的ON可以模仿PS-ODN，其下述特征類似于PS-ODNa)總電荷；b)單元之間的距離；c)鏈長(zhǎng)度；d)純偶極子，在一側(cè)有負(fù)電荷積累；e)結(jié)合蛋白的能力；f)結(jié)合病毒蛋白的能力；g)穿透細(xì)胞的能力；h)可接受的治療指數(shù)；i)抗病毒活性。該ON具有優(yōu)選的硫代磷酸酯主鏈，但是不限于它。非沃森-克里克核苷酸/核苷的實(shí)例記載在KOOL，2002，Acc.Chem.Res.35936-943；和Takeshita等，(1987)J.Biol.Chem.26210171-10179中，其中描述了含有合成的無堿基位點(diǎn)的ODN。
抗病毒的聚合物另一個(gè)方案是使用模仿硫代磷酸酯ODN的活性的聚合物。如文獻(xiàn)中記載，證實(shí)了幾種陰離子聚合物具有抗病毒的抑制劑活性。這些聚合物屬于幾種類型(1)多糖的硫酸酯(糊精和葡聚糖硫酸酯；硫酸纖維素)；(2)含有磺化苯或萘環(huán)的聚合物和萘磺酸酯聚合物；(3)聚羧酸酯(丙烯酸聚合物)；和乙?；彵蕉柞＠w維素(Neurath等(2002)BMC Infect Dis 227)；和(4)無堿基寡核苷酸(Takeshita等，1987，J.Biol.Chem.26210171-10179)。文獻(xiàn)中記載了非核苷酸抗病毒的聚合物的其它實(shí)例。本文所述的聚合物能模仿本發(fā)明中所述的PS-ODN，其下述特征類似于PS-ODNa)鏈長(zhǎng)度；b)純偶極子，在一側(cè)有負(fù)電荷積累；c)結(jié)合蛋白的能力；d)結(jié)合病毒蛋白的能力；e)可接受的治療指數(shù)；f)抗病毒活性。為了模仿PS-ODN的作用，抗病毒的聚合物可以優(yōu)選地是聚陰離子，其單元之間的距離類似于PS-ODN。其還可以具有獨(dú)立的或與輸送系統(tǒng)相組合的穿透細(xì)胞的能力。
雙鏈PS-ODN的抗病毒活性隨機(jī)序列(REP 2017)和其補(bǔ)體(PS修飾的或未修飾的)是如別處所述的熒光標(biāo)記的，并通過如本發(fā)明所述的熒光偏振測(cè)試了它們結(jié)合純化的HSV-1和HIV-1蛋白的能力。通過丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證了雜交。單鏈(ss)或雙鏈(ds)的未修飾的REP 2017(2017U)在HSV-1或HIV-1裂解物中沒有結(jié)合活性。但是，單鏈或雙鏈的的PS修飾的REP 2017能進(jìn)行HSV-1和HIV-1相互作用(見圖33)。
根據(jù)本文所述的結(jié)果，一個(gè)方案是使用雙鏈ON作為有效的抗病毒劑。優(yōu)選地，這樣的ON具有硫代磷酸酯主鏈，但是還可以具有其它的和/或另外的修飾，其能增強(qiáng)它們的輸送和/或抗病毒活性和/或穩(wěn)定性，如本文中關(guān)于單鏈的ON所述。
藥物發(fā)現(xiàn)的體外試驗(yàn)體外試驗(yàn)的開發(fā)是基于熒光偏振檢測(cè)PS-ODN結(jié)合病毒組分、例如病毒蛋白的能力。當(dāng)?shù)鞍?或另一種相互作用物)結(jié)合到熒光標(biāo)記的餌物時(shí)，餌物在溶液中的三維折疊(tumbling)會(huì)受到阻礙。通過從標(biāo)記的餌物發(fā)出的光的偏振的固有增加檢測(cè)了該折疊的阻礙。因此，將增強(qiáng)的偏振(記為無因次量綱(dimensionless measure)[mP])與增強(qiáng)的結(jié)合相關(guān)聯(lián)。
一種方法是使用作為餌物的PS-ODN隨機(jī)物，其在3′端使用不可彎曲連接物(3′-(6-熒光素)CPG)標(biāo)記了FITC。將該P(yáng)S-ODN隨機(jī)物在試驗(yàn)緩沖液(10mM Tris，pH7.2，80mM NaCl，10mM EDTA，100mM β-巰基乙醇和1％吐溫20)中稀釋至2nM。然后將該寡聚物與合適的相互作用物混合。在該情況下，我們使用蔗糖梯度純化的HSV-1(菌株Maclntyre)、HIV-1(菌株Mn)或RSV(菌株A2)的裂解物，它們懸浮在0.5M KCl和0.5％TritonX-100(HSV-1和HIV-1)或10mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA和0.1％Triton X-100(RSV)中。餌物相互作用后，用各種未標(biāo)記的PS-ODN挑戰(zhàn)復(fù)合物，以檢測(cè)它們從其復(fù)合物中置換出餌物的能力。
在圖29中，我們顯示了用3種不同大小的餌物進(jìn)行的初步試驗(yàn)6(REP2032-FL)、10(REP 2003-FL)和20個(gè)堿基(REP 2004-FL)。測(cè)試了這些餌物與HSV-1(圖29a)、HIV-1(圖29b)和RSV(圖29c)裂解物相互作用的能力。在存在任何病毒裂解物的情況下，結(jié)合度取決于使用的餌物的大小，2004-FL在存在病毒裂解物的情況下表現(xiàn)出最大的mP(結(jié)合)位移。我們注意到，這與PS-ODN隨機(jī)物的大小依賴性的抗病毒功效類似。然后用該餌物評(píng)價(jià)不同大小的PS-ODN競(jìng)爭(zhēng)餌物與裂解物的相互作用的能力。
在圖30中，用遞增大小的PS-ODN挑戰(zhàn)了REP 2004-FL與HSV-1(圖30a)、HIV-1(圖30b)和RSV(圖30c)裂解物的相互作用。對(duì)于每種測(cè)試的病毒裂解物，我們注意到REP 2003不能將餌物從裂解物中競(jìng)爭(zhēng)出來。如通過REP 2004(未標(biāo)記的餌物)競(jìng)爭(zhēng)物引起的相對(duì)較弱的競(jìng)爭(zhēng)所揭示的，餌物相互作用非常強(qiáng)。但是觀察到，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)物PS-ODN的大小超過20個(gè)堿基時(shí)，其置換餌物的能力變得更大。這表明，隨著PS-ODN隨機(jī)物大小的增大，在病毒裂解物中對(duì)蛋白組分的親和力也增大。該現(xiàn)象反映了更大的PS-ODN隨機(jī)物對(duì)HSV-1、HSV-2、CMV、HIV-1和RSV的抗病毒活性的增強(qiáng)。
餌物競(jìng)爭(zhēng)的功效和PS-ODN隨機(jī)物的抗病毒活性之間的相似性表明，該試驗(yàn)范例是抗病毒活性良好預(yù)測(cè)物。該試驗(yàn)是有力的、容易執(zhí)行和非常穩(wěn)定的，這使得它成為鑒別新的抗病毒分子的高通量篩選的非常好的備選品，所述的鑒別不是基于特定靶位的鑒別，而是基于它們與一種或多種組分(例如病毒蛋白)相互作用的能力。
本文所述的方法是用于篩選來自任何理想來源的新型化合物，例如來自通過組合化學(xué)合成的庫或通過純化天然產(chǎn)物分離的庫。它可以用于a)檢測(cè)新ON的合適大小、修飾和主鏈；b)測(cè)試新型分子，包括新型聚合物；預(yù)測(cè)特定病毒對(duì)新型ON或新型化合物的敏感性；或d)檢測(cè)化合物的合適序列，以最大地抑制特定病毒。
與更大的PS-ODN隨機(jī)物的增強(qiáng)的裂解物親和力表明，PS-ODN隨機(jī)物的抗病毒作用機(jī)制是基于與一種或多種病毒蛋白組分的相互作用，其預(yù)防感染或改正病毒粒子的復(fù)制。它還表明，該相互作用是電荷(大小)依賴性的，而不依賴于序列。由于這些PS-ODN隨機(jī)物對(duì)跨越幾個(gè)不同家族的多種病毒具有大小依賴性的活性，我們提出，PS-ODN隨機(jī)物干擾常見的、電荷依賴性的蛋白-蛋白相互作用、蛋白DNA/RNA相互作用和/或其它分子-分子相互作用。這些相互作用可以包括(但不限于)a.在衣殼形成過程中各衣殼亞單元之間的相互作用；b.衣殼/核殼體蛋白和病毒基因組之間的相互作用；c.在芽殖過程中衣殼和糖蛋白之間的相互作用；d.在感染過程中糖蛋白和其受體之間的相互作用；e.參與病毒復(fù)制的其它病毒關(guān)鍵組分之間的相互作用。
蛋白-蛋白相互作用的這些多樣的、同時(shí)的抑制代表了抗病毒的抑制新機(jī)制。
PS-ODN序列組成對(duì)裂解物的作用我們監(jiān)視了不同序列的PS-ODN與幾種病毒裂解物相互作用的能力。在每種情況下，如本文前面所述，將20-mer的PS-ODN在3′端標(biāo)記上FITC。測(cè)試的PS-ODN由A20、T20、G20、C20、AC10、AG10、TC10、TG10、REP 2004和REP 2017組成。這些序列中的每一種都在試驗(yàn)緩沖液中稀釋至4nM，并在存在1ug HSV-1、HIV-1或RSV裂解物的情況下孵育。通過熒光偏振檢測(cè)了相互作用。
所有測(cè)試序列的相互作用圖譜與全部病毒裂解物類似，這表明結(jié)合相互作用的性質(zhì)是非常相似的。在每種裂解物中，均勻組合物(A20、G20、T20、C20)的PS-ODN是最弱的相互作用物，且A20是其中最弱的相互作用物，形成顯著邊界。關(guān)于剩下的測(cè)試的PS-ODN，除了TG10，在每種裂解物中一致地表現(xiàn)出最強(qiáng)的相互作用外，它們都表現(xiàn)出類似的強(qiáng)相互作用(見圖35)。
PS-ODN隨機(jī)物在HIV-I中的靶位鑒別如實(shí)施例9所述，通過熒光偏振測(cè)試了PS-ODN隨機(jī)物結(jié)合純化的HIV-1蛋白的能力。使遞增量的純化的HIV-1 p24或純化的HIV-1 gp41與REP 2004-FL反應(yīng)(見圖31)。我們對(duì)這兩種蛋白注意到，都存在蛋白濃度依賴性的熒光偏振位移，這指示著與這兩種蛋白的相互作用。
還使用REP 2032、REP 2003、REP 2004、REP 2006和REP 2007的熒光版本測(cè)試了一定大小范圍的PS-ODN隨機(jī)物結(jié)合到這些蛋白的能力(見圖32)。我們對(duì)p24觀察到，p24沒有大小依賴性的相互作用(見圖32a)，但是我們確實(shí)看到，超過20個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物與低于20個(gè)堿基的相比，有g(shù)p41結(jié)合的增加(見圖32b)。這表明，當(dāng)PS-ODN隨機(jī)物的長(zhǎng)度超過20個(gè)堿基時(shí)，多個(gè)拷貝的gp41可以結(jié)合到各隨機(jī)物上，增強(qiáng)它們的偏振。
這是有意義的觀察，因?yàn)樗C實(shí)了更大的ON在病毒合成過程中隔絕結(jié)構(gòu)蛋白和限制它們用于形成新病毒粒子的有效性的潛力。
高親和力寡核苷酸另一個(gè)方案是富集或純化抗病毒的ON的方法，所述的ON對(duì)病毒組分(例如病毒蛋白)的親和力比起始ON庫中的平均ON親和力更高。該方法因而提供了一種或多種非序列互補(bǔ)的ON，其它將表現(xiàn)出對(duì)一種或多種病毒組分增強(qiáng)的親和力，例如具有有利于這樣的更高結(jié)合親和力的三維形狀?；驹硎牵M管ON將作為線性分子與病毒組分結(jié)合，它們還可以折疊成能增強(qiáng)與這樣的病毒組分的相互作用的三維形狀。不限于特定的技術(shù)，可以以下述方式純化或富集高親和力的ON。
純化一種或多種高親和力的ON的一種方法包括，使用帶有結(jié)合的病毒蛋白的固定相介質(zhì)作為親合基質(zhì)來結(jié)合ON，其然后可以在遞增的嚴(yán)格條件(例如遞增濃度的鹽或其它離液劑和/或遞增的溫度和/或pH變化)下洗脫。這樣的方法可以例如如下進(jìn)行(a)將ON庫裝載到交換柱上，所述交換柱具有一種或幾種病毒蛋白或結(jié)合到固定相的病毒裂解物；(b)從柱上置換(洗脫)結(jié)合的ON，例如通過使用置換溶液，例如遞增的鹽溶液；(c)收集在不同的鹽濃度洗脫的ON級(jí)分；(d)從不同級(jí)分、更優(yōu)選地從高鹽濃度的級(jí)分克隆并測(cè)序洗脫的ON，在高鹽濃度洗脫的ON具有更大的與病毒蛋白的結(jié)合親和力；和(e)在試驗(yàn)中測(cè)試測(cè)序的ON的活性，例如在結(jié)合和/或病毒抑制試驗(yàn)、例如本文所述的熒光偏振-結(jié)合試驗(yàn)中，和/或在細(xì)胞病毒抑制試驗(yàn)中和/或在動(dòng)物病毒抑制試驗(yàn)中。
在第二個(gè)實(shí)施例中，從SELEX方法(Morris等(1998)Biochemistry 952902-2907)衍生和修正出的方法可以用于純化高親和力的ON。這種方法的一種實(shí)施可以如下進(jìn)行(a)提供起始ON庫物質(zhì)，例如，收集合成的含有高數(shù)目序列的隨機(jī)ON，例如含有1014～1016個(gè)不同序列。每個(gè)ON分子含有隨機(jī)序列片段，在每一末端側(cè)接引物結(jié)合序列，以促進(jìn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。因?yàn)榛旧纤械姆肿拥暮塑账嵝蛄卸际仟?dú)特的，在群體中取樣了巨大數(shù)量的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)決定了每個(gè)分子的生化性質(zhì)，例如結(jié)合給定的病毒靶分子的能力；(b)使ON與一種或幾種病毒蛋白或病毒裂解物接觸；(c)使用分離技術(shù)篩選結(jié)合到病毒蛋白上的ON，該技術(shù)可以分離結(jié)合的和未結(jié)合的ON，例如天然凝膠遷移和硝酸纖維素過濾。這些方法能將結(jié)合物從未結(jié)合物中物理地分離出，以便擇優(yōu)地回收結(jié)合最好的那些序列。另外，為了篩選能結(jié)合小蛋白的ON，理想地將目標(biāo)結(jié)合到固體載體上，并用該載體作為親合純化基質(zhì)。那些不能結(jié)合的分子會(huì)被洗下，而結(jié)合的分子則被游離的靶目標(biāo)洗脫，從而物理地分離了結(jié)合的和未結(jié)合的物質(zhì)；(d)擴(kuò)增洗脫的結(jié)合的ON，例如通過使用PCR，其使用能與ON的側(cè)翼序列雜交的引物；(e)為了擇優(yōu)地回收表現(xiàn)出與病毒蛋白的最高結(jié)合親和力的ON，步驟(b)、(c)和(d)可以進(jìn)行多次(即多個(gè)富集和放大的循環(huán)或回合)。幾個(gè)富集和放大循環(huán)后，通過表現(xiàn)出理想的生化性質(zhì)的序列使群體顯現(xiàn)；(f)對(duì)選自富集循環(huán)(例如最后一個(gè)這樣的循環(huán))的一種或多種ON進(jìn)行克隆和測(cè)序；和(g)在試驗(yàn)中測(cè)試測(cè)序的ON的結(jié)合和/或活性，例如在本文所述的熒光偏振結(jié)合試驗(yàn)和/或在細(xì)胞病毒抑制試驗(yàn)和/或在動(dòng)物病毒抑制試驗(yàn)中。
另一個(gè)方案是采用改進(jìn)的剪接合成方法，建立一個(gè)-珠一個(gè)-PS-ODN和一個(gè)-珠一個(gè)-PS2-ODN庫，如Yang等(2002)Nucl.Acids Res.30(e132)1-8所述。可以進(jìn)行對(duì)病毒蛋白特異性的珠的結(jié)合和選擇。通過使用選擇的珠子的基于PCR的鑒別標(biāo)記，可以進(jìn)行核酸堿基和任何硫代酯/二硫代酯鍵位點(diǎn)的測(cè)序。該方法可以快速和方便地鑒別出結(jié)合到病毒蛋白上的PS-ODN或PS2-ODN，并表現(xiàn)出有效的抗病毒性質(zhì)。
一旦確定了(例如通過各序列的擴(kuò)增和測(cè)序)能高親和力地結(jié)合到病毒蛋白上的特異性序列，可以選擇和合成(例如通過化學(xué)的或酶促的合成)一種或多種這樣的高親和力序列，以提供高親和力的ON制品，可以修飾它們以提高其活性，包括提高它們的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。在本發(fā)明中可以使用這樣的高親和力的ON。
朊病毒疾病另一個(gè)方案是在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中用于朊病毒疾病的治療、進(jìn)程控制或預(yù)防。該致命的神經(jīng)變性病是傳染性的，可以感染人和動(dòng)物。認(rèn)為細(xì)胞朊病毒蛋白中的結(jié)構(gòu)變化、其瘙癢病異構(gòu)的PrPC、PrPSC是朊病毒疾病的發(fā)作和傳播中的必須步驟。淀粉狀蛋白聚合物與朊病毒疾病的神經(jīng)病理學(xué)相關(guān)。
朊病毒蛋白片段和雙鏈核酸的孵育導(dǎo)致淀粉狀蛋白纖維的形成(Nandi等(2002)，J Mol Biol 322153-161)。對(duì)蛋白具有親和力的ON，例如硫代磷酸酯，用于競(jìng)爭(zhēng)或抑制雙鏈核酸與PrPC的相互作用，并隨后終止淀粉狀蛋白聚合物的形成。這樣的不同大小的ON和不同的組合物可以用于合適的輸送形式，以治療患有朊病毒疾病的患者，或用于高危情形下的預(yù)防?？梢匀鏝andi等(supra)所述通過測(cè)試在有試驗(yàn)ON存在的情形下的淀粉狀蛋白聚合酶的折疊變化，鑒別出這樣的干擾ON。
推定的病毒病原學(xué)另一個(gè)方案是在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中用于治療或預(yù)防具有如(但不限于)在下面的實(shí)施例中所述的推定的病毒病原學(xué)的疾病或病癥。病毒是疾病和病癥(其與原發(fā)性病毒感染無關(guān))中的推定的致病物。例如，關(guān)節(jié)炎與HCV(Olivieri等(2003)Rheum Dis Clin North Am 29111-122)、細(xì)小病毒B19、HIV、HSV、CMV、EBV和VZV(Stahl等(2000)ClinRheumatol 19281-286)有關(guān)。還已經(jīng)鑒別出其它病毒在不同的疾病中起作用。例如，流感A在帕金森氏疾病中(TAKAHASHI等(1999)，Jpn J InfectDis 5289-98)，冠狀病毒、EBV和其它病毒在多發(fā)性硬化中(Talbot等(2001)Curr Top Microbiol Immunol 253247-71)；EBV、CMV和HSV-6在慢性疲勞綜合癥(Lemer等(2002)Drugs Today 38549-561)；和副粘病毒在哮喘(Walter等(2002)J Clin Invest 110165-175)和在佩吉特病中；和HBV、HSV和流感在Guilfain-Barre綜合征中。
因?yàn)檫@些病原學(xué)，使用本發(fā)明抑制相關(guān)的病毒可以延緩、減慢或預(yù)防相應(yīng)疾病或病癥的發(fā)展、或至少該疾病的一些癥狀。
寡核苷酸修飾和合成如上面的總結(jié)所述，修飾的寡核苷酸在本發(fā)明中是有用的。這樣的修飾的寡核苷酸包括例如含有修飾的主鏈或非天然的核苷間鍵合的寡核苷酸。具有修飾的主鏈的寡核苷酸包括在主鏈中保留有和沒有磷原子的那些。
這樣的修飾的寡核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3′-亞烷基膦酸酯、5′-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯，氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯、卡硼烷基(carboranyl)磷酸酯和具有正常的3′-5′鍵的borano-磷酸酯、它們的2′-5′連接的類似物和具有反轉(zhuǎn)極性的那些，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸內(nèi)鍵是3′至3′、5′至5′或2′至2′鍵。具有反轉(zhuǎn)極性的寡核苷酸典型地包括在3′-最多核苷酸內(nèi)鍵處的單獨(dú)的3′至3′鍵，即單獨(dú)的反轉(zhuǎn)核苷殘基，其可以是無堿基的(該核酸堿基是缺失的，或者在其位置具有羥基)。還包括了各種鹽、混合鹽和游離酸形式。
具有如上所述的含磷鍵的寡核苷酸的制備記載在例如美國(guó)專利號(hào)3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050中，其中的每一篇全文結(jié)合于此作為參考。
一些不包含磷原子的示例性的修飾的寡核苷酸主鏈具有通過短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子的或雜環(huán)的核苷間鍵合形成的主鏈。它們包括具有下述鍵的那些嗎啉代鍵(部分地從核苷的糖部分形成)；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；formacetyl和thioformacetyl主鏈；亞甲基formacetyl和thioformacetyl主鏈；核乙?；麈?；含有鏈烯基的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和氨磺酰主鏈；酰胺主鏈；和其它具有混合的N、O、S和CH2組分部分的。特別有利的是包括一種或多種荷電部分的主鏈鍵。描述了前述寡核苷酸的制備的美國(guó)專利實(shí)例包括美國(guó)專利號(hào)5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其中的每一篇全文結(jié)合于此作為參考。
修飾的寡核苷酸還可以含有一種或多種取代的糖部分。例如，這樣的寡核苷酸可以包括一個(gè)下述的2′-修飾OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-鏈烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述的烷基、鏈烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10鏈烯基和炔基或2′-O-(O-卡硼烷-1-基)甲基。具體的實(shí)例是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)～OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2，其中n和m是1至10。其它示例性的寡核苷酸包括一個(gè)下述的2′-修飾C1至C10低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、鏈烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、用于提高寡核苷酸的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或用于提高寡核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。實(shí)例包括2′-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也稱作2’-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即烷氧基烷氧基基團(tuán)；2′-二甲基-氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基團(tuán)，也稱作2′-DMAOE；和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也稱作2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其它的修飾包括鎖定的核酸(LNAS)，其中的2′-羥基基團(tuán)是連接到糖環(huán)的3′或4′碳原子上，由此形成雙環(huán)糖部分。鍵可以是連接2′氧原子和4′碳原子的亞甲基(-CH2-)～基團(tuán)，其中n是1或2。LNA及其制備記載在WO 98/39352和WO 99/14226中，其全文結(jié)合于此作為參考。
其它的修飾包括硫-氮橋修飾，例如在Orum等(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.3239-243中所述的鎖定的核酸。
其它的修飾包括2′-甲氧基(2’-O-CH3)、2′甲氧基乙基(2’-O-CH2-CH3)、2′-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2’-O-烯丙基(2’-O-CH2-CH＝CH2)和2′-氟代(2′-F)。2’修飾可以是在arabino(上)位置或核(下)位置。類似的修飾還可以在寡核苷酸的其它的位置，特別是3′端核苷酸上、或2′-5′連接的寡核苷酸的糖的3′位置和5′端核苷酸的5′位置。寡核苷酸還可以具有糖模仿物，例如代替呋喃戊糖基糖的環(huán)丁基部分。描述了這種修飾的糖結(jié)構(gòu)的示例性的美國(guó)專利包括例如美國(guó)專利號(hào)4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，其中的每一篇全文結(jié)合于此作為參考。
其它的修飾包括ON多聯(lián)體，其由多個(gè)通過連接物連接的寡核苷酸序列組成。該連接物可以例如由修飾的核苷酸或非核苷酸單元組成。在一些實(shí)施方案中，該連接物為ON多聯(lián)體提供了彈性。通過連接更小的寡核苷酸結(jié)構(gòu)塊來得到理想的長(zhǎng)度，應(yīng)用這樣的ON多聯(lián)體可以提供便利的合成最終分子的方法。例如，可以用12個(gè)碳的連接物(C12亞磷酰胺)連接兩種或多種ON多聯(lián)體，并提供長(zhǎng)度、穩(wěn)定性和彈性。
如本文所使用的，“未修飾的”或“天然的”堿基(核酸堿基)包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。寡核苷酸還可以包括堿基修飾或取代。修飾的堿基包括其它的合成的和天然存在的堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶堿的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它的8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其它修飾的堿基包括三環(huán)嘧啶例如吩噁嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夾子例如取代的吩噁嗪胞嘧啶核苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞嘧啶核苷(2H-嘧啶并[4，5b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞嘧啶核苷(H-吡啶并[3′，2′4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修飾的堿基還可以包括這樣的，其中的嘌呤或嘧啶堿基被替換為其它的雜環(huán)，例如7-脫氮-腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤核苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核酸堿基包括美國(guó)專利號(hào)3,687,808所述的那些，TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering，第858-859頁，Kroschwitz，J.I.編.John Wiley和Son，1990公開的那些，Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公開的那些，和Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Application，第289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編，CRC Press，1993公開的那些。
其它的修飾包含二硫代磷酸酯鍵。已知二硫代磷酸酯ODN(PS2-ODN)和PS-ODN具有類似的蛋白結(jié)合親和力(Tonkinson等(1994)Antisense Res.Dev.4269-278)(Cheng等(1997)J.Mol.Recogn.10101-107)，已知可能的ODN作用機(jī)制是結(jié)合至病毒蛋白，可以理想地在本發(fā)明所述的抗病毒的ODN上包括二硫代磷酸酯鍵。
修飾ODN的另一個(gè)方案是生產(chǎn)立體定義的或立體富集的ODN，如在Yu等(2000)Bioorg.Med Chem.8275-284和在Inagawa等(2002)FEBS Lett.2548-52中所述。通過常規(guī)方法制備的ODN由借助于圍繞參與核苷酸間鍵的磷原子的不對(duì)稱性的非對(duì)映異構(gòu)體的混合物組成。這會(huì)影響ODN和病毒組分(例如病毒蛋白)之間的結(jié)合的穩(wěn)定性。以前的數(shù)據(jù)表明，蛋白結(jié)合顯然地是立體依賴性的(Yu等)。因而，使用立體定義的或立體富集的ODN可以改善它們的蛋白結(jié)合性質(zhì)和改善它們的抗病毒功效。
可以以許多不同的整合方式和水平利用修飾(例如上述的那些)的結(jié)合。也就是說，特定的修飾不需要包括在每個(gè)核苷酸或寡核苷酸的鍵上，可以組合地在單獨(dú)的寡核苷酸或甚至單獨(dú)的核苷酸中利用不同的修飾。
寡核苷酸的合成可以使用本領(lǐng)域已知的方法合成本發(fā)明的寡核苷酸。例如，利用標(biāo)準(zhǔn)的具有碘氧化的亞磷酰胺化學(xué)，可以在自動(dòng)DNA合成儀(例如AppliedBiosystems型號(hào)380B)上合成未取代的和取代的磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。為了逐步進(jìn)行亞磷酸酯鍵的硫代，可以將硫代磷酸酯(P＝S)合成為磷酸二酯寡核苷酸，除了可以將標(biāo)準(zhǔn)氧化瓶替換為0.2M的311-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物在乙腈中的溶液之外。硫代等待步驟(thioation waitstep)可以增加到68秒，然后進(jìn)行帽化步驟(capping step)。從CPG柱剪下后，在55℃、在濃氫氧化銨中去封閉。(18小時(shí))，可以通過用2.5體積的乙醇(來自0.5M NaCl溶液)沉淀2次，純化寡核苷酸。
可以如美國(guó)專利號(hào)5,508,270所述制備亞膦酸酯寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)4,469,863所述制備烷基膦酸酯寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)5,610,289和5,625,050所述制備3′-脫氧-3′-亞甲基膦酸酯寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)5,256,775和美國(guó)專利號(hào)5,366,878所述制備亞磷酰胺寡核苷酸；可以如公開的PCT申請(qǐng)PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分別公開為WO 94/17093和WO 94/02499)所述制備烷基硫代膦酰酯寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)5,476,925所述制備3′-脫氧-3′-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)5,023,243所述制備磷酸三酯寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)5,130,302和5,177,198所述制備borano磷酸酯寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289所述制備亞甲基甲基亞氨基連接的寡核苷酸(也稱作MMI連接的寡核苷酸)、亞甲基二甲基-聯(lián)亞氨基連接的寡核苷酸(也稱作MDII連接的寡核苷酸)和亞甲基羰基氨基連接的寡核苷酸(也稱作酰胺-3連接的寡核苷酸)和亞甲基氨基羰基連接的寡-核苷酸(也稱作酰胺-4連接的寡聚物核苷)、以及混合的主鏈化合物(具有例如改變的MMI和P＝O或P＝S鍵)；可以如美國(guó)專利號(hào)5,264,562和5,264,564所述制備formacetal和thioformacetal連接的寡核苷酸；可以如美國(guó)專利號(hào)5,223,618所述制備環(huán)氧乙烷連接的寡核苷酸。引用的每項(xiàng)專利和專利申請(qǐng)全文結(jié)合于此作為參考。
寡核苷酸制劑和藥物組合物可以在寡核苷酸制劑或藥物組合物中制備本發(fā)明的寡核苷酸。因而，本發(fā)明的寡核苷酸還可以與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物相混合、包封、結(jié)合或另外關(guān)聯(lián)，例如脂質(zhì)體，受體靶向的分子，經(jīng)口的、直腸的、局部的或其它的制劑，以輔助攝入、分布和/或吸收。描述了這樣的攝入、分布和/或吸收的輔助制劑的制備的示例性美國(guó)專利包括例如美國(guó)專利號(hào)5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，每個(gè)全文結(jié)合于此作為參考。
本發(fā)明的寡核苷酸、制劑和組合物包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、或這樣的酯的鹽、或任何其它化合物，其在施用給動(dòng)物(包括人)后能直接地或間接地提供生物活性代謝物或其殘余物。因此，例如，本申請(qǐng)還包括本發(fā)明的化合物的前藥和藥學(xué)上可接受的鹽、這樣的前藥的藥學(xué)上可接受的鹽和其它的生物等同物。
術(shù)語“前藥”是指制備成無活性形式的治療劑，其在體內(nèi)或其細(xì)胞中會(huì)通過內(nèi)源酶或其它化學(xué)品和/或條件的作用轉(zhuǎn)化成活性形式(即藥物)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸的前藥形式是制備成根據(jù)在Gosselin等WO 93/24510和在Imbach等WO 94/26764和美國(guó)專利號(hào)5,770,713中所述的方法的SATE[(S-乙?；?2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物，其全文結(jié)合于此作為參考。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明的化合物的生理學(xué)上和藥學(xué)上可接受的鹽即保留了母體化合物的理想生物學(xué)活性且不引起不希望的毒理學(xué)作用的鹽。已知許多這樣的藥學(xué)上可接受的鹽，且可以用在本發(fā)明中。
對(duì)于寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的鹽的有用實(shí)例包括但不限于與陽離子(例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣)形成的鹽，多胺例如精胺和亞精胺等；與無機(jī)酸(例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸式加成鹽；與有機(jī)酸(例如，醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等)形成的鹽；和與元素陰離子(例如氯、溴和碘)形成的鹽。
本發(fā)明還包含藥物組合物和制劑，其含有本發(fā)明的抗病毒的寡核苷酸。根據(jù)需要局部的還是全身的治療以及要治療的區(qū)域，可以以許多方式施用這樣的藥物組合物。例如，可以局部地施用，(包括眼的和粘膜包括陰道的和直腸的輸送)；肺的，例如通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)的；鼻內(nèi)的；表皮的和透皮的；經(jīng)口的；或腸胃外的。腸胃外的施用包括靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的或肌肉內(nèi)的注射或灌輸；或顱內(nèi)的，例如鞘內(nèi)的或心室內(nèi)的施用。
用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、霜?jiǎng)⒛z、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。常規(guī)的藥物載體、水性的、粉末的或油性的基質(zhì)、增稠劑等可以是需要的或理想的。還可以使用有涂層的避孕套、手套等。優(yōu)選的局部制劑包括這樣的，其中本發(fā)明的寡核苷酸是與局部輸送劑相混合，例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、甾族化合物、螯合劑和表面活性劑。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油酰磷脂?；鵇OPE乙醇胺、二肉豆蔻?；字；憠ADMPC、二硬脂酰磷脂酰基膽堿)、陰離子的(例如二肉豆蔻酰基磷脂?；视虳MPG)和陽離子的(例如二油?；募谆被鵇OTAP和二油?；字；掖及稤OTMA)?？梢詫⒐押塑账岚庠谥|(zhì)體中，或與其形成復(fù)合物，特別是與陽離子脂質(zhì)體?；蛘?，可以使寡核苷酸與脂質(zhì)絡(luò)合，特別是與陽離子脂質(zhì)。優(yōu)選的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸(laurie acid)、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、酰基肉堿、?；憠A或C1-10烷基酯(例如異丙基肉豆蔻酸酯IPM)、單酸甘油酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受的鹽。
用于經(jīng)口施用的組合物和制劑包括粉末或顆粒、微粒、納米顆粒、在水或非水性介質(zhì)中的混懸液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、片劑或微片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可以是需要的。優(yōu)選的經(jīng)口制劑是這樣的，其中本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種穿透增強(qiáng)劑、表面活性劑和螯合劑一起施用。示例性的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。示例性的膽汁酸/鹽包括鵝脫氧膽酸(CDCA)和烏索脫氧膽酸(UDCA)、膽酸、脫氫膽酸、脫氧膽酸、葡糖膽酸(glucholic acid)、甘膽酸(glycholic acid)、甘氨脫氧膽酸(glycodeoxycholicacid)、?；悄懰?、?；敲撗跄懰?、?；?24，25-二氫-梭鏈孢酸鈉、甘氨二氫梭鏈孢酸鈉(sodium glycodihydrofusidate)。示例性的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、?；鈮A、酰基膽堿或單酸甘油酯、甘油二酯或其藥學(xué)上可接受的鹽(例如鈉鹽)。還優(yōu)選的是穿透增強(qiáng)劑的組合，例如，脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽組合。特別優(yōu)選的組合是月桂酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。其它示例性的穿透增強(qiáng)劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚?？梢砸灶w粒形式經(jīng)口地輸送本發(fā)明的寡核苷酸，包括噴霧干燥的顆?；蚪j(luò)合形成微米或納米顆粒。寡核苷酸絡(luò)合劑包括聚-氨基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷(polyoxethanes)、聚烷基氰基丙烯酸酯；陽離子化的明膠、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亞胺、短梗霉多糖(pollulans)、纖維素和淀粉。特別有益的絡(luò)合劑包括脫乙酰殼多糖、N-三甲基脫乙酰殼多糖、聚-L-賴氨酸、聚組氨酸、polyorithine、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基亞乙基P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如對(duì)氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(D，L-乳-co-羥基乙酸(PLGA)、藻酸鹽和聚乙二醇(PEG)。
用于腸胃外的、鞘內(nèi)的或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可以包括無菌水性溶液，其還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其它的合適的添加劑，例如但不限于穿透增強(qiáng)劑、載體化合物和其它的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑和含有脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以從多種組分生成，包括但不限于預(yù)制的液體、自乳化固體和自乳化半固體。
本發(fā)明的藥物制劑可以常規(guī)的以單位劑量形式存在，其可以根據(jù)制藥工業(yè)熟知的常規(guī)技術(shù)制備。這樣的技術(shù)包括將活性成分與藥物載體或賦形劑相結(jié)合的步驟。通常，制劑是通過將活性成分與液體載體或磨碎的固體載體或者二者均勻地和緊密地組合，然后在必要時(shí)混合產(chǎn)物來制備的。
本發(fā)明的組合物可以制成任何多種可能的劑型，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以制成在水性、非水性或混合介質(zhì)中的混懸液。水性混懸液還可以含有能提高混懸液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。混懸液還可以含有穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可以制成并用作泡沫。藥物泡沫包括的制劑例如但不限于乳劑、微乳、霜?jiǎng)?、凝膠劑和脂質(zhì)體。盡管它們的性質(zhì)基本上類似，這些制劑在組分和最終產(chǎn)品的稠度上有差別。這樣的組合物和制劑的制備是藥物和制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，可以用于制備本發(fā)明的組合物。
乳劑本發(fā)明的制劑和組合物可以制備并制成乳劑。乳劑典型地是一種液體以微滴形式(其直徑通常超過0.1μm)分散在另一種液體中的異源系統(tǒng)。(Idson，in Pharmaceutical Dosage Form，Lieberman，Rieger和Banker(LIDS.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，199頁；Rosoff，inPharmaceutical Dosage Form，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，245頁；Block in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷2，335頁；Higuchi等，in Remington′s PharmaceuticalScience，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，301頁)。乳劑經(jīng)常是雙相系統(tǒng)，其包含2個(gè)彼此緊密地混合并分散的不能混合的溶液相。通常，乳劑可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)的形式。當(dāng)水相作為微小液滴細(xì)碎并分散到本體油相中時(shí)，得到的組合物稱作油包水(w/o)乳劑?；蛘?，當(dāng)油相作為微小液滴細(xì)碎并分散到本體水相中時(shí)，得到的組合物稱作水包油(o/w)乳劑。除了分散相和活性藥物外，乳劑可以含有其它組分，其可以作為在水相、油相中的溶液，或者其自身作為分開的相。需要時(shí)，在乳劑中還可以存在藥物賦形劑例如乳化劑、穩(wěn)定劑、染料和抗氧化劑。藥物乳劑還可以是含有超過2個(gè)相的多重乳劑，例如，油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳劑的情況。這樣的復(fù)合制劑經(jīng)常會(huì)提供簡(jiǎn)單的兩相乳劑所沒有的某些優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)多重乳劑中的o/w乳劑的各油滴還包有小水滴時(shí)，該多重乳劑形成W/O/W乳劑。同樣地，在油相中穩(wěn)定化的水滴中包封的油滴的系統(tǒng)，構(gòu)成o/w/o乳劑。
乳劑的特征在于較小或沒有熱力學(xué)穩(wěn)定性。通常，乳劑的分散相或不連續(xù)相較好地分散在外相或連續(xù)相中，并借助于乳化劑或制劑的粘度維持在該狀態(tài)。乳劑的每個(gè)相都可以是半固體或固體，如乳劑-類型的軟膏基質(zhì)和霜?jiǎng)┑那樾?。穩(wěn)定乳劑的其它方法需要使用乳化劑，其可以混合在乳劑的任意相中。乳化劑可以寬泛地分成4類合成的表面活性劑、天然存在的乳化劑、吸附基質(zhì)和細(xì)分散的固體(Idson，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷1，199頁)。
合成的表面活性劑也稱作表面活性劑，在乳劑的配制中有廣泛應(yīng)用，已經(jīng)記載在文獻(xiàn)(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，285頁；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，卷1，199頁)。表面活性劑典型地是兩親的，且含有親水的和疏水的部分。已經(jīng)將表面活性劑的親水性和疏水性的比率定義為親水性/親脂性比(HLB)，它是在制劑制備過程中分類和選擇表面活性劑的評(píng)價(jià)工具。根據(jù)親水基團(tuán)的性質(zhì)，可以將表面活性劑分成不同的類非離子的、陰離子的、陽離子的和兩性的(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，285頁)。
在乳劑制劑中使用的天然存在的乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂和阿拉伯膠。吸附基質(zhì)具有親水性，所以它們可以吸收水、形成w/o乳劑，并保留它們的半固體稠度，例如無水的羊毛脂和親水性凡士林。細(xì)碎的固體還已經(jīng)被用作良好乳化劑，特別是與表面活性劑相組合和在粘性制品中。它們包括極性無機(jī)固體，例如重金屬氫氧化物、不溶漲的粘土例如膨潤(rùn)土、綠坡縷石、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫石、膠體硅酸鋁和膠體硅酸鋁鎂、顏料和非極性固體例如碳或三硬脂酸甘油酯。
在乳劑制劑中還包括許多種類的非乳化物，它們有助于乳劑的性質(zhì)。這包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、濕潤(rùn)劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，335頁；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，199頁)。
親水膠體或水膠體包括天然存在的樹膠和合成的聚合物例如多糖(例如，阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、卡拉膠、瓜耳膠、刺梧桐樹膠和黃芪膠)、纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)、和合成的聚合物(例如，碳聚物、纖維素醚和羧乙烯基聚合物)。它們?cè)谒蟹稚⒒蚺蛎洠纬赡z體溶液，其通過圍繞著分散相的液滴形成強(qiáng)界面膜和通過增加外相的粘度來穩(wěn)定乳劑。
由于乳劑經(jīng)常含有許多成分，例如碳水化合物、蛋白、甾醇和磷脂，它們會(huì)容易地支持微生物的生長(zhǎng)，所以這些制劑經(jīng)常含有防腐劑。經(jīng)常在乳劑制劑中使用的防腐劑包括羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、季銨鹽、苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸酯和硼酸，還經(jīng)常向乳劑制劑中加入抗氧化劑，以預(yù)防制劑的變質(zhì)。使用的抗氧化劑可以是自由基清除劑，例如生育酚、alkylgallates、丁基化的羥基茴香醚、丁基化的羥基甲苯，或還原劑例如抗壞血酸和偏亞硫酸氫鈉，和抗氧化劑協(xié)同劑例如檸檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通過皮膚的、經(jīng)口的和腸胃外的途徑應(yīng)用乳劑制劑和制備它們的方法已經(jīng)記載在文獻(xiàn)(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.199)。已經(jīng)廣泛地使用了經(jīng)口輸送的乳劑制劑，原因在于該制劑的方便、吸收和生物利用度方面的功效。(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.245；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，P.199)。礦物油基質(zhì)的緩瀉藥、油溶性的維生素和高脂肪營(yíng)養(yǎng)制品屬于已經(jīng)經(jīng)常作為o/w乳劑經(jīng)口地施用的物質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸的組合物是制成微乳。微乳可以定義為水、油和兩親分子的系統(tǒng)，其是單一的光學(xué)各向同性的和熱力學(xué)穩(wěn)定的液體溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.245)。典型地，微乳是如下制備的系統(tǒng)首先將油分散到水性表面活性劑溶液中，然后加入足夠量的第四組分(通常是中等鏈長(zhǎng)度的醇)，形成透明系統(tǒng)。因此，還已經(jīng)將微乳描述為2個(gè)不能混合液體的熱力學(xué)穩(wěn)定的、各向同性的澄清分散系，其通過表面活性分子的界面膜穩(wěn)定化(Leung和Shah，inControlled Release of DrugsPolymers and Aggregate Systems，Rosoff，M.，編，1989，VCH Publisher，New York，頁185-215)。通常通過3～5種組分的組合制備微乳，它們包括油、水、表面活性劑、輔助表面活性劑和電解質(zhì)。微乳是油包水(w/o)還是水包油(o/w)類型取決于使用的油和表面活性劑的性質(zhì)和表面活性劑分子的極性頭和烴尾的結(jié)構(gòu)和幾何包裝(Schott，in Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.271)。
已經(jīng)廣泛地研究了利用相圖的現(xiàn)象學(xué)方法，并且可以產(chǎn)生了關(guān)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員如何制備微乳的全面理論(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷1，p.245；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，卷1，p.335)。與常規(guī)乳劑相比，微乳的優(yōu)點(diǎn)是能將水不溶性的藥物溶解到同時(shí)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的液滴制劑中。
在微乳的制備中使用的表面活性劑包括但不限于離子表面活性劑、非離子表面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油一月桂酸酯(ML31O)、四甘油一油酸酯(MO310)、六甘油一油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油一油酸酯(MO750)、decaglycerol sequioleate(SO750)、十甘油十油酸酯(DA0750)，它們單獨(dú)使用或與輔助表面活性劑組合使用。輔助表面活性劑通常是短鏈醇，例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，其可以通過穿透表面活性劑膜并隨后建立無序膜(因?yàn)樵诒砻婊钚詣┓肿又挟a(chǎn)生了空隙空間)來增強(qiáng)界面的流動(dòng)性。但是，可以不使用輔助表面活性劑來制備微乳，無醇的自乳化微乳系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。水相可以典型地是(但不限于)水、藥物的水性溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇，和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于下述物質(zhì)，例如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中等鏈(C8-C12)單-、二-和三甘油酯、聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、飽和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
從藥物溶解和增強(qiáng)藥物的吸附的角度看，微乳是特別令人感興趣的。已經(jīng)建議用基于脂質(zhì)的微乳(o/w和w/o)來增強(qiáng)經(jīng)口的藥物(包括肽)的生物利用度(Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11，1385-1390；Ritschet，Metli.Find.Exp.Clin.Pharmacol，1993，13，205)。微乳提供的優(yōu)點(diǎn)是改善了藥物溶解、防止藥物被酶水解、可能增強(qiáng)藥物吸收(因?yàn)楸砻婊钚詣┱T導(dǎo)的膜流動(dòng)性和滲透性的變化)、容易制備、容易以固體劑型口服施用、提高了臨床效力和降低了毒性(Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11，1385；Ho等，J.Pharm.Set，1996，85，138-143)。當(dāng)在環(huán)境溫度將它們的組分混合到一起時(shí)，常常會(huì)自然地形成微乳。當(dāng)制備熱不穩(wěn)定的藥物、肽或寡核苷酸時(shí)，這是特別有利的。在化妝品和藥物應(yīng)用領(lǐng)域，還已經(jīng)將微乳有效地用于透皮輸送活性組分。預(yù)期本發(fā)明的微乳組合物和制劑將會(huì)有利于增強(qiáng)寡核苷酸和核酸從胃腸道的全身吸收，并改善寡核苷酸和核酸在胃腸道、陰道、口腔和其它給藥區(qū)域中的局部的細(xì)胞攝入。
本發(fā)明的微乳還可以含有其它組分和添加劑，例如山梨聚糖單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和穿透增強(qiáng)劑，以改善制劑的性質(zhì)和增強(qiáng)本發(fā)明的寡核苷酸和核酸的吸收。在本發(fā)明的微乳中使用的穿透增強(qiáng)劑可以分為5大類中的一種表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。
脂質(zhì)體除了微乳以外，還有許多有組織的表面活性劑結(jié)構(gòu)，人們已經(jīng)對(duì)它們進(jìn)行了研究并用于藥物制劑。這包括單分子層、膠束、雙分子層和泡囊。泡囊能提供特異性，并延長(zhǎng)藥物輸送的作用時(shí)間。因而，如本文所使用的，術(shù)語“脂質(zhì)體”是指由排列成一個(gè)或多個(gè)球形雙分子層的兩親脂質(zhì)組成的泡囊，即脂質(zhì)體是單層的或多層的泡囊，其具有從親脂性物質(zhì)和水性內(nèi)部形成的膜。水性部分典型地含有要輸送的組合物。為了穿過完整的哺乳動(dòng)物皮膚，脂質(zhì)泡囊必須在合適的透皮梯度的影響下穿過一系列的細(xì)孔，每個(gè)的直徑小于50nm。因此，理想的是使用脂質(zhì)體，其是高變形的且能穿過這樣的細(xì)孔。脂質(zhì)體的其它因素包括脂表面電荷和脂質(zhì)體的水體積。
脂質(zhì)體的其它優(yōu)點(diǎn)包括從天然磷脂得到的脂質(zhì)體是生物相容的和可生物降解的；脂質(zhì)體可以包括廣范圍的水和脂溶的藥物；脂質(zhì)體可以防止包封在其內(nèi)腔中的藥物的代謝和降解(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(編)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，卷1，p.245)。
關(guān)于局部施用，已經(jīng)證實(shí)脂質(zhì)體與其它制劑相比具有幾項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括減少了與施用藥物的高全身吸收有關(guān)的副作用、增加了施用的藥物在目標(biāo)靶物的積累、和將廣范圍的藥物(親水的和疏水的)輸送進(jìn)皮膚中的能力。包括鎮(zhèn)痛藥、抗體、激素和高分子量的DNA在內(nèi)的化合物已經(jīng)施用給皮膚，通常會(huì)導(dǎo)致上表皮的靶向。
脂質(zhì)體可以分為2大類。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，其與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。帶正電荷的DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物能結(jié)合到帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面，并內(nèi)含到內(nèi)體中。由于內(nèi)體中的酸性pH，脂質(zhì)體破裂，釋放出它們的內(nèi)含物到細(xì)胞質(zhì)中(Wang等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。
pH-敏感的或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體會(huì)捕獲DNA，而不是與其絡(luò)合。由于DNA和脂質(zhì)帶有相似的電荷，它們相互排斥而不是形成復(fù)合物。DNA因而被捕獲到這些脂質(zhì)體的水性內(nèi)部。已經(jīng)使用了pH-敏感的脂質(zhì)體，例如，用于將能編碼胸腺嘧啶核苷激酶基因的DNA輸送進(jìn)培養(yǎng)物中的細(xì)胞單層(Zhou等，Journal of Controlled Relase 1992，19，269-274)。
一類主要的脂質(zhì)體組合物包含磷脂，除了天然產(chǎn)生的磷脂?；憠A之外。中性的脂質(zhì)體組合物例如可以從二肉豆蔻?；字；憠A(DMPC)或二棕櫚?；字；憠A(DPPC)形成。陰離子脂質(zhì)體組合物通常從二肉豆蔻酰基磷脂酰基甘油形成，而陰離子融合脂質(zhì)體主要是從二油酰磷脂?；掖及?DOPE)形成。其它類型的脂質(zhì)體組合物是從磷脂?；憠A(PC)、例如大豆PC和蛋PC形成。另一類是從磷脂和/或磷脂?；憠A和/或膽固醇的混合物形成。
幾項(xiàng)研究已經(jīng)評(píng)價(jià)了脂質(zhì)體藥物制劑向皮膚的局部輸送。將含有干擾素的脂質(zhì)體應(yīng)用到豚鼠皮膚上，會(huì)減輕皮膚皰疹潰瘍，而通過其它方式(例如作為溶液或乳劑)輸送干擾素則是無效的(Weiner等，Journal of DrugTargeting，1992，2，405-410)。而且，另一項(xiàng)研究測(cè)試了作為脂質(zhì)體制劑的一部分施用的干擾素對(duì)使用水性系統(tǒng)的干擾素的施用的功效，結(jié)論是，脂質(zhì)體制劑比水性施用更優(yōu)越(du Plessis等，Antiviral Research，1992，18，259-265)。
還已經(jīng)測(cè)試了非離子的脂質(zhì)體系統(tǒng)，以確定它們?cè)谙蚱つw輸送藥物的效用，特別是含有非離子的表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng)。使用含有NovasoneTMI(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非離子的脂質(zhì)體制劑來將環(huán)孢素-A輸送進(jìn)小鼠真皮中。結(jié)果表面，這樣的非離子的脂質(zhì)體系統(tǒng)能有效地促進(jìn)環(huán)孢素-A在不同的皮膚層中的沉積(Hu等S.T.P.Pharma.SCI.，1994，4，6，466)。
脂質(zhì)體還包括“空間上穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，如本文所使用的，該術(shù)語是指含有一種或多種特殊脂質(zhì)的脂質(zhì)體，當(dāng)混入脂質(zhì)體中時(shí)，其會(huì)導(dǎo)致與沒有這種特殊脂質(zhì)的脂質(zhì)體相比提高的循環(huán)壽命?？臻g上穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實(shí)例是這樣的，其中脂質(zhì)體的形成泡囊的脂質(zhì)部分的一部分包括一種或多種糖脂，例如單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，或源自一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。不受任何具體理論的限制，相信對(duì)于含有神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂或源自PEG的脂質(zhì)的空間上穩(wěn)定的脂質(zhì)體，這些空間上穩(wěn)定的脂質(zhì)體的循環(huán)半衰期的增加是由于減少了向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞中的攝入(Allen等，F(xiàn)EBS Lett.，1987，223，42；Wu等，Cancer Research，1993，53，3765)。
包含一種或多種糖脂的各種脂質(zhì)體已經(jīng)報(bào)道在Papahadjopoulos等、Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64(單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，半乳糖腦苷硫酸酯和磷脂?；〈?；Gabizon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1988，85，6949，；Allen等，美國(guó)專利號(hào)4,837,028和國(guó)際申請(qǐng)公開WO88/04924(鞘磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂GM1或半乳糖腦苷硫酸酯)；Webb等，美國(guó)專利號(hào)5,543,152(鞘磷脂)；Lim等，WO 97/13499(1，2-sn-二肉豆蔻?；字；憠A)。
包含用一種或多種親水聚合物衍生的脂質(zhì)的脂質(zhì)體及其制備方法記載在，例如，Sunamoto等，Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2778(非離子去污劑，2C1215G，其含有PEG部分)；Illum等，F(xiàn)EBS Lett.，1984，167，79(含有聚二醇的聚苯乙烯顆粒的親水涂層)；Sears，美國(guó)專利號(hào)4,426,330和4,534,899(通過連接聚亞烷基二醇(例如PEG)的羧基修飾的合成的磷脂)；Klibanov等，F(xiàn)EBS Lett.，1990，268，235(用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰基乙醇胺(PE))；Blume等，Biochimica et Biophysica Acta，1990，1029，91(PEG-衍生的磷脂，例如DSPE-PEG，從二硬脂酰磷脂酰基乙醇胺(DSPE)和PEG的組合形成)；Fisher，歐洲專利號(hào)EP 0 445 131 B1和WO90/04384(在脂質(zhì)體外表面共價(jià)的結(jié)合的PEG部分)；Woodle等，美國(guó)專利號(hào)5,013,556和5,356,633，和Martin等，美國(guó)專利號(hào)5,213,804和歐洲專利號(hào)EP 0 496 813 B1(含有1-20摩爾百分比的用PEG衍生的PE的脂質(zhì)體組合物)；Martin等，WO 91/05545和美國(guó)專利號(hào)5,225,212和Zalipsky等，WO94/20073(含有許多其它脂質(zhì)-聚合物結(jié)合物的脂質(zhì)體)；Choi等，WO96/10391(包括PEG-修飾的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)的脂質(zhì)體)；Miyazaki等，美國(guó)專利號(hào)5,540,935，和Tagawa等，美國(guó)專利號(hào)5,556,948(含有PEG的脂質(zhì)體，其可以進(jìn)一步用在它們表面的功能性部分衍生)。
包含核酸的脂質(zhì)體已經(jīng)記載在，例如，Thierry等，WO 96/40062(將高分子量的核酸包封到脂質(zhì)體中的方法)；Tagawa等，美國(guó)專利號(hào)5,264,221(含有RNA的結(jié)合蛋白的脂質(zhì)體)；Rahman等，美國(guó)專利號(hào)5,665,710(將寡脫氧核苷酸包封到脂質(zhì)體中的方法)；Love等，WO 97/04787(包含反義寡核苷酸的脂質(zhì)體)。
另一種類型的脂質(zhì)體、傳遞體(transfersomes)是可高度變形的脂質(zhì)聚集體，它用作藥物輸送工具是有吸引力的(Cevc等，1998，BiochimBiophys Acta.1368(2)201-15)?？梢詫鬟f體稱作脂質(zhì)液體，它們可高度變形，所以可以穿過比液滴小的孔。傳遞體能適應(yīng)使用它們的環(huán)境，例如，它們是形狀適應(yīng)的、自修復(fù)、經(jīng)常不分段地接近它們的靶位和經(jīng)常自動(dòng)裝載?？梢灾谱鱾鬟f體，例如，通過向標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體組合物添加表面邊界活性劑，通常是表面活性劑。
表面活性劑表面活性劑廣泛地用于制劑，例如乳劑(包括微乳)和脂質(zhì)體。對(duì)許多不同類型的表面活性劑(天然的和合成的)的性質(zhì)進(jìn)行分類和排列的最常見方法是通過使用親水性/親脂性比(HLB)。親水基團(tuán)(也稱作“頭”)的性質(zhì)提供了為在制劑中使用的不同表面活性劑分類的最有用的方式(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285)。
如果表面活性劑分子不是離子化的，將其歸類為非離子的表面活性劑。非離子的表面活性劑廣泛地用于藥物和化妝品產(chǎn)品中，在寬范圍的pH值是可用的，隨結(jié)構(gòu)不同，典型的HLB值從2至約18。非離子的表面活性劑包含非離子的酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基化的酯；和非離子的烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化的醇和乙氧基化的/丙氧基化的嵌段聚合物也包括在該類中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子的表面活性劑類中最常用的成員。
當(dāng)溶解或分散在水中時(shí)帶有負(fù)電荷的表面活性劑分子稱為陰離子型的。陰離子表面活性劑包括羧化物例如肥皂、?；轷；?、氨基酸的酰基酰胺，硫酸酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化的烷基硫酸酯，磺酸酯例如烷基苯磺酸酯、?；惲虼蛩狨?、?；鹿鹚狨ズ突腔晁狨?，和磷酸酯。烷基硫酸酯和肥皂是最常用的陰離子表面活性劑。
當(dāng)溶解或分散在水中時(shí)帶有正電荷的表面活性劑分子稱為陽離子型的。陽離子表面活性劑包含季銨鹽和乙氧基化的胺，季銨鹽是最常用的。
可以帶有正電荷或負(fù)電荷的表面活性劑分子稱為兩性的。兩性的表面活性劑包含丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜堿和磷脂。
表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的應(yīng)用已經(jīng)記載在Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285。
穿透增強(qiáng)劑在有些實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑在組合物中、或與其一起使用，以增加向動(dòng)物皮膚的核酸(特別是寡核苷酸)的輸送。大多數(shù)藥物是以離子化的和非離子化的形式存在于溶液中。但是，通常只有脂溶的或親脂的藥物能容易地穿過細(xì)胞膜。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果用穿透增強(qiáng)劑處理要穿過的細(xì)胞膜，甚至非親脂的藥物也可以穿過該膜。除了輔助非親脂的藥物穿過細(xì)胞膜的擴(kuò)散外，穿透增強(qiáng)劑還能增強(qiáng)親脂藥物滲透性。
穿透增強(qiáng)劑可以歸類為5大類之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，p.92)。在下面更詳細(xì)地描述了每一類穿透增強(qiáng)劑。
表面活性劑與本發(fā)明有關(guān)，表面活性劑是化學(xué)實(shí)體，當(dāng)溶解到水性溶液中時(shí)，它能減少溶液的表面張力或水性溶液和其它液體之間的界面張力，結(jié)果增強(qiáng)了穿過粘膜的寡核苷酸吸收。這些穿透增強(qiáng)劑包括例如十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚(Lee等，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier System，1991，p.92)；和全氟化合物乳劑，例如FC-43.Takahashi等，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)，每一篇全文結(jié)合于此作為參考。
脂肪酸能作為穿透增強(qiáng)劑的各種脂肪酸和它們的衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯(1-單油酰-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、?；鈮A、?；憠A、它們的C1-10烷基酯(例如甲基、異丙基和叔丁基)和它們的單-和二甘油酸酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯等)(Lee等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier System，1991，p.92；Muranishi，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier System，1990，7，1-33；EI Hariri等，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)，每一篇全文結(jié)合于此作為參考。
膽汁鹽膽汁的生理作用包括促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38 inGoodman和Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutic，第9版，Hardman等編，Mcgraw-Hill，New York，1996，pp.934-935)。各種天然的膽汁鹽和它們的合成的衍生物作為穿透增強(qiáng)劑。因此，術(shù)語″膽汁鹽″包括任何天然存在的膽汁組分以及它們的任何合成衍生物。本發(fā)明的膽汁鹽包括例如膽酸(或其藥學(xué)上可接受的鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、葡糖膽酸(葡糖膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、甘氨脫氧膽酸(甘氨脫氧膽酸鈉)、?；悄懰?牛磺膽酸鈉)、牛磺脫氧膽酸(?；敲撗跄懰徕c)、鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉)、烏索脫氧膽酸(UDCA)、牛磺-24，25-二氫-梭鏈孢酸鈉(STDHF)、甘氨二氫梭鏈孢酸鈉和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier System，1991，92頁；Swinyard，39章InRemington′s Pharmaceutical Science，18版，Gennaro，編，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，1990，782-783頁；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier System，1990，7，1-33；Yamamoto等.，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita等，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。
螯合劑在上下文中，可以認(rèn)為螯合劑是能從溶液中除去金屬離子(通過與其形成絡(luò)合物)的化合物，結(jié)果是增強(qiáng)了寡核苷酸透過粘膜的吸收。關(guān)于它們作為本發(fā)明的穿透增強(qiáng)劑的應(yīng)用，螯合劑還具有作為脫氧核糖核酸酶抑制劑的附加優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)表征的DNA核酸酶的催化需要二價(jià)的金屬離子，因而會(huì)被螯合劑抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339)。沒有限制，螯合劑包括乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽和高香蘭酸鹽(homovanilate))、膠原的N-酰基衍生物、laureth-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System，1991，92頁；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur等，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。
非螯合非表面活性劑如本文所使用的，非螯合非表面活性劑的穿透增強(qiáng)化合物是這樣的化合物，其未表現(xiàn)出顯著的螯合劑或表面活性劑活性，但是仍然能增加寡核苷酸透過消化器官粘膜的吸收(Muranishi，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。這樣的穿透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括不飽和的環(huán)脲、1-烷基-和1-鏈烯基氮雜環(huán)-烷酮衍生物(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，第92頁)；和非甾族化合物的抗炎劑，例如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。
還可以向本發(fā)明的藥物和其它組合物和制劑中加入能增加細(xì)胞水平的寡核苷酸攝入的試劑。例如，還已知陽離子脂質(zhì)例如脂轉(zhuǎn)染試劑(Junichi等，美國(guó)專利號(hào)5,705,188)、陽離子甘油衍生物和聚陽離子分子例如聚賴氨酸(Lollo等，PCT申請(qǐng)WO 97/30731)能增強(qiáng)寡核苷酸的細(xì)胞攝入。
可以利用其它試劑來增強(qiáng)施用的核酸的穿透，包括二醇例如乙二醇和丙二醇，吡咯例如2-吡咯、氮酮(azones)和萜類例如苧烯和薄荷酮。
載體本發(fā)明的某些組合物還在制劑中含有載體化合物。如本文所使用的，“載體化合物”或“載體”是指核酸或其類似物，其是惰性的(即本身不具有生物活性)，但是在體內(nèi)過程中被認(rèn)為是核酸，其能降低具有生物活性的核酸的生物利用度，例如通過降解生物活性的核酸或促進(jìn)其從循環(huán)中的除去實(shí)現(xiàn)。核酸和載體化合物的共同施用(后一種物質(zhì)經(jīng)常過量)可以實(shí)質(zhì)上減少肝、腎或其它循環(huán)外的貯器中回收的核酸的量。例如，當(dāng)與聚肌苷酸、葡聚糖硫酸酯、polycytidic acid或4-乙酰酰胺基-4’-異硫代氰基-茋-2，2-二磺酸共同施用時(shí)，可以部分地減少硫代磷酸酯寡核苷酸在肝組織中的回收(Miyao等，Antisense Res.Dev.，1995，5，115-121；Takakura等，Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.，1996，6，177-183)，每一篇全文結(jié)合于此作為參考。
賦形劑與載體化合物不同，“藥物載體”或“賦形劑”是藥學(xué)上可接受溶劑、混懸劑或任何其它的藥理學(xué)上惰性的載體，其用于給動(dòng)物輸送一種或多種核酸，典型地是液體或固體。當(dāng)與核酸和特定藥物組合物的其它組分組合時(shí)，參考意欲的給藥方式，通常選擇藥物載體來提供理想的容積、稠度等。典型的藥物載體包含但不限于粘合劑(例如預(yù)膠凝的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如乳糖和其它糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、硅石、膠體二氧化硅、硬脂酸、金屬的硬脂酸鹽、還原的植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(例如淀粉、羥基乙酸淀粉鈉(sodium starch glycotate)等)；和濕潤(rùn)劑(例如十二烷基硫酸鈉等)。
適合于非腸胃外施用、且不會(huì)與核酸發(fā)生有毒反應(yīng)的藥學(xué)上可接受的有機(jī)的或無機(jī)的賦形劑也可以用于制備本發(fā)明的組合物。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
用于核酸的局部施用的制劑可以包含在普通溶劑(例如醇)中的無菌的和非無菌的水性溶液、非水性溶液，或在液體或固體油基質(zhì)中的核酸溶液，所述常規(guī)溶劑例如醇。溶液還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其它的合適的添加劑。可以使用適合于非腸胃外施用、且不會(huì)與核酸發(fā)生有毒反應(yīng)的藥學(xué)上可接受的有機(jī)的或無機(jī)的賦形劑。
其它的藥物組合物組分本組合物還可以含有其它本領(lǐng)域熟知用量的在藥物組合物中常用的組分。因而，例如，組合物可以含有其它的、可相容的藥學(xué)上有活性的物質(zhì)，例如抗癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以含有在物理配制本發(fā)明的組合物的各種劑型中有用的其它物質(zhì)，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。但是，當(dāng)加入了這樣的物質(zhì)時(shí)，它們不應(yīng)當(dāng)不合適地干擾本發(fā)明的組合物組分的生物活性。制劑可以是無菌的，在需要時(shí)可以與助劑混合，例如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、矯味劑和/或芳族物質(zhì)等，它們不與制劑中的核酸發(fā)生有害的相互作用。
水性混懸液可以含有能提高混懸液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖和/或穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了藥物組合物，其含有(a)一種或多種抗病毒的寡核苷酸和(b)一種或多種其它的通過不同機(jī)制發(fā)揮作用的化療劑。
這樣的化療劑的實(shí)例包含但不限于柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素D、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、二氯乙基硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、普卡霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞嘧啶核苷、羥基脲、脫氧考福霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟代尿嘧啶(5-FU)、5-氟代脫氧尿核苷(5-FUdR)、甲氨喋呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉑和己烯雌酚(DES)。一般地參見，TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，1987，1206-1228頁，Berkow等，編，Rahway，NJ。當(dāng)與本發(fā)明的化合物使用時(shí)，這樣的化療劑可以個(gè)別地(例如5-FU和寡核苷酸)、依次地(例如使用5-FU和寡核苷酸一段時(shí)間后再用MTX和寡核苷酸一段時(shí)間)或與一種或多種其它的這樣的化療劑(例如5-EU、MTX和寡核苷酸或5-FU、放療和寡核苷酸)組合使用?？寡姿幇ǖ幌抻诜晴拮寤衔锏目寡姿幒推べ|(zhì)甾類和抗病毒藥，包括但不限于利巴韋林、西多福韋、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷和更昔洛韋，也可以組合在本發(fā)明的組合物中。一般地參見，The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第15版，Berkow等，編，1987，Rahway，NJ.，第2499-2506和46-49頁)。其它的非寡核苷酸化療劑也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩種或多種組合的化合物可以一起或依次地使用。
實(shí)施例實(shí)施例1單純皰疹病毒單純皰疹病毒(HSV)影響相當(dāng)一部分人群。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)ODN或ODN隨機(jī)物能抑制病毒(例如HSV)的感染。通過在VERO細(xì)胞(對(duì)HSV-1(毒株KOS)和HSV-2(毒株MS2)感染敏感)中進(jìn)行的細(xì)胞HSV復(fù)制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與HSV復(fù)制起點(diǎn)互補(bǔ)的單鏈的PS-ODN能抑制HSV-1和HSV-2的復(fù)制。令人驚奇的是，與人(343 ARS)和質(zhì)粒(pBR322/pUC)起點(diǎn)互補(bǔ)的對(duì)照PS-ODN也能抑制病毒的感染性。用隨機(jī)序列PS-ODN和PS-ODN隨機(jī)物的實(shí)驗(yàn)表明，病毒感染的抑制隨著ODN大小的增加而增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)表明，ON是治療性治療病毒感染的有效的抗病毒劑。
發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)為，阻止病毒(例如HHV)傳播的潛在機(jī)制是阻止了其DNA的復(fù)制。鑒于此，將與HSV1和HSV2的復(fù)制起點(diǎn)互補(bǔ)的硫代磷酸酯寡核苷酸(ODN)導(dǎo)入受感染的細(xì)胞。這些ODN會(huì)導(dǎo)致在病毒復(fù)制起點(diǎn)形成DNA三倍體，阻斷必要的反式作用因子和病毒DNA復(fù)制的關(guān)聯(lián)。在本文中描述了這些實(shí)驗(yàn)的意外結(jié)果，它們表明，在實(shí)驗(yàn)范例中，ODN抑制病毒感染的效力隨著它們的大小(長(zhǎng)度)的增加而增加。
HSV-1的抑制在噬斑減少試驗(yàn)(PRA)中檢測(cè)了PS-ODN抑制HSV-1的能力。在MEM(最低必需培養(yǎng)基)+10％胎牛血清(補(bǔ)充了慶大霉素、萬古霉素和兩性霉素B)中，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)無限繁殖的非洲綠猴腎(VERO)細(xì)胞。將細(xì)胞接種到12孔平板中，其密度是在生長(zhǎng)4天后能生成匯合的細(xì)胞單層。達(dá)到匯合后，將培養(yǎng)基換成僅含有5％血清+如上所述的補(bǔ)充物，并在有測(cè)試化合物存在的情況下將細(xì)胞暴露于HSV-1(菌株KOS，共約40-60PFU)中90分鐘。病毒暴露后，將培養(yǎng)基替換為新的“覆蓋”培養(yǎng)基，其含有5％血清、1％人免疫球蛋白、如上所述的補(bǔ)充物和測(cè)試化合物。感染后3-4天，對(duì)受感染的培養(yǎng)物進(jìn)行福爾馬林固定和甲苯紫(cresylviolet)染色，并進(jìn)行噬斑計(jì)數(shù)。
所有的ON(除另有說明外)都是在University of Calgary Core DNAServices lab合成的。ON(見表1)是在1或15μmol的合成規(guī)模制備的，并在50cm Sephadex G-25柱上去保護(hù)和脫鹽。通過UV成影凝膠電泳分析得到的ON，經(jīng)測(cè)定含有全長(zhǎng)的約95％、n-1和n-2寡聚物和至多5％的短寡聚物種類(假定它們具有隨機(jī)缺失)。為了隨機(jī)寡聚物的合成，將等摩爾量的腺嘌呤、鳥苷、胞嘧啶和胸苷amidite混合到一起，以使在合成過程中在ODN的每個(gè)位置整合的隨機(jī)性最大。
為了測(cè)試PS-ODN是否能抑制HSV-1，在HSV-1 PRA中測(cè)試了REP1001、2001和3007。預(yù)期只有REP 2001將會(huì)表現(xiàn)出任意活性，因?yàn)樵揚(yáng)S-ODN指向HSV的復(fù)制起點(diǎn)(其它的2種是指向人和質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn))。但是，所有的3種PS-ODN都表現(xiàn)出抗-HSV-1活性(見圖1)。而且，抗-HSV-1作用的效力取決于寡聚物的大小(見圖2)。
為了證實(shí)PS-ODN的抗-HSV-1活性的大小依賴性和相對(duì)的序列獨(dú)立性，我們?cè)囼?yàn)了不同大小的PS-ODN(REP 2002、2003、2004、2005和2006)。通過將每個(gè)堿基合成為″擺動(dòng)″(N)，使每種PS-ODN實(shí)際上代表一群具有相同大小的不同隨機(jī)序列，為這些PS-ODN提供關(guān)于序列特異性作用的惰性，這些PS-ODN稱作″隨機(jī)物″。當(dāng)在HSV-1 PRA中測(cè)試這些寡聚物時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，10個(gè)或更少堿基的寡聚物沒有可檢測(cè)出的抗-HSV-1活性，但是隨著PS-ODN的大小增加到10個(gè)堿基以上，效力也增加(IC50減少，見圖3和4)。我們還注意到，超過20個(gè)堿基的PS-ODN的IC50值明顯低于臨床上接受的抗-HSV-1藥物-無環(huán)鳥苷(見圖4)。
為了更好地定義PS-ODN的抗-HSV-1活性的有效大小范圍，我們測(cè)試了覆蓋較寬的大小范圍(10～120個(gè)堿基)的PS-ODN隨機(jī)物(見圖5和6)。我們發(fā)現(xiàn)，12個(gè)和更大的堿基的寡聚物具有可檢測(cè)出的抗-HSV-1活性，對(duì)HSV-1的效力也隨著增加的PS-ODN隨機(jī)物的長(zhǎng)度(至少高達(dá)120個(gè)堿基)而增加。但是，在超過40個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物中，每增加堿基大小，效力的增加更小(見圖7)。
為了對(duì)比非PS-ODN隨機(jī)物、隨機(jī)序列PS-ODN和HSV-1特異性序列PS-ODN的效力，我們?cè)囼?yàn)了在大小為10、20和40個(gè)堿基的ODN中的這3種類型的修飾(見圖8和9)。未修飾的ODN隨機(jī)物在測(cè)試的大小沒有可檢測(cè)的抗-HSV-1活性(見圖8a-c)。隨機(jī)序列和特異性的HSV-1序列PS-ODN都表現(xiàn)出大小依賴性的抗-HSV-1活性(對(duì)于這些修飾的任一個(gè)，在10個(gè)堿基中沒有觀察到活性，見圖8d和g)。隨機(jī)序列、特異性的HSV-1序列和隨機(jī)物PS-ODN的對(duì)比(見圖10)表明，對(duì)于長(zhǎng)度為20個(gè)堿基的PS-ODN，特異性的HSV-1序列具有增強(qiáng)的抗-HSV-1活性，但是在40個(gè)堿基的長(zhǎng)度，隨機(jī)物、隨機(jī)序列或特異性的HSV-1序列的所有修飾對(duì)HSV-1的有效性相同。
據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道的PS-ODN對(duì)HSV-1的IC50低至0.059μM和0.043μM。
實(shí)施例2HSV-2的抑制在PRA中檢測(cè)了PS-ODN抑制HSV-2的能力。在MEM+10％胎牛血清(補(bǔ)充了慶大霉素、萬古霉素和兩性霉素B)中，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)無限繁殖的非洲綠猴腎(VERO)細(xì)胞。將細(xì)胞接種到12孔平板中，其密度是在生長(zhǎng)4天后能生成匯合的細(xì)胞單層。達(dá)到匯合后，將培養(yǎng)基換成僅含有5％血清+如上所述的補(bǔ)充物，并在有測(cè)試化合物存在的情況下將細(xì)胞暴露于HSV-2(菌株MS2，共約40-60PFU)中90分鐘。病毒暴露后，將培養(yǎng)基替換為新的“覆蓋”培養(yǎng)基，其含有5％血清、1％人免疫球蛋白、如上所述的補(bǔ)充物和測(cè)試化合物。感染后3-4天，對(duì)受感染的培養(yǎng)物進(jìn)行福爾馬林固定和甲苯紫染色，并進(jìn)行噬斑計(jì)數(shù)。
為了測(cè)試PS-ODN是否能抑制HSV-2，在HSV-2 PRA中測(cè)試了REP1001、2001和3007。預(yù)期只有REP 2001將會(huì)表現(xiàn)出任意活性，因?yàn)樵揚(yáng)S-ODN指向HSV-1/2的復(fù)制起點(diǎn)(其它的2種是指向人和質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn))。但是，所有的3種PS-ODN都表現(xiàn)出抗-HSV-2活性(見圖12)。而且，抗-HSV-2作用的效力依賴于PS-ODN的大小且獨(dú)立于序列(見圖13)。
為了證實(shí)PS-ODN的抗-HSV-2活性的大小依賴性和序列獨(dú)立性，我們?cè)囼?yàn)了不同大小的PS-ODN(REP 2001、2002、2003、2004、2005和2006)。通過將每個(gè)堿基合成為″擺動(dòng)″(N)，使每種PS-ODN實(shí)際上代表一群具有相同大小的不同隨機(jī)序列，為這些PS-ODN提供關(guān)于序列特異性作用的惰性，這些PS-ODN稱作″隨機(jī)物″。當(dāng)在HSV-2 PRA中測(cè)試這些PS-ODN時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，10個(gè)或更少堿基的PS-ODN沒有可檢測(cè)出的抗-HSV-2活性，但是隨著PS-ODN的大小增加到10個(gè)堿基以上，效力也增加(IC50減少，見圖14和15)。我們還注意到，超過20個(gè)堿基的PS-ODN的IC50值明顯低于臨床上接受的抗-HSV-2藥物-無環(huán)鳥苷TM(見圖15)。
據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道的PS-ODN對(duì)HSV-2的IC50低至0.012μM。
為了確定非特異性的序列組合物是否對(duì)ON的抗病毒活性有影響，測(cè)試了幾種大小等同但是在其序列組成有差別的PS-ODN在HSV-1 PRA中的抗-HSV-1活性。測(cè)試的PS-ODN是REP 2006(N20)、REP 2028(G40)、REP 2029(A40)、REP 2030(T40)和REP 2031(C40)。從HSV-1 PRA得到的IC50值(見圖37)表明，REP 2006(N40)顯然是所有的測(cè)試序列中最有活性的，而REP 2029(A40)則是最少活性的。我們還注意到，所有其它的PS-ODN的活性都明顯不如N40，它們按照功效的排列次序是N40＞C40＞T40＞A40＞＞G40。
我們還測(cè)試了具有不同的序列成(含有2種不同的核苷酸)的不同PS ODN的功效(見圖37b)。PS-ODN隨機(jī)物(REP 2006)對(duì)HSV-1的功效明顯比AC20(REP 2055)、TC20(REP 2056)或AG20(REP 2057)高，它們的功效排列如下N40＞AG＞AC＞TC。該數(shù)據(jù)表明，盡管抗病毒作用是非序列互補(bǔ)的，某些非特異性的序列組成(即C40和N40)具有最有效的抗病毒活性。我們認(rèn)為可以通過下述事實(shí)解釋該現(xiàn)象，即雖然保留了固有的蛋白結(jié)合能力，C40、A40、T40和G40等序列高親和力地結(jié)合更少的病毒蛋白，可能是由于在這些序列中形成了一些限制性的三級(jí)結(jié)構(gòu)。另一方面，由于N40的隨機(jī)性質(zhì)，限制了其高親和力地結(jié)合廣范圍的抗病毒蛋白的能力，這有助于其強(qiáng)大的抗病毒活性。
實(shí)施例3CMV抑制在噬斑減少試驗(yàn)(PRA)中檢測(cè)了PS-ODN抑制CMV的能力。該試驗(yàn)與用于測(cè)試抗HSV-1和抗-HSV-2的試驗(yàn)相同，只是用CMV(菌株AD169)作為病毒接種物，用人成纖維細(xì)胞作為細(xì)胞宿主。
為了測(cè)試PS-ODN的抗-CMV活性的大小依賴性和序列獨(dú)立性，我們?cè)囼?yàn)了不同大小的PS-ODN隨機(jī)物(見圖16a、b)。當(dāng)在CMV PRA中測(cè)試這些PS-ODN時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著PS-ODN大小的增加，效力也增加(IC50減少，見圖16c)。
為了更清楚地說明PS-ODN的抗CMV活性的有效大小范圍，我們測(cè)試了覆蓋較寬大小范圍(10～80個(gè)堿基)的PS-ODN隨機(jī)物。我們還包含了幾種臨床上接受的小分子CMV治療劑(丙氧鳥苷、膦甲酸和西多福韋)和2種市售的CMV視網(wǎng)膜炎的反義治療劑(福米韋生TM；市場(chǎng)上買到的和由University of Calgary合成)(見圖17)。我們發(fā)現(xiàn)，盡管增加的PS-ODN隨機(jī)物大小導(dǎo)致增強(qiáng)的功效，該作用在40個(gè)堿基時(shí)飽和(見圖18)。而且，20、40和80個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物都明顯比測(cè)試的任何小分子治療劑更有效(圖17)。另外，40和80個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物比福米韋生TM更有效。
據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道的PS-ODN對(duì)CMV的IC50低至0.067μM。
實(shí)施例4HIV-1的抑制通過2個(gè)不同的試驗(yàn)檢測(cè)了PS-ODN隨機(jī)物抑制HIV-1的能力細(xì)胞病變作用(CPE)通過使用MTT染料報(bào)告細(xì)胞代謝的程度，監(jiān)測(cè)細(xì)胞病變作用。在補(bǔ)充了抗生素的MEM+10％胎牛血清中，在37℃和5％CO2中培養(yǎng)無限繁殖的人淋巴細(xì)胞(MT4)細(xì)胞。將細(xì)胞接種到96孔平板的含有合適的測(cè)試化合物的培養(yǎng)基中，孵育2小時(shí)。在用測(cè)試化合物預(yù)孵育后，向孔中加入HIV-1(毒株NL4-3)(0.0002 TCID50/細(xì)胞)。另外孵育6天后，通過MTT轉(zhuǎn)化監(jiān)視CPE。在不接種病毒的情況下，通過孵育藥物6天來檢測(cè)細(xì)胞毒性。為了將MTT吸收值轉(zhuǎn)化成％存活率，將未受感染、未處理的細(xì)胞的吸收值設(shè)定為100％，將受感染、未處理的細(xì)胞的吸收值設(shè)定為0％。
復(fù)制試驗(yàn)(RA)在無限繁殖的人胚腎(293A)細(xì)胞中監(jiān)測(cè)了HIV的復(fù)制能力。這些細(xì)胞是用2種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的。一種質(zhì)粒含有具有被熒光素酶表達(dá)盒中斷的env基因的重組的野生型HIV-1基因組(NL4-3)(鑒別為毒株CNDO)，另一種質(zhì)粒含有來自鼠白血病病毒(MLV)的env基因。這兩種質(zhì)粒提供了所有的蛋白因子，它們翻譯后生成成熟的嵌合病毒，其含有除了從MLV env基因翻譯生成的蛋白產(chǎn)物之外的所有HIV-1組分。從這些細(xì)胞生產(chǎn)的病毒粒子是感染性的和可復(fù)制的，但是不能生產(chǎn)感染性病毒粒子的下一代，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙賓nv基因產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將這些細(xì)胞胰蛋白酶化，涂布到96孔平板中。細(xì)胞已經(jīng)粘附后，洗滌培養(yǎng)基，并替換為含有測(cè)試化合物的培養(yǎng)基。另外繼續(xù)生產(chǎn)病毒24小時(shí)。然后收獲上清液，用于重感染原初293A細(xì)胞。通過熒光素酶基因產(chǎn)物鑒別出受感染的原初細(xì)胞。熒光素酶陽性的細(xì)胞數(shù)量是重組HIV-1的復(fù)制和/或感染程度的尺度。通過使用具有幾個(gè)點(diǎn)突變(已知會(huì)誘導(dǎo)對(duì)幾種不同類型的抗-HIV藥物的抗性)的HIV-1基因組，還可以用該試驗(yàn)測(cè)試對(duì)許多臨床上接受的抗-HIV-1藥物的抗性。將沒有可檢測(cè)的熒光素酶陽性的細(xì)胞的抑制百分比設(shè)定為100％，在受感染的、未處理的對(duì)照組中的陽性細(xì)胞的數(shù)量為0％。
為了測(cè)試PS-ODN的抗-HIV-1活性的大小依賴性和序列獨(dú)立性，我們?cè)囼?yàn)了不同大小的PS-ODN隨機(jī)物。當(dāng)在HIV-1 CPE試驗(yàn)中測(cè)試這些PS-ODN時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著PS-ODN大小的增加，效力也增加(IC50減少，見圖19a、b和20)。我們還注意到，PS-ODN隨機(jī)物在該試驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出對(duì)宿主細(xì)胞的顯著毒性(見圖19c、d)。
據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道的PS-ODN對(duì)HIV-1的IC50低至0.011μM。
為了更清楚地說明PS-ODN的抗HIV-1活性的有效大小范圍，我們通過使用野生型HIV-1(重組NL 4-3(CNDO))的RA測(cè)試了更多的覆蓋較寬大小范圍(10～80個(gè)堿基)的PS-ODN隨機(jī)物。另外，我們還測(cè)試了4種目前用于臨床的蛋白酶抑制劑(氨普奈韋(aprenavir)、茚地那韋、洛匹那韋和沙奎那韋)。我們發(fā)現(xiàn)，10個(gè)和更大堿基的PS-ODN隨機(jī)物具有抗-HIV-1活性，且抗-HIV-1功效也隨著PS-ODN隨機(jī)物長(zhǎng)度的增加而增加，但是在40個(gè)堿基時(shí)飽和(見圖21e-h和圖22b)。而且，40和80個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物的功效幾乎與4種臨床的對(duì)照相同(見圖21a-d和22a)。
據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道的PS-ODN對(duì)HIV-1的IC50低至0.014μM。
為了測(cè)試PS-ODN隨機(jī)物抑制HIV的藥物抗性毒株的能力，我們使用HIV-1的重組MDRC4毒株復(fù)制了上述試驗(yàn)。該重組毒株對(duì)來自所有種類的至少16種不同的臨床上接受的藥物表現(xiàn)出顯著的抗性核苷酸RT抑制劑、非核苷酸RT抑制劑和蛋白酶抑制劑。所有PS-ODN隨機(jī)物對(duì)抗性毒株的表現(xiàn)與它們對(duì)野生型毒株的相同(見圖23e-h)。但是，4種蛋白酶抑制劑中的3種表現(xiàn)出對(duì)突變株的功效的降低(見圖23a-d和24)，所以現(xiàn)在40和80個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物比這些藥物對(duì)該抗性毒株更有效。
實(shí)施例5RSV的抑制通過alamar blue監(jiān)視CPE(細(xì)胞代謝的間接檢測(cè))，檢測(cè)了PS-ODN隨機(jī)物抑制RSV的能力。在MEM+5％胎牛血清中，在37℃和5％CO2培養(yǎng)人喉癌(Hep2)細(xì)胞。將細(xì)胞接種到96孔平板中，其密度是能在生長(zhǎng)5-6天后產(chǎn)生匯合的細(xì)胞單層。接種后，在存在減少體積測(cè)試化合物的情況下，用RSV(毒株A2，108.2TCID50/ml)感染細(xì)胞2小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)基換掉，并補(bǔ)加測(cè)試化合物。感染后6天，通過檢測(cè)alamar blue的熒光轉(zhuǎn)變監(jiān)測(cè)CPE。通過處理未受感染的細(xì)胞7天并檢測(cè)這些細(xì)胞中的alamar blue轉(zhuǎn)變，監(jiān)測(cè)測(cè)試化合物在Hep2細(xì)胞中的毒性。在未受感染的、未處理的細(xì)胞中的alamar blue讀數(shù)設(shè)定為100％存活率，在受感染的、未處理的細(xì)胞中的讀數(shù)設(shè)定為0％存活率。
為了證實(shí)PS-ODN的抗-RSV活性的大小依賴性和序列獨(dú)立性，我們?cè)囼?yàn)了不同大小的PS-ODN隨機(jī)物。另外，我們測(cè)試了臨床上接受的用于RSV感染、利巴韋林(三唑核苷制劑TM)的治療劑。當(dāng)在RSV CPE試驗(yàn)中測(cè)試時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著PS-ODN隨機(jī)物大小的增加，功效也增加，但是在40個(gè)堿基大小時(shí)飽和(見圖25a-c和26)。我們還注意到，20、40和80個(gè)堿基的PS-ODN隨機(jī)物的IC50值明顯比臨床上接受的抗-RSV藥物-利巴韋林更低(見圖25a-d和26)。PS-ODN隨機(jī)物在Hep2細(xì)胞中沒有表現(xiàn)出毒性，但是利巴韋林明顯有毒性(治療指數(shù)＝2.08，見圖25e-h)。
據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道的PS-ODN對(duì)RSV-1的IC50低至0.015μM。
實(shí)施例6柯薩奇病毒B2的抑制通過alamar blue監(jiān)視CPE(細(xì)胞代謝的間接檢測(cè))，檢測(cè)了PS-ODN隨機(jī)物抑制COX B2的能力。在MEM+5％胎牛血清中，在37℃和5％CO2培養(yǎng)恒河猴腎(LLC-MK2)細(xì)胞。將細(xì)胞接種到96孔平板中，其密度是能在生長(zhǎng)5-6天后產(chǎn)生匯合的細(xì)胞單層。接種后，在存在減少體積的測(cè)試化合物的情況下，用COX B2(毒株Ohio-1，107.8TCID50/ml)感染細(xì)胞2小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)基換掉，并補(bǔ)加測(cè)試化合物。感染后6天，通過檢測(cè)alamarblue的熒光轉(zhuǎn)變監(jiān)測(cè)CPE。通過處理未受感染的細(xì)胞7天并檢測(cè)這些細(xì)胞中的alamar blue轉(zhuǎn)變，監(jiān)測(cè)測(cè)試化合物在LLC-MK2細(xì)胞中的毒性。在未受感染的、未處理的細(xì)胞中的alamar blue讀數(shù)設(shè)定為100％存活率，在受感染的、未處理的細(xì)胞中的讀數(shù)設(shè)定為0％存活率。
我們?cè)贑OX B2 CPE試驗(yàn)中測(cè)試了REP 2006的抗-COX B2活性。我們發(fā)現(xiàn)，盡管在LLC-MK2細(xì)胞中表現(xiàn)出一些輕微毒性(見圖27b)，該P(yáng)S-ODN隨機(jī)物能使受感染的LLC-MK2細(xì)胞部分地從COX B2感染狀態(tài)獲救(見圖27a)。
實(shí)施例7牛痘病毒的抑制我們使用牛痘感染模型測(cè)量了我們的化合物對(duì)痘病毒(包括天花病毒)的潛在功效。通過alamar blue監(jiān)測(cè)CPE(細(xì)胞代謝的間接檢測(cè))，檢測(cè)了PS-ODN隨機(jī)物抑制牛痘的能力。在MEM+5％胎牛血清中，在37℃和5％CO2培養(yǎng)Vero細(xì)胞。將細(xì)胞接種到96孔平板中，其密度是能在生長(zhǎng)5-6天后產(chǎn)生匯合的細(xì)胞單層。接種后，在存在減少體積的測(cè)試化合物的情況下，用牛痘(107.9TCID50/ml)感染細(xì)胞2小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)基換掉，并補(bǔ)加測(cè)試化合物(除了西多福韋是在50μM外，都在10μM)。感染后5天，收集上清液。通過用1∶100稀釋的上清液重新感染VERO細(xì)胞、并在重新感染后7天通過檢測(cè)alamar blue的熒光轉(zhuǎn)變來監(jiān)測(cè)CPE，檢測(cè)上清液中的病毒負(fù)載。
我們?cè)囼?yàn)了不同大小的PS-ODN隨機(jī)物(REP 2004、2006和2007)。另外，我們?cè)囼?yàn)了用于牛痘感染的已知有效的治療劑-西多福韋(西多福韋注射劑TM)。當(dāng)在牛痘CPE試驗(yàn)中測(cè)試時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，REP 2004、2006和2007的治療都表現(xiàn)出抗病毒活性(即，產(chǎn)生的上清液在重新感染后表現(xiàn)出減少的CPE)，但是該活性比用西多福韋時(shí)觀察到的弱(見圖36)。
實(shí)施例8DHBV、副流感病毒-3病毒和漢坦病毒的抑制。
因?yàn)镈HBV、副流感病毒-3病毒和漢坦病毒不能容易地產(chǎn)生可檢測(cè)的噬斑或CPE，我們利用熒光灶形成單位(FFFU)檢測(cè)測(cè)試了REP 2006在這些病毒中的功效。在該試驗(yàn)中，將REP 2006(終濃度為10μM)與隨后吸附到細(xì)胞上的病毒相混合。吸附后，將受感染的細(xì)胞再孵育7-14天，在這時(shí)用甲醇固定它們。通過針對(duì)合適的病毒抗原的免疫熒光顯微法，檢測(cè)了病毒復(fù)制區(qū)。對(duì)于測(cè)試的3種病毒中的每一種，具體的實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果是如下所述

該原始數(shù)據(jù)表明，在10μM時(shí)，REP 2006有效地抑制DHBV、副流感病毒-2和漢坦病毒。我們預(yù)期，在初步試驗(yàn)中給定的強(qiáng)反應(yīng)，IC50值會(huì)更低。這些數(shù)據(jù)支持了PS-ODN隨機(jī)物用于治療漢坦病毒和乙型肝炎(與DHBV密切相關(guān))的人感染的功效，并提供了即時(shí)治療RSV和副流感病毒-3造成的小兒細(xì)支氣管炎的基本原理，其在治療開始時(shí)可能不需要區(qū)別診斷。
實(shí)施例9目前的非反應(yīng)性病毒迄今為止，當(dāng)在下面的病毒系統(tǒng)中不使用輸送系統(tǒng)、藥物組合或化學(xué)修飾時(shí)，我們還沒有觀察到PS-ODN隨機(jī)物(至多10μM)的可檢測(cè)的抗病毒功效


在本試驗(yàn)方法中，我們沒有證實(shí)活性。但是，抗病毒活性的缺失可能是由于PS-ODN在該試驗(yàn)條件下的更低的細(xì)胞穿透。但是，進(jìn)行了其它試驗(yàn)來完成這些病毒的功效結(jié)果。當(dāng)為了提高其胞內(nèi)濃度而使用輸送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體制劑)時(shí)，這些病毒可以對(duì)PS-ODN發(fā)生反應(yīng)。另外，當(dāng)與其它的抗病毒藥(例如本文所述的)組合時(shí)，PS-ODN可以表現(xiàn)出對(duì)這些病毒的抗病毒功效。用于提高胞內(nèi)濃度的化學(xué)修飾還可以用來提供對(duì)這些病毒的PS-ODN活性。
由于我們具有有力的證據(jù)，即PS-ODN的電荷特征對(duì)于抑制來自幾種不同家族的病毒是重要的，我們預(yù)期該抑制病毒活性的電荷依賴性的機(jī)制具有抑制所有包殼病毒的活性的潛力。其必然的結(jié)果是，沒有檢測(cè)到針對(duì)實(shí)施例9所列出的那些病毒的抗病毒功效表明，PS-ODN和這些病毒的結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用的強(qiáng)度不足以阻止病毒蛋白在這些病毒復(fù)制過程中的相互作用。實(shí)現(xiàn)針對(duì)這些病毒的功效的一種方式是，改變DNA或抗病毒聚合物的電荷特征(例如在DNA用二硫代磷酸酯取代硫代磷酸酯鍵)，從而增強(qiáng)它們對(duì)病毒蛋白的親和力。
實(shí)施例10檢測(cè)寡核苷酸是否主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用的試驗(yàn)如果能滿足下述的3個(gè)試驗(yàn)中的任何一個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為目標(biāo)ON(例如ODN)是主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。
試驗(yàn)#1-對(duì)抗病毒功效的部分簡(jiǎn)并作用該試驗(yàn)用于檢測(cè)特定ON序列在其部分序列被簡(jiǎn)并時(shí)的抗病毒活性。如果具有相同化學(xué)性質(zhì)的簡(jiǎn)并ON保留了其下述活性，則認(rèn)為它是主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。將根據(jù)下述規(guī)則使ON簡(jiǎn)并LON＝原始ON中的堿基數(shù)目X＝要簡(jiǎn)并的寡聚物的每個(gè)末端上的堿基數(shù)目(但是具有與原始ON相同的化學(xué)性質(zhì))如果LON是奇數(shù)，那么X＝LON/4如果LON是偶數(shù)，那么X＝(LON/4)的整數(shù)部分+1每個(gè)簡(jiǎn)并堿基應(yīng)當(dāng)根據(jù)任意的合適方法學(xué)合成，例如本文所述的用于合成PS-ODN隨機(jī)物的方法學(xué)。
如果聲稱ON對(duì)皰疹病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科或副粘病毒科家族的成員具有抗病毒活性，將使用本文所述的病毒家族、優(yōu)選地使用所述的病毒株的試驗(yàn)生成IC50。如果聲稱ON對(duì)上面沒有提到的具體病毒家族的成員具有抗病毒活性，則通過制藥工業(yè)接受的抗病毒功效試驗(yàn)生成IC50值。使用最少7個(gè)化合物濃度生成IC50值，在劑量反應(yīng)曲線的線性區(qū)域有3個(gè)或更多的點(diǎn)。使用該試驗(yàn)，將所述ON的IC50與其簡(jiǎn)并副本進(jìn)行了對(duì)比。如果25個(gè)和更少堿基的ON的簡(jiǎn)并ON的IC50比原始ON大2倍以下，或者26個(gè)或更多堿基(基于最小三重檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過平均值的15％)的ON的簡(jiǎn)并ON的IC50比原始ON大10以下，那么應(yīng)當(dāng)認(rèn)為ON是主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。
試驗(yàn)#2-隨機(jī)物的功效對(duì)比該試驗(yàn)用于對(duì)比ON的抗病毒功效和在相同病毒或病毒家族中的具有等同大小和相同化學(xué)性質(zhì)的隨機(jī)物ON的抗病毒功效。
如果聲稱ON對(duì)皰疹病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科或副粘病毒科家族的成員具有抗病毒活性，將使用本文所述的病毒家族、優(yōu)選地使用所述的病毒株的試驗(yàn)生成IC50。如果聲稱ON對(duì)上面沒有提到的具體病毒家族的成員具有抗病毒活性，則通過制藥工業(yè)接受的抗病毒功效試驗(yàn)生成IC50。使用最少7個(gè)化合物濃度生成IC50值，在劑量反應(yīng)曲線的線性區(qū)域有3個(gè)或更多的點(diǎn)。使用該試驗(yàn)，將ON的IC50與等同大小和相同化學(xué)性質(zhì)的ON隨機(jī)物進(jìn)行了對(duì)比。如果25個(gè)和更少堿基的ON的簡(jiǎn)并ON的IC50比原始ON大2倍以下，或者26個(gè)或更多堿基(基于最小三重檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過平均值的15％)的ON的簡(jiǎn)并ON的IC50比原始ON大10倍以下，那么應(yīng)當(dāng)認(rèn)為ON是主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。
試驗(yàn)#3-不同病毒家族的功效對(duì)比該試驗(yàn)用于對(duì)比ON對(duì)靶病毒(其基因組與ON同源)的功效和ON對(duì)第二種病毒(其基因組與ON沒有同源性)的功效。在許多情況下，不同的病毒將選自與靶病毒的病毒家族不同的病毒家族。使用在2種病毒中的相同長(zhǎng)度和化學(xué)性質(zhì)的隨機(jī)物的活性標(biāo)準(zhǔn)化從2種病毒得到的ON的IC50值，對(duì)比了靶病毒和第二種病毒中的ON的相對(duì)活性。
因而，如果聲稱ON對(duì)某種病毒具有抗病毒活性，則使用本文所述的皰疹病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科或副粘病毒科家族的試驗(yàn)之一或本領(lǐng)域已知的其它試驗(yàn)在該病毒中確定IC50的生成。類似地，使用本文所述的一種病毒(其基因組與ON的序列沒有同源性)試驗(yàn)，將生成針對(duì)第二種病毒的ON的IC50。還生成了等同大小和化學(xué)性質(zhì)的隨機(jī)物對(duì)每種病毒的IC50。用隨機(jī)物對(duì)2種病毒的IC50功效標(biāo)準(zhǔn)化下述具體ON的IC50值1.對(duì)第一種(同源的)病毒的ON和隨機(jī)物的IC50進(jìn)行代數(shù)變換，使隨機(jī)物的IC50現(xiàn)在是1。
2.對(duì)第二種(非同源的)病毒的ON和隨機(jī)物的IC50進(jìn)行代數(shù)變換，使隨機(jī)物的IC50現(xiàn)在是1。
3.用變換的同源病毒中的ON的IC50除變換的非同源病毒中的ON的IC50，計(jì)算在同源的和非同源的病毒中ON的IC50的倍數(shù)差異。
對(duì)于長(zhǎng)度低于25個(gè)堿基的ON，如果倍數(shù)差異低于2，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為ON通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。對(duì)于長(zhǎng)度為25個(gè)堿基或更大的ON，如果倍數(shù)差異低于10，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為ON通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。
試驗(yàn)#4不同病毒家族的功效該試驗(yàn)用于確定ON是否對(duì)病毒具有藥物樣活性，其中所述ON的序列不與病毒基因組的任何部分同源。因而，應(yīng)當(dāng)使用本文所述的皰疹病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科或副粘病毒科的試驗(yàn)之一檢測(cè)ON，使測(cè)試的ON的序列不與要使用的病毒基因組的任何部分同源。應(yīng)使用最少7個(gè)ON濃度生成IC50值，在線性范圍有3個(gè)或更多的點(diǎn)。如果得到的劑量反應(yīng)曲線指示藥物樣活性(其典型地表現(xiàn)為衰減或S形曲線，隨著ON濃度的降低，抗病毒功效也減少)且從所述曲線生成的IC50低于1μM，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為ON具有藥物樣活性。如果認(rèn)為ON對(duì)病毒具有藥物樣活性，且ON不與該病毒互補(bǔ)、因而不具有依賴于互補(bǔ)序列的活性，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。
在這些試驗(yàn)中使用的閾值在科研或工業(yè)領(lǐng)域，都沒有科學(xué)的或經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)來設(shè)計(jì)大于25個(gè)堿基的反義ON。另外，據(jù)我們所知，還沒有在任何人試驗(yàn)中施用的ON制劑，其使用大于25個(gè)核苷酸的ON。
鑒于這些事實(shí)，我們已經(jīng)建立了2個(gè)不同的閾值，我們用它們將序列定義為主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。對(duì)于25和更少堿基的寡聚物，如果要被認(rèn)為主要是通過反義機(jī)制發(fā)揮作用，ON的抗病毒活性必須是相同化學(xué)性質(zhì)的隨機(jī)物或簡(jiǎn)并ON的至少2倍。如果反義ON不是隨機(jī)物或簡(jiǎn)并ON的至少2倍，那么我們的結(jié)論是，其活性的多半可以歸因于非反義的作用方式。
對(duì)于26個(gè)和更大堿基的ON，如果要被認(rèn)為是通過反義機(jī)制發(fā)揮作用，ON的抗病毒活性必須是相同化學(xué)性質(zhì)的隨機(jī)物或簡(jiǎn)并ON的至少10倍(1log)。我們關(guān)于該更大閾值的基本原理是，鑒于本領(lǐng)域目前的反義ON設(shè)計(jì)的狀態(tài)，可以合理地假設(shè)，26個(gè)堿基和更大的、且聲稱具有抗病毒活性的寡聚物是利用本文所述的發(fā)明知識(shí)來設(shè)計(jì)的(通常可接受的反義ON的最佳長(zhǎng)度是在16和21個(gè)堿基之間)。
在上面的試驗(yàn)1～3中所述的閾值是缺省閾值。如果特別說明，其它的閾值也可以用于對(duì)比上述的試驗(yàn)1～3中。因此，例如，對(duì)于長(zhǎng)度低于25個(gè)堿基的ON和/或長(zhǎng)度為25個(gè)或更多堿基的ON，如果特別說明，用于檢測(cè)ON是否主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用的閾值可以是10倍、8倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1.5倍或相等中的任一個(gè)。在上面的試驗(yàn)4中所述的閾值也是缺省閾值。如果特別說明，用于檢測(cè)試驗(yàn)4中的ON是否主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用的閾值可以是小于1μM、0.8μM、0.6μM、0.5μM、0.4μM、0.3μM、0.2μM或0.1μM的IC50。類似地，盡管缺省的是滿足上述4個(gè)試驗(yàn)中的任一個(gè)就足夠，如果特別說明，可以要求ON在缺省閾值時(shí)能滿足任意2個(gè)(例如，試驗(yàn)1&2，1&3，1&4，2&3，2&4，3&4)或任意3個(gè)(1&2&3，1&3&4，2&3&4)或全部4個(gè)試驗(yàn)，或者如果特別說明，在如上所述的另一個(gè)閾值。
對(duì)皰疹病毒科的抗病毒試驗(yàn)如下進(jìn)行噬斑減少試驗(yàn)對(duì)于HSV-1或HSV-2，在補(bǔ)充了10％熱滅活的胎牛血清和慶大霉素、萬古霉素和兩性霉素B的MEM中，在37℃和5％CO2下，使VERO細(xì)胞(ATCC#CCL-81)在12孔組織培養(yǎng)板(NUNC或等同物)中生長(zhǎng)至匯合。達(dá)到匯合后，將培養(yǎng)基換成如上所述的含有5％胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基，其添加了HSV-1(毒株KOS，共40-60PFU)或HSV-2(毒株MS2，共40-60PFU)。病毒吸附進(jìn)行90分鐘，此后洗滌細(xì)胞，替換為新的“覆蓋”培養(yǎng)基，其含有5％胎牛血清和1％人免疫球蛋白。吸附后3-4天，用福爾馬林固定細(xì)胞，并在福爾馬林固定后進(jìn)行噬斑計(jì)數(shù)。
對(duì)于CMV，如在HSV-1/2試驗(yàn)中關(guān)于VERO細(xì)胞所述培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)基組分和吸附/覆蓋方法相同，但是有下述例外1.在吸附過程中用CMV(毒株AD169，共40-60PFU)感染細(xì)胞。
2.在覆蓋培養(yǎng)基中，將1％人免疫球蛋白替換為4％sea-plaque瓊脂糖。
對(duì)于其它皰疹病毒科，在如上所述噬斑試驗(yàn)中，在吸附過程中使用合適的細(xì)胞宿主和40-60PFU的病毒進(jìn)行測(cè)試。
只有如果在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)在沒有化合物的情況下形成了可鑒別的噬斑，該試驗(yàn)才是有效的。
IC50是與未處理的對(duì)照相比存在50％的噬斑時(shí)的濃度。
在吸附和覆蓋過程中，都存在要測(cè)試的化合物。
對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒科的抗病毒試驗(yàn)如下進(jìn)行在HIV-1感染的細(xì)胞的上清液中的總p24的檢測(cè)在有化合物存在的情況下，用HIV-1的原代分離物感染人PBMC。然后在補(bǔ)充了化合物的新鮮培養(yǎng)基中另外培養(yǎng)細(xì)胞7天，此后使用商業(yè)的p24 ELISA試劑盒(BIOMERIEUX或等同物)檢測(cè)上清液中的p24水平。
只有如果在受感染的、未處理的細(xì)胞的組織培養(yǎng)上清液中有p24累積，該試驗(yàn)才是有效的。
IC50是可檢測(cè)的p24的量為未處理的對(duì)照中的p24的量的50％時(shí)的濃度。
在吸附過程中和在吸附后的培養(yǎng)基中都存在要測(cè)試的化合物。
對(duì)副粘病毒科的抗病毒試驗(yàn)對(duì)于RSV，如下檢測(cè)CPE在96孔平板中接種Hep2細(xì)胞，在MEM+5％胎牛血清中、在37℃和5％CO2下培養(yǎng)過夜。次日，用RSV(毒株A2，108.2TCID50/ml，以100μl/孔)通過吸附2小時(shí)來感染細(xì)胞。吸附后，更換培養(yǎng)基，生長(zhǎng)7天后，通過活細(xì)胞將Alamar Blue染料向其熒光加合物的轉(zhuǎn)化檢測(cè)CPE。
只有在沒有化合物的情況下在受感染的細(xì)胞中的CPE測(cè)量(如通過Alamar Blue轉(zhuǎn)化所檢測(cè)的)是在未受感染的細(xì)胞中測(cè)量到的轉(zhuǎn)化的10％時(shí)，該試驗(yàn)才是有效的。
為了進(jìn)行IC50對(duì)比，將在受感染的細(xì)胞中觀察到的轉(zhuǎn)化水平設(shè)定為100％CPE，在未受感染的細(xì)胞中觀察到的轉(zhuǎn)化水平設(shè)定為0％CPE。因此，IC50是生成50％CPE時(shí)的化合物濃度。
在吸附過程中和在吸附后的培養(yǎng)基中都存在要測(cè)試的化合物。
在說明書中引用的所有專利和其它文獻(xiàn)都是用來說明本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的技術(shù)水平，它們?nèi)慕Y(jié)合于此作為參考，包括任何表格和圖，如果每篇文獻(xiàn)已經(jīng)各自整體引作參考，也同樣適用。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地明白，本發(fā)明充分適用于實(shí)現(xiàn)提及的和其中固有的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)。本文所述的作為優(yōu)選實(shí)施方案的目前代表的方法、變化和組合物是示例性的，無意為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠進(jìn)行變化和其它應(yīng)用，這都在本發(fā)明的精神內(nèi)，由權(quán)利要求的范圍所限定。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地明白，對(duì)本文所述的發(fā)明可以進(jìn)行不同的替代和變化，而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。例如，可以對(duì)寡核苷酸的合成條件和組成進(jìn)行改變。因而，這樣的其它實(shí)施方案也在本發(fā)明和下面的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
在缺少任意的一個(gè)或多個(gè)本文沒有特別說明的要素、限制時(shí)，也可以合適地實(shí)現(xiàn)本文解釋說明的發(fā)明。因此，例如，在本文的每個(gè)情形中，術(shù)語“包含”、“基本上由……組成”和“包括”中的任意一個(gè)都可以替換為另外2個(gè)中的一個(gè)。已經(jīng)采用的術(shù)語和表述用作說明性的而不是限制性的術(shù)語，使用這樣的術(shù)語和表達(dá)無意排除所列的和所述的特征或其部分的任何等同物，但是應(yīng)當(dāng)理解，在要求的本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種變化。因而，應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選的實(shí)施方案和最佳特征進(jìn)行了具體公開，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用本文公開的概念的修飾和變體，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這樣的修飾和變體也在所附的權(quán)利要求所限定的發(fā)明范圍內(nèi)。
另外，當(dāng)描述的本發(fā)明的特征或方面涉及到馬庫什基團(tuán)或其它的替代基團(tuán)時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明還由此描述了馬庫什基團(tuán)或其它基團(tuán)的任意成員或成員的子群。
另外，除非有相反說明，當(dāng)在實(shí)施方案中提及各種數(shù)值時(shí)，通過取任意2個(gè)不同值作為范圍的端點(diǎn)描述了其它實(shí)施方案。這樣的范圍也在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。
因此，其它的實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍和下面的權(quán)利要求內(nèi)。
表1-寡核苷酸的描述REP 1001來自人自主復(fù)制序列的20mer序列T T G A T A A A T A G T A C T A G G A CPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2001來自HSV-1復(fù)制起點(diǎn)的22mer序列G A A G C G T T C G C A C T T C G T C C C APS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 3007來自pUC19/pBR322復(fù)制起點(diǎn)的16mer序列C T T G C G G T A T T C G G A APS . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 20025mer隨機(jī)物序列N N N N NPS . . . . .
REP 20326mer隨機(jī)物序列N N N N N NPS . . . . . .
REP 200310mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . .
REP 200912mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . .
REP 201014mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . .
REP 201116mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 201218mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 200420mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 200530mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 200640mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 200780mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N50PS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N50PS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PEP 2008120mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N50PS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N120PS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 201310mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N無修飾REP 201420mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N無修飾REP 201540mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N無修飾REP 201610mer隨機(jī)序列序列T C C G A A G A C GPS . . . . . . . . . .
REP 201720mer隨機(jī)序列序列A C A C C T C C G A A G A C G A T A A CPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 201840mer隨機(jī)序列序列C T A C A G A C A T A C A C C T C C G A A G A C G A T A A C A C T A G A C A T APS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2019集中于HSV-1 IE110蛋白(NCBI登記號(hào)X04614)起始密碼子的10mer序列序列C C C C C PS . . . . . . . . . .
REP 2020集中于HSV-1 IE110蛋白(NCBI登記號(hào)X04614)起始密碼子的20mer序列序列T A C G A C C C C C PS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2021集中于HSV-1 IE110蛋白(NCBI登記號(hào)X04614)起始密碼子的40mer序列序列T C C A G C C G C A T A C G A C C C C C PS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 202440mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2-OMe . . . . . . . .
REP 202640mer隨機(jī)物序列N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NPCH3. . . . . . . .
REP 2036抗CMV的商購的反義物(vitravine/福米韋生)的21mer，國(guó)內(nèi)合成序列G C G T T T G C T C T T C T T C T T G C GPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2036 抗CMV的商購的反義物(vitravine/福米韋生)的21mer，商購(cGMP)序列G C G T T T G C T C T T C T T C T T G C GPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A20 20mer序列A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
G20 20mer序列G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C20 20mer序列C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T2020mer序列 T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AC10 20mer序列 A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AG10 20mer序列 A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
TC10 20mer序列 T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
TG10 20mer序列 T G T G T G T G T G T G T G T G T G T G-FITCPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2029 40mer序列 A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A APS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2028 40mer序列 G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G GPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2031 40mer序列 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C CPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2030 40mer序列 T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T TPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2055 40mer序列 A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C A CPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2056 40mer序列 T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T CPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2057 40mer序列 A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A G A GPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2O59 20mer RNA隨機(jī)物序列 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
REP 2060 30mer RNA隨機(jī)物序列 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N NPS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
權(quán)利要求
1.一種抗病毒的寡核苷酸制劑，其含有至少一種抗病毒的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗病毒的寡核苷酸制劑，其含有至少2種不同的抗病毒的寡核苷酸的混合物。
3.一種抗病毒的隨機(jī)物寡核苷酸制劑，其含有至少一個(gè)抗病毒的隨機(jī)物寡核苷酸，其中所述隨機(jī)物的抗病毒活性主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的抗病毒的寡核苷酸隨機(jī)物制劑，其含有至少2種不同長(zhǎng)度的抗病毒的隨機(jī)物的混合物。
5.一種具有抗靶病毒的抗病毒活性的寡核苷酸制劑，其含有至少一種抗病毒的寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸的長(zhǎng)度是至少29個(gè)核苷酸，且所述的寡核苷酸的序列與所述靶病毒的基因組序列的任何部分不互補(bǔ)。
6.一種具有抗靶病毒的抗病毒活性的寡核苷酸制劑，其含有至少一種抗病毒的寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸的長(zhǎng)度是至少6個(gè)核苷酸，且所述寡核苷酸的序列與所述靶病毒的基因組序列的任何部分不互補(bǔ)，且不是基本上由polyA、polyC、polyG、polyT、G四合體或G-豐富的序列組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的制劑對(duì)靶病毒的IC50是0.10μM或更小。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的制劑對(duì)靶病毒的IC50是0.05μM或更小。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的制劑對(duì)靶病毒的IC50是0.025μM或更小。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的制劑對(duì)靶病毒的IC50是0.015μM或更小。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向DNA病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向RNA病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向皰疹病毒科的成員。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向HSV-1。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向HSV-2。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向CMV。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向嗜肝DNA病毒科的成員。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向HBV。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向細(xì)小病毒科的成員。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向痘病毒科的成員。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向乳頭瘤病毒科的成員。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向腺病毒科的成員。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒科的成員。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向HIV-1。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向HIV-2。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向副粘病毒科的成員。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向RSV。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向副流感病毒。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向布尼亞病毒科的成員。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向漢坦病毒。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向微小RNA病毒科的成員。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向柯薩奇病毒。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向鼻病毒。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向黃病毒科的成員。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向黃熱病毒。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑；其中所述的寡核苷酸靶向登革病毒。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向西尼羅病毒。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向丙型肝炎病毒。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向線狀病毒科的成員。
40.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向埃博拉病毒。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向馬爾堡病毒。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向正粘病毒科的成員。
43.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向流感病毒。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向披膜病毒科的成員。
45.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向冠狀病毒科的成員。
46.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向呼腸孤病毒科的成員。
47.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向彈狀病毒科的成員。
48.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向沙粒病毒科的成員。
49.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸靶向calciviridae的成員。
50.根據(jù)權(quán)利要求1～4和6～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少6個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
51.根據(jù)權(quán)利要求1～4和6～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少10個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
52.根據(jù)權(quán)利要求1～4和6～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
53.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少29個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
54.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少32個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
55.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少34個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
56.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少36個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
57.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少38個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
58.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
59.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少46個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
60.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
61.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少80個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
62.根據(jù)權(quán)利要求1～49中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是至少120個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
63.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)磷酸二酯鍵。
64.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾。
65.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中每個(gè)所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)硫代磷酸酯鍵。
66.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中每個(gè)所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)硫代磷酸酯鍵和輸送系統(tǒng)。
67.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中每個(gè)所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)硫代磷酸酯鍵和脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)。
68.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)對(duì)核糖部分的2’-O甲基修飾。
69.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)對(duì)核糖部分的2′-修飾。
70.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)甲基膦酸酯鍵。
71.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中每個(gè)所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)二硫代磷酸酯鍵。
72.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中每個(gè)所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)二硫代磷酸酯鍵和輸送系統(tǒng)。
73.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中每個(gè)所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)二硫代磷酸酯鍵和脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)。
74.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是由兩個(gè)或多個(gè)通過連接物連接的寡核苷酸序列組成的多聯(lián)體。
75.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸在一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基處連接或結(jié)合到分子上以得到一個(gè)或多個(gè)特征，所述分子修飾寡核苷酸的特征，所述特征選自更高的穩(wěn)定性、更低的血清相互作用、更高的細(xì)胞攝入、更高的病毒蛋白相互作用、改善的被配制適于輸送的能力、可檢測(cè)出的信號(hào)、更高的抗病毒活性、更好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、特異性的組織分布、更低的毒性。
76.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是雙鏈的。
77.根據(jù)權(quán)利要求1～62中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸是雙鏈的或單鏈的，且包含至少一個(gè)能通過非沃森-克里克相互作用進(jìn)行雜交的堿基。
78.根據(jù)權(quán)利要求1～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)G四合體基序部分。
79.根據(jù)權(quán)利要求1～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)CpG基序部分。
80.根據(jù)權(quán)利要求1～4和7～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸包含與病毒mRNA互補(bǔ)的部分。
81.根據(jù)權(quán)利要求1～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸結(jié)合一種或多種病毒組分。
82.根據(jù)權(quán)利要求1～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中所述的寡核苷酸與一種或多種宿主組分相互作用，其中所述的相互作用導(dǎo)致病毒活性或生成的抑制。
83.根據(jù)權(quán)利要求1～4和7～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列是源自病毒基因組。
84.根據(jù)權(quán)利要求1～4和7～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列是源自病毒基因組，且具有主要是非序列互補(bǔ)性的作用方式的抗病毒活性。
85.根據(jù)權(quán)利要求1～4和7～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列是源自病毒包裝序列或參與相似的相互作用的其它病毒序列。
86.根據(jù)權(quán)利要求1～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列參與與病毒組分或宿主組分或二者的相似相互作用。
87.根據(jù)權(quán)利要求1～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列包含polyA、polyC、polyG、polyT、polyAC、polyAG、polyAT、polyCG、polyCT或polyGT。
88.根據(jù)權(quán)利要求1～77中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其中至少一部分所述的寡核苷酸的序列包含兩個(gè)或多個(gè)重復(fù)序列。
89.根據(jù)權(quán)利要求1和5～88中的任一項(xiàng)的寡核苷酸制劑，其含有至少2種不同的抗病毒的寡核苷酸的混合物。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其含有至少10種不同的抗病毒的寡核苷酸的混合物。
91.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其含有至少100種不同的抗病毒的寡核苷酸的混合物。
92.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其含有至少1000種不同的抗病毒的寡核苷酸的混合物。
93.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其含有至少106種不同的抗病毒的寡核苷酸的混合物。
94.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少6個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
95.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少10個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
96.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
97.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少29個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
98.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少32個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
99.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少34個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
100.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少36個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
101.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少38個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
102.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
103.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
104.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少80個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
105.根據(jù)權(quán)利要求89的寡核苷酸制劑，其中大多數(shù)所述的不同的寡核苷酸是至少120個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
106.一種抗病毒的藥物組合物，其包含治療有效量的至少一種藥理學(xué)上可接受的根據(jù)權(quán)利要求1～105中的任一項(xiàng)的抗病毒寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸的抗病毒活性主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式產(chǎn)生；和藥學(xué)上可接受的載體。
107.根據(jù)權(quán)利要求105的抗病毒的藥物組合物，用于治療、控制或預(yù)防病毒病原學(xué)疾病。
108.根據(jù)權(quán)利要求105的抗病毒的藥物組合物，用于治療、控制或預(yù)防朊病毒疾病。
109.根據(jù)權(quán)利要求105的抗病毒的藥物組合物，用于通過選自下述的方式輸送眼內(nèi)的、經(jīng)口的攝入、腸的、吸入、經(jīng)皮注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、氣管內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射。
110.根據(jù)權(quán)利要求105的抗病毒的藥物組合物，其中所述的組合物還包含輸送系統(tǒng)。
111.根據(jù)權(quán)利要求105的抗病毒的藥物組合物，其中所述的組合物還包含脂質(zhì)體制劑。
112.根據(jù)權(quán)利要求110或111抗病毒的藥物組合物，其中所述的輸送系統(tǒng)或脂質(zhì)體制劑靶向特異性的細(xì)胞或特異性的組織。
113.根據(jù)權(quán)利要求105的抗病毒的藥物組合物，其中所述的組合物還組合地包含至少一種其它的抗病毒藥。
114.根據(jù)權(quán)利要求105的抗病毒的藥物組合物，其中所述的組合物還組合地包含非核苷酸的抗病毒的聚合物。
115.一種試劑盒，其包含在標(biāo)注的包裝中的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1～105中的任一項(xiàng)的抗病毒的寡核苷酸或抗病毒的寡核苷酸制劑，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要通過非序列互補(bǔ)的作用方式產(chǎn)生，在所述包裝上的標(biāo)簽說明了所述抗病毒的寡核苷酸可以用來抵抗至少一種病毒。
116.根據(jù)權(quán)利要求115的試劑盒，其中所述的試劑盒含有至少2種不同的抗病毒的寡核苷酸的混合物。
117.根據(jù)權(quán)利要求115的試劑盒，其中所述的試劑盒被管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人。
118.根據(jù)權(quán)利要求115的試劑盒，其中所述的試劑盒被管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于至少一種非人的動(dòng)物。
119.一種篩選用作抗病毒劑的抗病毒寡核苷酸的方法，其包括合成許多不同的隨機(jī)寡核苷酸；測(cè)試所述的寡核苷酸的抑制病毒產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力的活性，選擇所述的具有藥學(xué)上可接受水平的活性的寡核苷酸用作抗病毒劑。
120.根據(jù)權(quán)利要求119的方法，其中所述的不同的隨機(jī)寡核苷酸包含不同長(zhǎng)度的隨機(jī)物。
121.根據(jù)權(quán)利要求119的方法，其中所述的不同的隨機(jī)寡核苷酸包含一組不同長(zhǎng)度的寡核苷酸，在所述組中的每種寡核苷酸包含所述組中的最短寡核苷酸的序列。
122.根據(jù)權(quán)利要求119的方法，其中所述的不同的隨機(jī)寡核苷酸包含許多寡核苷酸，其含有長(zhǎng)度為至少6個(gè)核苷酸的隨機(jī)物片段。
123.一種預(yù)防或治療受試者的病毒感染的方法，其包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的至少一種藥理學(xué)上可接受的根據(jù)權(quán)利要求1～105中的任一項(xiàng)的寡核苷酸。
124.根據(jù)權(quán)利要求123的方法，其中所述的受試者是人。
125.根據(jù)權(quán)利要求123的方法，其中所述的受試者是非人的動(dòng)物。
126.根據(jù)權(quán)利要求123的方法，其中所述的受試者是植物。
127.一種預(yù)防性治療腫瘤病毒在人或非人的動(dòng)物中造成的癌癥的方法，其包括給需要這種治療的人或非人的動(dòng)物施用藥理學(xué)上可接受的、治療有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1～105中的任一項(xiàng)的寡核苷酸。
128.根據(jù)權(quán)利要求127的方法，其中所述的寡核苷酸是施用給人。
129.一種鑒別改變寡核苷酸與至少一種病毒組分結(jié)合的化合物的篩選方法，所述的方法包括在分開的反應(yīng)中，在有和沒有待篩選的化合物存在的情況下，使所述的寡核苷酸接觸所述的病毒組分；和確定在存在所述的化合物的情況與不存在所述的化合物的情況相比，所述的寡核苷酸與所述的病毒組分的結(jié)合是否存在差異，所述差異的存在表示所述的化合物改變了所述寡核苷酸與所述病毒組分的結(jié)合。
130.通過權(quán)利要求129的方法鑒別出的新型抗病毒化合物。
131.一種從寡核苷酸庫中純化出結(jié)合至少一種病毒組分的寡核苷酸的方法，其包括使所述的庫接觸至少一種病毒組分；從所述的病毒組分中置換出所述的庫的結(jié)合的寡核苷酸；和收集置換出的寡核苷酸。
132.權(quán)利要求131的方法，還包括對(duì)從所述的固定相介質(zhì)收集的結(jié)合的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序和測(cè)試其抗病毒活性。
133.一種從寡核苷酸庫中富集結(jié)合至少一種病毒組分的寡核苷酸的方法，其包括使所述的庫接觸至少一種病毒組分；和擴(kuò)增結(jié)合到所述病毒組分的寡核苷酸，得到富集的寡核苷酸庫。
134.權(quán)利要求133的方法，其中使用所述的富集的寡核苷酸庫作為寡核苷酸庫進(jìn)行至少一次另外的接觸和擴(kuò)增。
135.權(quán)利要求133或134的方法，還包括對(duì)所述的富集的寡核苷酸庫中的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序和測(cè)試抗病毒活性。
136.一種抗病毒的寡核苷酸制品，其包括使用權(quán)利要求131～135中的任一項(xiàng)的方法鑒別的一種或多種寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸制品中的所述寡核苷酸表現(xiàn)出的與至少一種病毒組分的平均結(jié)合親和力比初始寡核苷酸庫中的寡核苷酸的平均結(jié)合親和力更高。
137.權(quán)利要求136的抗病毒的寡核苷酸制品，其中所述的寡核苷酸的平均結(jié)合親和力是初始寡核苷酸庫中的寡核苷酸的平均結(jié)合親和力的至2倍。
全文摘要
描述了具有抗病毒活性的隨機(jī)序列寡核苷酸和它們作為抗病毒劑的應(yīng)用。在許多情況下，寡核苷酸是大于40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。還描述了預(yù)防或治療人或動(dòng)物中的病毒感染的方法，和預(yù)防性治療腫瘤病毒在人或動(dòng)物中造成的癌癥的方法。所述方法典型地包括給需要該治療的人或動(dòng)物施用藥理學(xué)上可接受的、治療有效量的至少一種寡核苷酸，所述寡核苷酸不通過序列互補(bǔ)的作用方式發(fā)揮作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1694959SQ03825133
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者安德魯·瓦揚(yáng), 瓊－馬克·朱托 申請(qǐng)人:雷普利瑟公司