專利名稱：小白菜水分脅迫蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種小白菜水分脅迫蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干旱脅迫是植物逆境最普遍的形式，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計，世界干旱、半干旱地區(qū)占陸地面積的34.9％；我國干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的52％，年受旱面積達(dá)200～270萬hm2，全國灌溉區(qū)年缺水約300億m3，因缺水而少收糧食350～400億kg；特別是我國主要產(chǎn)糧區(qū)如華北、東北和西北，是我國缺水最嚴(yán)重的地區(qū)，春旱頻繁達(dá)到十年九遇。干旱對世界作物產(chǎn)量的影響，在諸多自然逆境中占首位，其危害相當(dāng)于其它災(zāi)害之和。近年來，洪澇災(zāi)害頻頻發(fā)生，而洪澇災(zāi)害對農(nóng)作物的損害除能造成絕產(chǎn)外，更多的情況是農(nóng)田內(nèi)澇造成作物減產(chǎn)、品質(zhì)下降。高鹽環(huán)境嚴(yán)重地影響植物的生長和發(fā)育，是造成作物減產(chǎn)的主要原因之一。隨著世界范圍內(nèi)可耕地日趨減少以及鹽堿、干旱狀況的日趨嚴(yán)重，研究植物耐鹽脅迫的分子機(jī)制，從而尋找有效改進(jìn)植物耐鹽性的方法，已經(jīng)引起人們廣泛的關(guān)注。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會誘發(fā)植物體內(nèi)多種結(jié)構(gòu)和功能的改變，以利于植物適應(yīng)新環(huán)境。根據(jù)GeneBank中的EST拼接結(jié)果，利用RACE(Rapid Amplification of cDNAEnds)PCR技術(shù)我們從小白菜中克隆了水分脅迫相關(guān)基因，根據(jù)GeneBank的搜索結(jié)果，將該基因命名為水分脅迫基因。
在對現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，雖然“Plant Physiol Biochem(植物生理生物化學(xué))，2001，391017-1026”對一些水分脅迫相關(guān)基因功能已經(jīng)做了充分肯定，指出該基因在干旱脅迫下和水分脅迫能夠增強(qiáng)表達(dá)，但沒有指出該基因的表達(dá)與水淹相關(guān)，至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻(xiàn)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種小白菜水分脅迫蛋白編碼序列。本發(fā)明公開了與小白菜水分脅迫密切相關(guān)的蛋白的氨基酸序列以及小白菜水分脅迫基因的核酸序列，及其在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物水分脅迫上的應(yīng)用，包括植物的抗旱、水淹以及抗鹽等逆境的改良。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明所分離出的水分脅迫DNA分子，該分子包括編碼具有小白菜水分脅迫蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列有至少70％的同源性或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的小白菜水分脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發(fā)明所提供的載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。在實例中該宿主細(xì)胞是擬南芥。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“小白菜水分脅迫蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有小白菜水分脅迫蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第479-736位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第479-736位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第479-736位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的小白菜水分脅迫相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“小白菜水分脅迫蛋白或多肽”指具有小白菜水分脅迫蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然小白菜水分脅迫相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括小白菜水分脅迫相關(guān)蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的小白菜水分脅迫多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與小白菜水分脅迫相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用小白菜水分脅迫多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“小白菜水分脅迫保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


表291％ identity in 175 nt overlapQuery446 aagatatggcaggaatcatcaacaagatcggagatgctctccacatcggaggaggcaaca 505|||||||||||||| ||||||||||||||||||| || |||||||| |||||||||||||Sbjct61 aagatatggcaggactcatcaacaagatcggagacgcactccacattggaggaggcaaca 120Query506 aggaagatgagcacaagaagga---ggaacacaagaaacacgccgacgagcacaagagtg 562|||||| ||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||Sbjct121 aggaaggtgagcacaagaaggaagaggaacacaagaaacacgttgacgagcacaagagtg 180Query563 gtgagcacaaggagggtatcgttgataagatcaaagacaagatccacggcggagaagg 620|||||||||| || ||||| ||||| ||||||||||||||||||||||| || |||||
Sbjct181 gtgagcacaaagaaggtattgttgacaagatcaaagacaagatccacggtggtgaagg 238Query小白菜水分脅迫相關(guān)蛋白水分脅迫的核酸序列Sbjct擬南芥水分脅迫蛋白基因核酸序列(NM_104319)表2為本發(fā)明的小白菜水分脅迫蛋白(水分脅迫)與擬南芥水分脅迫蛋白的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表352％ identity in 632aa overlap，66％ similarity in 95aa overlapQuery34 VSLIRSKTRSTAEKATAAETTNMTVRRKRRRDKKEKKHHDDGHHSSSSDSDSD 86V I+ K K+ E ++K+++DKKEKKHHDDGHHSSSSDSDSDSbjct46 VDKIKDKIHGGEGKSHDGEGKSHDGEKKKKKDKKEKKHHDDGHHSSSSDSDSD 98Query小白菜水分脅迫相關(guān)蛋白水分脅迫的氨基酸序列Sbjct擬南芥水分脅迫蛋白氨基酸序列(NP_175843)表3為本發(fā)明的小白菜水分脅迫蛋白(水分脅迫)與水分脅迫的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明還包括小白菜水分脅迫蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然水分脅迫相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的小白菜水分脅迫多肽時，可以將小白菜水分脅迫編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成小白菜水分脅迫蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用， “可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析小白菜水分脅迫基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析小白菜水分脅迫的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有小白菜水分脅迫核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼小白菜水分脅迫相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在小白菜水分脅迫相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于小白菜水分脅迫相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的小白菜水分脅迫核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選小白菜水分脅迫相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與小白菜水分脅迫相關(guān)基因相關(guān)的小白菜cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選小白菜cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對小白菜水分脅迫相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自小白菜的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與小白菜水分脅迫相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的小白菜水分脅迫相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的小白菜水分脅迫蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與小白菜水分脅迫相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發(fā)明在水分脅迫中具有明顯的作用，對提高植物的產(chǎn)量有所幫助。提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，解決日益緊迫的糧食、能源危機(jī)是一項迫在眉睫的世界課題。我國的農(nóng)作物在很多地區(qū)存在者產(chǎn)量低、不穩(wěn)產(chǎn)的因素，提高農(nóng)作物的光合效率是解決這一問題的有效方法，本發(fā)明的水分脅迫II基因水分脅迫正具備這項功能。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。
具體實施例方式
下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1小白菜水分脅迫基因的克隆1.組織分離(isolation)小白菜(品種為“特矮青”)從市場上購得，將小白菜置于28℃發(fā)芽24小時，然后播種于溫室中，待小白菜葉片為4-5片時，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)擬南芥水分脅迫II基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個階段進(jìn)行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到2002BP(782bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)水分脅迫基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個水分脅迫基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+BP003(5’-GACGGAAAGCGTGAACTTCAAG-3’)]得到2002BP3’(356bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)水分脅迫基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個與水分脅迫相關(guān)基因。
(3).5’-RACE第一輪PCR[AAP+BP004(5’-TGAAGAAACCTCAAAGGGGCCT--3’)]第二輪PCR[(AUAP+BPR005(5’-TCGGAGCTCCCTCTGCACTTGC-3’))得到2001BP 5’(約500bp)(過程同(1))將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從小白菜中新得到的基因確為一個與植物水分脅迫相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的小白菜水分脅迫相關(guān)蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實施例2小白菜水分脅迫相關(guān)基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的小白菜水分脅迫全長cDNA的長度為594bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于479-736位核苷酸(245個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出小白菜水分脅迫的氨基酸序列，共85個氨基酸殘基，分子量為78.84kDa，等電點(pI)為5.11。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。
將小白菜水分脅迫相關(guān)的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與甘藍(lán)型油菜水分脅迫基因(NM_104319)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與擬南芥水分脅迫蛋白(NP_175843)也有84％的相同性(附表3)。由此可見，小白菜水分脅迫基因水分脅迫與擬南芥水分脅迫蛋白無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認(rèn)為水分脅迫在抑制水分脅迫上也具有相似的作用。
實施例3小白菜水分脅迫相關(guān)蛋白或多肽在擬南芥中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的水分脅迫性鑒定含目的基因(小白菜水分脅迫基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)小白菜水分脅迫相關(guān)的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將小白菜水分脅迫基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。
預(yù)培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含小白菜水分脅迫基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的水分脅迫鑒定鑒于編碼水分脅迫基因在同源性搜索上已初步被證明是水分脅迫基因，在進(jìn)一步對含小白菜水分脅迫的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行水分脅迫性鑒定。我們利用RT-PCR和Northern blot對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了檢測，兩種方法均證明目的基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中。我們以正常的擬南芥和以轉(zhuǎn)水分脅迫基因的擬南芥植株進(jìn)行水淹、干旱以及氯化鈉脅迫處理，處理條件為分別4℃處理48小時，完全水淹(指將整株植株都置于水下)48小時和NaCL 200Mm 5小時。結(jié)果證明轉(zhuǎn)水分脅迫基因植株在抗水分脅迫上均強(qiáng)于未轉(zhuǎn)基因的植株。在水淹、干旱以及氯化鈉脅迫處理脅迫后，轉(zhuǎn)基因的植株恢復(fù)生長的時間明顯比未轉(zhuǎn)基因的植株短。這證明該基因?qū)λ?、干旱以及氯化鈉脅迫逆境具有抗性，小白菜水分脅迫基因?qū)⒖捎糜诶棉D(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物水分脅迫的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
小白菜水分脅迫基因水分脅迫在小白菜中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從小白菜葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用SnaBI，KpnI和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，將BoFLC基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)2-3雜交條帶，說明水分脅迫基因在小白菜中屬于低拷貝基因。
小白菜水分脅迫相關(guān)基因水分脅迫在小白菜中的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將小白菜“特矮青”，播在溫室(溫度設(shè)置為25-26℃，光照時間為16小時)。待葉片長到2-3片葉時抽取甘藍(lán)葉的RNA。以正常生長的植株作為對照，以水淹、干旱和氯化鈉處理的植株為材料(條件同上)，利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；正常生長的小白菜的植株水分脅迫轉(zhuǎn)錄水平比上述水分脅迫處理的材料的表達(dá)水平明顯偏低，這說明水分脅迫轉(zhuǎn)錄水平與水分脅迫極顯著相關(guān)。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ATGGCAGCCTCTCTCCAATCC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸
(iii).序列描述SEQ ID NO.2CCCTTTGGGTCCAAGAAGGA(2)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大學(xué)<120>小白菜水分脅迫蛋白編碼序列<140>
<141><160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>972<212>DNA<213>小白菜(Brassica Campestris ssp.Chinensis)CTGACAGGTA ATGAATTATG AGGAAGTCCT TACATCCCCT CCAGTTCTGT TCAATTCTGT 60TTCCGAATTC CGAATCGATG GCAAAGCTTG AAGGGGTGAT TGATAGGGAT CATAACTCGT 120CATCGAGCCC AGGAGAAAAC TTACAAATCG GAGAATGTTA TAACCCAAAA AGTTCCTTTT 180TTTGATGAGC CTTGAAGCCC ATAAAAATGC TTGTATTCCA GGACTCATCG CCAAATGGGT 240ATAGCAGGGT TCATCATCGA CCAATTCTTG TGCGAGAAAT TTCGAAGATA TTCGTTGAGA 300ATCAACGCAT ATTTGACCCT CTATGCGGTA TATTCTAAAT TGAAATTCGG ATATTGAAGG 360TATATAAAGA GTTTTTTCCG ACTTTTTTGT GCCGCAGCAT TTCCCCGTTA ATTGTAATTC 420TCATGCAAGG GAGGAGGCAA CAAGGAAGAT ATGGCAGGAA TCATCAACAA GATCGGAGAT 480GCTCTCCACA TCGGAGGAGG CAACAAGGAA GATGAGCACA AGAAGGAGGA ACACAAGAAA 540CACGCCGACG AGCACAAGAG TGGTGAGCAC AAGGAGGGTA TCGTTGATAA GATCAAAGAC 600AAGATCCACG GCGGAGAAGG CCACAGCAGC GGAGACCACA AACATGACGG TGAGAAGAAA 660AAGAAGAAGG GACAAGAAGG AGAAGAAACA CCATGATGAT GGTCACCACA GCAGCAGCAG 720TGACAGCGAC AGCGATTAAG GTAAGAAAGT GAGGAAGACT ATCAATGCTG CTGTTGTCCT 780TTTACTCTTG ATAGAGAGGG AGGGGTAGAT GAAAAGAGAA GAGTGCATCT GTCTTCCTTT 840GTTATCTAAT TTTCTTTTAA TTGTCGTTTT CACCTCTTAT GTTTAATGTT TTCTTGTCAG 900AAAAATAAAC CTCATGTATC GTAATCTACA TTAATAAAAT CGAGTTTCCT AACTAAAAAA 960AAAAAAAAAA AA 972<210>2<211>85<212>PRT<213>小白菜(Brassica Campestris ssp.Chinensis)<400>2MLSTSEEATR KMSTRRRNTR NTPTSTRVVS TRRVSLIRSK TRSTAEKATA AETTNMTVRR 60KRRRDKKEKK HHDDGHHSSS SDSDSD 8權(quán)利要求
1.一種小白菜水分脅迫蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有小白菜水分脅迫蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小白菜水分脅迫蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的小白菜水分脅迫蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第479-736位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小白菜水分脅迫蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小白菜水分脅迫蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種小白菜水分脅迫蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有小白菜水分脅迫蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479－736位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45－55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第479－736位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明在水分脅迫中具有明顯的作用，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/79GK1528898SQ200310107970
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者唐克軒, 李柱剛, 趙凌俠, 孫小芬, 唐東芹 申請人:上海交通大學(xué)