專利名稱：能在鹽化土壤中生長(zhǎng)的抗脅迫、超大轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求以下相關(guān)申請(qǐng)的權(quán)益由Roberto Gaxiola于1999年11月10日提出的名稱為“質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其在植物中的應(yīng)用”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/164,808；由Roberto Gaxiola于2000年8月22日提出的名稱為“質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其在植物中的應(yīng)用”的美國(guó)專利申請(qǐng)09/644,039以及由Roberto Gaxiola于2000年8月18日提出的名稱為“抗干旱、抗冷凍轉(zhuǎn)基因植物”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/226233，這些申請(qǐng)所包含的全部?jī)?nèi)容都以參考文獻(xiàn)的形式被收錄在此。政府支持在此所描敘的發(fā)明全部或部分由國(guó)立衛(wèi)生研究院(NationalInstitute of Health)批準(zhǔn)號(hào)GM52414、DK54214、DK43495、DK51509、DK34845、GM35010及由國(guó)家科學(xué)基金批準(zhǔn)號(hào)MCB9317175提供支持。政府在本發(fā)明中擁有一定的權(quán)利。
2.相關(guān)領(lǐng)域背景進(jìn)入新世紀(jì)后，養(yǎng)活整個(gè)人類的前景堪優(yōu)。隨著世界人口的不斷增長(zhǎng)，農(nóng)業(yè)研究一個(gè)主要目標(biāo)是提高作物產(chǎn)量。同樣，園藝研究的一個(gè)主要目標(biāo)是培育作物以外的強(qiáng)抗性植物，如觀賞植物、牧草、灌木以及其它發(fā)現(xiàn)有利于人類或能娛悅?cè)说闹参铩?br> 直到最近，作物和園藝植物的改良都有賴于對(duì)攜帶目標(biāo)性狀的植株進(jìn)行選擇育種。然而，這種選擇育種技術(shù)通常不太令人滿意，因?yàn)樵S多植株含有異種遺傳成分而使其目標(biāo)性狀和親本不一樣。
分子生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)允許人類對(duì)動(dòng)植物種質(zhì)進(jìn)行操作。植物遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(其典型形式為DNA或RNA)，其后將此遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物中去。使用這種技術(shù)培育了抗蟲性增強(qiáng)的植物、能產(chǎn)生藥物與其它化學(xué)物質(zhì)的植物及表達(dá)有利性狀的植物。有利的是，這種植物不僅包含有用基因，而且是可育的。
植物科學(xué)一個(gè)特別重要的新領(lǐng)域是培育脅迫抗性提高的植物。一般來(lái)說(shuō)，植物都擁有和維持著保證其在不利環(huán)境條件下生存的適應(yīng)機(jī)制。植物普遍遭受到的兩類的脅迫是冷凍和干旱，它們都和細(xì)胞脫水有關(guān)。已知某些植物攜帶在寒冷或長(zhǎng)期脫水條件下開(kāi)啟的基因，這些基因編碼的產(chǎn)物直接或間接地使此植物的抗旱性和/或抗凍性比其許多類似植物高?，F(xiàn)在已經(jīng)表征了許多熱脅迫和水分脅迫相關(guān)基因(見(jiàn)例如，美國(guó)專利5,837,545、5,071,962、4,707,359)。很多人相信，這些基因編碼某種可能有利于植物生存的蛋白質(zhì)，如“水分脅迫蛋白”。例如，某些植物在脅迫條件下產(chǎn)生名為脫落酸(ABA)的激素，此激素使植株氣孔關(guān)閉，從而降低了其受脅迫的嚴(yán)重程度。不幸的是，已知ABA抑制新葉的形成，促進(jìn)花和果實(shí)的脫落并導(dǎo)致減產(chǎn)。
據(jù)信，許多熱帶植物都不具備耐受長(zhǎng)期干旱和/或冷凍條件的進(jìn)化能力。相反，已知許多溫帶植物都形成了至少一些耐受此條件的能力。在干燥條件下及冷凍后，各植物種類的生產(chǎn)力有很大不同。例如，煙草(煙草屬(Nicotiana spp.))的新葉對(duì)干旱高度敏感，因而其不能在水資源匱乏和蒸發(fā)量高的地區(qū)進(jìn)行商業(yè)種植。與水分脅迫相比，對(duì)抗凍相關(guān)蛋白質(zhì)和基因知之甚少。然而，已經(jīng)假設(shè)了抗凍主成分可能和耐脫水有關(guān)(見(jiàn)例如，Yelenosky，G.C.，Guy，L.(1989)Plant Physiol.89444-451)。
另一個(gè)特別重要的新領(lǐng)域是培育在鹽化土壤中生長(zhǎng)能力提高的植物。含溶解鹽水分的供給使土壤發(fā)生鹽化。水分蒸發(fā)后，鹽類就在土壤中逐漸積累。在我們這個(gè)星球的大多數(shù)豐產(chǎn)地區(qū)，灌溉土地的不斷鹽化危及著農(nóng)業(yè)的未來(lái)(Serrano，R.等，Crit.Rev.Plant Sci.，13121-138(1994))。例如，干旱地區(qū)為大多數(shù)作物的生長(zhǎng)提供了最適宜的光周期和溫度條件，但其降雨量不太適宜。人工灌溉只能在短期內(nèi)解決問(wèn)題，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)處于這樣環(huán)境下的土壤往往很快被鹽化。為了能在防礙包括糧食作物在內(nèi)的許多植物生長(zhǎng)的鹽化環(huán)境下種植，植物必須在其胞質(zhì)中維持比其生長(zhǎng)土壤中存在的低得多的Na+/K+比率。
生理學(xué)研究表明，根的鹽外排和/或葉細(xì)胞液泡的鹽匯集是耐鹽的關(guān)鍵決定因素(Kirsch，M.，et al.，Plant Mol.Biol.，32543-547(1996))。氯化鈉(NaCl)的毒性濃度首先在完全展開(kāi)的葉片中形成，在此，NaCl被區(qū)室化于液泡中。只有在超過(guò)其負(fù)載容量時(shí)，胞質(zhì)及質(zhì)外體濃度才達(dá)到毒性水平，最終導(dǎo)致膨壓的喪失和植物的死亡。據(jù)說(shuō)，通過(guò)V-ATPase(腺苷三磷酸酶)可使液泡腔過(guò)度酸化以提供使胞質(zhì)解毒的Na+/H+交換活性所需的額外質(zhì)子(Tsiantis，M.S.，et al.，PlantJ.，9729-736(1996))。已知鹽脅迫能增加例如向日葵幼苗根液泡膜囊泡中的ATP依賴型及焦磷酸(PPi)依賴型H+轉(zhuǎn)運(yùn)。鹽處理也可誘導(dǎo)氨氯吡嗪脒敏感型Na+/H+交換活性(Ballesteros，E.，et al.，PhysiologiaPlantarun，99328-334(1997))。在鹽生植物(Mesembryanthemumcrystallinum)中，高含量NaCl刺激葉細(xì)胞液泡H+-ATPase(V-ATPase)及液泡Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。
農(nóng)業(yè)上還有的另一個(gè)重要領(lǐng)域是提高作物產(chǎn)量及改善某些觀賞植物的美學(xué)質(zhì)量。作物的產(chǎn)量及某些觀賞植物的美學(xué)質(zhì)量可以通過(guò)種植其營(yíng)養(yǎng)和/或繁殖結(jié)構(gòu)比野生型大的植物來(lái)得到提高。在本領(lǐng)域已知某些生長(zhǎng)因子可被用來(lái)增加植株和/或其花的大小。不幸的是，這類生長(zhǎng)因子的應(yīng)用是昂貴的和耗時(shí)的。
因此，在對(duì)這樣的植物存在需要其具有提高的對(duì)干旱和/或冷凍脅迫的抗性，擁有比其野生型相應(yīng)品種更大的大小特性，和具有增加的對(duì)其生長(zhǎng)土壤中鹽分的耐性。
發(fā)明概述本發(fā)明公開(kāi)了液泡焦磷酸酶表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)基因植物。已發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出這種上調(diào)活性的植物一般比其對(duì)應(yīng)野生型大，并且證明了其對(duì)干旱和/或冷凍的脅迫抗性以及對(duì)其生長(zhǎng)介質(zhì)中鹽分的耐性都得到了提高。
根據(jù)本發(fā)明，任何改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的合適外源核酸分子都可用來(lái)轉(zhuǎn)化該轉(zhuǎn)基因植物。外源核酸可包含編碼液泡焦磷酸酶蛋白(外源液泡焦磷酸酶)如AVP1，其功能部分(肽，多肽)或其同系物的核酸，和/或改變導(dǎo)入該外源核酸的植物中內(nèi)源液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸。在此所說(shuō)的“外源核酸”是指來(lái)自其導(dǎo)入的植物細(xì)胞以外來(lái)源或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因部分的植物或植物部分以外來(lái)源的核酸。用于轉(zhuǎn)化的外源核酸可以是RNA或DNA，(例如，cDNA、基因組DNA)。此外，外源核酸可以是環(huán)狀或線型、雙鏈或單鏈分子。單鏈核酸可以是有義鏈或反義鏈。編碼液泡焦磷酸酶蛋白的核酸的“功能部分”是指核酸中編碼能保持液泡焦磷酸酶蛋白功能特性的蛋白質(zhì)或多肽的部分。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，此核酸編碼AVP1，其功能部分或同系物。
可改變其中導(dǎo)入了外源核酸的植物中內(nèi)源液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸包括在植物中起作用的調(diào)節(jié)序列(如，誘導(dǎo)型的和組成型的)以及反義核酸。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括液泡焦磷酸酶的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和/或抑制基因。此核酸也可以包括如多腺苷酸化位點(diǎn)，報(bào)告基因和/或內(nèi)含子序列及其它類似序列，這些序列對(duì)核酸的功能或表達(dá)是非必需的，但可通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄和/或穩(wěn)定性(如mRNA的)等而提供該核酸的改良表達(dá)和/或功能。這些元件可被核酸分子包含而獲得核酸的最佳性能。
本發(fā)明所用的核酸可利用現(xiàn)有的方法從多種來(lái)源得到。例如，本發(fā)明所用編碼液泡焦磷酸酶(如，AVP1)的核酸可來(lái)自于天然來(lái)源，如煙草、細(xì)菌、番茄或玉米。在一個(gè)實(shí)施方案中，此核酸編碼與轉(zhuǎn)基因植物的野生型相應(yīng)的液泡焦磷酸酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此核酸編碼與轉(zhuǎn)基因植物的野生型不同的液泡焦磷酸酶。改變其中導(dǎo)入了外源核酸的植物中內(nèi)源液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸也可通過(guò)化學(xué)合成、重組產(chǎn)生和/或通過(guò)商業(yè)來(lái)源得到。
將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入植物的各種方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，可使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化法、顆粒轟擊法、微粒轟擊法(如，美國(guó)專利4,945,050；美國(guó)專利5,100,792)、原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法、向花粉轉(zhuǎn)移基因、繁殖器官注射法及未成熟胚注射法。外源核酸可被導(dǎo)入植物任何合適的細(xì)胞，如植物的根細(xì)胞、莖細(xì)胞和/或葉細(xì)胞。
任何合適的植物都可用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。例如，番茄、玉米、煙草、水稻、高粱、黃瓜、萵苣、草坪草、觀賞類(如，大花、大葉)及豆科植物都可按本文所述被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物能在土壤或水(水培)等任何支持植物生長(zhǎng)的介質(zhì)中生長(zhǎng)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選耐受土壤中高鹽濃度。術(shù)語(yǔ)“鹽”包括任何鹽類，即酸中的氫被金屬或其它等同物取代后形成的化合物，包括但不限于含一價(jià)和二價(jià)毒性陽(yáng)離子的鹽類，如NaCl、KCl、CaCl2、MgCl、CdCl、ZnCl及硫化物鹽類。
通過(guò)向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化可改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)以致表達(dá)上調(diào)的外源核酸，可向本發(fā)明的植物引入耐鹽性。任何合適的液泡焦磷酸酶(其中幾種已被克隆)都可用于本發(fā)明的組合物和方法中(例如，Sarasian，Z.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，891775-1779(1992)；Jenslerchl，等，Moled.Biol.，29833-840(1995)；Kim，Y.等，Plant Physiol.，106375-382(1994))。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及耐鹽轉(zhuǎn)基因植物，其含有設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1的外源核酸結(jié)構(gòu)(Sarasian，Z.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，891775-1779(1992))。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可在整體植株、種子、葉片、根或植物任何其它部分中進(jìn)行。此轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選被改變，以致它們可在抑制其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)的鹽濃度中生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子及由轉(zhuǎn)基因種子發(fā)育而來(lái)的后代轉(zhuǎn)基因植物都是本發(fā)明的主題，有利的是，它們都攜帶此耐鹽性狀。可從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物以獲得轉(zhuǎn)基因植物，這些轉(zhuǎn)基因植物可作一定水平耐鹽性的篩選。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，外源核酸編碼AVP1或其同系物。優(yōu)選液泡焦磷酸酶在植物中的表達(dá)增強(qiáng)到一定程度，使得轉(zhuǎn)基因植物可耐受濃度為約0.2M至約0.3M的氯化鈉(NaCl)。通過(guò)向一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中導(dǎo)入使植物液泡焦磷酸酶表達(dá)上調(diào)的核酸以形成轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可獲得能在鹽水中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物。這里所說(shuō)的“鹽水”包括含有鹽分的水，優(yōu)選地，水中鹽分的濃度為約0.2M至約0.4M。在一個(gè)實(shí)施方案中，鹽水指的是海水。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物也可用于獲得耐鹽(約0.2M至約0.4M的鹽濃度)雙轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及耐鹽雙轉(zhuǎn)基因植物，其含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)化了可改變植物液泡焦磷酸酶及Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(antiporter)表達(dá)的外源核酸的植物細(xì)胞。有利結(jié)構(gòu)的液泡焦磷酸酶是AVP1或其同系物，Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為AtNHX1或其同系物。本發(fā)明還包含雙轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代以及此轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和由此種子發(fā)育而成的后代轉(zhuǎn)基因植物。
通過(guò)向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化可改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)以致使表達(dá)上調(diào)的外源核酸，也可向植物中引入干旱和/或冷凍耐受性。在一個(gè)優(yōu)選方案中，提供了實(shí)質(zhì)上抗旱和/或抗凍的轉(zhuǎn)基因植物，其基因組中攜帶或多個(gè)外源導(dǎo)入的液泡H+轉(zhuǎn)運(yùn)泵基因。特別優(yōu)選的可育、耐旱和/或耐凍并能在鹽化土壤中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物中含有分離的編碼液泡H+轉(zhuǎn)運(yùn)泵的外源嵌合DNA結(jié)構(gòu)，其優(yōu)選可操作地連接上啟動(dòng)子，如35-S啟動(dòng)子或其它強(qiáng)啟動(dòng)子，包括但不限于組織特異性啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)基因植物可包含這樣的多核苷酸序列，此序列含有可操作地連接啟動(dòng)子的外源液泡膜焦磷酸H+泵基因。在另一種特別優(yōu)選的抗旱和/或抗凍并能在鹽化土壤中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物中，此多核苷酸序列含有可操作地連接了35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子的外源液泡膜焦磷酸H+泵基因。特別優(yōu)選的液泡膜焦磷酸H+泵基因?yàn)锳VP1基因。
通過(guò)以上描述的方法上調(diào)液泡焦磷酸酶的表達(dá)也可以用來(lái)提供具有比其相應(yīng)野生型植物更大的營(yíng)養(yǎng)和/或繁殖器官的植物。即，本發(fā)明提供了增加植物產(chǎn)量的方法，包括向一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞導(dǎo)入可改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸以形成轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此增加植物的產(chǎn)量。此方法可進(jìn)一步包括從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生植株以獲得轉(zhuǎn)基因植物，以及選擇比其相應(yīng)野生型植物更大的轉(zhuǎn)基因植物，從而產(chǎn)生比其相應(yīng)野生型植物更大的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還包括獲得花比其相應(yīng)野生型植物大的轉(zhuǎn)基因植物(如觀賞植物)的方法，此方法包含向一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞導(dǎo)入可改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸以形成轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明還公開(kāi)了新型基因盒，包括含可操作地連接嵌合啟動(dòng)子的液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)的H+泵基因的基因盒。還公開(kāi)了包含可操作地連接啟動(dòng)子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因的新基因盒，以及包含可操作地連接35S啟動(dòng)子雙串聯(lián)增強(qiáng)子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因的新編碼序列。優(yōu)選地，此編碼序列被設(shè)計(jì)來(lái)超量表達(dá)AVP1。
本發(fā)明還公開(kāi)了新型表達(dá)載體，包括含這樣的多核苷酸序列的表達(dá)載體，此多核苷酸序列含外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因，該基因可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子，進(jìn)一步可操作地連接多克隆位點(diǎn)；還包括含以下多核苷酸序列的表達(dá)載體，該多核苷酸序列中含外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因，該基因可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子，并進(jìn)一步可操作地連接異源編碼序列。
本發(fā)明人了解，所公開(kāi)的發(fā)明可應(yīng)用于任何植物，包括但不限于作物植物、觀賞植物、草、灌木、或其它發(fā)現(xiàn)有利于人類或能娛悅?cè)说闹参铩?br>

圖1B(1)、1B(2)及1B(3)從
圖1A中代表性WT及1’和2’品系得到的典型5天齡幼苗根及根毛的顯微圖片，其與垂直植物營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面平行生長(zhǎng)。
圖1C從野生型(WT)及超量表達(dá)AVP-1的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)分離的膜組分的免疫印跡。
圖2經(jīng)過(guò)7天水分缺乏脅迫后典型野生型植物(WT)與超量表達(dá)AVP-1的代表轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的俯視圖。
圖3在鹽化土壤生長(zhǎng)的野生型植物(WT)與超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的透視圖。
圖4A在酵母前液泡區(qū)室(pre-vacuolar compartment)中參與鈉匯集的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的工作模式示意圖；Nhxl(Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，Vmal(液泡膜H+-ATPase)，Gefl(酵母CLC氯化物通道)，Enal(質(zhì)膜Na+-ATPase)。
圖4B圖4A中在酵母前液泡區(qū)室中參與鈉匯集的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的工作模式示意圖，還包括Avpl(A.thaliana液泡焦磷酸能化質(zhì)子泵)。
圖5A與圖5B顯示野生型酵母菌株及攜帶各種影響鈉耐受性的突變的酵母菌株細(xì)胞內(nèi)Na+與K+濃度的條形圖，這里的值是兩次測(cè)定的平均值，條代表標(biāo)準(zhǔn)差。
圖6A，6B，6C以接緣線A-A和B-B相連時(shí)，表示擬南芥屬(Arabidopsis)NhX1同系物AtNHX1(SEQ ID NO1)、人HsNHE-6(SEQ IDNO2)及酵母ScNHX1(SEQ ID NO3)推導(dǎo)的氨基酸序列的對(duì)比；相同的殘基以黑框表示，短線表示序列間隔區(qū)，序列對(duì)比上的*表示人NHE1(163DVF-FLFLLPPI173)(SEQ ID NO4)假定的氨氯吡嗪脒結(jié)合位點(diǎn)。
圖7于鹽化土壤中生長(zhǎng)的野生型植物(WT)與超量表達(dá)AVP-1的典型轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的Na+與K+濃度條形圖。
圖8圖3中2’的35SAVP-1轉(zhuǎn)基因液泡膜囊泡(正方形)與圖3中野生型(WT)囊泡鈣吸收?qǐng)D。
圖9A與9B表示與野生型液泡相比，液泡中通過(guò)質(zhì)子驅(qū)動(dòng)作用干物質(zhì)(solids)高度積累的理論機(jī)制圖解。
發(fā)明詳述由于植物液泡占一個(gè)成熟植物細(xì)胞總細(xì)胞內(nèi)體積的40％至99％，液泡體積的變化顯著影響細(xì)胞的大小(R.G.Zhen，E.j.Kim，P.A.Rea，in ThePlant Vacuole.(Academic Press Limited，1997)，vol.25，pp.298-337)。液泡體積通過(guò)由泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的離子與水流控制。在植物中，引導(dǎo)離子、溶質(zhì)及水跨膜運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力是質(zhì)子梯度。液泡H+泵的活性導(dǎo)致其腔內(nèi)酸化并建立跨液泡膜的H+電化學(xué)勢(shì)梯度，為無(wú)機(jī)離子、蔗糖及有機(jī)酸的次級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供能量。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值及離子的穩(wěn)態(tài)，并導(dǎo)致產(chǎn)生促進(jìn)液泡膨脹的滲透勢(shì)所需溶質(zhì)的積累(H.Sze，X.Li，M.G.Palmgren，The Plant Cell 11，677-689(1999))。
有3個(gè)不同的泵產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)梯度。一個(gè)位于質(zhì)膜上，從細(xì)胞中排出H+(PM H+-ATPase)；兩個(gè)位于液泡膜或其它內(nèi)膜區(qū)室中，使它們的內(nèi)腔酸化(液泡型H+-ATPase與H+-PPase)(R.A.Leigh，in The PlantVacuole L.a.Sanders，Ed.(Academic Press，San Diego，California，1997)，vol.25，pp.171-194.)。
以前的工作表明，利用反義結(jié)構(gòu)減少胡蘿卜液泡H+-ATPase A亞基的水平可導(dǎo)致植物細(xì)胞膨脹度降低及葉形態(tài)的改變(J.P.Gogarten，等，ThePlant Cell 4，851-864(1992))。本發(fā)明人假設(shè)液泡中H+供應(yīng)的增加可導(dǎo)致細(xì)胞膨脹。最近，基于液泡離子積累功能中質(zhì)子的有效性理論，本發(fā)明人作出這樣的假說(shuō)液泡中干物質(zhì)的積累可能有利于抗旱并產(chǎn)生更抗凍的植物。
本發(fā)明人知曉，植物有許多液泡H+-轉(zhuǎn)運(yùn)泵，通過(guò)上調(diào)其活性、提高其表達(dá)、上調(diào)其轉(zhuǎn)錄和/或翻譯、或增加其拷貝數(shù)，可以由液泡中質(zhì)子的有效性增加導(dǎo)致液泡中干物質(zhì)的積累增加。發(fā)明人通過(guò)增加液泡H+-轉(zhuǎn)運(yùn)泵、無(wú)機(jī)焦磷酸酶或由單個(gè)多肽組成的V-PPase的拷貝數(shù)檢驗(yàn)了這個(gè)假說(shuō)(R.G.Zhen，E.j.Kim，P.A.Rea，in The Plant Vacuole.(Academic PressLimited，1997)，vol.25，pp.298-337)。在擬南芥屬中，由AVP-1基因編碼的V-PPase能夠產(chǎn)生大小與液泡H+-ATPase的類似的跨液泡膜H+梯度(V.Sarafian，Y.Kim，R.J.Poole，P.A.Rea，Proc.Natl.Acad.Sci.89，1775-1779(1992))。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，其它植物中的相似基因?qū)⒁韵嗨频姆绞阶饔谩?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，包含可操作地連接用于超量表達(dá)液泡焦磷酸酶的啟動(dòng)子的液泡焦磷酸酶基因的結(jié)構(gòu)(例如表達(dá)盒)被用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。在此所說(shuō)的“超量表達(dá)”是指比缺乏此結(jié)構(gòu)的表達(dá)/活性更強(qiáng)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，包含可操作地連接用于超量表達(dá)AVP1的嵌合啟動(dòng)子的AVP1基因的結(jié)構(gòu)被用來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。更具體的是，本發(fā)明涉及其中AVP1基因可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物除那些與糧食價(jià)值和觀賞價(jià)值有關(guān)的用途外可找到其它用途。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可吸收與其野生型對(duì)應(yīng)植物不同或更多的離子。如下面的討論，通過(guò)對(duì)酵母突變菌株(enal)的研究表明液泡中H+-轉(zhuǎn)運(yùn)泵對(duì)高等植物陽(yáng)離子的解毒起著重要作用(植物中涉及細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子解毒體系的組分已經(jīng)通過(guò)互補(bǔ)出芽釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的鹽敏感突變體而被鑒定出來(lái))。根據(jù)此研究，包含改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸的轉(zhuǎn)基因植物和/或其后代也可用于對(duì)土壤和生長(zhǎng)介質(zhì)進(jìn)行生物除污。此類植物可被用來(lái)從支持植物生長(zhǎng)的介質(zhì)中(如，土壤，水)除去陽(yáng)離子(如，單價(jià)和/或雙價(jià)陽(yáng)離子)。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物可被用來(lái)從支持植物生長(zhǎng)的介質(zhì)中除去鈉(Na)，鉛(Pb)，錳(Mn)，和/或鈣(Ca)離子。
為了證明增加液泡H+供應(yīng)對(duì)抗旱和/或抗凍性、耐鹽性及植株大小的影響，本發(fā)明人產(chǎn)生了包含液泡質(zhì)子泵AVP1額外拷貝的轉(zhuǎn)基因植物。
將含AVP-1基因的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana)植物中。然后分離包含此基因額外拷貝的轉(zhuǎn)基因品系。AVP-1的開(kāi)放閱讀框被克隆到修飾pRT103的Xma1位點(diǎn)[R.Topfer，V.Matzert，B.Gronenborn，J.Schell和H-H.Steinbiss，Nucleic acid Research 15，5890(1987)]。此載體包含35-S啟動(dòng)子的串聯(lián)重復(fù)。含35-S串聯(lián)啟動(dòng)子、AVP-1的開(kāi)放閱讀框及多腺苷酸化信號(hào)的HindIII片段被亞克隆到pPZP212載體的HindIII位點(diǎn)上[P.Hajdukiewicz，Z.Svab和P.Maliga，Plant MolecularBiology 25，989-994(1994)]。對(duì)經(jīng)過(guò)真空滲入處理的開(kāi)花擬南芥(colunbia生態(tài)型)的進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。通過(guò)將轉(zhuǎn)化植物種子鋪板到補(bǔ)加25mg/L卡那霉素的植物營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行選擇。隨后對(duì)植株進(jìn)行兩代選擇以鑒定轉(zhuǎn)基因純合的轉(zhuǎn)基因植物。
圖1A是于10小時(shí)光/暗周期下水培7周的典型野生型(WT)(每10株取一株)及兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)的俯視圖。從
圖1A中可以看到最高水平表達(dá)AVP-1蛋白的轉(zhuǎn)基因品系2’與轉(zhuǎn)基因品系1’及野生型(WT)的形象比較，證明了AVP-1的量與植物大小相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的質(zhì)量比其野生型的大。在75℃(n＝4)烘烤24小時(shí)后測(cè)量整個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的干重，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因品系1’和2’的干重分別比其野生型(WT)的高1.5和3倍。
圖1B(1)、1B(2)及1B(3)是從
圖1A中WT代表株及1’和2’轉(zhuǎn)基因品系得到的典型5天齡幼苗根及根毛表面平行地種植于垂直植物營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的顯微圖片(放大倍數(shù)40倍；圖中條長(zhǎng)為2mm)。轉(zhuǎn)基因品系1’和2’幼苗的根毛平均長(zhǎng)度分別比野生型(WT)根毛長(zhǎng)40％和70％(
圖1B)(從每組幼苗中選取5株測(cè)定主根周圍根毛的長(zhǎng)度，平均每株測(cè)量80條根毛)。根毛長(zhǎng)度和液泡大小相關(guān)，因此，根毛長(zhǎng)度的增加可能源于液泡體積的增大)。這與擬南芥屬突變體rdh3形成比較，據(jù)報(bào)道，擬南芥屬突變體rdh3具有縮小了的液泡容積，是具異常短根毛的矮化植物(M.E.Galway，J.W.J.Heckman，J.W.Schiefelbein，Planta201，209-218(1997))。已得到認(rèn)可的是，擴(kuò)大的根結(jié)構(gòu)將對(duì)土壤侵蝕、豆科植物的固氮產(chǎn)生積極的影響并將利于植物水分的吸收。
圖1C是從野生型(WT)及超量表達(dá)AVP-1的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)分離的膜組分的免疫印跡圖。從水培過(guò)6周的8周齡野生型(WT)和AVP-1轉(zhuǎn)基因植株(1’和2’)的幼枝中分離總體膜組分。依次分別在8kg和100kg下將植株幼枝勻漿離心15和30分鐘。將在100kg離心的膜沉淀重新懸浮于10mM Tris(Ph7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油和1mM PMSF蛋白(10mg)中，以10％SDS-PAGE分離，電印跡，并用抗相應(yīng)于AVP-1蛋白推測(cè)親水環(huán)IV的KLH結(jié)合合成肽的抗體進(jìn)行免疫染色。(V.Sarafian，Y.Kim，R.J.Poole，P.A.Rea，Proc.Natl.Acad.Sci.89，1775-1779(1992))。以化學(xué)發(fā)光檢測(cè)PPase。
圖1C表明，轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)的AVP-1表達(dá)水平比野生型(WT)高(即，1’比WT高15％，2’比WT高50％)。
因?yàn)樾←渼儕Z水后其耐旱性因細(xì)胞K+含量的增加(從100mM到300mM)而得到加強(qiáng)(S.Gupta，G.Berkowitz，P.Pier，Plant Physiol 89，1358-1365(1989))，所以假設(shè)(但本發(fā)明在此并不局限于這種理論)AVP-1轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的提高可能是由于它們液泡中鉀濃度升高而增加了其保水力的緣故。實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證看來(lái)證明了這點(diǎn)。
圖2是經(jīng)過(guò)7天水分缺乏脅迫后典型野生型植物(WT)與超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的俯視圖。對(duì)野生型和超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物(圖3A)進(jìn)行耐旱測(cè)試(24℃)。經(jīng)過(guò)7天的缺水脅迫后，野生型(WT)植株枯萎，而來(lái)自35AVP-1轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)的植株都挺立且保持活力。此外，隨后對(duì)干旱脅迫植株進(jìn)行澆灌時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物繼續(xù)正常生長(zhǎng)、抽苔并結(jié)籽，而野生型植株死亡。在缺水脅迫期間測(cè)定野生型和35SAVP-1轉(zhuǎn)基因植株葉片的相對(duì)含水量，結(jié)果表明，與野生型(WT)植株相比轉(zhuǎn)基因植物保水力增加。
盡管在附圖中沒(méi)有得到表述，有關(guān)大量植物種在24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的抗凍測(cè)試(低于0℃)也得到類似結(jié)果。盡管不局限于此假說(shuō)，據(jù)信，超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的抗凍性比野生型(WT)提高是由于液泡中陽(yáng)離子量的增加。高濃度的陽(yáng)離子提供了更強(qiáng)的滲透壓而導(dǎo)致保水力得到加強(qiáng)，從而不僅賦予植株抵抗低土壤水勢(shì)的能力，而且還使植株更好地免受冷凍的傷害，冷凍會(huì)導(dǎo)致植株明顯脫水。
圖3是在鹽化土壤生長(zhǎng)的野生株(WT)與超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的透視圖。于10小時(shí)光/暗周期條件下，在土壤中分別種植5個(gè)野生型(WT)植物及2個(gè)超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)。以稀釋營(yíng)養(yǎng)液(1/8 MS鹽)澆灌植株6周，其后以補(bǔ)充NaCl的稀釋營(yíng)養(yǎng)液澆灌。NaCl的起始濃度為100mM，每4天增加100mM。圖3中的照片對(duì)應(yīng)于在300mM NaCl存在時(shí)第10天的植株。圖3表明，在含鹽土中，兩個(gè)AVP-1(1’和2’)植物類型的生長(zhǎng)明顯比野生型植物強(qiáng)壯。超量表達(dá)AVP-1(焦磷酸能化液泡膜質(zhì)子泵，本發(fā)明的工作)或AtNHX1(Na+/K+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，(Apse，M.，等，Science，2851256-1258(1999))和本發(fā)明的工作)的擬南芥遺傳工程植株能在高濃度NaCl存在時(shí)生長(zhǎng)的事實(shí)有力地支持了本文所描述的策略?？梢灶A(yù)料，雙價(jià)轉(zhuǎn)基因植物可被證明具有更強(qiáng)的耐鹽表型。在重要的農(nóng)藝作物中，這些擬南芥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其對(duì)應(yīng)物可能起類似的作用。35S AVP1擬南芥屬轉(zhuǎn)基因植物尺度的增加也有益于遺傳工程作物潛在產(chǎn)量的提高。植物細(xì)胞器中陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)的工作模式盡管本發(fā)明不局限于任何特定假說(shuō)，本發(fā)明人還是提出了植物細(xì)胞器中陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)的工作模式，這可以解釋有關(guān)本文所公開(kāi)的轉(zhuǎn)基因植物意想不到的結(jié)果。
在植物中，大多數(shù)運(yùn)輸過(guò)程由質(zhì)子的初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量。位于質(zhì)膜和液泡膜上的H+轉(zhuǎn)運(yùn)泵將H+從胞質(zhì)分別轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外及液泡區(qū)室中(Rea，P.A.，等，Tonoplast Adenosine Triphosphate and inorganicPyrophosphate. InMethods Plant Biochem.，第385-405頁(yè)，AcademicPress Limited，London(1990))。植物液泡膜含有兩類H+轉(zhuǎn)運(yùn)泵V-ATPase及無(wú)機(jī)焦磷酸酶或V-PPase。它們的作用導(dǎo)致腔酸化并建立跨液泡膜的H+電化學(xué)勢(shì)梯度(Davies，J.M.，等The Bioenergetics of Vacuolar H+Pumps. InPlant Vacuole，pp.340-364，Leigh，R.A.，Sanders，D(eds.)，Academic Press，San Diego(1997))。液泡膜涉及到廣泛的生理學(xué)過(guò)程，包括胞質(zhì)pH穩(wěn)定性、調(diào)控Ca2+的區(qū)室化、Na+等毒性離子的匯集、膨壓調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存與再生。液泡占一個(gè)成熟植物細(xì)胞總細(xì)胞內(nèi)體積的40％至99％。液泡質(zhì)子泵焦磷酸酶是植物液泡膜的一個(gè)普遍而豐富的組分，它能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的與V-ATPase所產(chǎn)生的相似或更大的跨液泡膜H+電化學(xué)勢(shì)。(Rea，P.A等，Tonoplast Adenosine Triphosphate and InorganicPyrophosphates.InMethods Plant Biochem.，pp.385-405，AcdemicPress Limited，London(1990))。焦磷酸(PPi)是在廣泛的生物合成途徑中活化或聚合步驟中的副產(chǎn)物，在植物中作為ATP的替代能量供體在以下途徑中起作用通過(guò)蔗糖合成酶的蔗糖轉(zhuǎn)移，通過(guò)PPi果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶的糖酵解及通過(guò)液泡質(zhì)子泵焦磷酸酶的液泡膜能化作用(Stitt，M.，Bot.Acta111167-175(1998))。
大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，包括披有網(wǎng)格蛋白的小泡、內(nèi)體、高爾基體膜及液泡，都具有酸性內(nèi)腔(Xie，X.S.等，J.Biol.Chem.，26418870-18873(1989))。此酸化作用由質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)生電ATPase調(diào)節(jié)，在植物液泡中也由焦磷酸驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵V-PPase調(diào)節(jié)(Davies，J.M等，TheBioenergetics of Vacuolar H+Punps.InLergh R.A.，Sanders，D.，(eds)The Plant Vacuole，pp340-363，Academic Press，San Diego(1997)；Zhen，R.G.，等，The Molecular and Biochemical Basis of Pyrophospate-Energized Proton Translocation at the Vacuolar Membrane，AcademicPress Limited(1997))。需要陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)的存在以維持凈電中性(al-Awqati，A.，Curr.Opin.Cell.Biol.，7504-508(1995))。
圖4A是在酵母前液泡區(qū)室中參與鈉富集的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的工作模式示意圖；Nhxl(Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，Vmal(液泡膜H+-ATPase)，Gefl(酵母CLC氯化物通道)，Enal(質(zhì)膜Na+-ATPase)。CLC電壓門控氯化物通道超家族的酵母成員Gef1為酵母新高爾基體囊泡中銅的裝載及前液泡區(qū)室中陽(yáng)離子的富集所需(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998)；Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)；實(shí)施例1)。此外，已經(jīng)顯示，通過(guò)導(dǎo)入CLC超家族的原型成員Torpedo marmorata CLC-O或?qū)霐M南芥CLC-c及CLC-d氯化物通道基因可抑制gef1突變體的缺陷(Hechenberger，M等，J.Biol.Chem.，27133632-33638(1996)；Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sxi.USA，954046-40509(1998))。圖4B是圖4A中在酵母前液泡區(qū)室中參與鈉富集的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的工作模式示意圖，其還包括Avp1(擬南芥屬液泡焦磷酸能化質(zhì)子泵)。
盡管不希望為理論所束縛，還是通過(guò)2項(xiàng)觀察提出了酵母中Na+富集模式的假設(shè)，如圖4A與4B所示。第一，gef1突變體對(duì)高濃度NaCl敏感。第二，Na+/H+交換體Nhx1位于前液泡區(qū)室中(Nass，R.，等，Biol.Chem.，27321054-21060(1998))。圖4A與4B提出的模式假定通過(guò)NhX1的Na+富集依賴于液泡H+-ATPase及Gef1氯化物通道。Gef1介導(dǎo)的陽(yáng)離子內(nèi)流允許通過(guò)液泡H+-ATPase建立足夠的質(zhì)子梯度以驅(qū)動(dòng)Na+通過(guò)Na+/H+交換向上積累。
基于此模式，提出理論增加質(zhì)子向假定的內(nèi)體區(qū)室流入將通過(guò)Nhx1交換體增進(jìn)Na+的富集。為了提高H+的有效性，對(duì)擬南芥編碼液泡焦磷酸能化質(zhì)子泵的功能獲得性(gain-of-function)突變基因AVP1-D進(jìn)行了表達(dá)(圖3B)(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))。這種植物泵在酵母中的表達(dá)恢復(fù)了測(cè)試菌株的Na+抗性，但條件是此菌株具有功能性NHX1及GEF1基因。此外，Gef1p與Nhx1p共存于共同細(xì)胞器，即前液泡區(qū)室中(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。這些結(jié)果有力地支持了圖4A與4B中的模式，并表明了酵母前液泡區(qū)室能被用于鑒定令人困惑的參與細(xì)胞內(nèi)鈉鹽解毒的植物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
圖4A與4B中提出的模式完全與高等植物液泡在陽(yáng)離子解毒中所起作用的生理資料一致。酵母和植物細(xì)胞的小泡從高爾基體網(wǎng)絡(luò)到液泡的運(yùn)輸途徑和信號(hào)是相同的(Neuhaus，J.M.，等，Plant Mol.Biol.，38127-144(1998)；(Paris，N.，等，Plant Physiol.，11529-39(1997)；Sato，M.H.等，J.Biol.Chem.，27224531-24535(1997)；Vitale，A.V.等，Trends Plant Sci.，4148-154(1999))。因此，在酵母中進(jìn)行了有關(guān)研究以確定高等植物液泡在陽(yáng)離子解毒中的作用。酵母中陽(yáng)離子富集機(jī)制的研究實(shí)施例1酵母菌株中AtNhx1與Avp1的功能為了測(cè)試圖4A與4B中提出的富集模式，構(gòu)建了酵母突變體菌株(ena1)，它缺乏質(zhì)膜鈉外排泵，因而必需依靠?jī)?nèi)部解毒系統(tǒng)以使其能在高鹽中生長(zhǎng)。圖4A與4B中的這種富集模式(Nass，R.和Rao，R.，J.Biol.Chem.27321045-21060(1998)，以及Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))預(yù)測(cè)，如果能夠增強(qiáng)假定的內(nèi)體區(qū)室中質(zhì)子的有效性，即增加質(zhì)子的流入，胞質(zhì)Na+將由Nhx1交換體得到富集，從而會(huì)使ena1突變株獲得耐鹽性。
酵母液泡ATPase是一個(gè)多亞基蛋白質(zhì)，因此通過(guò)超量表達(dá)其中任何亞基都很難增強(qiáng)酶的活性。相反，通過(guò)在酵母表達(dá)擬南芥AVP1基因而增加質(zhì)子的流入則能達(dá)到這樣的效果。這個(gè)基因編碼單個(gè)多肽，當(dāng)它在酵母中表達(dá)時(shí)，能夠?qū)①|(zhì)子泵入液泡腔中(Kim，E.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，916128-6132(1994))。為了保證這種質(zhì)子泵的最大活性，對(duì)能增強(qiáng)H+泵動(dòng)能力的AVP1基因(AVP1-D)的E229D功能獲得性突變體進(jìn)行了表達(dá)(Zhen，R.G.等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))。對(duì)在含高濃度NaCl的SD-尿嘧啶培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后的突變型及野生型細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈉和鉀濃度進(jìn)行了測(cè)定。材料與方法酵母菌株及質(zhì)粒使用了W303(ura3-1 can1-100 leu2-3，112trp1-1 his3-11，(Gaxiola，R.A.等，EMBO J.，113157-3164(1992))的等基因菌株。利用pRG52質(zhì)粒(gef1∷HIS3)(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))和pRG197質(zhì)粒(nhx1∷HIS3)質(zhì)粒構(gòu)建GEF1與NHX1基因缺失，分別產(chǎn)生RGY85和RGY296菌株。enal∷HIS3突變體是從Fink實(shí)驗(yàn)室保藏中心(Fink Lab collection)(L5709)中獲得的。
轉(zhuǎn)化方法使用乙酸鋰方法(Gietz，D.，等，Nucleic Acids Res.，201425(1992))對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。通過(guò)單突變菌株的雜交獲得雙突變體RGY324(gef1∷HIS enal∷HIS3)、RGY326(nhx1∷HIS3enal∷HIS3)及RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)。從減數(shù)分裂后代中通過(guò)與每個(gè)單突變體有關(guān)的表型評(píng)分對(duì)雙突變體進(jìn)行鑒定。孢子形成、四分體剖分及接合型的評(píng)分如文獻(xiàn)所述(Guthrie C.and Fink，G.R.，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic，San Diego(1991))。細(xì)胞在YPD(1％酵母/2％蛋白胨/2％葡萄糖；Difco)、YPGAL(1％酵母/2％蛋白胨/2％半乳糖；Difco)、SD(Difco；含2％葡萄糖的合成培養(yǎng)基)或AGP(AGP是合成基本培養(yǎng)基，包含10mM精氨酸、8mM磷酸、2％葡萄糖、2mM MgSO4、1mM KCl、0.2mM CaCl2及微量礦物質(zhì)和維生素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Rodrguez-Navarro，A.and Ramos，J.，J.Bacteriol.，159940-945(1984))。按說(shuō)明加入MnCl2(Sigma)、氯化四甲銨(Sigma)、NaCl(Sigma)或潮霉素B(Sigma)。
以pYES2載體(Invitrogen)及pYES2-AVP1-E229D質(zhì)粒(如Zhen，R.G等所述，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))轉(zhuǎn)化野生型菌株L5709(enal∷HIS3)、RGY324(gef1∷HIS3 enal∷HIS3)及RGY326(nhx1∷HIS3enal∷HIS3)。以pRG151(GEF1-GFP)(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))及pRIN73[NHX1-(HA)3](Nass，R.，and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))對(duì)用于組織化學(xué)分析的菌株RGY324(gef1∷HIS3 enal∷HIS3)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
以pAD4載體(Ballester，R.，等，Cell，95681-686(1998))轉(zhuǎn)化野生型及RGY296(nhx1∷HIS3)菌株。以pRG308(ADH1∷AtNHX1)(見(jiàn)AtNHX1的克隆)轉(zhuǎn)化RGY296(nhx1∷HIS3)。
細(xì)胞內(nèi)鈉和鉀濃度的測(cè)定細(xì)胞在SD-尿嘧啶(SD-ura)培養(yǎng)基(Difco；含2％葡萄糖而不含尿嘧啶的合成培養(yǎng)基)中過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)后的原液接種到Y(jié)PGAL培養(yǎng)基(1％酵母/2％蛋白胨/2％半乳糖；Difco)上并培養(yǎng)至A600達(dá)到0.6。在此OD值時(shí)，加入NaCl至終濃度為0.7M。再將細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)后離心收集，以1.1M山梨糖醇及20mM MgCl2洗滌兩次，于95℃用水提取(entracted)30分鐘。
在Georgia大學(xué)化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室以Inductively CoupledPlasma-MS(見(jiàn)環(huán)球網(wǎng)rserv/uga.edu.rsnew/chemicalanalysis/)測(cè)定細(xì)胞中Na+及K+量。按文獻(xiàn)(Gaxiola，R.A.等，EMBO J.，113157-3164(1992))通過(guò)計(jì)算在1M NaCl中培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)水分值來(lái)估測(cè)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子濃度。
免疫熒光在SD-尿嘧啶、-亮氨酸培養(yǎng)基(Difco；含2％葡萄糖而不含尿嘧啶及亮氨酸的合成培養(yǎng)基)將RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，加入0.1mg/ml潮霉素B，培養(yǎng)物于30℃溫育1小時(shí)。在室溫靜止的條件下以3.7％的甲醛(Sigma)固定細(xì)胞45分鐘。按文獻(xiàn)(Pringle，J.，等，in Immunofluorescence Methods for Yeast，eds.Guthrie，C.And Fink，G.F.(Academic，Sand Diego)，Vol.194pp.565-602(1991))進(jìn)行原生質(zhì)球制備、透化、洗滌及抗體孵育。所用的第一抗體MBA HA11由Babco(Richmond，CA)提供。Cy3-結(jié)合羊抗鼠IgG由Jackon Immunoresearch提供。加入4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(Sigma)至封固培養(yǎng)基中以對(duì)線粒體及核DNA進(jìn)行染色。
亞細(xì)胞分級(jí)分離及Western分析在APG培養(yǎng)基(pH7.0)上培養(yǎng)RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)菌株，按文獻(xiàn)(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))對(duì)胞溶產(chǎn)物進(jìn)行10級(jí)蔗糖密度梯度分級(jí)分離。按文獻(xiàn)(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))對(duì)每個(gè)組分的等分試樣(100μg)進(jìn)行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS/PAGE)并向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移。以單克隆抗GEP(綠色熒光蛋白)抗體(1∶10,000稀釋，CLONTECH)、抗血凝素抗體(1∶10,000稀釋，Boehringer Mannheim)及過(guò)氧化物酶偶連羊抗鼠抗體(1∶5,000)為探針進(jìn)行Western雜交，以ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Pharmacia)顯影。
AtNHX1的克隆以一個(gè)包含部分克隆的已表達(dá)序列標(biāo)簽(擬南芥屬BiologicalResource Center，DNA保藏中心)作探針從擬南芥(Kieber，J.J.，等，Cell，72427-441(1993))的噬菌體cDNA文庫(kù)(來(lái)源于擬南芥屬Biological Resource Center)克隆AtNHX1。全長(zhǎng)克隆(2.1kB)連接到載體pSK2(Stratagene)的NotI位點(diǎn)，形成質(zhì)粒pRG293。以pRG293(作為模板)、GGCCCGGGATGGATTCTCTAGTGTCGAAACTGCCTTCG(SEQ ID NO5)(斜體堿基對(duì)應(yīng)于OFR的1-30個(gè)核苷酸)及T7寡核苷酸對(duì)AtNHX1開(kāi)放閱讀框(ORF)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以XbaI及SalI消化后連接到pAD4載體中以形成質(zhì)粒pRG308。對(duì)AtNHX1 ORF進(jìn)行測(cè)序以檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物的忠實(shí)性。此全長(zhǎng)序列比據(jù)Arabidopsis Genome Initiative(ATM021B04.4)報(bào)道的ORF長(zhǎng)，并已被GenBank收錄(登錄號(hào)AF106324)AVP1-D的克隆載體pYES32(Invitrogen)被導(dǎo)入到野生型及ena1、enal nhxl、enal gefl突變體中。質(zhì)粒pYes2-AVP1-D(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))被導(dǎo)入到ena1、enal nhxl、enal gefl突變體中。將每個(gè)菌株作5倍系列稀釋(始于105個(gè)細(xì)胞)后鋪板于包含或不包含0.5M NaCl的YPGAL(1％酵母提取物/2％蛋白胨/2％半乳糖)上，并于30℃溫育2天。以0.7M NaCl處理指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞(pYES2載體轉(zhuǎn)化的野生型、ena1及攜帶pYes2-AVP1-D的ena1、enal nhxl、enal gefl突變體)6小時(shí)。制備總細(xì)胞提取物并測(cè)定Na+及K+的濃度。
結(jié)果具上述結(jié)構(gòu)的ena1突變體缺乏質(zhì)膜鈉外排泵，因而必須依靠?jī)?nèi)部解毒系統(tǒng)去克服鈉的毒性。ena1菌株的生長(zhǎng)對(duì)低濃度鈉(200mM)敏感，此濃度不會(huì)抑制野生菌株的生長(zhǎng)。AVP1-D的超量表達(dá)恢復(fù)了鹽敏感ena1突變體的耐鹽性。通過(guò)AVP1-D恢復(fù)ena1突變體的耐鹽性需要功能性NHX1及GEF1基因enla nhx1 AVP1-D及enal gef1 AVP1-D菌株是鹽敏感的。
圖5A與圖5B是野生型酵母菌株及攜帶各種影響鈉耐受性的各種突變的酵母菌株細(xì)胞內(nèi)Na+與K+濃度條形圖，這里的值是兩次測(cè)定的平均，條代表標(biāo)準(zhǔn)差。在添加0.7M NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)后，測(cè)定野生型菌株及攜帶各種影響鈉鹽耐性突變的菌株細(xì)胞內(nèi)Na+與K+的含量。發(fā)現(xiàn)ena1突變體細(xì)胞內(nèi)Na+含量比野生型菌株高8倍?？梢钥吹皆趀nal AVP-D菌株中細(xì)胞總Na+一致的下降。這種下降的原因還尚未知曉。發(fā)現(xiàn)enalAVP-D菌株是抗鹽的，即使其細(xì)胞內(nèi)Na+含量比野生型高4倍。在缺乏gef1或nhx1(即，enal gefl或enal nhxl)的enal AVP-D菌株中，Na+濃度沒(méi)有降低到GEF1 NHX1菌株中的程度?？偠灾z傳和生理資料與Nhx1、Gefl及Avpl協(xié)作富集內(nèi)部鈉鹽的模式是相符的。從圖中可以看出，擬南芥屬液泡H+-焦磷酸酶(Avp1)證實(shí)賦予了酵母enal突變體以耐鹽性。
發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)K+的含量與耐鹽性相關(guān)，而與菌株中Na+含量呈反相關(guān)(圖4B)。在野生型中K+的濃度是100mM，但在enal突變體中則降低到20mM。有趣的是，在AVP1-D基因超量表達(dá)的enal菌株中，細(xì)胞內(nèi)K+的濃度幾乎恢復(fù)到了野生型的水平(圖4B)。然而，AVP1-D超量表達(dá)不能使細(xì)胞內(nèi)K+的濃度恢復(fù)到野生型的水平，除非NHx1及GEF1都具有功能(見(jiàn)，圖4Benal nhxl或enal gefl雙突變體)。
如此所述，酵母細(xì)胞內(nèi)Na+解毒需要功能性Na+/H+交換體(Nhx1)及氯化物通道(Gef1)，并且它們共存于前液泡區(qū)室中(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。在克隆酵母NHX1基因的擬南芥同系物(AtNHX1)并在nhx1酵母突變體檢測(cè)其功能后，發(fā)現(xiàn)AtNHX1基因能夠部分抑制nhx1突變體的陽(yáng)離子敏感表型。圖6是擬南芥屬AtNHX1(SEQ ID NO1)的Nhx1同系物、人HsNHE-6(SEQ ID NO2)及酵母SxNHX1(SEQ ID NO3)的推導(dǎo)氨基酸序列的對(duì)比，相同的殘基以黑框表示，短線表示序列間隔區(qū)，序列對(duì)比上的*表示人NHE1(163DVF-FLFLLPPI173)(SEQ ID NO4)假定的氨氯吡嗪脒結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例2酵母菌株Geflp與Nhxlp的功能和共定位被鑒定為在鈉鹽解毒中起重要作用的NHX1與GEF1基因?qū)ζ渌?yáng)離子的解毒也是需要的。根據(jù)圖4A與4B提出的模式，對(duì)有毒性陽(yáng)離子存在的酵母菌株gefl與nhxl(enal)突變體的生活力進(jìn)行了一項(xiàng)研究。
這種富集模式不僅假設(shè)了陽(yáng)離子通道Gef1和鈉交換體Nhx1之間的功能聯(lián)系，還預(yù)言這兩種蛋白共存于共同的區(qū)室中。因?yàn)橐郧暗难芯勘砻髁薔hx1位于前液泡區(qū)室中(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))，所以也進(jìn)行了確定Gef1和Nhx1蛋白是否也共存于這個(gè)區(qū)室中的試驗(yàn)。
材料與方法以質(zhì)粒pRG151；GEF1-GFP及pRIN73；NHX1-(HA)3轉(zhuǎn)化菌株RGY419(gefl nhxl)。轉(zhuǎn)化體在SD(Difco；含2％葡萄糖的合成培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。為了確定轉(zhuǎn)化體對(duì)毒性陽(yáng)離子的敏感度，對(duì)此菌株進(jìn)行5倍的系列稀釋(始于105個(gè)細(xì)胞)，然后將其于30℃在按說(shuō)明附加了3mM MnCl2、0.45M四甲銨(TMA)或0.05mg/ml潮霉素B(HYG)的YPD(1％酵母提取物/2％蛋白胨/2％葡萄糖)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天。
進(jìn)行了兩項(xiàng)研究以證明Gef1p和Nhx1p的共同定位。
對(duì)轉(zhuǎn)化有兩種結(jié)構(gòu)體(GEF1-GFP融合物及NHX1-(HA)3-標(biāo)簽融合物)的gefl nhxl細(xì)胞中的亞細(xì)胞組分進(jìn)行了熒光分布的測(cè)定和免疫檢測(cè)。在細(xì)胞OD600達(dá)到0.5時(shí)，在其中加入潮霉素B(Sigma)至終濃度為0.1mg/ml，然后將細(xì)胞于30℃溫育40分鐘。以HA表位的抗體及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。通過(guò)帶電荷偶連裝置的顯微鏡觀察細(xì)胞并利用去卷積算法進(jìn)行光學(xué)切片(Scanalytics，Billerica，MA)(Kennedy，B.K.，等，Cell，89381-391(1997))；(Bar＝1·m.)。
同時(shí)測(cè)定了Gef1p及Nhx1p在蔗糖梯度中的移動(dòng)特性，以為Nhx1(HA)3及GEF1-GFP的共同定位提供證據(jù)。以質(zhì)粒pRG151；GEF1-GFP及pRIN73；NHX1-(HA)3轉(zhuǎn)化菌株RGY419(gefl nhxl)后在APG培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Rodriguez-Navarro，A.and Rea，P.A.，J.Biol.Chem.，159940-945(1984))。將此菌體轉(zhuǎn)化成原生質(zhì)球，溶解，并按文獻(xiàn)進(jìn)行10級(jí)蔗糖梯度(18-45％)分級(jí)分離(Sorin，A.，等，J.Biol.Chem.，2729895-9901(1997)and Antebi，A.and Fink，G.R.，Mol.Biol.Cell，3633-654(1992))。Western雜交顯示了Gef1-GFP及Nhx1-HA的分布。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gef1突變體對(duì)3mM MnCl2、0.45M氯化四甲銨及0.05mg/ml潮霉素B敏感。也發(fā)現(xiàn)nhx1突變體對(duì)氯化四甲銨及潮霉素敏感。nhx1突變體對(duì)潮霉素高度敏感可為nhx1的功能分析提供一個(gè)重要的工具。
發(fā)現(xiàn)血凝素(HA)標(biāo)記的Nhx1和Gef1-GFP融合物共同定位，正如其在表面熒光去卷積(deconvolution)顯微鏡中所示。在圖象作90度旋轉(zhuǎn)后信號(hào)重合的持續(xù)性進(jìn)一步證明了這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在這些細(xì)胞中的共定位。NHX1-(HA)3與GEF1-GFP的共定位也由這兩種蛋白在表達(dá)此標(biāo)記蛋白的細(xì)胞膜制品蔗糖密度梯度中的共移動(dòng)得到了支持。包含這兩種蛋白的膜組分的沉降行為和前液泡區(qū)室的一致(Nass，R.and Rao，R.，J.Biol.Chem.，27321054-21060(1998))。GEF1-GFP(而不是Nhx1)也存在于高爾基組分中，這與以前的研究結(jié)果一致(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998)，Schwappach，B.，等，J.Biol.Chem.，27315110-15118(1998))。實(shí)施例3NHX1的擬南芥同系物對(duì)潮霉素的抑制能力突變酵母的敏感性在此所述的酵母菌株為鑒定其它生物體中的耐鹽介導(dǎo)基因提供了重要的工具。為了驗(yàn)證這種體系的效用，對(duì)來(lái)源于擬南芥屬(見(jiàn)材料和方法)的與S.cerevisiae NHX1 ORF高度同源的序列進(jìn)行了鑒別，并利用一個(gè)已表達(dá)序列標(biāo)簽(見(jiàn)材料和方法)獲得了此擬南芥基因的全長(zhǎng)克隆。源于擬南芥屬(AtNHX1)、人(HsNHE-6)及酵母(ScNHX1)的Nhx1同系物氨基酸序列的對(duì)比揭示了所預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域上同一和相似的氨基酸片段(圖6A-C)。然而，需要強(qiáng)調(diào)的是，盡管具有這些關(guān)系，AtNHX1及ScNHX1的C-末端區(qū)域都沒(méi)顯示出高度的同源性(圖6A-C)。
哺乳動(dòng)物Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)特點(diǎn)是它們可被氨氯吡嗪脒抑制。通過(guò)人NHE1反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Counillon，L.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，904508-4512(1993))的點(diǎn)突變體確定了一個(gè)假定的氨氯吡嗪脒結(jié)合位點(diǎn)(163DVFFLFLLPPI173)(SEQ ID NO4)。AtNHX1、HsNHE-6及ScNHX1的序列幾乎相同(圖6)。然而，以氨氯吡嗪脒抑制酵母培養(yǎng)物中Nhx1或AtNhx1的試驗(yàn)沒(méi)有獲得成功。
根據(jù)酵母nhx1突變體對(duì)潮霉素高度敏感，可以檢驗(yàn)酵母中克隆的擬南芥屬AtMHX1 ORF是否能夠提供Na+/H+交換功能。將載體pAD4(Ballerter，R.，等，Cell，59681-686(1989))導(dǎo)入野生型及nhxl菌株中。將質(zhì)粒pRG308；ADH；AtNHXI導(dǎo)入如上nhxl突變體。將此菌株的5倍系列稀釋液(始于105個(gè)細(xì)胞)于30℃在YPD(-)或添加0.05mg/ml潮霉素(+)的YPD上培養(yǎng)2天。經(jīng)系列稀釋的同樣菌株也培養(yǎng)在AGP(見(jiàn)材料或方法)(-)或添加有0.4M NaCl的APG培養(yǎng)基上(Rodriguez-Navarro，A.and Ramos，J.，J.Bacteriol.，159940-945(1984)。
AtNHX1基因能夠抑制nhxl突變體對(duì)潮霉素的敏感性。AtNHX1基因也抑制nhxl突變體對(duì)NaCl的敏感性，但僅僅是在K+的可用性降低的條件下。然而，AtNHX1不能拯救超量表達(dá)AVP1-D基因的雙突變體enal nhxl的Na+-敏感生長(zhǎng)表型。實(shí)施例4功能獲得型(Gain-of-Function)酵母AtNHX1突變體的制備材料和方法通過(guò)誘變處理克隆基因以構(gòu)建突變文庫(kù)的方法在enal酵母中制備了可增強(qiáng)耐鹽性的AtNHX功能獲得性突變體。此文庫(kù)用于轉(zhuǎn)化鹽敏感酵母突變體enal及耐鹽增強(qiáng)表型的克隆。
據(jù)Arabidopsis Genome Initiative(AGI)報(bào)道與AtNHX1基因類似的其它基因也在突變酵母中得到表達(dá)而形成了功能獲得型突變體。據(jù)信，某些AtNHX1同系物是質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此，其在酵母中的功能通常有賴于pH值，要求用于成功篩選的培養(yǎng)基具有精確的組分和pH值。質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定有助于培育通過(guò)降低納的吸收而使耐鹽性得到提高的植物。此外，酵母中植物cDNA表達(dá)文庫(kù)也可用于鑒定涉及NaCl解毒的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其它家族。
為了制備AtNHX的功能獲得突變體，使用了由Stratgene(EpicurianColi XL1-Red competent Cells Cat#200129)提出的隨機(jī)突變導(dǎo)入的方法。此方法涉及將克隆基因?qū)肴狈?種DNA修復(fù)基本途徑的菌株中。此菌株的隨機(jī)突變率比野生型的高5000倍。將突變的AtNHX基因文庫(kù)導(dǎo)入enal酵母突變體并作耐鹽篩選。酵母轉(zhuǎn)化按Schiestl及其同事(Gietz，D等，Nucl.Acid Res.201425(1992)，在此作為一個(gè)整體參考而收錄)所述的方法進(jìn)行。XK1-Red隨機(jī)突變誘導(dǎo)的替代策略是如Fink及其同事所述的PCR方法(Madhani，H.D.等，Cell，91673-684(1997))。
為了檢測(cè)AtNHX1同系物，最初采取了用于AtNHX1(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)的同樣菌株和條件。然而，如果這些篩選菌株和/或條件不起作用，則進(jìn)行重新設(shè)計(jì)。在對(duì)質(zhì)膜AtNHX1同系物進(jìn)行處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)鑒定培養(yǎng)基的pH條件非常關(guān)鍵。
結(jié)果擬南芥功能獲得型突變基因AVP1-D的超量表達(dá)增強(qiáng)了酵母細(xì)胞內(nèi)的解毒能力(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)。有人提出這樣的假說(shuō)(盡管本發(fā)明者并不局限于此種假說(shuō))后者是由于流入液泡區(qū)室的H+增加，從而通過(guò)Nhx1交換蛋白加強(qiáng)了H+富集的緣故。酵母陽(yáng)離子富集研究結(jié)論以上有關(guān)酵母的研究為酵母細(xì)胞內(nèi)Na+富集時(shí)前液泡pH值的重要性提供了證據(jù)。植物H+-焦磷酸酶(Avp1)的超量表達(dá)僅僅賦予那些包含功能性氯化物通道(Gef1)及Na+/K+交換體(Nhx1)的酵母菌株以耐鹽性。
這些資料支持了這樣的模式Na+/K+交換體(Nhx1)與液泡ATPase及GEF1陽(yáng)離子通道一道起作用以使陽(yáng)離子在前液泡區(qū)室中得到富集。幾項(xiàng)研究表明，前液泡區(qū)室可能源于質(zhì)膜和新高爾基體。這些囊泡可能參與液泡的組裝或物質(zhì)向此細(xì)胞器的傳輸。這樣就很自然地認(rèn)為，這些前液泡囊泡通過(guò)使陽(yáng)離子富集以降低其在胞質(zhì)及其它細(xì)胞器中的濃度而使離子毒性得到解除。
在此所述的酵母體系容許對(duì)各種耐鹽相關(guān)異質(zhì)蛋白進(jìn)行功能評(píng)估，這些蛋白包括氯化物通道、H+泵、Na+/K+交換體及其它陽(yáng)離子/H+交換體或陽(yáng)離子/碳酸氫鹽共運(yùn)輸體。此系統(tǒng)穩(wěn)定而靈活。擬南芥屬氯化物通道(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4065(1998)，Hechenberger，M.，等，J.Biol.Chem.，27133632-33638(1996))、H+泵及Na+/K+交換體的功能可在其相應(yīng)的酵母突變體中加以分析。盡管AtNHX1不能抑制酵母nhx1突變體的所有表型，它可抑制某些表型并結(jié)合AtNHX1與酵母NHX1之間DNA同系物的事實(shí)，揭示了該植物基因執(zhí)行與酵母同系物類似功能。AtNHX1基因抑制nhx1突變體對(duì)潮霉素敏感性而只具有弱Na+解毒表型的現(xiàn)象可能是由兩種生物體中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的不同調(diào)節(jié)作用或陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)選擇性差異引起的。
鹽調(diào)節(jié)AtNHX1及植物基因抑制酵母nhx1突變體的能力表明了酵母和植物中陽(yáng)離子的解毒機(jī)制可能類似。的確，前面的研究表明了耐鹽植物液泡中鈉的積累可能由液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)，這種反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用由液泡H+-ATPase(V-ATPase)和/或H+-轉(zhuǎn)運(yùn)焦磷酸酶(V-PPase，refs.Barkla，B.J.等，Symp.Soc.Exp.Biol.，48141-153(1994)，Zhen，R.G.等，The Molecular and Biochemical Basis of Pyrophosphate-Energized Peoton Translocation at the Vacuolar Membrane(Academic，San Diego)，Kirsh，M，等，Plant Mol.Biol.，32543-547(1996))產(chǎn)生的質(zhì)子動(dòng)力。
在此所述的gef1及nhxl突變體都對(duì)潮霉素高度敏感的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了對(duì)潮霉素的抗性水平依賴于液泡和前液泡細(xì)胞器的功能。K+吸收降低(trkl)的酵母突變體對(duì)潮霉素高度敏感(Madrid，R.等，J.Biol.Chem.，27314838-14844(1998))；K+吸收的降低使質(zhì)膜電勢(shì)超極化并驅(qū)動(dòng)潮霉素等堿性陽(yáng)離子的吸收。質(zhì)膜H+-ATPase的H+泵活性降低的突變(Pmal)使質(zhì)膜電勢(shì)去極化，并賦予了對(duì)潮霉素的抗性(McCuskerm，J.H.，等，Mil.Cell.Biol.，74082-4088(1987))。因此，諸如gefl或nhxl等影響液泡及前液泡區(qū)室的pH值或膜電勢(shì)的突變體可能影響潮霉素的區(qū)室化。液泡H+-轉(zhuǎn)運(yùn)泵活性上調(diào)的轉(zhuǎn)基因植物在鹽脅迫植株中表達(dá)量降低的現(xiàn)象為擬南芥屬AtNHX1基因在鹽穩(wěn)態(tài)上的作用提供了支持(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。具體地，使用擬南芥作為受體模式植物說(shuō)明了這些基因的超量表達(dá)會(huì)使植物獲得耐鹽性。最近的一項(xiàng)報(bào)道顯示，超量表達(dá)AtNHX1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥于短晝周期條件下在澆灌含200mM NaCl及1/8 M.S.鹽的水分的土壤中保持了持久的生長(zhǎng)(Apse，M.等.Science，2851256-1258(1999))。值得注意的是，每次添加1/8M.S.鹽就提供了2.5mM鉀以減緩NaCl脅迫強(qiáng)度，并且，短晝周期也降低了氧化脅迫。實(shí)施例5鹽脅迫植物中AtNHX1基因的增強(qiáng)表達(dá)材料與方法在無(wú)菌條件下，將擬南芥植株(Columbia生態(tài)型)無(wú)菌種植在無(wú)添加物且無(wú)蔗糖的植物營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，在連續(xù)光照環(huán)境于19℃生長(zhǎng)15天。加入NaCl或KCl至終濃度為250mM后使植株恒溫生長(zhǎng)6小時(shí)。從鹽脅迫及非鹽脅迫植株組織中提取總RNA(Niyogi，K.K.and Fink，G.R.PlantCell.4721-733(1992))，在Hybond-N(Amersham)膜上與來(lái)源于pRG308質(zhì)粒的32P標(biāo)記DNA探針雜交。雜交在65℃下過(guò)夜進(jìn)行。與65℃下以0.2％標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽水(SSC)/0.1％SDS洗膜(Ausebel，F(xiàn).等，Curr.Protocols inMol.Biol.(Wiley，NY)(1988))。使用18S探針作為上樣對(duì)照(Unfried，I.等，Nucleic Acids Res.，177513(1989))。采取MACBAS2.4程序確定RNA的相對(duì)量。
結(jié)果NaCl脅迫使AtNHX1 mRNA水平增加了4.2倍，而KCl卻只提高了2.8倍。這種由鈉導(dǎo)致的mRNA水平的增加與酵母NHX1基因(Nass，R.，等，Biol.Chem.，27321054-21060(1998))的相似。用AtNHX1進(jìn)行RNA組織印跡雜交。從15天齡以250mM NaCl或KCl處理6小時(shí)后的植株及無(wú)鹽處理的對(duì)照植株中提取10mg總RNA，然后進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳。以AtNHX1 ORF內(nèi)部探針進(jìn)行印跡雜交。以18S核糖體探針作上樣對(duì)照。實(shí)施例6超量表達(dá)AtNHX1的轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性材料和方法使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化獲取超量表達(dá)AtNHX1的轉(zhuǎn)基因植物。利用CaMV 35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子表達(dá)轉(zhuǎn)基因AtNHX1(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。
將15株野生型及15株35S AtNH1轉(zhuǎn)基因植株在12小時(shí)白晝周期下培植20天。在此期間，每5天以稀釋營(yíng)養(yǎng)液(1/8 M.S.鹽)澆灌植株。在第21天以含200mM NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌植株，在第33天以含300mM NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌植株。植株在最后一次NaCl處理后10天拍照。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以含300mM NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌后，轉(zhuǎn)基因植物所受影響明顯比野生型植株輕。
利用35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子構(gòu)造超量表達(dá)AVP1野生型基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(Topfer，R.，等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。AVP1編碼來(lái)自擬南芥屬中的焦磷酸能化液泡膜質(zhì)子泵(Zhen，R.G.等，J.Biol.Chem.27222340-22348(1997))。以前的研究表明了AVP1基因在擬南芥屬基因組中以單拷貝的形式存在(Kim，Y.等，Plant Physiol.，106375-382(1994))，然而，Arabidopsis Genome Initiative(AGI)將BAC F9K20中第一染色體的與AVP1同源但不同的序列命名為ORFF9K20.2。
使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生超量表達(dá)AVP1的轉(zhuǎn)基因植物。利用CaMV 35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子表達(dá)轉(zhuǎn)基因AVP1(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。將15株野生型及15株轉(zhuǎn)35SAVP1基因植株在24小時(shí)白晝周期下培植16天。在此期間，每4天以稀釋營(yíng)養(yǎng)液(1/8M.S.鹽)澆灌植株。在第17天以含200mM NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌植株，在第27天以含250mM NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌植株。植株在最后一次NaCl處理后10天拍照。采取例6中所述的條件和處理方法。
結(jié)果與野生植株相比，35SAVP1植株的5個(gè)不同的品系在T2期都表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐鹽性。然而，最顯著的表型在純合的T3代植株中出現(xiàn)。這些轉(zhuǎn)基因植物比野生型植株大。此外，純合35SAVP1植株在24小時(shí)光照環(huán)境下的含250mM NaCl及1/8M.S.鹽的介質(zhì)中顯示出了持久的生長(zhǎng)。觀察到在短晝周期條件下(12小時(shí)白天光照周期)的含300mM NaCl及1/8M.S.鹽的介質(zhì)中種植的35SAVP1植株得到了持久的生長(zhǎng)。實(shí)施例8野生型植株及35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株在水培溶液中的生長(zhǎng)傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)可利用淡水的減少可能促使人們采取其它可利用的農(nóng)藝技術(shù)?？梢韵胂蟮氖牵S著耐鹽植物的出現(xiàn)，用海水進(jìn)行水培將會(huì)為作物生產(chǎn)創(chuàng)造一個(gè)新領(lǐng)域。據(jù)報(bào)道，水培可促進(jìn)植株生長(zhǎng)并提供無(wú)脅迫的根莖材料(Gibeaut，D.M.等，Plant Physiol.，317-319(1997))。水培另一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是它容許對(duì)離子組成進(jìn)行比在土壤中更精確的改變。這些優(yōu)勢(shì)對(duì)鹽脅迫的生理研究可能是重要的。
已建立了擬南芥植株的水培條件并對(duì)其在所含NaCl濃度不斷增加的培養(yǎng)基上的表現(xiàn)進(jìn)行了測(cè)試。
材料和方法在一個(gè)試驗(yàn)中，于12小時(shí)光周期條件下，對(duì)野生型及35SAVP1轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了水培種植。野生型及35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株在溶液培養(yǎng)基中培養(yǎng)65天。
另一項(xiàng)試驗(yàn)中，在12小時(shí)光周期條件下，將野生型及35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株在溶液培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天。從第21天開(kāi)始，按每4天50mM增量的逐級(jí)方式增加NaCl的濃度。在以200mM NaCl處理4天后對(duì)植株拍照。
在另一項(xiàng)試驗(yàn)中，以包含海水中全部離子組分的商業(yè)海水處理轉(zhuǎn)基因植物。在短晝光周期環(huán)境中，將35SAVP1及35SAtNHX1單與雙轉(zhuǎn)基因植物與野生型擬南芥一起水培4周(Gibeaut，D.M.等，PlantPhysiol.，317-319(1997))。然后，每4天添加相當(dāng)于50mM NaCl的TropicMarin海鹽(見(jiàn)www.thatpetplace.com/)。這種人工海水混合物包含真實(shí)海水中存在的其它全部大量和微量元素。對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并對(duì)鈉鹽的濃度和分布等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果在將野生型及35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株進(jìn)行水培時(shí)，發(fā)現(xiàn)野生型及35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株的根、葉、莖的大小顯著不同，35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株的要大得多。
在按每4天50mM的方式逐步提高NaCl濃度時(shí)(Apse，M.等，Sience，2851256-1258(1999))，35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株在200mMNaCl存在時(shí)表現(xiàn)健康，而野生型對(duì)照在其葉與莖中表現(xiàn)出嚴(yán)重的毒害性。
在短晝光周期環(huán)境中，將35SAVP1及35SAtNHX1單與雙轉(zhuǎn)基因植物與野生型擬南芥一起水培4周(Gibeaut，D.M.等，PlantPhysiol.，317-319(1997))，然后每4天用相當(dāng)于50mM NaCl的TropicMarin海鹽處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35SAVP1及35SAtNHX1單與雙轉(zhuǎn)基因植物能在海水鹽溶液中生長(zhǎng)。野生型擬南芥則不能。實(shí)施例9擬南芥質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在番茄植株中超量表達(dá)的效果對(duì)這些擬南芥質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AVP1及AtNHX1)在更重要的農(nóng)藝植物，即番茄植株中的超量表達(dá)效果進(jìn)行了檢測(cè)。據(jù)信，提高番茄植物的耐鹽性將可能產(chǎn)生重要的經(jīng)濟(jì)效益。
對(duì)AVP1及AtNHX1的番茄同系物進(jìn)行了分離，并構(gòu)建了用于超量表達(dá)它們的相應(yīng)嵌合體(Bidone，S.，等，Eur.J.Biochem.，25320-26(1998)；Burbidge，A.等，J.Exper.Botany，482111-2112(1997))。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)感染愈傷組織的方法導(dǎo)入此基因。通過(guò)組織培養(yǎng)再生轉(zhuǎn)化植株。對(duì)植株進(jìn)行耐鹽性分析及鈉鹽的濃度和分布等生理指標(biāo)的測(cè)定。
按McCormick所述的方法(McCormick，S.，Transformation oftomato with Agrobacterium tumefaciens.InPlant Tissue CultureManual，pp.1-9，Lindsey，K.(ed.).Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands(1991))將35SAVP1及35SAtNHX1結(jié)構(gòu)對(duì)番茄進(jìn)行轉(zhuǎn)化。以PCR及DNA凝膠印跡分析T0與T1轉(zhuǎn)基因植物中AVP1與AtNHX1轉(zhuǎn)基因的存在及其拷貝數(shù)。通過(guò)分析T1種子后代的分離，對(duì)雜合及純合植株進(jìn)行鑒定。對(duì)純合植株進(jìn)行耐鹽性分析及鈉鹽的濃度和分布等生理指標(biāo)的測(cè)定?；贏VP1及AtNHX1同系物中的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并寡核苷酸。這些簡(jiǎn)并引物用于由番茄poly(A)+RNA制備cDNA的RT-PCR反應(yīng)。將所得PCR片段作為探針從商業(yè)文庫(kù)(即StratageneCat#936004)中分離全長(zhǎng)cDNA克隆。Caboche及其同事描述了類似策略(Quesada，A.等，Plant Mol.Biol.，34265-274(1997))。
結(jié)果陽(yáng)性測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明在此所述的富集模式也可應(yīng)用于其它重要作物。
圖7是在鹽化土壤中生長(zhǎng)的野生型植物(WT)與超量表達(dá)AVP-1的典型轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的Na+與K+濃度圖。在10小時(shí)的光/暗周期下栽培5個(gè)野生型(WT)植物及2個(gè)超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)植株。以稀釋營(yíng)養(yǎng)液(1/8MS鹽)澆灌植株6周后再以添加NaCl的稀釋營(yíng)養(yǎng)液澆灌植株。NaCl的起始濃度為100nM，其后每4天增加100mM。在以300mM NaCl處理10天后對(duì)相應(yīng)的植物拍照。在以200mM NaCl處理24小時(shí)后收獲植株地上部分并測(cè)定其鮮重。在75℃烘烤48小時(shí)后測(cè)定其干重。以原子吸收法測(cè)定Na+與K+的含量。圖4中的數(shù)值為平均值+/-SE(n＝4)。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)基因品系(1’和2’)植株Na+與K+的含量比野生型對(duì)照株顯著高。
圖8是圖4中2’的35SAVP-1轉(zhuǎn)基因液泡膜囊泡鈣吸收(方框)與圖4中野生型(WT)囊泡鈣吸收?qǐng)D。在10小時(shí)光周期下將野生型植株(開(kāi)環(huán))及來(lái)自圖4中品系2’的轉(zhuǎn)基因植物水培9周。將液泡膜囊泡加入含250mM山梨糖醇、25mM BTP-Hepes pH8.0、50mM KCl、1.5nM MgSO4及10μM Ca++的緩沖液中。在加入200μM PPi以引發(fā)反應(yīng)之前，將此混合物于20℃溫育10分鐘。加入Ca++離子載體A23187至其終濃度為5μg/ml以消除Ca++梯度。將等分試樣(200μl)在指定時(shí)間過(guò)濾，然后以冷的上述(11)緩沖液洗滌。正如圖中所證實(shí)的，來(lái)源于品系2’的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鈣的吸收比野生型植株高。
上述數(shù)據(jù)與以下假說(shuō)是一致的即超量表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物的液泡膜中H+泵運(yùn)能力得到加強(qiáng)，H+供應(yīng)量的提高由通過(guò)H+驅(qū)動(dòng)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用最終導(dǎo)致液泡中離子積累的增加。為了進(jìn)一步支持此理論，對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因植物液泡膜囊泡中Ca++吸收能力進(jìn)行了測(cè)定。
Ca++是通過(guò)Ca++/H++反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入植物液泡的已得到了很好的證明(K.S.Schumaker，H.Sze，Plant Physiol.79，1111-1117(1985))。此外，編碼擬南芥Ca++/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CAX1與CAX2的基因已經(jīng)得到了分離和鑒定(K.D.Hirschi，R.G.Zhen，K.W.Cunningham，P.A.Rea，G.R.Fink，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8782-8786(1996))。圖8顯示在35SAVP-1轉(zhuǎn)基因植物的液泡膜囊泡中Ca++的吸收比野生型植株液泡中的高36％。應(yīng)用Ca++離子載體A23將45 Ca++計(jì)數(shù)降低到表明液泡緊張度的背景水平(圖8)(K.S.Schumaker，H.Sze，Plant Physiol.79，1111-1117(1985))。
盡管不為此理論所限，圖9A和9B中還是描述了與超量表達(dá)AVP-1基因的轉(zhuǎn)基因植物耐旱及耐凍性提高一致的模式。此模式說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因植物液泡中AVP-1泵數(shù)目的增加如何提供使次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體吸收更多陽(yáng)離子到液泡腔中去所需的更多H+。陽(yáng)離子量的增加使?jié)B透壓得到提高，由此提高了保水力，從而賦予植物抵抗低土壤水勢(shì)的能力。
為了得到超量表達(dá)AVP1及AtNHX1基因的擬南芥屬植株，利用T335SAVP1植株作為母本，T3 35S AtNHX1植株作為父本。母本植株人工去雄，收集開(kāi)花供體植株的新鮮花藥。通過(guò)和柱頭接觸，用這些花藥為去雄植株授粉。標(biāo)記已授粉的花并從同一雌性植株上除去余下的已開(kāi)放或未開(kāi)放的花以避免任何收獲混雜。收獲后的種子以50％的次氯酸鈉消毒，劇烈混合5分鐘后用水充分洗滌。消毒后的種子于在軟瓊脂中于4℃下過(guò)夜保藏。然后將其撒播到固體卡那霉素-潮霉素選擇培養(yǎng)基上。35SAVP1結(jié)構(gòu)含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因，賦予植物以卡那霉素耐性；而35SAtNHX1結(jié)構(gòu)包含修飾的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，賦予植物以潮霉素耐性。將抗性幼苗移植到土壤及液體培養(yǎng)基中以檢測(cè)其耐鹽表型。
利用前面所提過(guò)同樣的35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))構(gòu)建了超量表達(dá)擬南芥功能獲得性突變基因AVP1-D(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。超量表達(dá)功能獲得性突變基因的植株將可能顯示出增強(qiáng)的表型。對(duì)這些植株與35SAVP1及35SAtNHX1單和雙轉(zhuǎn)基因植物一起進(jìn)行表征。將擬南芥功能獲得性突變基因AVP1-D亞克隆到攜帶35S啟動(dòng)子及CaMV聚腺苷酸化信號(hào)的質(zhì)粒pRT103中(Topfer，R.等，Nucl.Acid Res.，155890(1987))。將含35SAVP-D嵌合基因的HindIII片段亞克隆到pBIBhyg中(Backer，D.，Nucl.Acid Res.，18203(1990))。以電穿孔法將所獲T-DNA載體轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌GV3101菌株中，以用于其后Columbia生態(tài)型擬南芥的真空滲透(Bechtold，N.等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，3161194-1199(1993))。整合通過(guò)T3植株的Southern雜交證實(shí)，陽(yáng)性T3植株基于Northern雜交監(jiān)測(cè)表達(dá)。實(shí)施例11野生型及35S AVP1轉(zhuǎn)基因植物根液泡轉(zhuǎn)運(yùn)比較研究進(jìn)行了一項(xiàng)研究以確定35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物的液泡是否顯示出更高的依賴焦磷酸的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性。分別對(duì)水培植株的根和莖進(jìn)行了測(cè)定。轉(zhuǎn)基因可能表現(xiàn)出組織特異性調(diào)控而不受35S啟動(dòng)子的影響。
為了比較野生型和35SAVP1轉(zhuǎn)基因型植株的PPI-依賴性H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從上述植株的根和葉中制備了封閉的液泡膜富集的囊泡。按Rea和Tuner(Rea，P.A.，等，Tonoplast Adenosine Triphosphate and inorganicPyrophosphate.InMethods Plant Biochem.，pp.385-405，AcademicPress Limited，London(1990))所述的方法進(jìn)行勻漿及差速離心。按Rea及其同事所述的方法(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，27222340-22348(1997))以吖啶橙(2.5μM)作為含液泡膜富集囊泡的鑒定培養(yǎng)基中跨膜pH差異指示劑進(jìn)行熒光檢測(cè)。檢測(cè)培養(yǎng)基含有300mM Tris-PPi、50mMKCl、2.5μM吖啶橙、5mM Tris-Mes(Ph8.0)。添加1.3mM MgSO4以觸發(fā)囊體內(nèi)的酸化后以2.5μM protonphore FCCP終止。熒光檢測(cè)分別在495及540nM激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行，狹縫寬度為5nm(Zhen，R.G.，等，J.Biol.Chem.，26923342-23350(1994))。以加入特異抑制劑氨基亞甲基二膦酸(Zhen，R.G.，等，Plant Physiol.，104153-159(1994))的方式進(jìn)一步驗(yàn)證了H+的轉(zhuǎn)運(yùn)是由AVP1驅(qū)動(dòng)的。實(shí)施例12轉(zhuǎn)基因植物葉和莖中Na+/K+比率的測(cè)定NaCl的毒害濃度首先在完全展開(kāi)的葉片中形成，其中的NaCl已被區(qū)室化到液泡中。NaCl的脅迫能干擾或降低K+的吸收，導(dǎo)致K+缺乏并使植株生長(zhǎng)受到抑制(Wu，S.J.等，Plant Cell，8617-627(1996))。K+濃度降低及Na+濃度升高的結(jié)果是對(duì)胞質(zhì)中重要酶的抑制。此類酶例如酵母3’(2’)，5’-二磷酸核苷酸酶，其活性在K+濃度低時(shí)對(duì)Na+更敏感(Murguia，J.R.等，Science，267232-234(1995))。
也可進(jìn)行測(cè)定以證明在此所述的轉(zhuǎn)基因植物葉細(xì)胞或其它部位液泡中Na+的富集能力得到了提高。為了測(cè)定葉和莖中Na+/K+比率，對(duì)野生型及35SAVP1/35SAtNHX1雙與單轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行水培(Gibeaut，D.M.等，Plant Physiol.，317-319(1997))。按50mM至250mM的逐級(jí)方式向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加NaCl(Apse，M.，等，Science，2851256-1258(1999))。在每個(gè)階段，采集所處理植株的蓮座狀葉和莖并測(cè)定其重量。將樣品于80℃烘烤并稱取干重。將干燥樣品于測(cè)定體積的水中煮沸并通過(guò)原子吸收分光光度法測(cè)定Na+和K+濃度(Apse，M.，等，Science，2851256-1258(1999))；Gaxiola，R.等，Embo J.，113157-2164(1992))。實(shí)施例13確定35S AVP1轉(zhuǎn)基因植物的大尺寸是因?yàn)槠浼?xì)胞體積更大還是它們包含更多的細(xì)胞或是兩者兼而有之將莖分生組織標(biāo)記指數(shù)與野生型植株的作了比較。通過(guò)形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察對(duì)葉片、根和莖細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和計(jì)數(shù)。為了確定35S AVP1轉(zhuǎn)基因植物的大尺寸是否因?yàn)槠浒嗟募?xì)胞，將其莖分生組織標(biāo)記指數(shù)與野生型植株的作了比較。
使用5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)檢測(cè)DNA的合成及細(xì)胞增殖，此物質(zhì)能替代胸腺嘧啶核苷酸整合到DNA中。利用抗BrdU單克隆抗體及抗鼠免疫球蛋白-堿性磷酸酶次級(jí)抗體對(duì)其DNA中整合有BrdU的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)合的抗BrdU單克隆抗體，確定DAPI染色與BrdU陽(yáng)性的比率。此方案從Chiatante及其同事(Levi，M.等，Physiol.Plant.7168-72(1987))所發(fā)表的修改而來(lái)，BrdU標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒II由Boehringer Mannheim提供。將植株以BrdU標(biāo)記培養(yǎng)基處理不同時(shí)間后按Meyerowitz及其同事所述的方法(Drews，G.等，PlantMol.Biol.Rep.5242-250(1988))進(jìn)行固定、石蠟包埋及切片。
為對(duì)葉組織進(jìn)行觀察，將新鮮組織包埋于5％的瓊脂糖中，然后以微切割器進(jìn)行切片。為了觀察主根，在室溫下以50％乙醇、5％乙酸及3.7％甲醛固定幼苗4小時(shí)，然后以系列梯度的乙醇使其脫水，并以二甲苯滲透后再用石蠟浸潤(rùn)。以0.05％甲苯胺藍(lán)染色8μm的切片，再顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞大小觀察和測(cè)定的替代方法如Greenberg及其同事所述(Rate，等，The Plant Cell，111615-1708(1999))。
使用Wisconsin Madison大學(xué)的擬南芥基因敲除工具(www.biotech.wisc.edu/NewServicesAndResearch/Arabidopsis)從60，480個(gè)已轉(zhuǎn)化有T-DNA載體pD991的擬南芥屬(WS生態(tài)型)品系中搜尋AtCLC-c、AtCLC-d、AVP1、AtNHX1及其同系物中T-DNA的插入。以上基因敲除體的表型將有助于理解這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在正常和脅迫條件下的生理功能?；蚯贸参锏某醪奖碚靼ㄆ淠望}性評(píng)價(jià)及Na+/K+比率的測(cè)定。通過(guò)它們之間及與35SAVP1及35SAtNHX1轉(zhuǎn)基因植物之間雜交產(chǎn)生雙敲除體將有助于進(jìn)一步理解轉(zhuǎn)運(yùn)體之間的相互作用。
按照Wisconsin大學(xué)網(wǎng)站上所說(shuō)明的原則設(shè)計(jì)PCR引物去搜尋擬南芥敲除體。測(cè)試引物提交到Wisconsin Madison大學(xué)進(jìn)行62個(gè)PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物返回給我們進(jìn)行Southern雜交分析。對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物測(cè)序。如果測(cè)序結(jié)果表明基因中有T-DNA的插入，則提交此基因的特異引物進(jìn)行另一組PCR反應(yīng)以確定從225個(gè)庫(kù)中篩選出的9個(gè)可能的庫(kù)中哪一個(gè)庫(kù)包含基因敲除。在鑒定出感興趣的庫(kù)后，從25管種子中篩選含T-DNA敲除的單個(gè)植物。實(shí)施例15植物細(xì)胞陽(yáng)離子解毒在此所述的研究與其它證據(jù)一起有力地證明了酵母和植物在囊泡從高爾基網(wǎng)絡(luò)到液泡的運(yùn)輸上享有共同的途徑和信號(hào)(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999)；Marty，F(xiàn).，”TheBiogenisis of VacuilesInsights from Microscopy.InThe PlantVacuole，1-42，Leigh R.A.and Sanders，D.，Academic Press，San Diego，California，1(997)；Bassham，D.C.等，Plant Physiol，117407-415(1998))。
盡管不愿為理論所束縛，本發(fā)明人還是相信，在兩個(gè)體系中，胞質(zhì)中陽(yáng)離子毒性的解除及其向液泡或直接向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移的動(dòng)力實(shí)體是前液泡區(qū)室。Gefl氯化物通道及Nhxl Na+/H+交換體已都被定位到酵母前液泡區(qū)室中(Gaxiola，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480-1485(1999))。對(duì)酵母細(xì)胞體內(nèi)gefl-GFP嵌合體的監(jiān)測(cè)表明它們位置的變化依賴于環(huán)境條件。此外，擬南芥4個(gè)CLC氯化物通道基因中的2個(gè)即CLC-c及CLC-c基因都顯示可以抑制gefl突變體表型，暗示其位置的相似(Gaxiola，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954046-4050(1998))。
為了理解植物細(xì)胞陽(yáng)離子解毒是怎樣及在哪兒進(jìn)行的，對(duì)AVP1、AtNHX1及AtCLC-c與d(Hong，B，等，Plant Physiol.，1191165-1175(1999))的GFP嵌合體在細(xì)胞內(nèi)的位置進(jìn)行了活體監(jiān)測(cè)。也利用了共聚焦顯微鏡確定不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同定位。為達(dá)到這個(gè)目的，需要HA-標(biāo)記形成的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗體進(jìn)行研究(Guiltinan，M.J.等，Meth.Cell Biol.，49143-151(1995)；Jauh，G.Y.等，Plant Cell，111867-1882(1999)；Mullen，R.T.等，Plant.J.，12313-322(1997))。
利用了Davis和Viestra所報(bào)道的擬南芥熒光增強(qiáng)可溶型GFP(Davies，S.J.，Viestra.R.D.，Soluble derivatives of greenfluorescent protein(GFP)for use in Arabidopsis thaliana，http//brindabella.mrc-lmb.cam.ac.uk/IndexGFP.html(1998))構(gòu)建了GFP嵌合體。制備了兩類GFP嵌合體，即一類受天然啟動(dòng)子調(diào)控，另一類受35S啟動(dòng)子滲入。以電穿孔法將包含GFP嵌合體的所得T-DNA載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101中，以用于其后擬南芥(Columbia生態(tài)型)的真空滲入(Bechtold，N.等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.IIISci.Vie，3161194-1199(1993))。對(duì)血凝素(HA)的表位標(biāo)記，使用了PCR策略，它是為酵母設(shè)計(jì)的但作了改進(jìn)以標(biāo)記在酵母載體中表達(dá)的植物基因。Futcher及其同事設(shè)計(jì)了一個(gè)包含其兩側(cè)為附加表位(HA)正向重復(fù)的URA3基因的載體(Schneider，B.L.等，Yeast，111265-1274(1995))。Tag-URA-tag序列組件以PCR擴(kuò)增而使所獲PCR片段在目標(biāo)基因的兩端具有同源性。利用酵母體內(nèi)重組將此PCR嵌合物整合至攜帶植物目標(biāo)ORF的質(zhì)粒中，以URA+表型篩選轉(zhuǎn)化體。當(dāng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體在存在5-氟-乳清酸的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，URA-3基因就“顯現(xiàn)出來(lái)”。攜帶該植物基因的載體具有與URA-3基因不同的選擇標(biāo)記。
總之，通過(guò)對(duì)有重要經(jīng)濟(jì)意義的農(nóng)作物體內(nèi)液泡V-PPase的控制，為作物改良提供了一條重要的途徑。耐旱及耐凍栽培品種為由于干旱或少雨而減產(chǎn)的地區(qū)提供了新的農(nóng)藝方法，并使農(nóng)民免受突然霜凍(冰雹等)的影響。這樣的作物也能夠在含鹽量太多以至于野生作物不能生長(zhǎng)的土壤中種植。
盡管本發(fā)明是以有關(guān)優(yōu)選實(shí)施方案為例進(jìn)行描述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)很容易理解，可在不背離本發(fā)明附加權(quán)利要求書所規(guī)定的本發(fā)明原則或范圍的前提下，對(duì)本發(fā)明作出各種變更和/或修改。本說(shuō)明書所引用的所有參考文獻(xiàn)都在此引入作為參考，相當(dāng)于每篇獨(dú)立的參考文獻(xiàn)都被明確而單獨(dú)地指出引入作為參考。
權(quán)利要求
1.基因盒，其包含可操作地連接嵌合啟動(dòng)子的液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因。
2.權(quán)利要求1的基因盒，其中液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因是外源的。
3.編碼序列，其包含可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因。
4.包含多核苷酸序列的表達(dá)載體，此多核苷酸序列含有外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因，該基因可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子，并進(jìn)一步可操作地連接多克隆位點(diǎn)。
5.抗旱及抗凍的轉(zhuǎn)基因植物，其包含這樣的多核苷酸序列，此多核苷酸序列中含有可操作地連接啟動(dòng)子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因。
6.權(quán)利要求5的抗旱及抗凍的轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的種子。
7.權(quán)利要求6的種子所產(chǎn)生的后代植物。
8.抗旱及抗凍轉(zhuǎn)基因植物，該植物包含如下多核苷酸序列，此多核苷酸序列含有可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因。
9.含多核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，此多核苷酸序列包含有多個(gè)可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因，其中，焦磷酸驅(qū)動(dòng)H+泵基因的數(shù)目足以在液泡膜上表達(dá)足量的液泡膜焦磷酸驅(qū)動(dòng)的H+泵，從而產(chǎn)生與野生型植物相比的抗旱及抗凍性。
10.耐鹽轉(zhuǎn)基因植物，其包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)化有改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸的植物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因植物，其中外源核酸編碼AVP1。
12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中外源核酸編碼AVP1的同系物。
13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因植物，其中AVP1的同系物來(lái)自煙草、細(xì)菌、番茄或玉米。
14.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因植物，其中AVP1存在于設(shè)計(jì)用來(lái)超量表達(dá)AVP1或設(shè)計(jì)用來(lái)下調(diào)內(nèi)源焦磷酸酶的結(jié)構(gòu)中。
15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物，其中該結(jié)構(gòu)包含可操作地與35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子連接的AVP1。
16.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因植物，其中AVP1來(lái)源于與該轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
17.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因植物，其中AVP1來(lái)源于不與該轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
18.能在抑制其對(duì)應(yīng)非轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)的鹽濃度中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物。
19.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物，其中鹽濃度為約0.2M至約0.3M。
20.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中該植物比對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物大。
21.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代。
22.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子。
23.從權(quán)利要求22的種子所產(chǎn)生的后代轉(zhuǎn)基因植物。
24.耐鹽轉(zhuǎn)基因植物，其包含外源核酸結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)被設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1或被設(shè)計(jì)用于下調(diào)內(nèi)源焦磷酸酶。
25.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代。
26.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子。
27.從權(quán)利要求26的種子所產(chǎn)生的后代轉(zhuǎn)基因植物。
28.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物，其中該結(jié)構(gòu)包含AVP1基因，該基因可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
29.包含可操作地連接嵌合啟動(dòng)子的AVP1基因的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)被設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1或被設(shè)計(jì)用于下調(diào)內(nèi)源焦磷酸酶。
30.權(quán)利要求29的結(jié)構(gòu)，其中AVP1基因可操作地與35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子連接。
31.轉(zhuǎn)基因植物，其通過(guò)向植物中導(dǎo)入改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸而獲得。
32.植物細(xì)胞，包含改變植物細(xì)胞中液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸。
33.權(quán)利要求32的植物細(xì)胞，其中植物細(xì)胞為根細(xì)胞或莖細(xì)胞。
34.權(quán)利要求32的植物細(xì)胞，其中外源核酸編碼AVP1。
35.權(quán)利要求34的植物細(xì)胞，其中AVP1存在于被設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1或被設(shè)計(jì)用于下調(diào)內(nèi)源焦磷酸酶的結(jié)構(gòu)中。
36.權(quán)利要求35的植物細(xì)胞，其中該結(jié)構(gòu)包含AVP1基因，該基因可操作地連接設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1的嵌合啟動(dòng)子。
37.權(quán)利要求36的植物細(xì)胞，其中AVP1基因可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
38.權(quán)利要求34的植物細(xì)胞，其中AVP1來(lái)源于與轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
39.權(quán)利要求34的植物細(xì)胞，其中AVP1來(lái)源于不與轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
40.制備耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入可改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸以產(chǎn)生該植物的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生耐鹽轉(zhuǎn)基因植物。
41.權(quán)利要求40的方法，還包括從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，并篩選耐鹽轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生耐鹽轉(zhuǎn)基因植物。
42.權(quán)利要求40的方法，其中外源核酸編碼AVP1。
43.權(quán)利要求42的方法，其中AVP1存在于被設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1或被設(shè)計(jì)用于下調(diào)內(nèi)源焦磷酸酶的結(jié)構(gòu)中。
44.權(quán)利要求43的方法，其中該結(jié)構(gòu)包含AVP1基因，該基因可操作地連接設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1的嵌合啟動(dòng)子。
45.權(quán)利要求44的方法，其中AVP1基因可操作地與35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子連接。
46.權(quán)利要求42的方法，其中AVP1來(lái)源于與該轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
47.權(quán)利要求42的方法，其中AVP1來(lái)源于不與該轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
48.權(quán)利要求40的方法，其中該植物能耐受抑制相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)的鹽濃度。
49.權(quán)利要求48的轉(zhuǎn)基因植物，其中鹽濃度為約0.2M至約0.3M。
50.通過(guò)權(quán)利要求40的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
51.制備耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1的核酸結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生耐鹽轉(zhuǎn)基因植物。
52.權(quán)利要求51的方法，還包括從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，并篩選耐鹽轉(zhuǎn)基因植物，從而獲得耐鹽轉(zhuǎn)基因植物。
53.由權(quán)利要求51的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
54.制備比其對(duì)應(yīng)野生型植物大的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入可改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生比其對(duì)應(yīng)野生型植物大的轉(zhuǎn)基因植物。
55.權(quán)利要求54的方法，還包括從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株以獲得轉(zhuǎn)基因植物并篩選比其對(duì)應(yīng)野生型植物大的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生比其對(duì)應(yīng)野生型植物大的轉(zhuǎn)基因植物。
56.權(quán)利要求54的方法，其中外源核酸編碼AVP1。
57.權(quán)利要求56的方法，其中AVP1存在于被設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1或被設(shè)計(jì)用于下調(diào)內(nèi)源焦磷酸酶的結(jié)構(gòu)中。
58.權(quán)利要求57的方法，其中該結(jié)構(gòu)包含AVP1基因，該基因可操作地連接設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1的嵌合啟動(dòng)子。
59.權(quán)利要求48的方法，其中AVP1基因可操作地連接35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
60.權(quán)利要求56的方法，其中AVP1來(lái)源于與該轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
61.權(quán)利要求56的方法，其中AVP1來(lái)源于不與該轉(zhuǎn)基因植物野生型對(duì)應(yīng)的野生型植物。
62.權(quán)利要求54的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物在土壤中栽培。
63.權(quán)利要求54的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物用水培法栽培。
64.由權(quán)利要求54的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
65.對(duì)土壤進(jìn)行生物除污的方法，包括在土壤中種植一種或更多種轉(zhuǎn)基因植物和/或其后代，其中轉(zhuǎn)基因植物和/或其后代包含改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸。
66.增加植物產(chǎn)量的方法，包括向植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入可改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此增加植物產(chǎn)量。
67.權(quán)利要求66的方法，還包括從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株以獲得轉(zhuǎn)基因植物并篩選比其對(duì)應(yīng)野生型植物大的轉(zhuǎn)基因植物，從而增加植物產(chǎn)量。
68.從可支持植物生長(zhǎng)的介質(zhì)中除去陽(yáng)離子的方法，包括在此介質(zhì)中種植一種或更多種轉(zhuǎn)基因植物和/或其后代，其中轉(zhuǎn)基因植物和/或其后代包含改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸。
69.權(quán)利要求68的方法，其中該介質(zhì)選自土壤和水。
70.權(quán)利要求68的方法，其中陽(yáng)離子選自鈉、鈣、錳和鉛。
71.產(chǎn)生能在鹽水中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入可改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生能在鹽水中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物。
72.權(quán)利要求71的方法，還包括從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并篩選能在鹽水中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生能在鹽水中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物。
73.權(quán)利要求71的方法，其中鹽水的濃度為約0.2M至約0.3M。
74.權(quán)利要求73的方法，其中鹽水為海水。
75.耐鹽轉(zhuǎn)基因植物，其包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)化有外源核酸的植物細(xì)胞，該外源核酸可改變植物中液泡焦磷酸酶及Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。
76.權(quán)利要求75的轉(zhuǎn)基因植物，其中液泡焦磷酸酶為AVP1或其同系物。
77.權(quán)利要求76的轉(zhuǎn)基因植物，其中AVP1的同系物來(lái)源于煙草、細(xì)菌、番茄或玉米。
78.權(quán)利要求76的轉(zhuǎn)基因植物，其中AVP1存在于被設(shè)計(jì)用于超量表達(dá)AVP1或被設(shè)計(jì)用于下調(diào)內(nèi)源焦磷酸酶的結(jié)構(gòu)中。
79.權(quán)利要求78的轉(zhuǎn)基因植物，其中該結(jié)構(gòu)包含可操作地與35S啟動(dòng)子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子連接的AVP1。
80.權(quán)利要求75的轉(zhuǎn)基因植物，其中Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為AtNHX1或其同系物。
81.權(quán)利要求75的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代。
82.權(quán)利要求75的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子。
83.從權(quán)利要求82的種子所產(chǎn)生的后代轉(zhuǎn)基因植物。
84.制備花尺寸比其對(duì)應(yīng)野生型植物增大的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入可改變植物液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生花尺寸比其對(duì)應(yīng)野生型植物大的轉(zhuǎn)基因植物。
85.權(quán)利要求84的方法，其中外源核酸編碼AVP1。
86.通過(guò)權(quán)利要求84的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
能在鹽化介質(zhì)中生長(zhǎng)的抗脅迫、超大轉(zhuǎn)基因植物，其含有導(dǎo)致液泡焦磷酸酶表達(dá)上調(diào)的多核苷酸序列。進(jìn)一步公開(kāi)了該轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的含有此多核苷酸序列的種子以及由其種子產(chǎn)生的后代植物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1399512SQ00816302
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月10日
發(fā)明者R·A·蓋歐拉 申請(qǐng)人:康涅狄格州大學(xué), 懷特黑德研究所