專利名稱：一種用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的重組靶向融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白質(zhì)及編碼它的融合基因。本發(fā)明還涉及CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2融合基因、包含所述融合基因的表達型重組體、包含所述表達型重組體的工程菌、由此工程菌表達和分離純化的靶向融合蛋白-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2以及這些融合蛋白中任意一種的用于治療艾滋病用途。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndromeAIDS)即艾滋病，是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。AIDS是由人免疫缺陷性病毒(human immunodeficiency virus HIV)感染引起。HIV主要感染表達CD4分子的T細(xì)胞、單核/巨噬和樹突狀細(xì)胞，以及中樞神經(jīng)細(xì)胞。據(jù)WHO2002年的數(shù)據(jù)，全球HIV感染者已超過6000萬，其中1/3已死亡。在今后20年內(nèi)，估計死亡人數(shù)將達到6800萬。目前全球HIV/AIDS人數(shù)已居各種疾病的首位，艾滋病已成為全球的瘟疫。2002年我國31個省、市、自治區(qū)累計報告HIV感染者約89萬例，但有關(guān)專家估計中國艾滋病實際感染者已達104萬，以青壯年為主，其中已經(jīng)死亡的約20萬。如果不采取有效的控制措施，到2010年感染者數(shù)量有可能達到1000萬。若防治得力在2010年可將感染者數(shù)量控制在150萬以內(nèi)。中國艾滋病防治形勢相當(dāng)嚴(yán)峻。
盡管目前HAART(High Active Antiretrovirus Therapy高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法)在發(fā)達國家中取得了矚目的成績，但大多數(shù)HIV感染者都集中在經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)，HAART昂貴的價格限制了它在這些發(fā)展中國家的應(yīng)用。全球HIV感染者接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的不足100萬。同時HAART本身存在一些無法克服的缺點，如HAART的毒副作用大、容易導(dǎo)致病毒的耐藥和病毒的潛伏，而且價格昂貴。HAART不能徹底根治艾滋病。
現(xiàn)有的各種治療手段，包括其它各種藥物治療，基因治療和治療性疫苗的研究均未取得成功。
靶向性治療技術(shù)又稱為“生物導(dǎo)彈”技術(shù)，正越來越引起人們的關(guān)注。一種生物導(dǎo)彈的設(shè)計思路是將單克隆抗體與藥物、抗生素或核素偶聯(lián)在一起用于臨床治療，其主要問題是靶向性差；另一種生物導(dǎo)彈的設(shè)計思路是運用基因工程技術(shù)將不同的功能區(qū)段拼接所構(gòu)建的融合蛋白作為“分子導(dǎo)向”型導(dǎo)彈，如人工構(gòu)建的融合蛋白TGF-PE40，IL2-PE40，CD4-PE40、CD4-TD(白喉毒素)，分別用于治療惡性腫瘤，某些自身免疫性疾病與艾滋病。臨床研究結(jié)果表明，此類融合蛋白雖具有良好的導(dǎo)向作用，但PE40、TD毒素蛋白質(zhì)對人體而言是異源蛋白，具有很強的免疫原性，可迅速誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生特異針對PE40或TD的抗體，抗體產(chǎn)生中和效應(yīng)使融合蛋白失效。因此，上述這些靶向性融合蛋白無一被應(yīng)用于臨床治療。
所以在治療AIDS領(lǐng)域急需低毒高效的靶向性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，因此，本發(fā)明提供了運用于抗HIV/SIV的一類融合蛋白，所述融合蛋白是包含受體多肽與來源于人體的具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
本發(fā)明涉及一種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。所述的SEQ ID NO1的核苷酸序列用于融合蛋白的導(dǎo)向作用。
本發(fā)明進一步涉及一種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明進一步涉及一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
本發(fā)明進一步涉及一種TNF-α的變異體，它的氨基酸列如SEQ IDNO4所示。
本發(fā)明進一步涉及一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
所述的SEQ ID NO3和5的核苷酸序列用于融合蛋白的殺滅作用。
本發(fā)明進一步涉及一種TNF-α的變異體，它的氨基酸列如SEQ IDNO6所示。
本發(fā)明進一步涉及一種靶向融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白為包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
所述的受體多肽優(yōu)選是CD4，CD4V1V2或CD4V1，或者它們的相關(guān)片斷，類似物或突變體；所述的殺傷多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突變體的TNF家族成員；或TNF超家族成員，如Trail，Light或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物；或所述的多肽是來源于人體的穿孔素、補體成分C9及顆粒溶解素；或者來源于人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E、絲氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、細(xì)胞色素或DNA核酸內(nèi)切酶；或可以抵御細(xì)菌的多肽和酶，如溶菌酶、防御素；或抗癌基因及其編碼的蛋白質(zhì)，如P53，以及一切來源于人體的具有致死細(xì)胞功能的基因及其編碼蛋白質(zhì)、或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物。
優(yōu)選地，編碼所述的CD4V1的基因序列為SEQ ID NO1所示的序列。
優(yōu)選地，所述的CD4V1基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm1，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述的TNFαm1基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm2，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述的殺傷多肽是TNFαm2，它的氨基酸序列為SEQ IDNO6所示的氨基酸序列。
本發(fā)明進一步涉及包括SEQ ID NO1的cDNA和SEQ ID NO3的cDNA的融合基因的重組體pCW-CD4V1TNFαm1。
本發(fā)明進一步涉及包括SEQ ID NO1的cDNA和SEQ ID NO5的cDNA的融合基因的重組體pCW-CD4V1TNFαm2。
本發(fā)明還涉及含有上述重組體的載體。
本發(fā)明還涉及含有能表達上述融合蛋白的構(gòu)建質(zhì)粒載體的真核或原核細(xì)胞，優(yōu)選為真核細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備上述的融合蛋白的方法，包括用所述的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
本發(fā)明還涉及一種含有上述融合蛋白的藥物組合物。
本發(fā)明進一步涉及所述的融合蛋白在制備用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的藥物中的用途。
優(yōu)選地，其通過殺滅受HIV/SIV感染的細(xì)胞或中和游離的HIV/SIV來完成。
本發(fā)明還提供了靶向融合蛋白CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2分別對受HIV/SIV感染細(xì)胞具有特異殺傷作用以及對血循環(huán)中游離病毒的中和作用的細(xì)胞試驗證據(jù)。
本發(fā)明由于靶向設(shè)計，可以既有效降低TNFα的毒性，又可以將TNFα的殺傷作用集中于受HIV/SIV感染的細(xì)胞，更有效發(fā)揮融合蛋白的殺傷作用，同時兼顧高效和安全。融和蛋白在殺傷受HIV/SIV感染的細(xì)胞的同時，其靶向分子CD4V1還能中和游離的HIV/SIV，實現(xiàn)對正常細(xì)胞的保護。因此這兩種融和蛋白都是雙功能的活性多肽。并且，實驗設(shè)計得到細(xì)胞試驗結(jié)果的支持。同時，由于CD4V1和TNFαm均來自人體，最大限度降低了免疫原性。不僅如此，在CD4V1和TNFαm之間還引入了富含柔性氨基酸的一個七氨基酸序列，可以幫助CD4V1和TNFαm各自以獨立的的三維空間結(jié)構(gòu)來行使其功能，并各自作為人體內(nèi)源蛋白被免疫系統(tǒng)識別而不被免疫系統(tǒng)識別為異源蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致藥物失效。


圖1為重組體pCW CD4V1-TNFαm1的構(gòu)建示意圖。
圖2為重組體pCWCD4V1-TNFαm2的構(gòu)建示意圖。
圖3為重組體pBS-TNFαm1，pGEM-CD4V1-TNFαm1以及pCWCD4V1-TNFαm1的酶切鑒定示意圖。
圖4為融和蛋白CD4V1-TNFαm1 SDS-PAGE電泳圖。其中1為未誘導(dǎo)的CD4V1-TNFαm1/DH5α菌體蛋白2為誘導(dǎo)的CD4V1-TNFαm1/DH5α菌體蛋白3為CD4V1-TNFαm1/DH5α菌體蛋白的包涵體4為切膠電洗脫后的CD4V1-TNFαm1蛋白樣品圖5為融和蛋白CD4V1-TNFαm1 SDS-PAGE膠的激光密度掃描圖。
圖6為重組體pBS-TNFαm1的測序結(jié)果。
圖7為重組體pCW-CD4V1TNFαm1的上游測序結(jié)果。
圖8為重組體pCW-CD4V1TNFαm1的下游測序結(jié)果。
圖9為重組體pBS-TNFαm2的測序結(jié)果。
圖10為融合蛋白CD4V1-TNFαm1對被SIV感染CEMx-174細(xì)胞的殺傷作用。
圖11為融合蛋白CD4V1-TNFαm1對正常CEMx-174細(xì)胞的作用。
圖12為融合蛋白CD4V1-TNFαm1對被SIV感染CEMx-174細(xì)胞的中和作用。
圖13為TNFα標(biāo)準(zhǔn)品對被SIV感染CEMx-174細(xì)胞的作用(縱坐標(biāo)為測量的OD值)。
圖14為融合蛋白CD4V1-TNFαm1在殺傷試驗中對病毒滴度的影響。
圖15為融合蛋白CD4V1-TNFαm1在中和試驗中對病毒滴度的影響。
圖16-1，2顯示殺傷試驗前后細(xì)胞的形態(tài)的熒光照片，其中圖16-1為融合蛋白CD4V1-TNFαm1殺傷試驗前細(xì)胞染色照片；圖16-2為融合蛋白殺傷試驗后細(xì)胞染色照片，放大倍數(shù)均為200X。
圖17-1，2顯示中和試驗前后細(xì)胞的形態(tài)的熒光照片，其中圖17-1為融合蛋白CD4V1-TNFαm1中和試驗前細(xì)胞染色照片；圖17-2為融合蛋白中和試驗后細(xì)胞染色照片，放大倍數(shù)均為200X。
具體實施方案本發(fā)明中融合蛋白是由靶向分子和殺傷分子兩部分組成，這種靶向設(shè)計的關(guān)鍵是實現(xiàn)靶向分子的特異性結(jié)合和殺傷分子對目標(biāo)細(xì)胞的高效殺傷。其中靶向分子是能與HIV或被HIV感染的細(xì)胞上的gp120特異結(jié)合的CD4或其衍生物，其一為CD4V1；殺傷分子是腫瘤壞死因子α(TNFα)或其衍生物，其中兩種為TNFαm1和TNFαm2。CD4是作為gp120識別靶細(xì)胞的通用錨定物。因為只有游離的HIV病毒以及被HIV感染的細(xì)胞才會特異性地表達病毒的包膜蛋白gp120，因而運用CD4或其衍生物作為靶向分子可實現(xiàn)與被HIV感染細(xì)胞的特異性結(jié)合。CD4-TNFα編碼基因及其突變型可經(jīng)真核或原核系統(tǒng)表達獲得融和蛋白。
TNFα是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。此外，中性粒細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，也可產(chǎn)TNFα。TNFα發(fā)現(xiàn)于1975年，是一種人源性的細(xì)胞毒性因子，其毒性作用主要是通過與受體結(jié)合與內(nèi)化，進而引發(fā)一系列的信號傳遞過程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。TNFα引起兩種主要的細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞毒和選擇性的轉(zhuǎn)錄激活。在NK和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒中TNFα的作用是Ca2+非依賴性的。TNFα三聚體同受體(主要是P55)結(jié)合，聚集成簇，受體復(fù)合物內(nèi)化，內(nèi)化的TNFα受體復(fù)合物可傳遞多種信號。一個可能的機制是通過G蛋白偶聯(lián)的活化作用激活磷脂酶A2通路，合成前列腺素和白三烯。同時，花生四烯酸等多不飽和脂肪酸的釋放和代謝在線粒體的電子傳遞系統(tǒng)被擾亂，開始產(chǎn)生自由基，最終通過某些酶、脂的氧化和DNA降解作用殺死細(xì)胞。另一方面信息會很快導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF KappaB的激活，活化的NF KappaB進入細(xì)胞核，激活一系列基因的轉(zhuǎn)錄。TNFα在已知細(xì)胞因子中的抗腫瘤活性最強。對包括神經(jīng)纖維瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞系都具有明顯的殺傷作用，所以，美國政府早在1985年就批準(zhǔn)了用TNFα來治療惡性腫瘤的臨床試驗申請。但由于原型TNFα過強的毒副作用，以致迄今未能成為臨床可用的治療惡性腫瘤的常規(guī)藥物。我們的一個關(guān)鍵的設(shè)計思想是認(rèn)為，TNFα的殺細(xì)胞活性是它的基本功能，從其作用機制看，如能將其準(zhǔn)確導(dǎo)入受HIV/SIV感染的細(xì)胞，同樣可以把被HIV/SIV感染的細(xì)胞殺滅，從而阻止HIV/SIV病毒的復(fù)制和繁殖。因此，運用DNA重組技術(shù)將之構(gòu)建成表達融和蛋白CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2的表達重組體，經(jīng)真核或原核表達系統(tǒng)表達出融和蛋白，然后純化復(fù)性。細(xì)胞試驗結(jié)果表明，兩種融和蛋白可特異強烈殺滅被HIV/SIV感染的細(xì)胞，與此同時，該融和蛋白的靶向分子CD4V1還能高效中和游離的HIV/SIV，而使其失活。因此這兩種融和蛋白都是雙功能的活性多肽。并且，未被HIV/SIV感染的正常細(xì)胞在加入這兩種融和蛋白以后，其生長不受影響，證明融和蛋白有良好的安全性。作為對照，原型TNFα既不能殺傷受HIV/SIV感染的細(xì)胞，也不能中和游離的HIV/SIV病毒，進一步驗證了我們的設(shè)計。同時，由于CD4V1和TNFαm均來自人體，最大限度降低了免疫原性。因此，本發(fā)明構(gòu)建的兩種融合蛋白用于抗HIV/SIV有著良好的特異性和安全性，是一種富有前景的治療艾滋病的潛在藥物。
另外，關(guān)于該融合蛋白是否有免疫原性，CD4V1與TNFα均為人源蛋白，原則上說，已經(jīng)盡可能地減小了免疫原性。鑒于融合蛋白可能改變其空間三維結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫原性。這個顧慮，就本融合蛋白而言，情況可能不同本融合蛋白中的CD4V1與TNFαm將更可能分別以各自獨立的三維結(jié)構(gòu)存在于溶液/血液中。如CD4V1-TNFαm2，它們的連接肽從N端至C端為Leu-Gly-Thr-Arg-lys-Arg-Lys-Pro-Val，其中，Leu屬于CD4V1的C末端最后一個氨基酸，同時是一個剛性氨基酸；其后的7個氨基酸都是柔性氨基酸；而該連接肽C端的最后3個氨基酸屬于原TNFα的N端切除7個氨基酸后的N端，其第三個氨基酸Val是一個剛性氨基酸。這樣，便構(gòu)成了CD4V1與TNFαm2以兩個剛性氨基酸為始末、以其間7個柔性氨基酸為活鏈各自形成獨立結(jié)構(gòu)的很大可能性。如果確系形成這樣的二個獨立的三維空間結(jié)構(gòu)，它們將分別是人體內(nèi)源蛋白，將不至于被免疫系統(tǒng)錯誤識別以致誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，致使藥物失效。細(xì)胞活性試驗結(jié)果表明，CD4V1與TNFαm2均良好地發(fā)揮了各自的功能。這一結(jié)果也從一個側(cè)面提示，CD4V1與TNFαm2各自保持了原有的三維結(jié)構(gòu)的很大可能性。并且，連接肽中的N端的Gly-Thr是由于加入了kpnI酶切位點引入的，其后3個氨基酸是人為引進的，計5氨基酸，不超過6氨基酸，按普遍接受的觀點，應(yīng)無免疫原性。總的看來，該融合蛋白不至于會有強烈的免疫原性而在臨應(yīng)用中失效。而且E.coli系統(tǒng)研制的多數(shù)活性多肽藥物均有一定的免疫原性，但并不影響其臨床應(yīng)用。本發(fā)明選取人工合成的密碼子為E.coli.嗜好的編碼CD4的胞外可變區(qū)V1區(qū)100個氨基酸的基因序列作為靶向分子，與利用PCR技術(shù)得到的強效腫瘤壞死因子α(TNFα)的衍生物TNFαm1和TNFαm2的基因片段重組，構(gòu)建表達重組體pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1和pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm2。
將以下描述的表達型重組體pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1和pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α經(jīng)篩選獲高表達工程菌pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1/DH5α和pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm2/DH5，行SDS-PAGE膠分析，重組融和蛋白pCW-CD4V1TNFαm1/DH5α和pCW-CD4V1TNFαm2/DH5分別約占菌體總蛋白的12％和13.7％。對pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1/DH5α高表達株進行大規(guī)模培養(yǎng)誘導(dǎo)，提取包涵體，8M尿素溶解，經(jīng)SDS-PAGE凝膠切割后電洗脫回收蛋白。經(jīng)冰凍酸性丙酮除去SDS，經(jīng)過透析、復(fù)性。
蛋白定量后，將融合蛋白CD4V1TNFαm1分別以8，16，32，64，128μg/ml的濃度處理被SIV感染的CMEx-174細(xì)胞。以正常的CMEx-174細(xì)胞及空白樣品作為陰性對照。觀察融合蛋白對細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表明該融合蛋白能有效地殺傷被SIV感染的CMEx-174，在128μg/ml時CD4-TNFαm的殺傷率可達到54.9％。并且，在殺傷實驗中單獨用TNFα蛋白作用被SIV感染的CEMx-174細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長情況和未加TNFα蛋白的被SIV感染的CEMx-174細(xì)胞的生長情況無顯著差異(P＞0.20)。說明本實驗研究的融合蛋白的殺傷作用是通過靶向性分子的介導(dǎo)，單獨的TNFα蛋白由于沒有靶向性分子的介導(dǎo)，因而無法殺傷感染SIV的CEMx-174細(xì)胞，初步驗證了作用機理。同時，將CD4TNFαm融合蛋白分別以4，8，16，32μg/ml的濃度進行中和實驗，32μg/ml劑量的融合蛋白對游離病毒的保護率可達33.5％，說明融和蛋白對未感染細(xì)胞有保護作用。殺傷率與中和率均與融合蛋白呈劑量依賴關(guān)系，并有滴度試驗支持以上結(jié)果。同時通過對照實驗該融合蛋白對正常細(xì)胞的生長無明顯影響。
細(xì)胞試驗表明，本發(fā)明中的融合蛋白CD4-TNFαm，用于抗HIV/SIV，有著良好的特異性和安全性，是一種富有前景的治療艾滋病的潛在藥物。
本發(fā)明提供了包含所述融合蛋白基因以及含該基因的表達型重組體。
優(yōu)選地，所述融合蛋白中的受體多肽是能夠與gp120和/或gp41特異性結(jié)合的CD4，CD4V1V2或CD4V1，或者它們的相關(guān)片斷，類似物或突變體。
優(yōu)選地，由于V1區(qū)100個氨基酸對于CD4結(jié)合gp120分子是足夠的，截取了CD4全長中的V1區(qū)100個氨基酸作為受體多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
更優(yōu)選地，為了實現(xiàn)融合蛋白在E.coli.系統(tǒng)中的高效表達，CD4V1基因片段系人工合成的突變的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO1所示。
優(yōu)選地，所述的功能多肽是TNF家族成員，如TNFα，TNFβ(又名淋巴毒素，lymphotoxin，LT)，TNFγ，或其衍生物或其突變體，或TNF超家族成員，如Trail(Tumor related Apoptosis inducedligand)，Light(for homologous tolymphotoxins，exhibitsInducible expression，and competes with HSVGlycoprotein D forHVEM，a receptor expressed byTlymphocytes，Light；，又稱為HEVMLherpesvirus entry mediator ligand)以及是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物?；蛘呤蔷哂辛呀饧?xì)胞作用來源于人體的穿孔素(human perforin，HP；pore forming protein，PFP)，可形成補體攻擊復(fù)合物的補體成分C9，顆粒溶解素(granulysin)；或者可引起凋亡的來源于人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E(GranzymeA，B，C，D，E)，絲氨酸酯酶(serine esterases)；直接參與細(xì)胞凋亡的的蛋白激酶C(PKC)，蛋白激酶A(APK)，天冬氨酸激酶(caspases)，細(xì)胞色素，DNA核酸內(nèi)切酶；可以抵御細(xì)菌的多肽和酶，如溶菌酶(Lysosome)，防御素(defensin)；具有抑制腫瘤作用的P53以及是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物。
更優(yōu)選地，其中所述功能多肽是TNFα的突變體TNFαm1和TNFαm2。本發(fā)明依據(jù)相關(guān)文獻的報導(dǎo)，采用兩種方式改造TNFα的結(jié)構(gòu)，其一是在TNFαN端第一位氨基酸Val前增加兩個氨基酸Gly，Thr在其后增加三個氨基酸Arg，Gly，Pro成為采用TNFαm1；其二是將原型TNFα的N端前7個氨基酸缺失突變，并將Pro8，Ser9，Asp10突變?yōu)锳rg8，Lys9，Arg10，獲得減毒增效的TNFαm2，以降低其毒副作用使之可以更適用于臨床，同時提高其抗腫瘤活性。
本發(fā)明提供了兩種編碼抗腫瘤新藥靶向融合蛋白CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2的基因CD4V1-TNFαm1，CD4V1-TNFαm2，分別具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了包含所述基因CD4V1-TNFαm1和CD4V1-TNFαm2的表達型重組體pCWCD4V1-TNFαm1和pCWCD4V1-TNFαm2以及工程菌pCWCD4V1-TNFαm1/DH5α和pCWCD4V1-TNFαm2/DH5α以及大量制備、純化和復(fù)性蛋白的技術(shù)路線。
以下通過實施例進一步描述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
實施例1.編碼重組靶向融合蛋白的基因CD4V1TNFαm1的獲得1.PCR引物及其序列1.1博亞公司合成TNFαm1引物Forward primer 5’-aaa gtaagaggtccaagat-3’25bp含KpnI位點Reverse primer 5’-aaa ttatcacagggcaatg-3’25bp含BamHI位點1.2博亞公司合成pCW111的測序引物Forward primer 5’-AAAAAGGGCATCAAATTAAACC-3’Reverse primer 5’-TCGGCGATATAGGCGCCAGC-3’PCR反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘后開始循環(huán)94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒。經(jīng)25個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。使用的擴增酶高保真Pfu。以1.0％瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，得到514bp左右的DNA片段。
2.突變型TNFαm1的獲得利用TNFαm1 PCR引物對對本實驗室構(gòu)建的TNFαcDNA進行特異擴增，其結(jié)果是在TNFαcDNA的5’端引入1個KpnI位點(GGTACC)和幾個額外的編碼氨基酸的密碼子GGT ACCGTAAGA GGTCCA(其中帶下劃線的為較原型比多出來的密碼子)，這段DNA序列對應(yīng)的氨基酸序列為Gly ThrValArg Gly Pro(帶下劃線的為較原型比多出來的氨基酸)。同時，還在其3’端引入1個BamHI位點(GGA TCC)和2個終止密碼子(UAA UGA)。將pfu酶擴增得到的平端PCR產(chǎn)物回收后，與經(jīng)過EcoRV酶切處理的PBSSK平端連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上，利用藍白板篩選陽性克隆。按照《分子克隆實驗指南》(第二版)(J.薩姆布魯克，等.主編，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1992)的堿裂解法小量制備抗性克隆的質(zhì)粒DNA，限制性分析證實質(zhì)粒插入片段大小與目的基因相符。因插入方向不同，得到兩種產(chǎn)物，通過BamHI單酶切，舍去無法切出約500bp的片段反向插入產(chǎn)物，獲測序重組體pBS-TNFαm1。pBS-TNFαm1酶切鑒定結(jié)果見圖3，測序結(jié)果見圖6。
3.融合基因CD4V1TNFαm1的獲得用ApaI、KpnI雙酶切處理定向的pBS-TNFαm1正向連接產(chǎn)物，回收534bp的片段。從博亞公司合成的pGEM-CD4質(zhì)粒含大腸桿菌嗜好的CD4V1基因序列，將用ApaI、KpnI雙酶切(購自大連寶生物生物公司)處理pGEM-CD4后回收的大片段，與用pBS-TNFαm1ApaI、KpnI雙酶切處理后回收的小片段連接，獲得重組體pGEM-CD4V1TNFαm1。重組體pGEM-CD4V1TNFαm1酶切鑒定結(jié)果見圖3。
實施例2.融合基因CD4V1-TNFαm1溫控型表達型重組體pCW-CD4V1TNFαm1的構(gòu)建用BamHI，NdeI雙酶切處理分別處理及pCW111載體，回收pGEM-CD4TNFαm1酶切產(chǎn)物中的CD4 TNF 797bp片段及pCW111的大片段并連接，得到重組體pCW-CD4V1TNFαm1，從而將CD4V1TNFαm1融合蛋白的編碼基因置于溫控啟動子PRPL的控制之下。重組體pCW-CD4V1TNFαm1酶切鑒定結(jié)果見圖3，測序結(jié)果見圖7，8。
實施例3.編碼TNFα突變體TNFαm2基因的獲得3.1博亞公司合成TNFαm2引物Forward primer 5’-aaa cgtaaacgcaagcct-3’含PstI和XhoI位點Reverse primer 5’-aaa ttatcacagggcaatg-3’25bp含BamHI酶切位點3.2突變型TNFαm2的獲得利用TNFαm2PCR引物對對質(zhì)粒pCW-CD4V1TNFαm1進行特異擴增，其結(jié)果是獲得將原型TNFα的N端前7個氨基酸缺失突變，并將Pro8，Ser9，Asp10突變?yōu)閍rg8，Lys9，Arg10，獲得的減毒強效突變的TNFαm2。同時，還在其3’端引入1個BamHI位點(GGA TCC)和2個終止密碼子(UAA UGA)。將pfu酶擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，玻璃奶回收酶切產(chǎn)物后，與經(jīng)過BamHI和XhoI雙酶切處理的PBSSK粘端連接，獲得重組質(zhì)粒pBS-TNFαm2，酶切鑒定結(jié)果見圖3，測序結(jié)果見圖9。
實施例4.融合基因CD4V1TNFαm2溫控型表達型重組體pCW-CD4V1TNFαm2的構(gòu)建將質(zhì)粒pBS-TNFαm2經(jīng)KpnI和BamHI雙酶切后，玻璃奶回收約500bp酶切產(chǎn)物，并與pCW-CD4V1TNFαm2經(jīng)KpnI和BamHI雙酶切處理后回收的5187bp酶切產(chǎn)物粘端連接，獲得溫控型表達型重組體pCW-CD4V1TNFαm2。
實施例5.融合蛋白CD4V1TNFαm1在大腸桿菌中的表達1.目的蛋白的表達與鑒定將pCW-CD4V1TNFαm1轉(zhuǎn)化DH5α，然后接種于5ml LB培養(yǎng)基，同時加入終濃度為100mg/ml的氨芐青霉素，32℃振搖培養(yǎng)過夜。按2％接種量重新接種兩管5ml LB/Amp+培養(yǎng)液。在32℃下振搖培養(yǎng)至OD600約為0.6時。然后分出一管置于42℃搖床，振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)5h；另一管繼續(xù)在32℃振蕩培養(yǎng)5h，作為對照。4000g離心收集菌體，加入上樣緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)，混勻，置于100℃沸水浴保持5min。10000g離心1min，取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白質(zhì)表達量通過Chromscan3快速凝膠掃描儀于626nm波長處掃描，并計算表達量。詳細(xì)方法參見參見盧圣棟主編的《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》第二版，365-387頁。
2.結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，pCW-CD4V1TNFαm1/DH5α表達的目的蛋白在約30KD處有明顯的蛋白帶出現(xiàn)，而未誘導(dǎo)樣品在相應(yīng)位置上沒有該條帶，蛋白大小與預(yù)期一致，初步斷定為目的蛋白，見圖4。經(jīng)SDS-PAGE凝膠激光掃描分析，目的蛋白占細(xì)胞總蛋白的12.0％，見圖5。
實施例6融合蛋白CD4V1TNFαm1的大量制備與純化1.大體積培養(yǎng)工程菌pCW-PL-SD-CD4V1TNFαm1/DH5α接種于50ml LB培養(yǎng)基，同時加入終濃度為100mg/ml的氨芐青霉素，32℃振搖培養(yǎng)過夜。按2％接種量重新接種于兩瓶分別含有500ml LB/Amp+培養(yǎng)液的2L三角瓶中。在32℃下振搖培養(yǎng)至OD600約為0.6時。然后置于42℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)5h。4000g離心、收集菌體，置于-20℃反復(fù)凍融。
2.包涵體的制備2.1洗滌細(xì)胞6000g×15分鐘離心收集細(xì)菌，稱重濕菌體。
用3％Triton X-100洗滌菌體，攪拌器上攪勻30分鐘，6000g×15分鐘離心收集用量為10ml-50ml緩沖液/1g濕菌體(包括下列各種洗滌緩沖液)。
2.2破細(xì)胞用緩沖液將細(xì)胞懸浮，緩沖液配制50mmol/LTris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用攪拌器在室溫下攪拌，使得懸浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
2.3超聲處理每次超打10秒，間隔15秒，20-50次作用(視菌體濃度而定)，至菌體不再粘稠為止。然后離心收集，6000g×15分鐘。上述操作應(yīng)在冰水中進行，為防止炭化，超聲功率不宜過大，在玻璃燒杯中進行較好，超聲波探頭深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。
2.4 5％Triton X-100洗滌用緩沖液徹底懸浮沉淀，攪拌并超聲波處理30次，參見上述步驟2.3。緩沖液為50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％Triton X-100。離心收集沉淀，6000g×15分鐘。
2.5包涵體的保存與溶解2.5.1用少量8M尿素逐漸溶解包涵體，取20μl溶液加入2×上樣緩沖液，混勻，沸水中煮3-5分鐘。取20ul進行SDS-PAGE電泳分析。其余包涵體可凍存于-70℃。
2.5.2如果過柱純化，應(yīng)按下述步驟操作用含體溶解液(50mmol/LTris.Cl，pH8.0，2mmol/L EDTA，10mMDTT，7M鹽酸胍)溶解包涵體，包涵體濃度約為10mg/ml。將溶解的包涵體12000g離心后，取上清，得到可以上柱的樣品溶液。
3.目的蛋白的純化取2.3步驟中所制備的包涵體溶液，加入等體積2×上樣緩沖液中，進行15％的SDS-PAGE電泳。
3.1.凝膠切割切下蛋白Marker泳道所在的膠條和少部分樣品膠條，將其放入快速染色液中速染15分鐘，剩余凝膠用保鮮膜包好置于4℃冰箱。速染的膠條脫色顯出條帶后，將膠條與剩余的凝膠對比，切下含目的帶部分的凝膠條。
3.2.電洗脫將切下的凝膠條及凝膠浸泡液裝入透析袋中并置于水平電泳槽中，加入蛋白電泳洗脫進行恒壓100v電泳。電泳10～12h后將洗脫液還位透析液再電泳10～12h。將透析袋中的浸泡液倒入50ml離心管中，如溶液較多可先用適量PEG10000濃縮。
3.3.痕量SDS的去除在離心管中加入5倍體積以上的冰凍酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀過夜。10,000r/m離心10分鐘，去掉上清收集沉淀。將收集的沉淀用蛋白沉淀液洗滌1次。
實施例7.融合蛋白的復(fù)性將洗滌后的蛋白沉淀用變性緩沖液(6mol/L鹽酸胍，0.1mol/L tris-HCl，PH8.6，1mmol/L EDTA，0.05mmol/L NaCl，10mmol/L DDT)在冰浴中溶解后轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，同時在透析袋內(nèi)加入蛋白復(fù)性液(50mmol/LTris-HCl，PH8.0，1mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.25mol/L左旋精氨酸，5mmol/L DDT)中，于蒸餾水中4℃透析48小時以使蛋白復(fù)性。
實施例8重組靶向融合蛋白CD4V1-TNFαm1對SIV感染的CEMX-174的殺傷作用8.1模式細(xì)胞的制備由于HIV不感染其它動物的CD4陽性細(xì)胞，因而迄今尚無一種人的艾滋病動物模型。猩猩感染HIV-1后僅僅表現(xiàn)為暫時性的T細(xì)胞數(shù)量的改變以及產(chǎn)生抗體，并不發(fā)展成艾滋病臨床癥狀。研究發(fā)現(xiàn)HIV-2和SIVMAC9亞洲短尾猴種分離的免疫缺陷病毒的核苷酸序列有大約75％甚至更高的同源性，與HIV-1僅有45％的同源性。但由于SIV和HIV-1在感染、復(fù)制、和調(diào)控方面基本相似，可通過研究SIV引起的靈長類動物艾滋病作為研究人類艾滋病的基礎(chǔ)。因此本實驗采用SIV進行初步的體外實驗來反應(yīng)靶向融和蛋白地抗HIV/SIV作用。
本試驗所使用的模式細(xì)胞為CEMX-174細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物研究所病毒室)。具體地，首先將液氮保存的CEMX-174細(xì)胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)接于含10％胎牛血清(天津三得利公司)的1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司，洛克維爾，馬里蘭州，美國)的100ml的培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時后換液，隨后在培養(yǎng)液中加入病毒滴度大于5120的SIV，來感染CEMX-174細(xì)胞。由于該細(xì)胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小時在顯微鏡下觀察細(xì)胞被感染情況，包括被感染細(xì)胞的百分率以及細(xì)胞的形態(tài)改變等。經(jīng)過4-5天的培養(yǎng)和反復(fù)感染，用免疫熒光檢測感染效率，平均感染率約47％。
8.2實驗方法與結(jié)果8.2.1MTT法測定細(xì)胞活性以往細(xì)胞試驗都是通過細(xì)胞計數(shù)來估計細(xì)胞活性的，這樣因其主觀因素和自身許多缺陷使得結(jié)果可信度不高。本發(fā)明采用MTT法測定細(xì)胞活性。MTT的商品名為噻唑藍，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源的MTT還原成難溶性的藍紫色結(jié)晶，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的藍紫色結(jié)晶。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其OD值，可間接反映活性細(xì)胞的數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成量與細(xì)胞數(shù)量成正比。所以本發(fā)明采用MTT測定細(xì)胞活性，提高結(jié)果的客觀性、可信度。
8.2.2實驗結(jié)果及說明本試驗采用5個劑量組，使藥物終濃度分別為8、16、32、64、128μg/ml。于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別處理1.25×105/ml被SIV感染的CEMx-174細(xì)胞及未被病毒感染的正常細(xì)胞。為了驗證融合蛋白的作用是通過靶向性分子介導(dǎo)的，而不是由TNFα單獨起作用的，還設(shè)計了用TNFα單獨作用于SIV感染了的細(xì)胞。用正常培養(yǎng)的CEMx-174細(xì)胞作為正常組，以未加細(xì)胞的1640培養(yǎng)基為調(diào)零組，以蛋白處理過的感染SIV的CEMx-174細(xì)胞為試驗組，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174細(xì)胞為對照組。48小時后通過熒光計數(shù)得出試驗組和對照組的熒光百分比，同時用MTT法測定細(xì)胞活性，算出融合蛋白的殺傷率。所得各孔存活細(xì)胞數(shù)進行方差分析(analysis of variance)和T檢驗(T-test)分析，結(jié)果見表1、2、3。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明P＜0.05，說明感染SIV的CEMx-174細(xì)胞加入CD4V1TNFαm1后，出現(xiàn)了明顯的殺傷作用，而且殺傷作用基本上是隨著劑量的增大而增強的。其中最大劑量組128μg/ml，CD4V1TNFαm1的殺傷率是54.9％。以上結(jié)果說明該融合蛋白可殺傷被SIV感染的細(xì)胞，見圖10。融合蛋白CD4V1-TNFαm1在8、16、32、64、128μg/ml劑量下對未感染SIV的CEMx-174細(xì)胞作用后，觀察細(xì)胞的生長狀況，用OD值反應(yīng)細(xì)胞的存活情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長情況和正常細(xì)胞的生長情況無顯著差異，P＞0.20。這些結(jié)果說明，融合蛋白CD4V1-TNFαm1對正常的未感染SIV的CEMx-174細(xì)胞并無毒性殺傷作用，融合蛋白的安全性得以保障，符合實驗設(shè)計要求，見圖11。同時，TNFα蛋白單獨作用于感染了SIV的CEMx-174細(xì)胞后，用OD值反應(yīng)細(xì)胞的存活情況。OD值1.072為對照組的。通過T檢驗發(fā)現(xiàn)試驗組與對照組數(shù)據(jù)無顯著差異。見圖13。殺傷率＝1-(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×對照組感染率÷(試驗組OD值-調(diào)零組OD值)×試驗組感染率

表1.殺傷試驗結(jié)果分組劑量 MTT法測得的 熒光計數(shù)滴度 殺傷ug/mlOD值百分比 ％NC /1.072±0.0130％ 0 /NC/SIV /0.560±0.00575.3％ 1∶1280/培養(yǎng)基 /0.061±0.0060％ / /NC/SIV+ 80.498±0.00672.1％ 1∶320 17.3％CD4V1 16 0.442±0.01266.2％ 未測 32.9％TNFαm1 32 0.421±0.01564.0％ 1∶80 38.7％64 0.397±0.00761.2％ 1∶40 45.4％128 0.363±0.00456.1％ 1∶10 54.9％說明1每組劑量有3個平行孔，每個孔用MTT法測定3次2 NC代表正常的CEMx-174細(xì)胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174細(xì)胞，熒光計數(shù)百分比即為感染率3試驗組測定的OD值與對照組(NC/SIV)相比較，均有顯著性差異P＜0.054數(shù)值的計算方法見正文說明表2.兩種融合蛋白作用于未感染SIV的CEMx-174細(xì)胞后，對細(xì)胞生長的影響分組劑量 MTT法測得的 統(tǒng)計學(xué)檢查(ug/ml) OD值 F檢驗T檢驗NC /1.072±0.011 //81.088±0.022 2.9051.145NC+ 16 1.055±0.044 4.1400.655CD4V1-TNFαm32 1.093±0.035 6.578-0.9671 64 1.075±0.017 0.608-0.227128 1.078±0.069 6.586-0.145說明融合蛋白CD4V1-TNFαm1在8、16、32、64、128μg/ml劑量下對未感染SIV的CEMx-174細(xì)胞作用后，觀察細(xì)胞的生長狀況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長情況和正常細(xì)胞的生長情況無顯著差異，P＞0.20。這些結(jié)果說明，融合蛋白CD4V1-TNFαm1對正常的未感染SIV的CEMx-174細(xì)胞并無毒性殺傷作用，融合蛋白的安全性得以保障，符合實驗設(shè)計要求。
表3.TNFα蛋白單獨作用于SIV感染了的CEMx-174細(xì)胞后，對細(xì)胞生長的影響分組 劑量 MTT法測得的 統(tǒng)計學(xué)檢查(ug/ml) OD值 F檢驗 T檢驗NC/SIV /0.370±0.011 / /80.359±0.096 0.051 1.337NC/SIV+16 0.359±0.096 0.132 -1.335TNFα 32 0.370±0.022 1.730 -0.02464 0.379±0.046 3.213 -1.352128 0.366±0.011 0.029 0.464說明單獨用TNFα蛋白在8、16、32、64、128μg/ml劑量下對感染SIV的CEMx-174細(xì)胞后，觀察細(xì)胞的生長狀況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長情況和未加TNFα蛋白的感染了SIV的CEMx-174細(xì)胞的生長情況無顯著差異，P＞0.20。這種結(jié)果說明了本實驗研究的兩種融合蛋白對感染SIV的CEMx-174細(xì)胞的殺傷作用是通過靶向性分子的介導(dǎo)，TNFα被內(nèi)吞入感染的細(xì)胞后啟動其殺傷作用的。單獨的TNFα蛋白由于沒有靶向性分子的介導(dǎo)，因而無法殺傷感染SIV的CEMx-174細(xì)胞，符合實驗設(shè)計要求。
實施例9重組靶向融合蛋白CD4V1TNFαm1對SIV感染的CEMX-174的保護作用9.1模式細(xì)胞的制備同8.19.2實驗方法與結(jié)果9.2.1MTT法測定細(xì)胞活性同8.2.19.2.2實驗結(jié)果及說明用正常培養(yǎng)的CEMx-174細(xì)胞作為正常組，以未加細(xì)胞的1640培養(yǎng)基為調(diào)零組，以蛋白處理過的CEMx-174細(xì)胞和SIV病毒顆?；旌衔餅樵囼灲M，以未加蛋白的CEMx-174細(xì)胞和SIV病毒顆?；旌衔餅閷φ战M，分4個劑量組，分別用4、8、16、32μg/ml的融合蛋白作用。(實驗結(jié)果見表4)將“正常CEMx-174細(xì)胞+SIV+融合蛋白”各組與“正常CEMx-174細(xì)胞+SIV”組6天后對剩余細(xì)胞用MTT法測定其活性，進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明P＜0.05，說明正常CEMx-174細(xì)胞混合SIV后加入CD4V1TNFαm1，出現(xiàn)了明顯的中和作用，抑制了游離病毒顆粒對細(xì)胞的感染，而且中和作用基本上是隨著劑量的增大而增強的。其中最大劑量組32μg/ml的CD4V1TNFαm1的保護率是33.5％。由于中和試驗其實的效果既有中和作用又有殺傷作用，很難定義一個純粹的中和率，所以以保護率來反應(yīng)融合蛋白的中和效應(yīng)。以上結(jié)果說明該融合蛋白可中和游離的SIV，抑制SIV對CEMx-174細(xì)胞感染，可有效保護正常的CEMx-174細(xì)胞。見圖12。
保護率＝(試驗組OD值-調(diào)零組OD值)-(對照組OD值-調(diào)零組OD值)÷(試驗組OD值-調(diào)零組OD值)表4.中和試驗結(jié)果分組劑量 MTT法測得的OD 滴度保護％(ug/ml) 值NC / 2.816±0.014/ /NC+SIV / 1.146±0.0051∶1280 /1640培養(yǎng)基 / 0.071±0.004/ /4 1.302±0.0021∶1280 12.7％NC+SIV+ 8 1.346±0.0031∶320 15.7％CD4V1TNFαm 161.435±0.0051∶80 21.2％321.688±0.0061∶40 33.5％說明1每組劑量有3個平行孔，每個孔用MTT法測定3次2NC代表正常的CEMx-174細(xì)胞，NC+SIV代表混合有SIV顆粒的正常的CEMx-174細(xì)胞3試驗組測定的OD值與對照組(NC+SIV)相比較，均有顯著性差異P＜0.054數(shù)值的計算方法見正文說明實施例10殺傷試驗及中和試驗的病毒滴度試驗將融合蛋白殺傷處理后培養(yǎng)48h的細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，(中和試驗要處理7天)，按照10、20、40、80、160、320、640、1280倍以培養(yǎng)基進行稀釋。分別取各稀釋液100μl于新的無菌96孔板中，加等量的1.0×105/ml CEMx-174細(xì)胞，置37℃CO2培養(yǎng)箱(95％空氣，5％CO2)中孵育，每48小時更換一半新鮮培養(yǎng)基。7天后觀察結(jié)果，以細(xì)胞融合形成的多核大細(xì)胞為指標(biāo)確定滴度。(結(jié)果見表1，4)細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的病毒完全是由于受病毒感染的細(xì)胞在病毒繁殖后裂解而釋放到上清中的。上清中的病毒數(shù)量可通過病毒滴度試驗來確定。在一定的稀釋度下，上清中的病毒被稀釋到滴度實驗的檢測靈敏度范圍以下，這樣的稀釋物加入正常細(xì)胞培養(yǎng)物中不導(dǎo)致合胞體的產(chǎn)生。我們采用2n梯度稀釋上清以感染細(xì)胞的方法，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，以培養(yǎng)細(xì)胞中合胞體的產(chǎn)生與否為標(biāo)準(zhǔn)確定病毒感染細(xì)胞的情況，可以直接得出在何稀釋度下病毒濃度低于滴度試驗的檢測靈敏度范圍的結(jié)果。以此為根據(jù)可推斷上清中原來含有的病毒的相對濃度，該指標(biāo)可作為病毒學(xué)檢驗的客觀指標(biāo)。從滴度示意圖(圖14和圖15)中可看出實驗組與陽性對照組之間在病毒滴度試驗結(jié)果上明顯差異，并呈明顯的劑量關(guān)系，從圖中可以看出隨著藥物劑量的增加，殺傷組和中和組病毒滴度逐漸下降。
實施例11感染細(xì)胞的熒光計數(shù)及顯微照相將殺傷試驗和中和試驗中各培養(yǎng)孔的細(xì)胞充分混懸，取1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，3000rpm離心3分鐘，棄上清。再用1ml的PBS洗一次，棄上清，在逐漸加入PBS，混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。取15μl混懸液滴加在載玻片上的環(huán)內(nèi)，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分鐘，取出晾干，加入gp120的抗體(猴抗SIV抗體，來自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分鐘。然后用pH7.2的PBS沖洗，并置于其中浸泡10分鐘，其間不斷振搖。取出片子后，再加入用萬分之二的Evens蘭配制的兔抗猴抗體(即二抗)，37℃水浴30分鐘，用PBS沖洗，晾干后在熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)并拍照。在熒光顯微鏡下觀察被SIV/HIV感染的細(xì)胞在藍色光的激發(fā)下發(fā)黃綠色熒光，可以看到細(xì)胞周邊呈黃綠色，而未被感染的細(xì)胞則不呈黃色，呈暗紅色。殺傷試驗和保護試驗結(jié)果中的熒光感染率見表1。殺傷試驗前后的熒光照片見圖16-1和圖16-2。圖16-1中可見被SIV/HIV感染的細(xì)胞，而圖16-2中可見許多細(xì)胞碎片，為被融合蛋白殺傷的SIV/HIV感染的細(xì)胞。保護試驗前后的熒光照片見圖17-1和圖17-2。圖17-1中可見被SIV/HIV感染的細(xì)胞，而圖16-2中多見未受SIV/HIV感染的正常細(xì)胞，說明細(xì)胞受到了融合蛋白的有效保護。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所<120>一種用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的重組靶向融合蛋白<130>
<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>303<212>DNA<213>人<400>1atgaaaaaag tagttctggg taaaaagggt gacaccgttg aactgacttg caccgcttcc 60cagaaaaagt ctatccagtt ccactggaaa aactccaacc agatcaaaat cctaggtaac120cagggttcct tcctgaccaa aggtccgtct aaactgaacg atcgtgctga ctcccgccgt180tctctatggg accagggtaa cttcccgctg attatcaaaa acctgaaaat cgaagattcc240gacacctaca tctgtgaagt tgaagaccag aaagaagaag ttcaactact ggttttcggt300ctg 303<210>2<211>101<212>PRT<213>人<400>2His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu1 5 10 15Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn20 25 30
Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys35 40 45Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp50 55 60Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp65 70 75 80Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln85 90 95Leu Leu Val Phe Gly100<210>3 <211>486 <212>DNA <213>人 <400>3gtaagaggtc caagatcatc ttctaaaacc ccgagtgaca agcctgtagc ccatgttgta 60gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg120gccaatggcg tggagctgag agataaccag ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc180atctactccc aggtcctctt caagggccaa ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc240cacaccatca gccgcatcgc cgtctcctac cagaccaagg tcaacctcct ctctgccatc300aagagcccct gccagaggga gaccccagag ggggctgagg ccaagccctg gtatgagccc360atctatctgg gaggggtctt ccagctggag aagggtgacc gactcagcgc tgagatcaat420cggcccgact atctcgactt tgccgagtct gggcaggtct actttgggat cattgccctg480tgataa 486<210>4<211>161
<212>PRT<213>人<400>4Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro1 5 10 15Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp20 25 30Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg35 40 45Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser50 55 60Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu65 70 75 80Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn85 90 95Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly100 105 110Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe115 120 125Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp130 135 140Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala145 150 155 160
Leu<210>5<211>456<212>DNA<213>人<400>5cgtaaacgca agcctgtagc ccatgttgta gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag 60tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag120ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa180ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgc cgtctcctac240cagaccaagg tcaacctcct ctctgccatc aagagcccct gccagaggga gaccccagag300ggggctgagg ccaagccctg gtatgagccc atctatctgg gaggggtctt ccagctggag360aagggtgacc gactcagcgc tgagatcaat cggcccgact atctcgactt tgccgagtct420gggcaggtct actttgggat cattgccctg tgataa 456<210>6<211>151<212>PRT<213>人<400>6Thr Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala1 5 10 15Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala20 25 30Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly
35 40 45Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro50 55 60Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser65 70 75 80Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln85 90 95Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile100 105 110Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala115 120 125Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val130 135 140Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150<210>7<211>798<212>DNA<213>人<400>7catatgaaaa aagtagttct gggtaaaaag ggtgacaccg ttgaactgac ttgcaccgct 60tcccagaaaa agtctatcca gttccactgg aaaaactcca accagatcaa aatcctaggt120aaccagggtt ccttcctgac caaaggtccg tctaaactga acgatcgtgc tgactcccgc180cgttctctat gggaccaggg taacttcccg ctgattatca asascctgaa aatcgaagat240
tccgacacct acatctgtga agttgaagac cagaaagaag aagttcaact actggttttc300ggtctgggta ccgtaagagg tccaagatca tcttctaaaa ccccgagtga caagcctgta360gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc420aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg agagataacc agctggtggt gccatcagag480ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat540gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc600ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg gagaccccag agggggctga ggccaagccc660tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc720gctgagatca atcggcccga ctatctcgac tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg780atcattgccc tgtgataa 798<210>8<211>264<212>PRT<213>人<400>8His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu1 5 10 15Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn20 25 30Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys35 40 45Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp50 55 60
Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp65 70 75 80Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln85 90 95Leu Leu Val Phe Gly Leu Gly Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser100 105 110Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln115 120 125Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu130 135 140Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu145 150 155 160Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys165 170 175Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val180 185 190Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys195 200 205Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro210 215 220Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser225 230 235 240
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln245 250 255Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu260<210>9<211>768<212>DNA<213>人<400>9catatgaaaa aagtagttct gggtaaaaag ggtgacaccg ttgaactgac ttgcaccgct 60tcccagaaaa agtctatcca gttccactgg aaaaactcca accagatcaa aatcctaggt120aaccagggtt ccttcctgac caaaggtccg tctaaactga acgatcgtgc tgactcccgc180cgttctctat gggaccaggg taacttcccg ctgattatca aaaacctgaa aatcgaagat240tccgacacct acatctgtga agttgaagac cagaaagaag aagttcaact actggttttc300ggtctgggta cccgtaaacg caagcctgta gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag360gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg420agagataacc agctggtggt gccatcagag ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc480ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc540gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg600gagaccccag agggggctga ggccaagccc tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc660ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc gctgagatca atcggcccga ctatctcgac720tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg atcattgccc tgtgataa 768<210>10<211>254
<212>PRT<213>人<400>10His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu1 5 10 15Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn20 25 30Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys35 40 45Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp50 55 60Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp65 70 75 80Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln85 90 95Leu Leu Val Phe Gly Leu Gly Thr Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His100 105 110Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg115 120 125Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln130 135 140Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu145 150 155 160
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr165 170 175Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser180 185 190Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala195 200 205Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu210 215 220Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp225 230 235 240Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu245 250
權(quán)利要求
1.一種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO3所示。
4.一種TNF-α的變異體，它的氨基酸列如SEQ ID NO4所示。
5.一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO5所示。
6.一種TNF-α的變異體，它的氨基酸列如SEQ ID NO6所示。
7.一種靶向融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白為包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其特征在于所述的受體多肽是CD4，CD4V1V2或CD4V1，或者它們的相關(guān)片斷，類似物或突變體，所述的殺傷多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突變體的TNF家族成員；或TNF超家族成員；或所述的多肽是來源于人體的穿孔素、補體成分C9及顆粒溶解素；或者來源于人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E、絲氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、細(xì)胞色素或DNA核酸內(nèi)切酶；或可以抵御細(xì)菌的多肽和酶，如溶菌酶、防御素；或抗癌基因及其編碼的蛋白質(zhì)；以及一切來源于人體的具有致死細(xì)胞功能的基因及其編碼蛋白質(zhì)、或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于所述的TNF超家族成員是Trail，Light或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于所述的抗癌基因為P53。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于編碼所述的CD4V1的基因序列為SEQ ID NO1所示的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于所述的CD4V1基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-8、11-12任一項所述的融合蛋白，其特征在于所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm1，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求7-8、11-12任一項所述的融合蛋白，其特征在于所述的TNFαm1基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求7-8、11-12任一項所述的融合蛋白，其特征在于所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm2，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求7-8、11-12任一項所述的融合蛋白，其特征在于所述的殺傷多肽是TNFαm2，它的氨基酸序列為SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO9所示的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
21.包括SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的融合基因的重組體pCW-CD4V1TNFαm1。
22.含有權(quán)利要求21所述的重組體的載體。
23.含有權(quán)利要求21所述的重組體的工程菌。
24.含有能表達權(quán)利要求7所述的融合蛋白的構(gòu)建質(zhì)粒載體的真核或原核細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞，其特征在于所述的構(gòu)建質(zhì)粒載體是含有權(quán)利要求21所述的重組體的載體。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的細(xì)胞，其特征在于所述的細(xì)胞為真核細(xì)胞。
27.制備權(quán)利要求8所述的融合蛋白的方法，包括用權(quán)利要求17所述的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
28.一種含有權(quán)利要求8所述的融合蛋白的藥物組合物。
29.權(quán)利要求8所述的融合蛋白在制備用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的藥物中的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的用途，其通過殺滅受HIV/SIV感染的細(xì)胞或中和游離的HIV/SIV來完成。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白質(zhì)及編碼它的融合基因。本發(fā)明還涉及CD4V1－TNFα ml和CD4V1－TNFα m2融合基因、包含所述融合基因的表達型重組體、包含所述表達型重組體的工程菌、由此工程菌表達和分離純化的靶向融合蛋白－TNFα ml和CD4V1－TNFα m2以及這些融合蛋白中任意一種的用于治療艾滋病用途。
文檔編號C12N15/63GK1621411SQ200310115150
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者盧圣棟, 王憬惺, 楊晶, 李濤, 申景平, 陳偉京, 涂新明, 魏強, 秦川, 蔣虹, 張兵林, 叢哲, 路金芝, 佟巍 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所