專利名稱：非必要代謝產(chǎn)物生成減少的代謝工程微生物的制作方法
在低增值(low-value added)產(chǎn)品如乙醇、乳酸、檸檬酸、氨基酸和許多抗生素的代謝生成中，底物上產(chǎn)品的產(chǎn)量(yield)，即消耗每單位底物形成的產(chǎn)物量(經(jīng)常表示為消耗每kg底物形成的kg產(chǎn)物)和生產(chǎn)率(productivity)，即單位反應(yīng)體積和單位時(shí)間內(nèi)形成的產(chǎn)物的量(經(jīng)常表示為每m3反應(yīng)體積、每小時(shí)形成的kg產(chǎn)物)是待優(yōu)化的最重要的設(shè)計(jì)變量。為了獲得高產(chǎn)量和生產(chǎn)率，必須引導(dǎo)碳以高速率從底物流向目的代謝物，并同時(shí)使所有可能的副產(chǎn)物的生成最小。這經(jīng)常需要對(duì)中心碳代謝(central carbon metabolism)進(jìn)行改造，由于細(xì)胞代謝這一部分的嚴(yán)緊調(diào)控，這種改造是困難的(Nielsen，2001)。
已經(jīng)優(yōu)化了許多發(fā)酵方法，從而主要形成所需的產(chǎn)物。但是，由于細(xì)胞代謝的復(fù)雜性，形成副產(chǎn)物是不可避免的。由于至少三個(gè)原因，這是不希望的·副產(chǎn)物可能對(duì)人類或動(dòng)物有毒。
·副產(chǎn)物可能在后續(xù)的分離工藝中引發(fā)問題或?qū)Νh(huán)境有害。
·副產(chǎn)物的形成導(dǎo)致碳流失，從而使原材料上產(chǎn)物的總產(chǎn)量低于理論最大值。
如果人類或動(dòng)物直接或間接暴露于產(chǎn)物，第一個(gè)原因明顯是麻煩的。通常，在制備用于人消費(fèi)的產(chǎn)品時(shí)，人們選擇不生成毒素的細(xì)胞系統(tǒng)，如使用不生成黃曲霉毒素的真菌細(xì)胞來生產(chǎn)食品級(jí)酶，使用不生成內(nèi)毒素的大腸桿菌(E.coli)菌株來生產(chǎn)藥品。如果副產(chǎn)物具有與所需產(chǎn)物非常相似的特征，第二個(gè)原因是特別麻煩的，因?yàn)榛钚援a(chǎn)物的分離需要非常有效的分離原理，其經(jīng)常成本較高。在某些情況下，副產(chǎn)物還可以導(dǎo)致其他類問題，如鈍化所需的產(chǎn)物。生產(chǎn)低增值產(chǎn)品如乙醇、乳酸、氨基酸和許多抗生素時(shí)，碳流失到副產(chǎn)物中的問題是主要的問題。
舉例來說，通過釀酒酵母(S.cerevisiae)的厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)乙醇時(shí)，主要問題是大量形成作為副產(chǎn)物的甘油。在厭氧生產(chǎn)條件下，由生物質(zhì)(biomass)形成所形成的胞質(zhì)NADH只能夠通過甘油的形成重新轉(zhuǎn)化為NAD+(van Dijken and Scheffers，1986)。有兩個(gè)基因GPD1和GPD2編碼甘油-3-磷酸脫氫酶，所述的甘油-3-磷酸脫氫酶在將二羥基丙酮-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸的同時(shí)將NADH重新生成NAD+。破壞GPD2導(dǎo)致甘油形成的一定程度減少，并且比生長(zhǎng)速率也顯著下降(Valadi et al.，1998；Nissen et al.，2000a)。gpd1gpd2雙缺失突變株不能在厭氧條件下生長(zhǎng)，因此嘗試了通過在gpd1gpd2雙缺失突變株中表達(dá)棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的細(xì)菌轉(zhuǎn)氫酶(催化NADH+NADP+＜＝＞NAD++NADPH)引入再生NAD+的新途徑(Nissen etal.，2000a)。但轉(zhuǎn)氫酶的表達(dá)不能恢復(fù)厭氧條件下的生長(zhǎng)。EP-A-0733712中也公開了轉(zhuǎn)氫酶表達(dá)的增加。
WO99/46363報(bào)道了磷酸化脫氫酶表達(dá)導(dǎo)致活細(xì)胞中的凈轉(zhuǎn)氫酶活性，目的是提高產(chǎn)物形成。因此，通過超表達(dá)編碼磷酸化NADH依賴型谷氨酸脫氫酶(EC1.2.1.12)的GDH2，他們?cè)噲D增加始于木糖和葡萄糖的乙醇形成。使用同一概念的另一嘗試是Verho等(2002)所述的表達(dá)真菌NADPH依賴型甘油醛脫氫酶。但是，在木糖上的生長(zhǎng)過程中，重組細(xì)胞還大量生成較多的木糖醇。
在提高乙醇生成和降低甘油形成的另一方法中，Nissen等(2000b)改造了釀酒酵母中的氨同化作用。通過破壞編碼NADPH依賴型谷氨酸脫氫酶的GDH1和超表達(dá)GDH2，與生物質(zhì)的合成相關(guān)的NADH的生成顯著減少，導(dǎo)致甘油產(chǎn)量的40％以上的減小(Nissen et al.，2000b)。另外，通過用于氨同化作用并且同樣為NADH依賴型的GS-GOGAT通路在釀酒酵母中的超表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了甘油產(chǎn)量的減小和乙醇產(chǎn)量的增加(Nissen et al.，2000b)。乙醇產(chǎn)量的這種增加緣自GS-GOGAT通路中ATP的額外消耗。該實(shí)例說明通過改造代謝的其他部分，具體通過調(diào)節(jié)氧化還原代謝可以實(shí)現(xiàn)通過中心碳代謝的流的再次定向，并且該方法對(duì)于提高其他產(chǎn)物的生成也是有作用的，因?yàn)镹ADPH對(duì)生物合成的供應(yīng)經(jīng)常限制生成能力。當(dāng)幾乎只有NADPH用作細(xì)胞內(nèi)生物合成中的電子供體時(shí)，NADH主要用來產(chǎn)生自由能(經(jīng)常以ATP中的高能磷酸鍵形式)。在某些條件下，如釀酒酵母在可發(fā)酵糖上厭氧生長(zhǎng)，形成不能用于產(chǎn)生ATP的過量NADH，這導(dǎo)致形成副產(chǎn)物，主要是甘油。
Valverde等(1999)公開了經(jīng)人工改造來表達(dá)含豌豆(Pisum sativum)GapN基因的cDNA的E.coli菌株，所述的Pisum sativum GapN基因編碼非磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPN或GAPDHN(EC 1.2.1.9)。該菌株中編碼NAD依賴型磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH的天然Gap-2基因通過插入物失活。發(fā)現(xiàn)GAPN的表達(dá)重新賦予該菌株在糖上厭氧生長(zhǎng)的能力，但是該菌株仍不能進(jìn)行厭氧發(fā)酵。
本發(fā)明現(xiàn)提供了一種代謝工程微生物(metabolically engineeredmicro-organiam)，其具有可操作的第一代謝途徑，其中在NAD作為第一種酶輔因子的反應(yīng)中，第一代謝物轉(zhuǎn)化為第二代謝物，所述的反應(yīng)步驟產(chǎn)生NAPH；其中在第二種酶催化的反應(yīng)中，所述的第二代謝物轉(zhuǎn)化成至少一種其他代謝物，并且具有可操作的第二代謝途徑，其特征在于關(guān)于催化NADP為輔因子、NADPH為產(chǎn)物的不可逆反應(yīng)的第三種酶，酶活性超過天然水平，其中在沒有所述第二種酶的參與下，所述的第一代謝物轉(zhuǎn)化為所述的另一代謝物。
在上述的本發(fā)明微生物中，所述的第一代謝途徑優(yōu)選為天然途徑。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的第一種酶是磷酸化脫氫酶。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括前文所參考的實(shí)施方案中，所述的第二種酶是激酶。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括在前面兩段中所參考的實(shí)施方案中，所述的第三種酶是非磷酸化脫氫酶，例如所述的第三種酶是GAPN(EC 1.2.1.9)。
磷酸化脫氫酶第一種酶的例子是GAPDH(EC 1.2.1.12)。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括上文參考的所有實(shí)施方案中，編碼所述第三種酶的至少一拷貝基因序列已經(jīng)重組導(dǎo)入到所述微生物中。
優(yōu)選的是，編碼所述第三種酶的基因序列可操作地連接于表達(dá)信號(hào)，所述的表達(dá)信號(hào)不與所述微生物中的所述基因序列天然相關(guān)。
本發(fā)明的微生物優(yōu)選為酵母。其可以是生成乙醇的發(fā)酵酵母。其可以是釀酒酵母菌株。
更通常地說，微生物可以是屬于酵母屬(Saccharomyces)的物種，如釀酒酵母、S.Kluyveri、葡萄酒酵母(S.bayanus)、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)；屬于克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的物種，如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、K.marxianus var marxianus、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)；屬于假絲酵母屬(Candida)的物種，如產(chǎn)朊假絲酵母(C.utilis)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)；屬于畢赤酵母屬(Pichia)的物種，如P.stipidis、甲醇酵母(Pichia Pastoris)、P.sorbitophila或其他酵母物種，如漢遜氏德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、適冷性海洋酵母(Yarrowia lipolytica)、接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
對(duì)于其他的微生物(非酵母)，非窮舉的適當(dāng)微生物的例子包括大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、產(chǎn)青霉菌(penicillium chrysogenum)、米根霉(Rhizopusoryzae)。
本發(fā)明包括基因轉(zhuǎn)化的、含有與表達(dá)信號(hào)可操作連接的編碼GAPN的一個(gè)或多個(gè)拷貝的異源DNA序列并對(duì)GAPDH(EC 1.2.12)具有功能性天然或異源表達(dá)能力的微生物。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明包括非必要代謝產(chǎn)物生成減少的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)如上所述的本發(fā)明微生物。非必要代謝產(chǎn)物可以是甘油、乙酸或氨基酸，也可以是微生物分泌的其他代謝物。
所需的產(chǎn)物可以是乙醇、乳酸、檸檬酸、氨基酸或抗生素。
因此，本發(fā)明可以用于提高微生物體內(nèi)乙醇的生成，也提高乙醇之外的代謝物的生成。因此，Porro等(1999)描述了在酵母中通過去除丙酮酸脫羧酶活性和表達(dá)乳酸脫氫酶異源活性來生成乳酸。在丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化中，再生NAD+，和丙酮酸向乙醇的總體轉(zhuǎn)化情況一樣。因此，糖向乳酸的總體轉(zhuǎn)化和糖向乙醇的轉(zhuǎn)化具有高度相似性，所以本發(fā)明對(duì)乳酸的生成也具有積極效果。
在絲狀真菌黑曲霉對(duì)檸檬酸的生成中，糖向檸檬酸的轉(zhuǎn)化有NADH的凈形成，即在甘油醛-3-P脫氫酶和丙酮酸脫氫酶的部位產(chǎn)生NADH。通過表達(dá)GAPN，可以用蛋白質(zhì)合成所需的NADPH的凈形成置換NADH的部分凈形成。因此，以其他方式如通過戊糖磷酸途徑(糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳，同時(shí)形成NADPH)產(chǎn)生NADPH形式的氧化還原力(power)的糖重新導(dǎo)向檸檬酸的形成，導(dǎo)致在糖上的產(chǎn)物的更高產(chǎn)量。類似的推理同樣適用于其他代謝物如琥珀酸和蘋果酸的生成。
在許多氨基酸的生成中，如谷氨酸棒桿菌對(duì)賴氨酸的生成中，氨基酸來源于中心碳代謝中的前體代謝物。因此，在細(xì)菌中，賴氨酸來源于草酰乙酸，還來源于丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸。在糖向前體代謝物的轉(zhuǎn)化中，存在有NADH的凈生成，因此糖向賴氨酸的總體轉(zhuǎn)化涉及NADH的凈生成。在草酰乙酸向賴氨酸的轉(zhuǎn)化中，存在有NADPH的凈消耗(某些情況下，間接通過使用谷氨酸，其需要消耗NADP從2-酮戊二酸再生)。因此，GAPN的表達(dá)導(dǎo)致糖向賴氨酸的總體轉(zhuǎn)化中NADH的凈形成減少和NADPH的凈消耗減少。類似的推理同樣適用于其他氨基酸如異亮氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸的合成。
在許多抗生素的生成中，如產(chǎn)青霉菌對(duì)青霉素的生成中，糖向抗生素的總體轉(zhuǎn)化中也有NADH的凈生成和NADPH的凈消耗。對(duì)于這些過程，表達(dá)GAPN也將是有利的。
增加GAPN表達(dá)可以有利地和調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或抑制)一種或多種其他酶表達(dá)或活性聯(lián)合。上面已經(jīng)提到了酵母中GAPN表達(dá)和乳酸脫氫酶表達(dá)之間的相互作用。通常，本發(fā)明可以用于改進(jìn)戊糖的代謝。本發(fā)明可以用于提高木糖吸收，減少木糖醇分泌。在許多微生物中，木糖代謝涉及將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的木糖還原酶(XR)、將木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖的木糖醇脫氫酶(XDH)，最后是將木酮糖磷酸化為進(jìn)入戊糖磷酸途徑的木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶。XR涉及NAPDH(使用NAD+和NADP+二者作為輔因子的酶，但它對(duì)NADP+具有偏向性)的形成，而XDH涉及NADH的消耗。因此，在吸收木糖時(shí)存在有NADPH的凈消耗和NADH的凈形成。所以，如果GAPN表達(dá)與木糖還原酶、木糖脫氫酶和木糖醇激酶表達(dá)相結(jié)合，增加GAPN表達(dá)會(huì)導(dǎo)致木糖吸收增加。
可以通過向微生物中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)拷貝的、帶有異源啟動(dòng)子或置于天然啟動(dòng)子序列的控制之下的酶的DNA編碼序列，提供GAPN或另一種所述第三種酶的表達(dá)。合適的是，編碼序列和有效表達(dá)信號(hào)以多拷貝質(zhì)粒形式導(dǎo)入。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明特別針對(duì)功能性細(xì)胞中生成過多NADH的問題和NADPH供應(yīng)受限制的問題。使細(xì)胞減少NADH形成的情況下增加NADPH的形成。例如，這通過在細(xì)胞中表達(dá)非磷酸化NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPN)(EC1.2.1.9)，以此作為改變細(xì)胞中氧化還原代謝的手段來實(shí)現(xiàn)。
GAPN催化甘油醛-3-磷酸和NADP+向3-磷酸甘油酸和NADPH的不可逆氧化。在多數(shù)細(xì)胞中，甘油醛-3-磷酸向3-磷酸甘油酸的轉(zhuǎn)化僅由兩種酶NAD+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(EC 1.2.1.12)和磷酸甘油酸激酶(PGK)(EC 2.7.2.3)的依次作用來催化，將NAD+和ADP轉(zhuǎn)化為NADH和ATP(參見

圖1)。將甘油醛-3-P轉(zhuǎn)化為3-P-甘油酸的途徑的凈化學(xué)計(jì)量關(guān)系為GAPN甘油醛-3-磷酸+NADP+→3-磷酸甘油酸+NADPHGAPDH+PGK甘油醛-3-磷酸+NAD++ADP+P＝3-磷酸甘油酸+NADPH+ATP因此，當(dāng)與GAPDH和PGK催化的總反應(yīng)相比時(shí)，GAPN催化的反應(yīng)生成一個(gè)NADPH，而非生成一個(gè)NADH和一個(gè)ATP。
甘油醛-3-磷酸向3-磷酸甘油酸的轉(zhuǎn)化是主要產(chǎn)能途徑糖酵解的一部分，因此當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)在含己糖或戊糖的基質(zhì)上時(shí)該反應(yīng)總是活躍的。
通過控制微生物細(xì)胞中g(shù)apN的表達(dá)量，可以對(duì)甘油醛-3-磷酸向3-磷酸甘油酸的轉(zhuǎn)化中應(yīng)有多大部分經(jīng)由GAPN進(jìn)行控制。因此，通過控制消耗一個(gè)NADH和ATP時(shí)形成一個(gè)NAPDH的量，可以操縱氧化還原代謝。
下面的實(shí)施例參照附圖，其中圖1說明實(shí)施例8中獲得的關(guān)于生物質(zhì)、葡萄糖和木糖濃度曲線(profile)的結(jié)果(表示木糖的符號(hào)為實(shí)心圓圈和空心菱形，兩條曲線緊密相重疊)；圖2說明實(shí)施例8中獲得的關(guān)于乙醇、木糖醇、甘油和乙酸濃度曲線(profile)的結(jié)果。(閉合的和開放的方框符號(hào)用于表示乙醇和乙酸。下面的閉合和開放方框限定的曲線為乙酸。上面的閉合和開放方框限定的曲線為乙醇。)為了在下面的實(shí)施例中進(jìn)行說明，將含突變鏈球菌(streptococcus mutans)中非磷酸化NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gapN)的核苷酸序列在釀酒酵母中于多拷貝質(zhì)粒上表達(dá)。所得的菌株特征在于能夠厭氧性地批量培養(yǎng)在己糖上(實(shí)施例3)和木糖上(實(shí)施例8)，其中厭氧性地批量培養(yǎng)在己糖上是用于乙醇生產(chǎn)的典型方法。在實(shí)施例5中測(cè)定實(shí)施例1的gapN菌株和攜帶空質(zhì)粒的參照株中NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性。只能在gapN菌株中測(cè)定到GAPN活性，該活性約為NAD+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性的10％。
當(dāng)與含空質(zhì)粒的菌株相比較時(shí)，實(shí)施例1中g(shù)apN菌株的生長(zhǎng)速率不受GAPN活性表達(dá)的影響。GapN菌株生成少43％的甘油，和多3％的乙醇。在實(shí)施例8中實(shí)現(xiàn)了乙醇生成的更大增加。
在厭氧生長(zhǎng)過程中釀酒酵母形成甘油來維持胞質(zhì)氧化還原平衡。在厭氧條件下，作為生成生物質(zhì)和有機(jī)酸的結(jié)果生成的NADH只有通過形成甘油來氧化成NAD+，因?yàn)楹粑遣豢赡艿?，且乙醇的形成是一個(gè)氧化還原中性的步驟。因此甘油的形成是一個(gè)氧化還原問題，通過將gapN導(dǎo)入到釀酒酵母中，通過GAPN轉(zhuǎn)化的每分子甘油醛-3-磷酸將減少一分子甘油的生成。通過具有足夠高的通過GAPN的流可以完全消除甘油的生成，使流重新導(dǎo)向乙醇和/或生物質(zhì)，從而增加乙醇產(chǎn)量。
通過在細(xì)胞中表達(dá)gapN來增加用于生物合成的NADPH的量，可以在NADPH供應(yīng)有限的情況下增加諸如蛋白質(zhì)的產(chǎn)物的生成。
示例性方法的優(yōu)點(diǎn)包括·可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的更大變化。
·只需要一個(gè)遺傳性改變。
·酶活性只影響其所催化的特定反應(yīng)和氧化還原代謝——對(duì)代謝的其他部分沒有影響，因此生長(zhǎng)速率不受影響。
·可以消除用酵母生產(chǎn)乙醇的過程中副產(chǎn)物甘油的生成。
實(shí)施例1GAPN在釀酒酵母中的表達(dá)菌株用釀酒酵母(M4054，S288C MATa ura3gap1)來構(gòu)建參照菌株和GAPN菌株。為了長(zhǎng)期維持，含質(zhì)粒的菌株在基本培養(yǎng)基(見下文)上的搖瓶培養(yǎng)物中生長(zhǎng)至靜止期。加入無菌甘油至濃度為20％(體積/體積)之后，于-80℃分裝保存。這些冷凍的貯液用于在具有基本培養(yǎng)基的平板上獲得單菌落(Verduyn et al.，1990)，該平板保存于4℃，2周內(nèi)用于預(yù)培養(yǎng)物接種。
參照菌株的構(gòu)建通過電穿孔，將含URA3基因和TPI1啟動(dòng)子的空pYX212 2μ高拷貝載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(M4054)中。
GAPN菌株的構(gòu)建gapN在含URA3基因和TPI1啟動(dòng)子的pYX212 2μ高拷貝載體上表達(dá)。通過共轉(zhuǎn)染以及EcoRI消化的pYX212和由突變鏈球菌PCR擴(kuò)增的gapN之間的同源重組，直接在釀酒酵母中構(gòu)建所述的質(zhì)粒。使用Expand High Fidelity(Roche)、與pYX212中TPI1啟動(dòng)子加上gapN第一部分相同的一個(gè)引物(gapN-START-EcoRI-TPI啟動(dòng)子5′-CTA CAA AAA ACA CAT ACA GGA ATT CATGAC AAA ACA ATA TAA AAA TTA TG)、與pYX212的MCS和包括終止密碼子的agpN最后部分相同的第二引物(gapN-STOP-NcoI-BamHI-AvrII-ApaI 5′-GGG CCCTAG GAT CCA TGG TGAATT TTA TTA TTT GAT ATC AAA TAC GAC GG)對(duì)突變鏈球菌的基因組DNA進(jìn)行PCR。因此gapN的ORF克隆到了pYX212中EcoRI和NcoI之間、TPI1啟動(dòng)子的下游。原起始密碼子TTG替換為ATG，以使在釀酒酵母中的翻譯成為可能。通過診斷PCR證實(shí)構(gòu)建體。
實(shí)施例2搖瓶培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)在帶擋板的棉花塞住的500ml Erlenmeyer燒瓶中進(jìn)行厭氧搖瓶培養(yǎng)，以篩選所獲得的轉(zhuǎn)化子。用于厭氧批量培養(yǎng)的預(yù)培養(yǎng)物生長(zhǎng)在不具有擋板的類似燒瓶中。這些燒瓶每個(gè)含100ml規(guī)定的礦質(zhì)培養(yǎng)基(defined mineralmedium)，其含有7.5g/L(NH4)2SO4；14g/L KH2PO4；0.5g/L MgSO4·7H2O；50μl/Lantifoam(Sigma A-8436)；2％(w/vol)葡萄糖；痕量金屬(15mg/L EDTA；4.5mg/LZnSO4·7H2O；0.84mg/L MnCl2·2H2O；0.30mg/L CoCl2·6H2O；0.30mg/L CuSO4·H2O；0.40mg/L Na2MoO4·2H2O；4.5mg/L CaCl2·2H2O；3.0mg/L FeSO4·7H2O；1.0mg/LH3BO3和0.10mg/L KI)和維生素(0.05mg/L D(-)生物素；1.0mg/L D(+)泛酸鈣；1.0mg/L煙酸；25mg/L肌醇；1.0mg/L鹽酸硫胺(thiamine chloride hydrochloride)；1.0mg/L鹽酸吡哆醇(pyridoxol hydrochloride)和0.20mg/L對(duì)氨基苯甲酸)。礦質(zhì)培養(yǎng)基的pH用NaOH調(diào)至6.5，和葡萄糖溶液分別高壓滅菌。高壓滅菌后，將維生素溶液通過除菌過濾加入到燒瓶中。將搖瓶和預(yù)培養(yǎng)物從平板培養(yǎng)物接種一個(gè)單菌落，于30℃以150rpm生長(zhǎng)。使預(yù)培養(yǎng)物生長(zhǎng)至指數(shù)期，用于接種厭氧批量培養(yǎng)物至起始濃度為1mg CDW/L。觀察到了參照菌株和GAPN菌株的生長(zhǎng)。
實(shí)施例3厭氧批量培養(yǎng)在工作體積為2升的良好控制的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐(B.Braun Biotech，Germany)中進(jìn)行培養(yǎng)。使用規(guī)定的礦質(zhì)培養(yǎng)基(Verduyn et al.，1990)，其每升含40g葡萄糖；5.0g(NH4)2SO4；3.0g KH2PO4；0.5g MgSO4·7H2O；和搖瓶培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)中所述的痕量金屬和維生素。加入300μl/L antiform(Sigma A-8436)，以免產(chǎn)生泡沫，向培養(yǎng)基添加釀酒酵母厭氧生長(zhǎng)所必需的420mg/L Tween 80和10mg/L麥角固醇。葡萄糖溶液和礦質(zhì)培養(yǎng)基分別高壓滅菌，然后和含維生素的無菌濾液以及首先溶解在煮沸的無水乙醇中的Tween 80和麥角固醇一起加入到發(fā)酵罐中。
用速度為600rpm的攪拌器于30℃進(jìn)行培養(yǎng)，然后以每分鐘400ml的流量通氮?dú)?。為了使O2向培養(yǎng)物的擴(kuò)散最小，生物反應(yīng)器安裝Norprene管。溶氧濃度用MettlerToledo極譜電極測(cè)定，并保持在檢測(cè)限之下。通過自動(dòng)添加4M KOH使pH保持在5.0。生物反應(yīng)器安裝冷凝器，放出的氣體導(dǎo)向氣體分析儀(INNOVA，Denmark)，以測(cè)定CO2的含量。參照菌株和GAPN菌株發(fā)酵過程中的生物質(zhì)濃度如圖2所示。發(fā)現(xiàn)GAPN菌株的最大比生長(zhǎng)速率和參照菌株的相同。
實(shí)施例4分析細(xì)胞外代謝物用來測(cè)定葡萄糖、乙醇、甘油、乙酸、丙酮酸和琥珀酸濃度的培養(yǎng)物樣品在取樣后馬上通過0.45μm的醋酸纖維素濾器(Osmonics)進(jìn)行過濾，將濾液于-20℃冷凍，待進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過在保持于65℃的、用5mMH2SO4以0.6ml/min的速率洗脫的Aminex HPX-87Hm柱(Bio-Rad)上進(jìn)行高壓液相層析來測(cè)定代謝物的濃度。用Waters 486可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(Tumable AbsobanceDetector)在210nm處通過分光光度法檢測(cè)乙酸和丙酮酸。用Waters 410示差折射計(jì)(Differential Refractometer)通過折射測(cè)定法檢測(cè)葡萄糖、乙醇、甘油和琥珀酸。厭氧發(fā)酵過程中代謝物的測(cè)定值示于圖3中。代謝物的終濃度列在下文中?？梢钥闯鯣APN菌株生成了更多的乙醇和更少的甘油。
根據(jù)葡萄糖的測(cè)定值，計(jì)算向不同代謝物的總體轉(zhuǎn)化產(chǎn)量，如下文所示。
觀察到乙醇產(chǎn)量提高了3％，甘油產(chǎn)量下降了40％。
實(shí)施例5測(cè)定酶活性如
等(2002)所述借助Fastprep FP120儀(SavantInstruments，New York)生成無細(xì)胞提取物。
在30℃，用分光光度計(jì)(來自Hewlett Packard的、帶有Chemstation軟件的HP8353 UV-VIS系統(tǒng))在340nm處跟蹤NADPH或NADH生成來分析酶活性。如Crow和Wittenberger(1979)所述測(cè)定1ml反應(yīng)混合物中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性。為了測(cè)定非磷酸化NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性，反應(yīng)混合物含有125mM三乙醇胺/HCl緩沖液(pH8.3)、1mM NADP+、5mM 2-巰基乙醇和無細(xì)胞提取物。用含125mM三乙醇胺/HCl緩沖液(pH8.3)、1mM NAD+、5mM半胱氨酸/HCl和無細(xì)胞提取物的反應(yīng)混合物測(cè)定NAD+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性。通過加入DL-甘油醛-3-磷酸(從DL-甘油醛-3-磷酸二乙基乙縮醛制備，Sigma G-5376)至終濃度2mM來啟動(dòng)反應(yīng)。通過Lowry法，使用無脂肪酸的BSA(Sigma A-6003)作為標(biāo)準(zhǔn)品來測(cè)定無細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)含量。酶活性的分析結(jié)果如下所示?？梢钥闯鰠⒄站曛袥]有NADP依賴型甘油醛脫氫酶的活性，而GAPN菌株中有一定的低活性(約為總甘油醛脫氫酶活性的10％)。
實(shí)施例6 GapN的測(cè)序?yàn)榱俗C實(shí)2μ高拷貝數(shù)質(zhì)粒中表達(dá)的gapN編碼基因中沒有發(fā)生突變，對(duì)含gapN的質(zhì)粒部分進(jìn)行測(cè)序。插到質(zhì)粒中和其中實(shí)際存在的gapN序列為“atg aca aaa caa tataaa aat tat gtc aat ggc gag tgg aag ctt tca gaa aat gaa attaaa atc tac gaa ccg gcc agt gga gct gaa ttg ggt tca gtt cca
gca atg agt act gaa gaa gta gat tat gtt tat gct tca gcc aagaaa gct caa cca gct tgg cga tca ctt tca tac ata gaa cgt gctgcc tac ctt cac aag gta gca gat att ttg atg cgt gat aaa gaaaaa ata ggt gct gtt ctt tcc aaa gag gtt gct aaa ggt tat aaatca gca gtc agc gaa gtt gtt cgt act gca gaa atc att aat tatgca gct gaa gaa ggt ctt cgt atg gaa ggt gaa gtc ctt gaa ggcggc agt ttt gaa gca gcc agc aag aaa aaa att gcc gtt gtt cgtcgt gaa cca gta ggt ctt gta tta gct att tca cca ttt aac taccct gtt aac ttg gca ggt tcg aaa att gca ccg gct ctt att gcggga aat gtt att gct ttt aaa cca ccg acg caa gga tca atc tcaggg ctc tta ctt gct gaa gca ttt gct gaa gct gga ctt cct gcaggt gtc ttt aat acc att aca ggt cgt ggt tct gaa att gga gactat att gta gaa cat caa gcc gtt aac ttt atc aat ttt act ggttca aca gga att ggg gaa cgt att ggc aaa atg gct ggt atg cgtccg att atg ctt gaa ctc ggt gga aaa gat tca gcc atc gtt cttgaa gat gca gac ctt gaa ttg act gct aaa aat att att gca ggtgct ttt ggt tat tca ggt caa cgc tgt aca gca gtt aaa cgt gttctt gtg atg gaa agt gtt gct gat gaa ctg gtc gaa aaa atc cgtaa aaa gtt ctt gca tta aca att ggt aat cca gaa gac gat gcagat att aca ccg ttg att gat aca aaa tca gct gat tat gta gaaggt ctt att aat gat gcc aat gat aaa gga gcc act gcc ctt actgaa atc aaa cgt gaa ggt aat ctt atc tgt cca atc ctc ttt gataag gta acg aca gat atg cgt ctt gct tgg gaa gaa cca ttt ggtcct gtt ctt ccg atc att cgt gtg aca tct gta gaa gaa gcc att
gaa att tct aac aaa tcg gaa tat gga ctt cag gct tct atc tttaca aat gat ttc cca cgc gct ttt ggt att gct gag cag ctt gaagtt ggt aca gtt cat atc aat aat aag aca cag cgc ggc acg gacaac ttc cca ttc tta ggg gct aaa aaa tca ggt gca ggt att caaggg gta aaa tat tct att gaa gct atg aca act gtt aaa tcc gtcgta ttt gat atc aaa”，其與突變鏈球菌的gapN序列相同。
實(shí)施例7GAPN在釀酒酵母的木糖代謝株中的表達(dá)菌株用釀酒酵母(MATa SUC2 MAL2-8 pADH-XYL1 pPGK-XYL2 pPGK-XKS1ura3-)來構(gòu)建表達(dá)GAPN的釀酒酵母的木糖代謝株。為了長(zhǎng)期維持，含質(zhì)粒的菌株在基本培養(yǎng)基(見下文)上的搖瓶培養(yǎng)物中生長(zhǎng)至靜止期。加入無菌甘油至濃度為20％(體積/體積)之后，于-80℃分裝保存。這些冷凍的貯液用于在具有基本培養(yǎng)基的平板上獲得單菌落(Verduyn et al.，1990)，該平板保存于4℃，2周內(nèi)用于預(yù)培養(yǎng)物接種。
參照菌株的構(gòu)建通過LiAc法將含URA3基因和TPI1啟動(dòng)子的空pYX212 2μ高拷貝載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(MATa SUC2 MAL2-8 pADH-XYL1 pPGK-XYL2pPGK-XKS1 ura3-)中，在具有葡萄糖的合成性最低限度氨培養(yǎng)基上選擇含有pYX2URA3 2μ質(zhì)粒的陽性克隆。
GAPN菌株的構(gòu)建通過LiAc法，將gapN編碼基因前面含有URA3基因和TPI1啟動(dòng)子的pYX212 2μ高拷貝載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(MATa SUC2 MAL2-8 pADH-XYL1pPGK-XYL2 pPGK-XKS1 ura3-)中，并在具有葡萄糖的合成性最低限度氨培養(yǎng)基上選擇URA 2μ中的TPI1啟動(dòng)子下游含gapN的陽性克隆。
在厭氧搖瓶中葡萄糖上測(cè)試多個(gè)轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)速率和GAPN活性。選擇具有未改變的生長(zhǎng)速率和高GAPN活性的轉(zhuǎn)化子，命名為Xy1GAPN菌株——參照菌株稱作Xy1參照菌株。兩種菌株具有位于預(yù)期范圍內(nèi)的類似木糖還原酶和木糖脫氫酶活性。
實(shí)施例8釀酒酵母的木糖代謝株的厭氧批量培養(yǎng)在工作體積為4升的良好控制的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。使用規(guī)定的礦質(zhì)培養(yǎng)基(Verduyn et al.，1990)，其每升含20g葡萄糖；50g木糖；5.0g(NH4)2SO4；3.0g KH2PO4；0.5g MgSO4·7H2O；和搖瓶培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)中所述的痕量金屬和維生素。加入500μl/Lantiform(SigmaA-8436)，以免產(chǎn)生泡沫，向培養(yǎng)基添加釀酒酵母厭氧生長(zhǎng)所必需的420mg/L Tween80和10mg/L麥角固醇。葡萄糖溶液和礦質(zhì)培養(yǎng)基分別高壓滅菌，然后和含維生素的無菌濾液以及首先溶解在煮沸的無水乙醇中的Tween 80和麥角固醇一起加入到發(fā)酵罐中。
用速度為500rpm的攪拌器于30℃進(jìn)行培養(yǎng)，然后以每分鐘800ml的流量通氮?dú)?。為了使O2向培養(yǎng)物的擴(kuò)散最小，生物反應(yīng)器安裝Norprene管。通過自動(dòng)添加2MNaOH使pH保持在5.0。生物反應(yīng)器安裝冷凝器，放出的氣體導(dǎo)向氣體分析儀(INNOVA，Denmark)，以測(cè)定CO2的含量。Xy1參照菌株(閉合的符號(hào))和Xy1 GAPN菌株(開放的符號(hào))的生物質(zhì)、葡萄糖和木糖的濃度曲線如圖1所示。Xy1參照菌株(閉合的符號(hào))和Xy1 GAPN菌株(開放的符號(hào))的乙醇、木糖醇、甘油和乙酸的濃度曲線如圖2所示。發(fā)現(xiàn)兩種菌株中葡萄糖和木糖吸收大致相同，而Xy1 GAPN菌株與Xy1參照菌株相比生成更多的乙醇，更少的木糖醇和更少的甘油。發(fā)酵50小時(shí)之后，獲得了代謝產(chǎn)物的下列濃度
這對(duì)應(yīng)于乙醇濃度的15％增加，甘油濃度的45％減小和木糖醇濃度的45％減小。
在葡萄糖上的生長(zhǎng)過程中，Xy1 GAPN菌株生成稍多的乙醇和較少的甘油(和實(shí)施例4的結(jié)果類似)。在木糖上的生長(zhǎng)過程中，估算了總的產(chǎn)量系數(shù)，如下所示。
這些產(chǎn)量系數(shù)大致對(duì)應(yīng)于乙醇產(chǎn)量的30％增加、甘油產(chǎn)量的40％降低和木糖醇產(chǎn)量的幾乎50％降低。
實(shí)施例9釀酒酵母的木糖代謝株的厭氧恒化器培養(yǎng)在恒定工作體積為1.0升和稀釋速率為0.05h-1(等于比生長(zhǎng)速率)的良好控制的2升夾套生物反應(yīng)器(B.Braun Biotech，Melsungen，Germany)中獲得厭氧穩(wěn)態(tài)恒化器培養(yǎng)物。用速度為500rpm的攪拌器于30℃進(jìn)行培養(yǎng)，然后通純氮?dú)?0.2L·min-1)。通過自動(dòng)添加2M NaOH使pH保持在5.0。為了使O2向培養(yǎng)物的擴(kuò)散最小，生物反應(yīng)器安裝Norprene管。溶氧濃度用Mettler Toledo極譜電極測(cè)定，并保持在檢測(cè)限之下。生物反應(yīng)器安裝冷凝器(5℃)，放出的氣體導(dǎo)向氣體分析儀(INNOVA，Denmark)，以測(cè)定CO2的含量。穩(wěn)態(tài)假設(shè)處于開始連續(xù)培養(yǎng)后經(jīng)歷至少5個(gè)停留時(shí)間的時(shí)候，并通過跨2個(gè)停留時(shí)間的兩個(gè)測(cè)定值處恒定的(±2％)生物質(zhì)濃度、代謝物濃度和二氧化碳放出速率證實(shí)。向培養(yǎng)物供應(yīng)與實(shí)施例8所述類似的規(guī)定培養(yǎng)基。
用于恒化器培養(yǎng)的預(yù)培養(yǎng)物于30℃、以160rpm在具有擋板的棉花塞住的500mlErlenmeyer燒瓶中生長(zhǎng)16-24小時(shí)，所述燒瓶每個(gè)含有與發(fā)酵罐中類似的pH為6.5的100ml培養(yǎng)基，除了不同濃度的葡萄糖(20g·L-1)、(NH4)2SO4(7.5g·L-1)、KH2PO4(14g·L-1)和antifoam(50μl·L-1)，并且不加Tween或麥角固醇。預(yù)培養(yǎng)物接種自30℃生長(zhǎng)的平板培養(yǎng)物。連續(xù)培養(yǎng)物接種20ml指數(shù)生長(zhǎng)的預(yù)培養(yǎng)物。
在穩(wěn)態(tài)的恒化器培養(yǎng)物中，測(cè)定了乙醇、甘油和木糖醇的濃度，結(jié)果如下所示。
根據(jù)對(duì)糖的測(cè)定，計(jì)算向不同代謝物的總轉(zhuǎn)化產(chǎn)量，如下所示。
觀察到乙醇產(chǎn)量提高了24％，甘油產(chǎn)量減小了幾乎60％，木糖醇產(chǎn)量減小了33％。
在該說明書中，除非另外特別指明，“或”一詞用作在滿足所述條件中一個(gè)或兩個(gè)時(shí)返回真值的操作符(operator)，不同于需要只滿足一個(gè)條件的操作符“排他性或”?！鞍币辉~的意思是“包括”，而非“由……組成”。
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權(quán)利要求
1.一種代謝工程微生物，其具有可操作的第一代謝途徑，其中在NAD作為第一種酶輔因子的反應(yīng)中，第一代謝物轉(zhuǎn)化為第二代謝物，所述的反應(yīng)步驟產(chǎn)生NADH；其中在第二種酶催化的反應(yīng)中，所述的第二代謝物轉(zhuǎn)化成至少一種其他代謝物，并且具有可操作的第二代謝途徑，其特征在于關(guān)于催化NADP為輔因子、NADPH為產(chǎn)物的不可逆反應(yīng)的第三種酶，酶活性超過天然水平，其中在沒有所述第二種酶的參與下，所述的第一代謝物轉(zhuǎn)化為所述的另一代謝物。
2.權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述的第一代謝途徑為天然途徑。
3.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的微生物，其中所述的第一種酶是磷酸化脫氫酶。
4.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的微生物，其中所述的第二種酶是激酶。
5.權(quán)利要求3所述的微生物，其中所述的第三種酶是非磷酸化脫氫酶。
6.權(quán)利要求5所述的微生物，其中所述的第三種酶是GAPN(EC 1.2.1.9)。
7.權(quán)利要求6所述的微生物，其中所述的第一種酶是GAPDH(EC 1.2.1.12)。
8.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的微生物，其中編碼所述第三種酶的至少一拷貝基因序列已經(jīng)重組導(dǎo)入到所述微生物中。
9.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的微生物，其中編碼所述第三種酶的基因序列可操作地連接于表達(dá)信號(hào)，所述的表達(dá)信號(hào)不與所述微生物中的所述基因序列天然相關(guān)。
10.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的微生物，其是酵母。
11.權(quán)利要求10中所述的微生物，其是屬于酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、德巴利氏酵母屬(Debaromyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、海洋酵母屬(Yarrowia)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)屬的微生物。
12.權(quán)利要求10中所述的微生物，其是菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、S.Kluyveri、葡萄酒酵母(S.bayanus)、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)、乳酸克魯維酵母(Klyuveromyces lactis)、K.marxianus varmarxianus、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、Pichia.stipidis、甲醇酵母(P.Pastoris)、P.sorbitophila、漢遜氏德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、適冷性海洋酵母(Yarrowia lipolytica)、接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
13.基因轉(zhuǎn)化的、含有與表達(dá)信號(hào)可操作連接的編碼GAPN的一個(gè)或多個(gè)拷貝的異源DNA序列并對(duì)GAPDH(EC 1.2.12)具有功能性天然或異源表達(dá)能力的微生物。
14.非必要代謝產(chǎn)物生成減少的所需代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)前述權(quán)利要求中所述的微生物。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所需的產(chǎn)物是乙醇、乳酸、檸檬酸、氨基酸或抗生素。
16.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的非必要代謝產(chǎn)物是甘油、乙酸或氨基酸。
全文摘要
一種代謝工程微生物，其具有可操作的第一代謝途徑，其中在NAD作為適合為磷酸化脫氫酶的第一種酶的輔因子的反應(yīng)中，第一代謝物轉(zhuǎn)化為第二代謝物，所述的反應(yīng)步驟產(chǎn)生NADH。在適合為激酶的第二種酶催化的反應(yīng)中，所述的第二代謝物轉(zhuǎn)化成至少一種其他代謝物。該微生物具有可操作的第二代謝途徑，其特征在于關(guān)于適合為非磷酸化脫氫酶如GAPN的、催化NADP為輔因子、NADPH為產(chǎn)物的不可逆反應(yīng)的第三種酶，酶活性超過天然水平。在沒有所述第二種酶的參與下，所述的第一代謝物轉(zhuǎn)化為所述的另一代謝物。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1717481SQ200380104133
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月25日
發(fā)明者克里斯托弗·布羅, 比吉特·雷根伯格, 延斯·尼爾森 申請(qǐng)人:弗盧克索姆科學(xué)公司