專利名稱：傷口護(hù)理組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及傷口愈合領(lǐng)域以及健康皮膚的修復(fù)與保養(yǎng)。
背景技術(shù)：
慢性傷口不愈合的一個(gè)主要原因是，一類蛋白酶破壞了新形成的傷口床(bed)(Vaalamo等人，1997；Weckroth等人，1996；DiColandrea等人，1998；Moses等人，1996)。通常通過能與MMP形成非常特異性的抑制復(fù)合物的4種組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP 1-4)的作用，來(lái)防止這些基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)破壞傷口床(例如，Olson等人，1997；Taylor等人，1996；Howard等人，1991)。也即，每個(gè)TIMP僅僅抑制一個(gè)特定的MMP亞型。在慢性傷口中，MMP與TIMP的比率較高，以致大多數(shù)的MMP沒有被抑制(Vaalamo等人，1996；Saarialho-Kere，1998)。實(shí)際上，隨著蛋白酶水平的提高，TIMP分子自身被水解。天然不存在能單獨(dú)抑制所有類型MMP的TIMP分子。
因此，需要另外的方法來(lái)使對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制最優(yōu)化并改善傷口愈合。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的多肽。本發(fā)明提供的多肽的例子包括包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO20或SEQ IDNO21的分離的多肽。還提供了編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸，例如，編碼包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO20或SEQ ID NO21的多肽的核酸。這種分離的核酸的例子包括含有SEQ ID NO6的核酸，以及在嚴(yán)格雜交條件下能與含有SEQ ID NO6的核酸雜交的分離的核酸。
本發(fā)明的多肽可用于治療傷口，包括慢性傷口。因此，本發(fā)明提供了一種組合物，其包括治療有效量的含有SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO20或SEQ ID NO21的多肽抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。該組合物能以例如洗劑、凝膠或乳膏的形式提供?？蛇x擇地，多肽可以以傷口敷料的形式提供。這種傷口敷料可包括含有SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO20或SEQ ID NO21的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種治療傷口的方法，包括對(duì)傷口施用治療有效量的含有SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO20或SEQ IDNO21的多肽。
本發(fā)明的多肽抑制劑具有很多有用的特性，例如，這些多肽抑制劑能促進(jìn)傷口愈合，預(yù)防瘢痕形成，改善皮膚品質(zhì)，或刺激光滑、健康皮膚的發(fā)育。此外，它們?cè)诓溉閯?dòng)物血清或血漿中是穩(wěn)定的。
本發(fā)明組合物、敷料和方法中的多肽抑制劑，能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中任何一種的蛋白酶活性。在一些實(shí)施方案中，多肽抑制劑能抑制超過一種這些基質(zhì)金屬蛋白酶。
附圖描述

圖1提供了顯示來(lái)自重組克隆的DNA的1.5％瓊脂糖凝膠的影印。連接的基因表達(dá)載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到JM109中，生長(zhǎng)于補(bǔ)充有氨芐青霉素的LB平板上。挑取單個(gè)菌落到液體培養(yǎng)基中，并從這些培養(yǎng)物中通過小量制備純化質(zhì)粒。3、6和8泳道含有大小與具有SEQ ID NO6插入片段的質(zhì)粒相應(yīng)的DNA。這些質(zhì)粒進(jìn)一步通過限制酶切消化來(lái)表征(沒顯示)。挑取3泳道的質(zhì)粒用于蛋白表達(dá)分析。
圖2提供了SEQ ID NO5多肽的最終能量最低化模型的分子顯示影印。圖2A提供了顯示蛋白總的三個(gè)維度的固體CPK空間充滿模型。注意來(lái)自基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合表面的TIMP-2樣延伸(分子的上左部)。圖2B提供了與圖2A相同的視圖，該顯示只示例了蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。形成中央β桶基序的β鏈結(jié)構(gòu)以淺灰色顯示，環(huán)和轉(zhuǎn)角以白色顯示，而單個(gè)α螺旋以深灰色顯示。蛋白以通過α碳的位置的跡線顯示。兩個(gè)示例都使用Rasmol制作。
圖3示例了SEQ ID NO5多肽的純化，如通過麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)-SEQ ID NO5多肽融合的12％SDS-PAGE分析估計(jì)的，以及純化的SEQ ID NO5多肽。蛋白的表達(dá)和純化按照實(shí)施例1中所描述的方案。泳道1，大約5μg的MBP-SEQ ID NO5多肽融合(級(jí)分II)；泳道2，大約10μg純化的(級(jí)分IV)SEQ ID NO5多肽。凝膠用考馬斯染色來(lái)顯示。
圖4提供了概括抗SEQ ID NO5多肽的多克隆抗體(pAbs)的ELISA分析圖。將1μg級(jí)分IV的SEQ ID NO5多肽吸附到微量滴定盤的孔中，并與指示稀度的純化pAbs(實(shí)心圓圈)或免疫前血清(空心圓圈)反應(yīng)。使用用Oregon Green-488標(biāo)記的山羊抗-兔第二抗體來(lái)獲得顯示。使用帶有485nm(激發(fā))和538nm(發(fā)射)通帶濾光片裝置的Dynex熒光微量滴定板讀數(shù)器。該圖中繪制了熒光對(duì)抗體(或血清)稀度的對(duì)數(shù)值的圖。
圖5提供了示例基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶促水解熒光素化膠原蛋白的圖。該測(cè)定測(cè)量了作為時(shí)間函數(shù)的熒光素從膠原蛋白的釋放。底物與酶在時(shí)間為0時(shí)混合，對(duì)膠原蛋白破壞監(jiān)控1200秒(粗線)。在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，于200秒時(shí)將等量的SEQ ID NO5多肽加入到正在進(jìn)行的水解反應(yīng)中(圖的箭標(biāo)處)。下面的虛線表示在短暫的滯后階段后，膠原蛋白破壞停止。激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm。
圖6提供了示例用SEQ ID NO5蛋白對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9進(jìn)行的滴定圖。使用熒光素釋放測(cè)定來(lái)確定抑制劑作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。將指示化學(xué)計(jì)算量的SEQ ID NO5多肽加入到基質(zhì)金屬蛋白酶-9中，混合物于室溫溫育5分鐘。將熒光素化的膠原蛋白和緩沖液加入到混合物中，監(jiān)控作為時(shí)間函數(shù)的熒光素的釋放。激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm。
圖7提供了示例確定的SEQ ID NO5多肽對(duì)幾種MMP的抑制常數(shù)的條線圖。從圖6的曲線求取瞬時(shí)速度值，并用于如方法部分所述計(jì)算Ki值。
圖8提供了SEQ ID NO5多肽的分子顯示影印。α碳主鏈跡線(淺灰色)突出了三個(gè)二硫鍵(以深灰色顯示)的位置。兩個(gè)上面的二硫鍵有助于維持MMP結(jié)合區(qū)域的幾何學(xué)，而下面的二硫鍵有助于把羧基末端鎖定成更剛性的構(gòu)象。單個(gè)色氨酸的位置也以淺灰色顯示。
圖9提供了示例天然的(實(shí)心圓圈)或還原的(空心圓圈)SEQ IDNO5多肽的化學(xué)變性圖。繪制了作為尿素濃度的函數(shù)解折疊的蛋白群體級(jí)分的圖。通過在添加尿素之前把蛋白與1mM DTT一起溫育來(lái)還原SEQ ID NO5多肽。熒光發(fā)射值轉(zhuǎn)化成如方法部分所述的解折疊的級(jí)分。
圖10提供了示例SEQ ID NO5多肽在人血清中穩(wěn)定性的圖。將1mg級(jí)分IV的SEQ ID NO5多肽加入到1mL的人血清(實(shí)心圓圈，下面的線)、1mL PBS(實(shí)心圓圈，上面的線)或0.2mg MMP-9和1mL人血清中。樣本在室溫溫育。在指示的時(shí)間把等分試樣從混合物中移走，并冷凍于-20℃直到36小時(shí)階段結(jié)束。然后使用純化的抗SEQID NO5多肽pAbs通過ELISA來(lái)分析等分試樣中的SEQ ID NO5多肽的含量。使用用Oregon Green-488標(biāo)記的山羊抗-兔第二抗體來(lái)獲得顯示。使用帶有485nm(激發(fā))和538nm(發(fā)射)通帶濾光片裝置的Dynex熒光微量滴定板讀數(shù)器。通過任意地把零時(shí)間點(diǎn)設(shè)定為100％來(lái)把熒光轉(zhuǎn)換成剩余的SEQ ID NO5多肽百分?jǐn)?shù)。
圖11提供了示例通過內(nèi)在的色氨酸熒光監(jiān)控的50μM SEQ IDNO5多肽的熱轉(zhuǎn)化的圖。收集數(shù)據(jù)并如實(shí)施例1中所述的進(jìn)行分析。繪制了作為溫度的函數(shù)解折疊的蛋白群體的級(jí)分的圖。
圖12提供了SEQ ID NO5多肽的熱力學(xué)特征。該圖示例了通過內(nèi)在的色氨酸熒光而測(cè)定的SEQ ID NO5多肽作為溫度函數(shù)的熱力學(xué)穩(wěn)定性。圖中包括的是通過在尿素中使蛋白變性于20℃和30℃測(cè)定的自由能值(也參見圖9)。根據(jù)實(shí)施例1中所述的方法計(jì)算自由能。
圖13也提供了SEQ ID NO5多肽的熱力學(xué)特征。該圖是通過內(nèi)在色氨酸熒光監(jiān)控的SEQ ID NO5多肽熱解折疊的范托夫圖。繪制了平衡常數(shù)的自然對(duì)數(shù)對(duì)1000/T的圖，其中T是絕對(duì)溫度。
圖14提供了示例SEQ ID NO5多肽的分析型凝膠過濾分析的圖。將500μg溶于PBS中的純化SEQ ID NO5多肽注射到BioSelect 125SEC柱中，并以0.5mL/分鐘的流速在PBS中進(jìn)行層析。繪制280nm處的吸光度對(duì)洗脫時(shí)間的圖。圖中疊加的是肌紅蛋白(分子量12kDa)、BSA(分子量65kDa)的洗脫點(diǎn)，以及柱空隙體積(V0)與總的體積(Vt)的位置。
圖15提供了基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)與SEQ ID NO5多肽之間的預(yù)測(cè)分子復(fù)合物模型。MMP-9(深灰色)與SEQ ID NO5多肽(淺灰色)的三維坐標(biāo)文件用作FTDOCK程序的輸入值(Gabb等人，1997)。得到的模型是兩種蛋白間形成的最可能的復(fù)合物。FTDOCK評(píng)估了計(jì)算對(duì)接(docking)相互作用時(shí)的幾何學(xué)與靜電因素。兩項(xiàng)合并成穩(wěn)健傅里葉相關(guān)函數(shù)。
圖16提供了示例MMP-9～SEQ ID NO5多肽結(jié)合與解離的SPR分析的圖。BiaCore CM-5芯片表面與MMP-9通過激活的羧基-胺鍵合化學(xué)進(jìn)行反應(yīng)。純化的SEQ ID NO5多肽以10μL/分鐘的速度流過該表面。結(jié)合的等溫線顯示了高度的親和力(0到400秒)。在400秒時(shí)，用僅僅緩沖取代流動(dòng)以觀察離解相。
圖17提供了通過HPLC分析示例SEQ ID NO5多肽～MMP-9復(fù)合物形成的層析。將100μg的SEQ ID NO5多肽與溶于PBS中的700μg MMP-9混合(大約每種蛋白1mM)，于室溫將反應(yīng)物溫育30分鐘，以實(shí)現(xiàn)結(jié)合。將該材料注射到BioSelect 125 SEC柱中，并在PBS中以0.5mL/分鐘的流速進(jìn)行層析。該跡線在圖中標(biāo)記為“復(fù)合物”。在另一個(gè)反應(yīng)中，將相同量的SEQ ID NO5多肽與MMP-9混合到一起，并立即注射到SEC柱中。該跡線在圖中標(biāo)記為“混合物”。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了可用于促進(jìn)傷口愈合的基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑。通常，本抑制劑與組合物能促進(jìn)傷口愈合，預(yù)防瘢痕形成，改善皮膚品質(zhì)以及刺激光滑、健康皮膚的發(fā)育。
根據(jù)本發(fā)明，與4種組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP 1-4)的區(qū)域具有足夠氨基酸序列同一性程度的多肽能與多種基質(zhì)金屬蛋白酶形成抑制復(fù)合物。施用這種多肽來(lái)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶，并減少傷口中的細(xì)胞外基質(zhì)破壞速度。因此，這種多肽抑制劑能提供更快的傷口愈合速度。
大多數(shù)抑制策略包括用有機(jī)小分子防止基質(zhì)金屬蛋白酶的酶活性。這些化合物通常對(duì)身體是有毒的，而且不是天然存在的分子。使用天然多肽來(lái)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶提供了高度的蛋白醇控制而沒有毒副作用。與小分子抑制策略不同，本發(fā)明的多肽能用于同時(shí)抑制單個(gè)或所有的基質(zhì)金屬蛋白酶種類的激活。這些多肽能自由地引入到皮膚中，到傷口周圍，或者它們能被固定到皮膚覆蓋物或傷口敷料中，或通過其送遞。
本發(fā)明提供了對(duì)用于愈合慢性傷口的蛋白酶活性水平的高度控制。例如，由于在慢性傷口愈合過程中需要一定量的蛋白酶水平(Agren等人，1999)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇僅僅部分抑制蛋白酶的活性。通過調(diào)節(jié)應(yīng)用的抑制劑多肽的類型的量，能控制基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制程度。
多肽抑制劑根據(jù)本發(fā)明，具有與TIMP相關(guān)的序列的多肽可用于傷口愈合，并用于促進(jìn)健康皮膚的發(fā)育。如這里所提供的，術(shù)語(yǔ)多肽與術(shù)語(yǔ)蛋白是同義使用的。本發(fā)明提供的多肽能抑制多種類型基質(zhì)蛋白酶的活性。但是，多肽抑制劑比天然存在的TIMP多肽更小并且更穩(wěn)定。而且，本多肽抑制劑的序列可以調(diào)節(jié)到使它們的結(jié)合特性最優(yōu)化，例如，該多肽序列可以調(diào)節(jié)到它能抑制廣譜的金屬蛋白酶，或可以改變?cè)撔蛄幸灾轮荒芤种埔环N或少數(shù)金屬蛋白酶。
例如，人TIMP-1可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
1 MAPFEPLASG ILLLLWLIAP SRACTCVPPH PQTAFCNSDL41 VIRAKFVGTP EVNQTTLYQR YEIKMTKMYK GFQALGDAAD81 IRFVYTPAME SVCGYFHRSH NRSEEFLIAG KLQDGLLHIT121 TCSFVAPWNS LSLAQRRGFT KTYTVGCEEC TVFPCLSIPC161 KLQSGTHCLW TDQLLQGSEK GFQSRHLACL PREPGLCTWQ201 SLRSQIA參見Docherty等人，Sequence of human tissue inhibitor ofmetalloproteinases and its identity to erythroid-potentiating activity，Nature 318(6041)，66-69(1985)。
人TIMP-2可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
1 MGAAARTLRL ALGLLLLATL LRPADACSCS PVHPQQAFCN41 ADVVIRAKAV SEKEVDSGND IYGNPIKRIQ YEIKQIKMFK81 GPEKDIEFIY TAPSSAVCGV SLDVGGKKEY LIAGKAEGDG121 KMHITLCDFI VPWDTLSTTQ KKSLNHRYQM GCECKITRCP161 MIPCYISSPD ECLWMDWVTE KNINGHQAKF FACIKRSDGS201 CAWYRGAAPP KQEFLDIEDP參見Stetler-Stevenson等人，Tissue inhibitor ofmetalloproteinase(TIMP-2).A new member of themetalloproteinase inhibitor family，Biol.Chem.264(29)，17374-17378(1989)。
人TIMP-3可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
1 MTPWLGLIVL LGSWSLGDWG AEACTCSPSH PQDAFCNSDI41 VIRAKVVGKK LVKEGPFGTL VYTIKQMKMY RGFTKMPHVQ81 YIHTEASESL CGLKLEVNKY QYLLTGRVYD GKMYTGLCNF121 VERWDQLTLS QRKGLNYRYH LGCNCKIKSC YYLPCFVTSK161 NECLWTDMLS NFGYPGYQSK HYACIRQKGG YCSWYRGWAP201 PDKSIINATD P參見Wick等人，A novel member of human tissue inhibitorof metalloproteinases(TIMP)gene family is regulated duringG1 progression，mitogenic stimulation，differentiation，andsenescence，J.Biol.Chem.269(29)，18953-18960(1994)。
人TIMP-4可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
1 MPGSPRPAPS WVLLLRLLAL LRPPGLGEAC SCAPAHPQQH41 ICHSALVIRA KISSEKVVPA SADPADTEKM LRYEIKQIKM81 FKGFEKVKDV QYIYTPFDSS LCGVKLEANS QKQYLLTGQV121 LSDGKVFIHL CNYIEPWEDL SLVQRESLNH HYHLNCGCQI161 TTCYTVPCTI SAPNECLWTD WLLERKLYGY QAQHYVCMKH201 VDGTCSWYRG HLPLRKEFVD IVQP參見Greene等人，Molecular cloning and characterizationof human tissue inhibitor of metalloptoteinase 4，J.Biol.Chem.271(48)，30375-30380(1996)。
本發(fā)明的多肽抑制劑具有與這些TIMP相關(guān)的序列。但是，本多肽比這些TIMP更短而且更穩(wěn)定。具體而言，本多肽抑制劑比那些天然可用的TIMP少大約100個(gè)氨基酸。因此，它們更簡(jiǎn)單、更便宜且更容易制備。更突出地，本抑制劑具有高度穩(wěn)定化的β桶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其已經(jīng)通過整合額外的半胱氨酸殘基而增強(qiáng)。這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)提供了抗變性和蛋白酶作用的抑制劑。
本多肽抑制劑能抑制多種類型的基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。本多肽還能防止酶原基質(zhì)金屬蛋白酶的激活，以及抑制成熟基質(zhì)金屬蛋白酶的酶活性。例如，含有在多種TIMP中較高保守性的序列的多肽可用于提供通常對(duì)多種基質(zhì)金屬蛋白酶有效的抑制劑。不過，含有在各種TIMP中較低保守性的序列的多肽，例如，對(duì)特異性TIMP唯一的序列，可用于提供對(duì)個(gè)別基質(zhì)金屬蛋白酶特異性的抑制劑。
因此，本發(fā)明預(yù)期具有與任何TIMP相關(guān)的序列的多肽，以及具有一個(gè)或更多氨基酸替代天然存在于TIMP中的氨基酸的變體多肽作為基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑。具有不同序列的多肽混合物也是預(yù)期的。通常，多肽序列，多肽變體以及多肽混合物被制成藥劑，并以使傷口愈合，皮膚再生，并防止瘢痕形成或生成健康皮膚最優(yōu)化的方式應(yīng)用。因此，本多肽組合物和制劑可進(jìn)行改變以便獲得較低或較高的抑制水平，只要能促進(jìn)愈合即可。
多肽抑制劑的大小可以變化。通常，只有大約5個(gè)氨基酸的多肽太小了而不能提供最優(yōu)的抑制。不過，超過大約8到9個(gè)氨基酸的多肽的長(zhǎng)度足以提供抑制。因此，雖然全長(zhǎng)不是關(guān)鍵的，但是本發(fā)明中應(yīng)用的通常是長(zhǎng)度超過8個(gè)氨基酸的多肽。本發(fā)明中應(yīng)用的其它多肽是長(zhǎng)度超過9個(gè)氨基酸的。本發(fā)明還應(yīng)用長(zhǎng)度超過10個(gè)氨基酸的其他多肽。而且，長(zhǎng)度超過大約15個(gè)氨基酸的多肽也可用于本發(fā)明。
多肽的大小沒有特定的上限。不過，較長(zhǎng)的多肽比較短的多肽更穩(wěn)定。本發(fā)明的多肽抑制劑一般短于大約400個(gè)氨基酸。本發(fā)明中使用的很多多肽抑制劑短于大約300個(gè)氨基酸。本發(fā)明中使用的其它多肽抑制劑短于大約200個(gè)氨基酸。也可使用短于大約150個(gè)氨基酸的多肽。同樣地，短于大約125個(gè)氨基酸的多肽也可用于本發(fā)明。
本發(fā)明提供的一個(gè)多肽具有SEQ ID NO5的序列，如下所示。
1 MCSCSPVHPQ QAFSNADVVI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP41 IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG81 GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPW在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)后，可以在SEQ ID NO5多肽的N-末端進(jìn)行切割以缺失N-末端甲硫氨酸。這種多肽具有SEQ ID NO20的序列，如下所示。
1 CSCSPVHPQ QAFSNADVVI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP41 IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG81 GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPWSEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽抑制劑顯示了對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9以及其它基質(zhì)金屬蛋白酶優(yōu)良的抑制特性。SEQ ID NO5和SEQ IDNO20多肽抑制劑具有幾種基本的和期望的特性。第一，這些蛋白容易以完全折疊和可溶的形式純化。通過改變表達(dá)載體，在非細(xì)菌性系統(tǒng)，桿狀病毒(bacculovirus)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中生產(chǎn)這些蛋白是可能的。第二，這些蛋白極其穩(wěn)定而且壽命長(zhǎng)。這種特性與β桶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有關(guān)，所述β桶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)通過添加能形成穩(wěn)定二硫鍵的半胱氨酸殘基來(lái)維持和增強(qiáng)。這種穩(wěn)定性對(duì)于將被引入到傷口環(huán)境的分子來(lái)說是一個(gè)重要的因素。第三，SEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽抑制劑是好的、廣范圍的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。它們能與基質(zhì)金屬蛋白酶形成壽命長(zhǎng)的化學(xué)計(jì)量的復(fù)合物。第四，這些SEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽抑制劑是免疫原性的，從而能容易地產(chǎn)生抗它們的抗體。這些抗體可用于在原位實(shí)驗(yàn)中追蹤蛋白。第五，SEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽抑制劑包含很多芳族氨基酸(一個(gè)色氨酸和四個(gè)酪氨酸)。這種芳族氨基酸使SEQ ID NO5/SEQ ID NO20多肽能適應(yīng)很多內(nèi)在熒光實(shí)驗(yàn)，減少用外在熒光團(tuán)修飾蛋白的需要。
使用分子建模方法來(lái)設(shè)計(jì)SEQ ID NO5多肽抑制劑。通過比對(duì)四種TIMP分子的氨基酸序列以限定高氨基酸同一性區(qū)域來(lái)構(gòu)建蛋白。從而SEQ ID NO5序列組成了衍生自序列比對(duì)研究的共有氨基酸序列。對(duì)TIMP-基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)的公開三維模型中的接觸區(qū)域的分析，發(fā)現(xiàn)可以除去不參與結(jié)合相互作用的大約100個(gè)氨基酸的蛋白結(jié)構(gòu)域。將二硫鍵引入到合成的蛋白抑制劑中以穩(wěn)定新的羧基末端。
可以在大腸桿菌中以高的產(chǎn)量生產(chǎn)SEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽，并純化成同質(zhì)性(Hodges等人，1998；Liu等人，1997)。應(yīng)用麥芽糖結(jié)合蛋白融合純化方案，以便在數(shù)日內(nèi)從粗提取物制備均質(zhì)的SEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽。但是，SEQ ID NO5和SEQ IDNO20多肽的分離不依賴于麥芽糖結(jié)合蛋白融合方案的使用。如果需要，編碼SEQ ID NO5或SEQ ID NO20多肽或本發(fā)明任何其它多肽的核酸能被克隆到可利用的任何表達(dá)載體中。
使用雜交與酶合成的組合，從一系列短的寡核苷酸在大約三周內(nèi)構(gòu)建了編碼SEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽的核酸。把全長(zhǎng)基因序列直接克隆到蛋白表達(dá)載體中，且序列通過DNA測(cè)序進(jìn)行檢驗(yàn)。核苷酸水平的設(shè)計(jì)通過將限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)整合到序列中而有助于克隆實(shí)驗(yàn)，它還通過使用大腸桿菌密碼子偏倚而有助于使蛋白表達(dá)最大化。
編碼SEQ ID NO5和SEQ ID NO20多肽的核酸為，例如，下文提供的SEQ ID NO6。
1 ATGTGCAGCT GCAGCCCGGT GCATCCGCAG CAGGCGTTTA41 GCAACGCGGA TGTGGTGATT CGCGCGAAAG CGGTGAGCGA81 AAAAGAAGTC GATAGCGGCA ACGATATTTA TGGCAACCCG121 ATTAAACGCA TTCAGTATGA AATTAAACAG ATTAAAATGT161 TTAAAGGCCC GGAAAAAGAT ATTGAATTTA TTTATACCGC201 GCCGAGCAGC GCGGTGTGCG GCGTGAGCCT GGATGTGGGC241 GGCAAAAAAG AATATTGCAT TGCGGGCAAA GCGGAAGGCG281 ATGGCAAAAT GCATATTACC CTGTGCGATT TTATTTGCCC321 GTGGTAGAAG CTTATAGAC本發(fā)明還提供了與SEQ ID NO6類似的核酸。具體而言，本發(fā)明提供了能在嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID NO6的核酸雜交的核酸。核酸雜交上下文中的“嚴(yán)格雜交條件”與“嚴(yán)格雜交洗滌條件”，是稍微序列依賴性的，而且根據(jù)核酸環(huán)境條件而可能有所不同。例如，較長(zhǎng)的序列趨向于特定地在較高的溫度雜交。核酸雜交的廣用指南可見于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecularbiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1頁(yè)，第2章“Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays”Elsevier，New York(1993)。也可參見J.Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，pp 9.31-9.58(1989)；J.Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，N.Y.(第3版.2001)。
一般，選擇高度嚴(yán)格的雜交和洗滌條件為比特定的雙鏈序列在限定的離子強(qiáng)度和pH時(shí)的熱解鏈溫度(Tm)低大約5℃。例如，在“高度嚴(yán)格條件”或“高度嚴(yán)格雜交條件”下，核酸將以比與其它序列可檢測(cè)地更高程度與它的互補(bǔ)序列雜交(例如，至少高于背景2倍)。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定100％互補(bǔ)的核酸。
可選擇地，可以調(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，以便檢測(cè)較低程度的相似性(異種探測(cè))。通常，嚴(yán)格條件為如下條件，其中pH 7.0到8.3時(shí)鹽濃度低于大約1.5M鈉離子，一般為大約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，而且對(duì)于短核酸(例如，10到50個(gè)核苷酸)的溫度為至少大約30℃，對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)的溫度為至少大約60℃。嚴(yán)格條件也可用添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)獲得。
示例的低嚴(yán)格條件包括用30到35％的甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液于37℃雜交，并在1×到2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl和0.3M檸檬酸三鈉)中于50到55℃洗滌。示例的中度嚴(yán)格條件包括在40到45％的甲酰胺，1.0M NaCl，1％ SDS中于37℃雜交，并在0.5×到1×SSC中于55到60℃洗滌。示例的高度嚴(yán)格條件包括在50％甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS中于37℃雜交，并在0.1×SSC中于60℃到65℃洗滌。
雜交中獲得的雜交體的互補(bǔ)性或序列同一性程度通常為雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。雜交核酸的類型和長(zhǎng)度也影響雜交是否發(fā)生，以及形成的雜交體在給定的一套雜交和洗滌條件下是否穩(wěn)定。對(duì)于DNA-DNA雜交體，Tm可以從Meinkoth和Wahl(Anal.Biochem.138267-284(1984))的方程式近似得來(lái)Tm81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L其中M為單價(jià)陽(yáng)離子的體積摩爾濃度，％GC為DNA中鳥嘌呤核苷和胞嘧啶核苷酸的百分?jǐn)?shù)，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分?jǐn)?shù)，L是堿基對(duì)中雜交體的長(zhǎng)度。Tm是50％的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。
非常嚴(yán)格條件為選擇等于Tm。
在DNA或RNA印跡中的過濾器上，用于具有超過100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交的嚴(yán)格雜交條件的例子為42℃時(shí)具有1mg肝素的50％甲酰胺，所述雜交進(jìn)行過夜。高度嚴(yán)格條件的例子為0.15M NaCl于72℃進(jìn)行大約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的例子為0.2×SSC于65℃洗滌15分鐘(也參見Sambrook，見上)。通常，高度嚴(yán)格洗滌先于低嚴(yán)格洗滌，以除去背景探針信號(hào)。用于例如超過100個(gè)核苷酸的雙鏈體的中度嚴(yán)格的例子為1×SSC于45℃進(jìn)行15分鐘。用于例如超過100個(gè)核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)格洗滌條件的例子為4-6×SSC于40℃進(jìn)行15分鐘。對(duì)于短探針(例如，大約10到50個(gè)核苷酸)，嚴(yán)格條件一般包括pH7.0到8.3時(shí)，低于大約1.0M鈉離子的鹽濃度，一般大約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，溫度一般為至少30℃。
嚴(yán)格條件也可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺獲得。一般，在特定雜交測(cè)定中，比對(duì)于不相關(guān)探針觀察到的高2×(或更高)的信噪比表明檢測(cè)到了特定的雜交。在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸也基本上是相同的，如果該核酸編碼的蛋白基本上是相同的話。在例如使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸的拷貝時(shí)將出現(xiàn)這種情況。
變體和衍生的多肽抑制劑具有SEQ ID NO1-5或20中的任何一個(gè)的多肽可預(yù)期作為本發(fā)明的多肽抑制劑。不過，具有SEQ ID NO1-5或20中的任何一個(gè)的多肽的多肽變體和衍生物也可用作多肽抑制劑。這種多肽變體和衍生物可具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、缺失、插入或其它的修飾，只要多肽變體或衍生物能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶即可。
分離的多肽的氨基酸殘基可以是遺傳編碼的L-氨基酸，天然存在的非遺傳編碼的L-氨基酸，合成的L-氨基酸或上述任何氨基酸的D-對(duì)映體。這里用于二十種遺傳編碼的L-氨基酸和常用的非編碼氨基酸的氨基酸符號(hào)為常規(guī)的，并如表1所示。
表1
包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽的一個(gè)或更多氨基酸可以被相似的化學(xué)和/或物理特性的氨基酸替代，只要這些變體或衍生多肽保持抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性、刺激成纖維細(xì)胞或角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)或刺激成纖維細(xì)胞的細(xì)胞遷移的能力即可。
能互相替代的氨基酸通常屬于相似的類或亞類。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，氨基酸可以分成三個(gè)主要類型親水氨基酸、疏水氨基酸和半胱氨酸樣氨基酸，這主要根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的特性。這些主要類型可以進(jìn)一步劃分成亞類。親水氨基酸包括具有酸性、堿性或極性側(cè)鏈的氨基酸，疏水氨基酸包括具有芳族或非極性側(cè)鏈的氨基酸。非極性氨基酸可以進(jìn)一步細(xì)分為其中包括脂族氨基酸。這里使用的氨基酸類型的定義如下“疏水氨基酸”指具有在生理pH時(shí)不帶電，而且被水溶液排斥的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的疏水氨基酸的例子包括Ile、Leu和Val。非遺傳編碼的疏水氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳族氨基酸”指其側(cè)鏈含有至少一個(gè)具有共扼π-電子系統(tǒng)(芳族基)的環(huán)的疏水氨基酸。芳族基可以進(jìn)一步用取代基團(tuán)如烷基、鏈烯基、炔基、羥基、磺?；⑾趸桶被约捌渌幕鶊F(tuán)取代。遺傳編碼的芳族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常見的非遺傳編碼的芳族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
“非極性氨基酸”指其側(cè)鏈一般在生理pH時(shí)不帶電并且是非極性的疏水氨基酸。遺傳編碼的非極性氨基酸的例子包括甘氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。非編碼的非極性氨基酸的例子包括Cha。
“脂族氨基酸”指具有飽和或不飽和直鏈、支鏈或環(huán)烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼的脂族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非編碼的脂族氨基酸包括Nle。
“親水氨基酸”指具有受水溶液吸引的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的親水氨基酸的例子包括Ser和Lys。非編碼的親水氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”指其側(cè)鏈pK值小于7的親水氨基酸。酸性氨基酸由于失去了氫離子，一般具有在生理pH時(shí)帶負(fù)電的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸鹽)和谷氨酸(谷氨酸鹽)。
“堿性氨基酸”指其側(cè)鏈pK值大于7的親水氨基酸。堿性氨基酸由于與水合氫離子結(jié)合，一般具有在生理pH時(shí)帶正電的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括非環(huán)狀氨基酸鳥氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“極性氨基酸”指其側(cè)鏈在生理pH時(shí)不帶電的親水氨基酸，但是其具有一個(gè)鍵，其中通常由兩個(gè)原子共享的電子對(duì)更靠近其中的一個(gè)原子。遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括瓜氨酸、N-乙?；嚢彼岷图琢虬彼醽嗧俊?br> “半胱氨酸樣氨基酸”指其側(cè)鏈能與另一個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈形成共價(jià)鍵如二硫鍵的氨基酸。一般，半胱氨酸樣氨基酸通常具有含有至少一個(gè)硫羥(SH)基團(tuán)的側(cè)鏈。遺傳編碼的半胱氨酸樣氨基酸的例子包括半胱氨酸。非遺傳編碼的半胱氨酸樣氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，上述的分類不是絕對(duì)的。幾種氨基酸顯示了超過一種特征性特性，從而能包括在超過一種類型中。例如，酪氨酸既具有芳環(huán)又具有極性羥基。因此，酪氨酸具有雙重特性，而且可以包括在芳族和極性類型中。類似地，除了能形成二硫鍵外，半胱氨酸也具有非極性特征。因此，雖然不能嚴(yán)格地劃分為疏水或非極性氨基酸，但在很多情況中，半胱氨酸可用于使多肽具有疏水性。
本發(fā)明多肽和多肽類似物中的某些常見的氨基酸，其可能不是遺傳編碼的，而且可能存在或被一個(gè)氨基酸替代，包括但不限于，β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等等；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；甲基甘氨酸(MeGly)；鳥氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亞砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙?；嚢彼?AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；對(duì)氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。這些氨基酸都落入上述定義的種類中。
上述的遺傳編碼和非遺傳編碼的氨基酸分類總結(jié)于下表2中。應(yīng)當(dāng)理解，表2只用于示例的目的，而不是為了對(duì)可能組成這里所述的多肽或多肽類似物的氨基酸殘基的窮舉。可用于制備這里所述的多肽和多肽類似物的其它氨基酸殘基可見于如Fasman，1989，CRCPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology，CRCPress，Inc.，以及那里所引用的參考文獻(xiàn)?；谝阎男袨楹?或它們的特征性化學(xué)和/或物理特性與具體確定的氨基酸相比較，這里沒有具體提及的氨基酸可能被方便地劃分到上述種類中。
表2
本發(fā)明的多肽的任何氨基酸都可以被任何相似分類的氨基酸替代，以產(chǎn)生變體或衍生多肽，只要多肽變體或衍生物保持抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的能力即可。
因此，為了使本發(fā)明多肽抑制劑的結(jié)構(gòu)和結(jié)合特性最優(yōu)化，生產(chǎn)了全長(zhǎng)氨基酸序列，其大約為四種已知TIMP序列的平均。這可以通過，例如，使用CLUSTAL程序(Higgins等人，1992)進(jìn)行TIMP氨基酸序列的穩(wěn)健逐對(duì)比對(duì)來(lái)完成。使用這種類型的比對(duì)構(gòu)建共有序列。對(duì)于接觸區(qū)域中的非保守氨基酸，可以進(jìn)行保持接近的疏水特征，但是沒有特定的側(cè)鏈-側(cè)鏈相互作用的替代。
可以鑒定參與結(jié)合的氨基酸，并與參與維持穩(wěn)定的β桶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的氨基酸區(qū)分開。在參與維持穩(wěn)定的β桶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的氨基酸中可以進(jìn)行保守氨基酸替代。可以在參與與金屬蛋白酶結(jié)合的氨基酸中進(jìn)行保守性較差的，或者甚至不保守的氨基酸改變。
多肽抑制劑的C-末端結(jié)構(gòu)域可以除去或添加額外的氨基酸。通過分析兩種TIMP/MMP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，很明顯的只有N-末端TIMP區(qū)域與MMP的催化結(jié)構(gòu)域顯著接觸。這后來(lái)通過使用MMP-9對(duì)接最終的蛋白模型而證實(shí)。
這種操作把SEQ ID NO5蛋白的全長(zhǎng)從一般TIMP大小的大約225個(gè)氨基酸減少到大約108個(gè)氨基酸。為了穩(wěn)定化蛋白的新C-末端，在SEQ ID NO5和20多肽中進(jìn)行了兩個(gè)另外的氨基酸的替代Leu85和Val101變?yōu)榘腚装彼?。結(jié)構(gòu)研究顯示，這兩個(gè)殘基正常在彼此的3內(nèi)，而且如果變成半胱氨酸，則能形成二硫鍵。這樣抑制劑多肽的最后的環(huán)狀區(qū)域被在適當(dāng)?shù)奈恢面i定。而且，13位的半胱氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸。從而SEQ ID NO5和20多肽中的所有半胱氨酸殘基(6)都參與了二硫鍵的形成。
可以進(jìn)行類似的操作來(lái)調(diào)節(jié)SEQ ID NO5和20多肽的穩(wěn)定性或結(jié)合特性。例如，為了進(jìn)一步增強(qiáng)本多肽抑制劑的穩(wěn)定性，建立了最優(yōu)化多肽抑制劑的同源模型。使用ProMod and SwissModel程序(Peitsch，1996；Peitsch等人，1996)，SEQ ID NO5或20抑制劑的氨基酸序列可以穿過任何一種可用的TIMP的α碳的跡線。然后使用GROMOS 96 forcefield，對(duì)該模型進(jìn)行能量最低化，使用SYBYLforcefield進(jìn)行幾輪分子力學(xué)幾何學(xué)最優(yōu)化(Clark等人，1989)。然后分析最終的最低化/最優(yōu)化模型中差的側(cè)鏈相互作用和扭轉(zhuǎn)幾何學(xué)。盡管已進(jìn)行這些研究來(lái)產(chǎn)生含有SEQ ID NO5序列的最優(yōu)三維模型，但通過與TIMP-2比較(參見實(shí)施側(cè))進(jìn)行了這些研究。通過與其它TIMP進(jìn)行比較進(jìn)行進(jìn)一步分析，能產(chǎn)生具有改變的穩(wěn)定性和結(jié)合特性的變體和衍生序列的多肽抑制劑。
最終的氨基酸序列然后可以逆向翻譯，而且可以特定地選擇核苷酸密碼子來(lái)反映有機(jī)體中最優(yōu)的密碼子選擇，在該有機(jī)體中表達(dá)多肽抑制劑，例如，在大腸桿菌，人類或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中。這些操作將使蛋白表達(dá)最大化。
SEQ ID NO5多肽的長(zhǎng)度為108個(gè)氨基酸，SEQ ID NO20多肽的長(zhǎng)度為107個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇進(jìn)行一系列的羧基末端缺失來(lái)制備較短的多肽。在使用該方法的同時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇保留C-末端附近的半胱氨酸殘基。例如，SEQ ID NO5多肽內(nèi)的Cys101參與一個(gè)重要的二硫鍵相互作用。因此，可以在SEQID NO5或20多肽上進(jìn)行只有7個(gè)氨基酸的C-末端缺失，以產(chǎn)生稍微短點(diǎn)但是功能性的抑制劑多肽?？蛇x擇地，可以將半胱氨酸添加到截短的多肽抑制劑的C-末端，如果缺失了超過7個(gè)氨基酸的話。
在某些實(shí)施方案中還修飾了SEQ ID NO5或20多肽的柔性環(huán)形區(qū)域，例如，通過缺失Val25與Glu47間的部分區(qū)域。這種缺失突變將保留主要的結(jié)合界面，但是可能除去了某些對(duì)TIMP-2樣分子的結(jié)合特異性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽抑制劑包括任何一種具有SEQID NO7的多肽。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50-Xaa51-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Xaa55-Xaa56-Xaa57-Xaa58-Xaa59-Xaa60-Xaa61-Xaa62-Xaa63-Xaa64-Xaa65-Xaa66-Xaa67-Xaa68-Xaa69-Xaa70-Xaa71-Xaa72-Xaa73-Xaa74-Xaa75-Xaa76-Xaa77-Xaa78-Xaa79-Xaa80-Xaa81-Xaa82-Xaa83-Xaa84-Xaa85-Xaa86-Xaa87-Xaa88-Xaa89-Xaa90-Xaa91-Xaa92-Xaa93-Xaa94-Xaa95-Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaa100-Xaa101-Xaa102-Xaa103-Xaa104-Xaa105-Xaa106-Xaa107-Xaa108其中Xaa1、Xaa6、Xaa9、Xaa33、Xaa38、Xaa40、Xaa53、Xaa56、Xaa57、Xaa68、Xaa74、Xaa80、Xaa81、Xaa89、Xaa93、Xaa95、Xaa97和Xaa107分別為非極性氨基酸；Xaa2、Xaa4、Xaa73、Xaa86、Xaa102和Xaa106分別為半胱氨酸樣氨基酸；Xaa3、Xaa5、Xaa10、Xaa11、Xaa14、Xaa15、Xaa26、Xaa32、Xaa34、Xaa37、Xaa39、Xaa45、Xaa46、Xaa50、Xaa65、Xaa66、Xaa69、Xaa70、Xaa76、Xaa85、和Xaa100分別為極性氨基酸；Xaa7、Xaa12、Xaa16、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa22、Xaa24、Xaa25、Xaa30、Xaa36、Xaa41、Xaa44、Xaa48、Xaa51、Xaa61、Xaa64、Xaa67、Xaa71、Xaa72、Xaa75、Xaa77、Xaa79、Xaa87、Xaa88、Xaa91、Xaa99、Xaa101、和Xaa105分別為脂族氨基酸；Xaa8、Xaa21、Xaa23、Xaa28、Xaa42、Xaa43、Xaa49、Xaa52、Xaa55、Xaa59、Xaa82、Xaa83、Xaa90、Xaa96和Xaa98分別為堿性氨基酸；Xaa13、Xaa54、Xaa63和Xaa104分別為芳族氨基酸；Xaa17、Xaa27、Xaa29、Xaa31、Xaa35、Xaa47、Xaa58、Xaa60、Xaa62、Xaa78、Xaa84、Xaa92、Xaa94和Xaa103分別為酸性氨基酸；而且Xaa108為色氨酸；而且其中該多肽具有β桶構(gòu)象，并且能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
在一些實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa2、Xaa4、Xaa73、Xaa86、Xaa102和Xaa106位置具有半胱氨酸而不是半胱氨酸樣氨基酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽在Xaa1位置具有甲硫氨酸?？蛇x擇地，由于在用于表達(dá)多肽抑制劑的細(xì)胞內(nèi)天然發(fā)生的加工，Xaa1氨基酸丟失。落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽也可在Xaa53或Xaa97位置中的任何一個(gè)具有甲硫氨酸。
在其它實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa3、Xaa5、Xaa14、Xaa26、Xaa32、Xaa66、Xaa69、Xaa70、Xaa76或Xaa100位置中的任何一個(gè)具有絲氨酸或蘇氨酸。
在其它實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa7、Xaa12、Xaa16、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa22、Xaa24、Xaa25、Xaa30、Xaa36、Xaa41、Xaa44、Xaa48、Xaa51、Xaa61、Xaa64、Xaa67、Xaa71、Xaa72、Xaa75、Xaa77、Xaa79、Xaa87、Xaa88、Xaa91、Xaa99、Xaa101或Xaa105位置中的任何一個(gè)具有丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa8或Xaa98位置中的任何一個(gè)具有組氨酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa6、Xaa9、Xaa40、Xaa57、Xaa68或Xaa107位置中的任何一個(gè)具有脯氨酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa10、Xaa11、Xaa15、Xaa34、Xaa39、Xaa45或Xaa50位置中的任何一個(gè)具有天冬酰胺或谷氨酰胺。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，Xaa13、Xaa54、Xaa63或Xaa104位置中的任何一個(gè)具有苯基丙氨酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa17、Xaa27、Xaa29、Xaa31、Xaa35、Xaa47、Xaa58、Xaa60、Xaa62、Xaa78、Xaa84、Xaa92、Xaa94或Xaa103位置中的任何一個(gè)具有天冬氨酸或谷氨酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa21、Xaa23、Xaa28、Xaa42、Xaa43、Xaa49、Xaa52、Xaa55、Xaa59、Xaa82、Xaa83、Xaa90或Xaa96位置中的任何一個(gè)具有賴氨酸或精氨酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa37、Xaa46、Xaa65或Xaa85位置中的任何一個(gè)具有酪氨酸。
在其它的實(shí)施方案中，落入SEQ ID NO7內(nèi)的目的多肽，在Xaa33、Xaa38、Xaa56、Xaa74、Xaa80、Xaa81、Xaa89、Xaa93或Xaa95位置中的任何一個(gè)具有甘氨酸。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO21Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50-Xaa51-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Xaa55-Xaa56-Xaa57-Xaa58-Xaa59-Xaa60-Xaa61-Xaa62-Xaa63-Xaa64-Xaa65-Xaa66-Xaa67-Xaa68-Xaa69-Xaa70-Xaa71-Xaa72-Xaa73-Xaa74-Xaa75-Xaa76-Xaa77-Xaa78-Xaa79-Xaa80-Xaa81-Xaa82-Xaa83-Xaa84-Xaa85-Xaa86-Xaa87-Xaa88-Xaa89-Xaa90-Xaa91-Xaa92-Xaa93-Xaa94-Xaa95-Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaa100-Xaa101-Xaa102-Xaa103-Xaa104-Xaa105-Xaa106-Xaa107-Xaa108其中Xaa1、Xaa53and Xaa97分別為甲硫氨酸；Xaa2、Xaa4、Xaa73、Xaa86、Xaa102和Xaa106分別為半胱氨酸；Xaa3、Xaa5、Xaa14、Xaa26、Xaa32、Xaa66、Xaa69、Xaa70、Xaa76和Xaa100分別為絲氨酸或蘇氨酸；Xaa7、Xaa12、Xaa16、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa22、Xaa24、Xaa25、Xaa30、Xaa36、Xaa41、Xaa44、Xaa48、Xaa51、Xaa61、Xaa64、Xaa67、Xaa71、Xaa72、Xaa75、Xaa77、Xaa79、Xaa87、Xaa88、Xaa91、Xaa99、Xaa101和Xaa105分別為丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸；Xaa8和Xaa98分別為組氨酸；Xaa6、Xaa9、Xaa40、Xaa57、Xaa68和Xaa107分別為脯氨酸；
Xaa10、Xaa11、Xaa15、Xaa34、Xaa39、Xaa45和Xaa50分別為天冬酰胺和谷氨酰胺；Xaa13、Xaa54、Xaa63和Xaa104分別為苯丙氨酸；Xaa17、Xaa27、Xaa29、Xaa31、Xaa35、Xaa47、Xaa58、Xaa60、Xaa62、Xaa78、Xaa84、Xaa92、Xaa94和Xaa103分別為天冬氨酸或谷氨酸；Xaa21、Xaa23、Xaa28、Xaa42、Xaa43、Xaa49、Xaa52、Xaa55、Xaa59、Xaa82、Xaa83、Xaa90和Xaa96分別為賴氨酸或精氨酸；Xaa37、Xaa46、Xaa65和Xaa85分別為酪氨酸；Xaa33、Xaa38、Xaa56、Xaa74、Xaa80、Xaa81、Xaa89、Xaa93和Xaa95分別為甘氨酸；Xaa108為色氨酸；而且其中該多肽具有β桶構(gòu)象，并且能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
本發(fā)明的目的多肽抑制劑具有β桶構(gòu)象。如這里所使用的，β桶構(gòu)象指多肽的中心含有能折疊成桶狀三級(jí)結(jié)構(gòu)的β鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過鏈內(nèi)氫鍵結(jié)合和內(nèi)部疏水堆積相互作用可以穩(wěn)定β桶。β桶是蛋白結(jié)構(gòu)和功能領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的公認(rèn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中，基礎(chǔ)的β桶構(gòu)象，可以通過能幫助維持折疊多肽的全面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)的二硫鍵來(lái)進(jìn)一步穩(wěn)定。例如，具有SEQ ID NO5或SEQ ID NO20的多肽，能折疊成帶有三個(gè)交聯(lián)分離的β肽鏈的二硫鍵的6鏈β桶構(gòu)象。參與結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶的氨基酸呈現(xiàn)于桶狀結(jié)構(gòu)的表面。
多肽的構(gòu)象可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何程序來(lái)確定。例如，可通過X-射線晶體學(xué)或通過計(jì)算機(jī)建模來(lái)確定構(gòu)象。例如，計(jì)算機(jī)建?？梢允褂贸绦蛉鏢wiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)和Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)程序進(jìn)行。建模工作可以在任何可用的具有足夠速度和RAM的計(jì)算機(jī)上進(jìn)行。例如，這里提供的很多計(jì)算機(jī)建模工作在運(yùn)行Windows 95的Compaq PC，以及Silicon Graphics，Inc.Octane UNIX工作站上進(jìn)行。此外，在OctaneUNIX工作站中使用來(lái)自Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子包。
為了進(jìn)行比較，選擇的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的三維結(jié)構(gòu)文件可以從如下的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Databank)下載(文件名，參考文獻(xiàn))MMP-1(1FBL，Li等人，1995)，MMP-2(1GEN，Libson等人，1995)，MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等人，1995；Reinemer等人，1994)，MMP-9(1MMQ，Browner等人，1995)，TIMP-2/MT-1 MMP復(fù)合物(1BUY，F(xiàn)ernandez-Catalan等人，1998)，TIMP-2(1BR9，Tuuttila等人，1998)和TIMP-1/MMP復(fù)合物(1UEA，Gomis-Ruth等人，1997；Huang等人，1996；Becker等人，1995)。這些文件可用于分析，并與天然存在的TIMP蛋白比較多肽抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，而且能促進(jìn)鑒定負(fù)責(zé)與不同基質(zhì)金屬蛋白酶的特異性結(jié)合相互作用的氨基酸。
多肽抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的能力可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何方法來(lái)評(píng)定。很多不同的測(cè)定方法可用于評(píng)定一種試劑能否用作蛋白酶活性的抑制劑。例如，可使用當(dāng)被蛋白酶切割時(shí)能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的蛋白底物。在一些實(shí)施方案中，在存在和不存在測(cè)試抑制劑時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶的活性可通過觀察熒光素化的蛋白底物的酶促水解來(lái)測(cè)定，例如，作為時(shí)間的函數(shù)。這種熒光素化蛋白底物的一個(gè)例子是獲自Molecular Probes，Inc.的熒光素化膠原蛋白。這種熒光素化蛋白底物可與選擇的基質(zhì)金屬蛋白酶或選擇的基質(zhì)金屬蛋白酶混合物一起溫育。熒光素化蛋白底物的切割可通過觀察隨時(shí)間過去的吸光度增加來(lái)檢測(cè)。在測(cè)定混合物中可使用各種量的底物和/或測(cè)試多肽抑制劑，來(lái)確定存在什么濃度作用，以及什么量的抑制劑對(duì)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶是最優(yōu)的。
從而可以改變本多肽的序列來(lái)調(diào)節(jié)多肽抑制劑對(duì)不同的基質(zhì)金屬蛋白酶的親和力。因?yàn)樾枰承┑鞍酌富钚?甚至在慢性傷口中)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞外的基質(zhì)重組(Agren 1999)，所以在某些實(shí)施方案中，渴望構(gòu)建不抑制具有極低的Ki值的基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑。例如，本多肽的Ki值可為從大約1μM到1mM。這種多肽將具有使得可以有某種瞬時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶活性的能力(歸因于相對(duì)高的Ki)。
多肽抑制劑([I])的抑制常數(shù)(Ki)可使用Segel(1993)提供的方法，利用Dixon圖(1/v對(duì)[I])測(cè)定，即斜率(slope)＝Km/(Vmax Ki [S])(1)其中Km為米氏常數(shù)，Vmax是反應(yīng)的最大速度，[S]為底物濃度。慢性傷口中也可通過調(diào)節(jié)抑制劑劑量和使用時(shí)間選擇，來(lái)控制抑制劑活性的程度和時(shí)間選擇。
期望本發(fā)明多肽抑制劑的毒性較低。但是，如果有擔(dān)心，則細(xì)胞毒性可通過將各種量的多肽添加到培養(yǎng)物中的成纖維細(xì)胞或角質(zhì)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行測(cè)定?？梢员O(jiān)控這些細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞完整性，來(lái)評(píng)定選擇的多肽抑制劑是否具有任何負(fù)面作用。
可通過將選擇的多肽導(dǎo)入到傷口中，并測(cè)量在存在該多肽時(shí)愈合速度是否改變，來(lái)評(píng)定選擇的多肽抑制劑的愈合速度。例如，可測(cè)定存在和不存在多肽時(shí)的傷口愈合速度。雖然可使用任何傷口，但是優(yōu)選具有預(yù)期特性的傷口模型。例如，存在可使用的兩種動(dòng)物慢性傷口模型。第一種是缺血性兔耳模型，第二種為誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型。
多肽修飾本發(fā)明還預(yù)期修飾多肽抑制劑以使它們穩(wěn)定，以促進(jìn)它們的攝取和吸收，并改善本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多肽的任何其它特征或特性。例如，可以環(huán)化多肽抑制劑，可以中和多肽抑制劑上的電荷，而且可以把多肽連接到其它化學(xué)部分。
具有適于在多肽內(nèi)或與其它部分形成這種鍵的功能基團(tuán)的兩種側(cè)鏈間的各種反應(yīng)，以及適于形成這種鍵的反應(yīng)條件，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。所需的反應(yīng)條件是足夠溫和的以便不降解多肽或另外損害多肽。用于保護(hù)必要的各種功能性的的合適的基團(tuán)是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，Greene & Wuts，1991，第2版，John Wiley &Sons，NY)，用于制備這種被保護(hù)的分子的各種反應(yīng)方案也是本領(lǐng)域熟知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以有效地除去N-末端和C-末端的電荷。這可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何方法來(lái)完成，例如，通過使N-末端乙?；约笆笴-末端酰胺化。
以各種方式制備和修飾多肽的方法是本領(lǐng)域所熟知的(參見，例如，Spatola，1983，Vega Data 1(3)的綜述)；Spatola，1983，“Peptide Backbone Modifications”InChemistry andBiochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins(Weinstein，ed.)，Marcel Dekker，New York，p.267(綜述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1463-468；Hudson等人，1979，Int.J.Prot.Res.14177-185(--CH2NH--，--CH2CH2--)；Spatola等人，1986，Life Sci.381243-1249(--CH2--S)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1307-314(--CH＝CH--，順式和反式)；Almquist等人，1980，J.Med.Chem.231392-1398(--COCH2--)；Jennings-White等人，Tetrahedron.Lett.232533(--COCH2--)；歐洲專利申請(qǐng)EP 45665(1982)CA9739405(--CH(OH)CH2--)；Holladay等人，1983，Tetrahedron Lett.244401-4404(--C(OH)CH2--)和Hruby，1982，Life Sci.31189-199(--CH2--S--)。
傷口愈合組合物本發(fā)明多肽可用于愈合傷口，尤其有益于慢性傷口愈合。單個(gè)多肽、多肽變體、多肽衍生物及其混合物(如具有不同序列的那些)可以組合在一種制劑中，來(lái)促進(jìn)傷口愈合以及預(yù)防或治療皮膚問題。最優(yōu)的愈合和皮膚再生可能需要一些基質(zhì)金屬蛋白酶活性。因此，本發(fā)明的組合物和制劑不必要促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的最大抑制。相反，由于需要使愈合最優(yōu)化和促進(jìn)健康皮膚發(fā)育，可以改變多肽抑制劑制劑的活性?？赏ㄟ^改變抑制劑多肽的類型、含量和量來(lái)獲得較低或較高水平的抑制，從而促進(jìn)愈合和健康皮膚發(fā)育。
為了促進(jìn)健康皮膚發(fā)育和/或治療傷口，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的任何方式把本發(fā)明多肽導(dǎo)入到皮膚或傷口中。例如，多肽可以制成治療組合物，其含有治療有效量的一種或多種多肽和藥物載體。可以以乳膏、噴霧、泡沫、凝膠或任何其它方式或制劑的形式，把這種組合物引入到皮膚或傷口中。在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以制成皮膚覆蓋物或敷料，其含有浸滲到覆蓋物或敷料物質(zhì)中，與覆蓋物或敷料物質(zhì)共價(jià)附著或其它連接的治療有效量的一種或多種多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚覆蓋物或敷料可以釋放多肽抑制劑。多肽抑制劑可以以無(wú)控制或控制的方式釋放。從而，本發(fā)明的皮膚覆蓋物或傷口敷料可提供多肽抑制劑向傷口中較慢的或定時(shí)的釋放。皮膚覆蓋物和敷料材料可以是本領(lǐng)域使用的任何材料，包括繃帶、紗布、無(wú)菌包裹物、水凝膠、水膠體及類似材料。
本發(fā)明多肽的治療有效量是，能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶到促進(jìn)健康皮膚發(fā)育和/或傷口愈合所需的程度的多肽量。例如，當(dāng)存在于治療或藥物組合物中時(shí)，本發(fā)明多肽的量的范圍為組合物重量的大約0.001％到大約35％。多肽可以構(gòu)成組合物重量的大約0.5％到大約20％。可選擇地，多肽構(gòu)成組合物重量的大約1.0％到大約10％。多肽抑制劑的治療有效量隨施用途徑可以必要地改變。例如，每kg體重30到112,000μg的治療量可有效用于靜脈內(nèi)施用。不過，健康皮膚發(fā)育或傷口治療所需的多肽抑制劑的量，不但隨著施用途徑而改變，而且還隨被治療的狀況的性質(zhì)以及患者的年齡和狀況而改變，并最終由主治醫(yī)師或臨床醫(yī)生判斷。
施用的劑量和方法根據(jù)要治療的皮膚或組織的位置和/或傷口的嚴(yán)重性可以改變。多肽和多肽綴合物的有用劑量，可通過使它們?cè)谶@里所述的動(dòng)物模型中的體外活性和體內(nèi)活性相關(guān)聯(lián)來(lái)確定?；衔锟梢砸詥挝粍┬头奖愕厥┯?；例如，每單位劑型中含有大約0.001μg到大約10mg，方便地大約0.01μg到大約5mg，更方便地，大約0.10μg到大約1mg，甚至更方便地大約1.0μg到大約500μg多肽。所需的劑量可以存在于單次劑量中，作為分次劑量，或者作為連續(xù)輸注。所需的劑量也可以以適當(dāng)?shù)拈g隔施用，例如，以每天兩次，三次，四次或者更多的亞劑量(subdose)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用這里提供的教導(dǎo)，很容易地從可用的信息制備和施用有效的制劑本發(fā)明的多肽抑制劑可制備成藥物組合物，并以適合于所選的施用途徑的各種劑型施用給哺乳動(dòng)物宿主如人類患者，所述施用途徑即口服或腸胃外，通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部或皮下途徑。
因此，多肽抑制劑可以全身施用，例如，通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)輸注或注射?？梢栽谒兄苽涠嚯囊种苿┤芤?，任選與無(wú)毒的表面活性劑混合。也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇、甘油三醋酸酯及其混合物和油類中制備分散體。在一般的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。
適于注射或輸注或局部應(yīng)用的藥物劑型包括含有活性成分的無(wú)菌水溶液或分散體或無(wú)菌粉末，其適于無(wú)菌的可注射或可輸注溶液或分散體的臨時(shí)制備，優(yōu)選被囊化到脂質(zhì)體中。在所有的情況中，最終劑型在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下必須是無(wú)菌的、流動(dòng)的并穩(wěn)定的。液體載體或媒介物可以是溶劑或液體分散介質(zhì)，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、聚乙二醇、液態(tài)聚乙二醇，等等)、植物油類、無(wú)毒的甘油酯及其合適的混合物?？梢酝ㄟ^例如，形成脂質(zhì)體，在分散體的情況中保持所需的顆粒大小，或通過使用表面活性劑來(lái)維持合適的流動(dòng)性?？梢酝ㄟ^各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氨丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等來(lái)防止微生物的作用。在一些情況中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇包括等滲劑，例如，糖、緩沖液或氯化鈉?？赏ㄟ^使用延遲吸收的試劑例如，單硬脂酸鋁和明膠的組合物來(lái)延長(zhǎng)可注射組合物的吸收。
如所需要的，無(wú)菌可注射溶液可通過把多肽或多肽綴合物以所需的量整合到帶有上面所列舉的各種其它成分的合適溶劑中來(lái)制備，接著進(jìn)行過濾滅菌。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況中，制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其產(chǎn)生了活性成分的粉末，再加上存在于預(yù)先無(wú)菌過濾溶液中的任何額外的所需成分。
在一些例子中，多肽抑制劑也可以組合藥學(xué)上可接受的載體如惰性稀釋劑或可同化的可食用載體經(jīng)口施用。它們可以裝入到硬或軟殼明膠膠囊中，可以壓縮成片劑，或可以直接與患者膳食的食物整合。對(duì)于口服治療的施用，多肽抑制劑可以與一種或多種賦形劑組合，而且可以以可吸收的片劑、口腔片、糖錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片(wafer)等等的形式使用。這些組合物和制劑應(yīng)含有至少0.1重量％的活性化合物。組合物和制劑的百分?jǐn)?shù)，當(dāng)然可以不同，而且方便地可以為給定單位劑型重量的大約2到大約60％。這種治療有用的組合物中活性化合物的量為可獲得有效劑量水平的量。
片劑、糖錠、藥丸、膠囊等等也可含有下述成分粘合劑如西黃著膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等等；潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂；且可添加增甜劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或增香劑如胡椒薄荷、冬綠油或櫻桃調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型為膠囊時(shí)，除上述類型材料以外，它可含有液體載體，如植物油或聚乙二醇。也可存在各種其它材料作為涂層，或另外用于修飾固體單位劑型的物理形狀。例如，片劑、藥丸或膠囊也可用明膠、蠟、蟲膠或糖等等涂敷。糖漿或酏劑也可含有活性組合物、蔗糖或果糖作為增甜劑，含有甲基和對(duì)羥苯甲酸丙酯作為防腐劑，含有染料和調(diào)味劑如櫻桃或柑橘食用香料。當(dāng)然，制備任何單位劑型中使用的任何材料必須是藥學(xué)上可接受的而且在使用量基本上是無(wú)毒的。此外，多肽抑制劑可以整合到持續(xù)釋放制劑和裝置中。
有用的固體載體包括精細(xì)分割的固體，如滑石、粘土、微晶纖維素、硅石、氧化鋁等等。有用的液體載體包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇摻和物，本化合物可以以有效水平溶解于或分散于其中，任選在非毒性表面活性劑的幫助下。也可加入佐劑如香料和額外的抗微生物劑以使給定應(yīng)用的特性最優(yōu)化。
增稠劑如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或改性無(wú)機(jī)材料也可與液體載體一起使用，以形成可涂布的糊劑、凝膠、軟膏、肥皂等等，直接應(yīng)用于使用者的皮膚。
總之，本發(fā)明的多肽可以局部施用，用于傷口治療和促進(jìn)健康皮膚發(fā)育?；钚远嚯目梢酝ㄟ^任何方式直接或間接地局部施用給選擇的組織，作為噴霧、泡沫、粉末、乳膏、膠凍、糊劑、栓劑或溶液。本文中使用的術(shù)語(yǔ)糊劑，應(yīng)當(dāng)包括如常直接應(yīng)用于皮膚或涂布到繃帶或敷料上的乳膏和其它粘稠的可涂布組合物。本發(fā)明的多肽可以共價(jià)附著到，穩(wěn)定吸附到或者另外應(yīng)用到皮膚覆蓋物或傷口敷料材料上。為了在手術(shù)后促進(jìn)愈合，本發(fā)明的活性多肽可直接應(yīng)用于靶組織或假器官裝置或可植入的持續(xù)釋放裝置。組合物可通過氣溶膠作為泡沫或霧，帶有或不帶有其它試劑，直接施用到皮膚或傷口上。
多肽可以以制劑的形式施用，該制劑包括位于蠟、油、乳化劑、水和/或基本上水溶性的材料中的多肽乳劑，在存在水時(shí)可形成凝膠。該制劑提供乳劑所需的特性，因?yàn)樗强赏坎嫉?，而且具有乳劑的乳脂狀的一致性，而?dāng)進(jìn)行正常的滅菌操作如蒸汽滅菌時(shí)沒有分解，因?yàn)槟z使乳劑穩(wěn)定。它還顯示了比常規(guī)凝膠好的水保留性能，因?yàn)樗槐３衷谌閯┖湍z中。
制劑可以含有濕潤(rùn)劑，來(lái)減少水在乳膏或洗劑中的蒸氣分壓，以降低乳膏或洗劑干燥的速度。合適的濕潤(rùn)劑能與水很大程度的混合，并通常適合應(yīng)用于皮膚。多元醇特別適于該目的，且合適的多元醇包括單丙二醇或丙三醇(甘油)。多元醇可以以總制劑的20-50％(按重量計(jì)算)的比例存在；可選擇地該范圍為30-40％。多元醇這種相對(duì)高的比例也確保了，如果糊劑干燥到任何程度，得到的糊劑保持柔軟和柔韌，因?yàn)楸伎捎米骶酆衔锏脑鏊軇?。例如，?dāng)糊劑應(yīng)用到繃帶時(shí)，它因此仍然可以很容易地從皮膚上除掉，而當(dāng)糊劑失去水時(shí)沒有必要割掉繃帶。多元醇還具有當(dāng)它與皮膚或傷口尤其是感染的傷口接觸時(shí)，能防止細(xì)菌在糊劑中增殖的優(yōu)點(diǎn)。
制劑可包括其它成分如抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗炎劑等等。還發(fā)現(xiàn)其它的成分適于整合到制劑中。
用于乳劑的蠟的例子是單硬脂酸甘油酯，或單硬脂酸甘油酯與PEG100硬脂酸酯的組合，PEG100硬脂酸酯可作為CITHROL GMS/AS/NA從Croda Universal Ltd商業(yè)獲得。該組合提供了蠟和乳化劑(PEG100硬脂酸酯)，該乳化劑特別與蠟相容，用于形成水中的乳劑。制劑中可包括第二種乳化劑，以增加乳劑的穩(wěn)定性，例如，PEG20硬脂酸酯，如Croda Universal Ltd提供的CITHROL 10MS。乳膏中乳化劑的總濃度一般在3-15％范圍內(nèi)。使用兩種乳化劑時(shí)，一個(gè)可以以大于另一個(gè)的濃度存在。
水不溶性材料與制劑的水形成凝膠。從而該材料是親水的，但卻不是任意大程度地溶于水。該材料可以是聚合材料，例如，水吸收的但不是水溶性的聚合物。不過，也可以使用與水形成凝膠，而且在升高的溫度仍然穩(wěn)定的非聚合材料，例如，粘土如高嶺土或膨潤(rùn)土。本發(fā)明中使用的一些聚合物為高吸水性聚合物，如WO-92/16245中公開的那些聚合物，而且其包括部分交聯(lián)以形成三維結(jié)構(gòu)的親水纖維素衍生物。合適的交聯(lián)纖維素衍生物包括那些羥基低碳烷基纖維素，其中烷基包括1到6個(gè)碳原子，例如，羥乙基纖維素或羥丙基纖維素，或羧基纖維素例如羧甲基羥乙基纖維素或羧甲基纖維素?？捎糜诒景l(fā)明的聚合物的例子是部分交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉聚合物，其由AkzoChemicals B.V.作為AKUCELL X181提供。該聚合物為高吸水性聚合物，因?yàn)樗芪罩辽?0倍于它自身重量的水。聚合物的交聯(lián)結(jié)構(gòu)預(yù)防它溶于水中，但是水能很容易地吸收到并保持于聚合物的三維結(jié)構(gòu)中以形成凝膠。水從這種凝膠中比從溶液中較慢地失去，而且這在減慢或防止乳膏制劑干燥中是有利的。制劑的聚合物含量通常低于10％，例如，聚合物含量范圍為按重量計(jì)算大約0.5％到大約5.0％，或按重量計(jì)算大約1.0％到大約2％。
可以將制劑滅菌，而且應(yīng)該通過改變聚合物含量來(lái)選擇制劑的成分，以提供成品所需的流動(dòng)性能。也即，如果產(chǎn)品需要滅菌，必須選擇制劑以在滅菌之前給出具有相對(duì)高的粘度/彈性的產(chǎn)品。如果制劑的某些成分不需要滅菌，可以在添加那些成分之前對(duì)制劑進(jìn)行滅菌，或者每種成分可以單獨(dú)滅菌。制劑可以通過在無(wú)菌條件下混合各種已滅菌的成分來(lái)進(jìn)行制備。當(dāng)成分單獨(dú)進(jìn)行滅菌，然后一起混合時(shí)，可以調(diào)整聚合物的含量來(lái)提供具有成品所需的流動(dòng)性能的產(chǎn)品。乳劑的含量確定了制劑的處理性能和觸感，較高的乳劑含量導(dǎo)致了提高的可涂布性和乳脂狀。
制劑可以包裝到用于儲(chǔ)存的試管、盆或其它合適形式的容器中，或者它可以涂布到基質(zhì)上，然后接著包裝。合適的基質(zhì)包括敷料，包括膜敷料和繃帶。
下述的實(shí)施例的目的是為了闡明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1方法該實(shí)施例提供了用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)的材料和方法。
分子生物學(xué)方法細(xì)菌生長(zhǎng)條件和培養(yǎng)如Miller(1972)所述的進(jìn)行。除非另有說明，該研究中進(jìn)行的所有操作都根據(jù)Maniatis等人(1982)或Sambrook等人(1989)或Sambrook等人(2001)；包括，瓊脂糖凝膠電泳和限制性內(nèi)切核酸酶消化。所有PCR反應(yīng)中使用的Vent DNA聚合酶都購(gòu)自New England Biolabs，并與提供的緩沖液一起使用。DNA測(cè)序(Sanger等人，1977)使用Applied Biosystems，Inc.的自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行，并通過Genosys，Inc.進(jìn)行。DNA寡核苷酸由Genosys，Inc.合成。蛋白濃度使用牛血清清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)物根據(jù)Bradford(1976)的方法確定，或者使用11,300M-1cm-1的計(jì)算摩爾吸光系數(shù)通過分光光度測(cè)定確定。使用來(lái)自BioRad，Inc.的7×250mm BioSelect SEC-125柱，根據(jù)Siegel和Monty(1966)所述進(jìn)行分析型凝膠過濾實(shí)驗(yàn)。所有的細(xì)菌菌株購(gòu)自New England Biolabs，Inc.。蛋白SDS PAGE凝膠按照Laemmli(1970)所述制備、運(yùn)行和處理?；瘜W(xué)試劑和層析樹脂來(lái)自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)，除非有具體說明。
分子建模分子建模利用兩種可視化程序，Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)與Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)。建模工作在運(yùn)行Windows 95的Compaq PC，以及SiliconGraphics，Inc.Octane UNIX工作站上進(jìn)行。此外，來(lái)自MolecularSimulations，Inc.的Cerius2分子包可用于Octane上。選擇的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的三維結(jié)構(gòu)文件可從如下的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(文件名，參考文獻(xiàn))下載MMP-1(1FBL，Li等人，1995)、MMP-2(1GEN，Libson等人，1995)、MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等人，1995；Reinemer等人，1994)、MMP-9(1MMQ，Browner等人，1995)、TIMP-2/MT-1 MMP復(fù)合物(1BUV，F(xiàn)ernandez-Catalan等人，1998)、TMP-2(1BR9，Tuuttila等人，1998)和TIMP-1/MMP復(fù)合物(1UEA，Gomis-Ruth等人，1997；Huang等人，1996；Becker等人，1995)。這些文件可用于分析蛋白的三維結(jié)構(gòu)，各個(gè)位置氨基酸的化學(xué)性質(zhì)，以及MMP-TIMP接觸界面的保守和變異氨基酸的鑒定。該信息可用于設(shè)計(jì)將結(jié)合很多基質(zhì)金屬蛋白酶的本發(fā)明的抑制劑。
第一步開始于全長(zhǎng)氨基酸序列，其為四種已知TIMP序列的平均。使用CLUSTAL程序(Higgins等人，1992)計(jì)算四種TIMP氨基酸序列的文件逐對(duì)比對(duì)?；谶@種比對(duì)構(gòu)建共有序列。對(duì)于接觸區(qū)域中的非保守氨基酸，可以進(jìn)行保持接近的疏水特征，但是沒有特定的側(cè)鏈-側(cè)鏈相互作用的替代。通過該實(shí)踐，獲得了共有的結(jié)合界面。TIMP-2的大柔性環(huán)部分，其在TIMP-1中是不明顯的，被構(gòu)建回到帶有幾個(gè)氨基酸序列改變的多肽抑制劑中。
第二步是除去共有抑制劑分子的C-末端結(jié)構(gòu)域。通過分析兩種TIMP/MMP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，確定了只有N-末端TIMP區(qū)域與MMP的催化結(jié)構(gòu)域顯著接觸。這后來(lái)通過使用MMP-9對(duì)接最終的蛋白模型而確認(rèn)。這種操作把蛋白的全長(zhǎng)從225個(gè)氨基酸減少到108個(gè)氨基酸。為了穩(wěn)定化蛋白的新C-末端，進(jìn)行了兩個(gè)額外的氨基酸的替代Leu85和Val101變?yōu)榘腚装彼帷Ｓ^察到這兩個(gè)殘基在彼此的3內(nèi)。因此，用半胱氨酸進(jìn)行替代將使得能夠形成二硫鍵。這樣蛋白的最后的環(huán)狀區(qū)域被在適當(dāng)位置鎖定。而且，13位的半胱氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸。從而最終蛋白抑制劑中的6個(gè)半胱氨酸殘基可用于參與形成二硫鍵。
第三步需要構(gòu)建新蛋白抑制劑的同源模型。利用ProMod andSwissModel程序(Peitsch，1996；Peitsch等人，1996)，抑制劑最后的108個(gè)氨基酸可穿過TIMP-2的α碳跡線。使用GROMOS 96forcefield，可對(duì)該模型進(jìn)行能量最低化，使用SYBYL forcefield進(jìn)行幾輪分子力學(xué)幾何學(xué)最優(yōu)化(Clark等人，1989)。然后分析最終的最低化/最優(yōu)化模型中差的側(cè)鏈相互作用和扭轉(zhuǎn)幾何學(xué)。
來(lái)自這種三維建模的最終多肽抑制劑具有SEQ ID NO5的序列，并命名為DST。該首字母縮略詞為Delta(最終蛋白的C-末端TIMP結(jié)構(gòu)域缺失)Synthetic(它是基于制作的結(jié)構(gòu)和同源建模的)TIMP(由于它基于TIMP1-2的結(jié)構(gòu))的縮寫。
基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建和克隆最終的SEQ ID NO5氨基酸序列使用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳密碼逆向翻譯。密碼子選擇基于大腸桿菌的密碼子偏倚，意思是選擇用于特定氨基酸的最終密碼子是大腸桿菌中于該氨基酸的最常用密碼子。全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因?yàn)?27bp。為了構(gòu)建該基因序列，橫跨編碼區(qū)的10條單鏈寡核苷酸由Genosys，Inc.合成。寡核苷酸長(zhǎng)度為70個(gè)核苷酸。每條寡核苷酸都與另一條寡核苷酸互補(bǔ)，以便與它的結(jié)合配偶體雜交，得到的片段含有50個(gè)堿基對(duì)的中心雙鏈體區(qū)域，而且每個(gè)末端側(cè)面為10個(gè)核苷酸的單鏈區(qū)域。使用的寡核苷酸序列顯示于表3中。
表3用于構(gòu)建抑制劑核酸的寡核苷酸1ATGTGCAGCT GCAGCCCGGT GCATCCGCAG CAGGCGTTTAGCAACGCGGA TGTGGTGATT CGCGCGAAAG-3′(SEQ ID NO8)2CGGTGAGCGA AAAAGAAGTC GATAGCGGCA ACGATATTTATGGCAACCCG ATTAAACGCA TTCAGTATGA-3′(SEQ ID NO9)3AATTAAACAG ATTAAAATGT TTAAAGGCCC GGAAAAAGATATTGAATTTA TTTATACCGC GCCGAGCAGC-3′(SEQ ID NO10)4GCGGTGTGCG GCGTGAGCCT GGATGTGGGC GGCAAAAAAGAATATTGCAT TGCGGGCAAA GCGGAAGGCG-3′(SEQ ID NO11)5ATGGCAAAAT GCATATTACC CTGTGCGATT TTATTTGCCCGTGGTAGAAG CTTATAGAC-3′(SEQ ID NO12)
6TCGCTCACCG CTTTCGCGCG AATCACCACA TCCGCGTTGCTAAACGCCTG CTGCGGATGC ACCGGGCTGC AGCTGCACAT-3′(SEQ ID NO13)7CTGTTTAATT TCATACTGAA TGCGTTTAAT CGGGTTGCCATAAATATCGT TGCCGCTATC GACTTCTTTT-3′(SEQ ID NO14)8CGCACACCGC GCTGCTCGGC GCGGTATAAA TAAATTCAATATCTTTTTCC GGGCCTTTAA ACATTTTAAT-3′(SEQ ID NO15)9ATTTTGCCAT CGCCTTCCGC TTTGCCCGCA ATGCAATATTCTTTTTTGCC GCCCACATCC AGGCTCACGC-3′(SEQ ID NO16)10GTCTATAAGC TTCTACCACG GGCAAATAAA ATCGCACAGGGTAATATGC-3′(SEQ ID NO17)11ATGTGCAGCTGCAGCCCGGT-3′(SEQ ID NO18)12GTCTATAAGC TTCTACCACG-3′(SEQ ID NO19)抑制劑核酸(SEQ ID NO6)的構(gòu)建以三個(gè)獨(dú)立的步驟完成。
第一，5μg的每種寡核苷酸以及它的互補(bǔ)結(jié)合配偶體(用于5個(gè)獨(dú)立反應(yīng))在10mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM NaCl中混合到一起，終體積為10μL。雜交混合物中使用的特定寡核苷酸為(參見表3)(1與6)、(2與7)、(3與8)、(4與9)以及(5與10)?；旌衔镌?5℃的水浴中加熱10分鐘。停止加熱，使整個(gè)水浴在5個(gè)小時(shí)時(shí)間段內(nèi)冷卻到室溫。
第二步，把來(lái)自5個(gè)“緩慢冷卻”反應(yīng)中每個(gè)的等分試樣(10μL)混合到一起(終體積為50μL)。試管于45℃加熱10分鐘，然后置于冰浴中。將T4 DNA連接酶和緩沖液(New England Biolabs)加入到試管中，反應(yīng)物(終體積60μL)于16℃溫育20小時(shí)。
第三步，具有SEQ ID NO6的全長(zhǎng)核酸使用兩個(gè)PCR引物(表3，11和12)而選自那些片段混合物，其中兩個(gè)PCR引物與結(jié)構(gòu)基因的最5’和3’末端互補(bǔ)。該步驟確保只有全長(zhǎng)核酸將被擴(kuò)增。此外，3’擴(kuò)增引物含有Hind III位點(diǎn)以促進(jìn)克隆。PCR反應(yīng)使用1μL前面一段中所述的連接混合物進(jìn)行。使用的PCR條件如下95℃，1分鐘；49℃，1分鐘；72℃，30秒。在Techne Progene PCR裝置中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的該程序。最后一個(gè)PCR循環(huán)之后，于72℃進(jìn)行10分鐘延伸溫育。PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過DNA瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過Promega DNA Wizard PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。在克隆之前，在存在ATP時(shí)用T4 DNA聚合物處理DNA片段，以確保完全雙鏈的末端。該反應(yīng)根據(jù)New England Biolabs，Inc.的說明書進(jìn)行。DNA使用Promega DNA Wizard PCR純化試劑盒進(jìn)行再次純化。然后DNA用Hind III消化，并通過乙醇沉淀進(jìn)行純化。最終的DNA重懸于小體積的10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA中。
克隆載體，pMAL-c2(New England Biolabs)，用Xmn I和HindIII進(jìn)行消化，并使用Promega DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。該消化產(chǎn)生了線性載體，其含有與DNA片段的5’平端以及3’Hind III末端相容的3’平端和5’Hind III末端。該組合確保了SEQ ID NO6 DNA片段的定向框內(nèi)克隆。載體和SEQ ID NO6 DNA片段以大約1∶10的摩爾比例混合，然后在存在T4 DNA連接酶時(shí)于16℃連接20個(gè)小時(shí)(總反應(yīng)體積為20μL)。用5μL連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細(xì)菌。在與帶有60μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)后，選擇單個(gè)菌落，并使用Promega小量制備DNA分離試劑盒，通過小量制備方法從這些菌落純化質(zhì)粒。通過DNA瓊脂糖凝膠電泳，限制性內(nèi)切核酸酶消化，最后通過DNA測(cè)序?qū)Ψ蛛x的質(zhì)粒進(jìn)行估計(jì)。編碼SEQ ID NO5多肽的質(zhì)粒構(gòu)建體命名為pDSTe。
蛋白抑制劑的純化表達(dá)策略使用來(lái)自New England Biolabs，Inc.的T4 RNA聚合物超表達(dá)系統(tǒng)。用于蛋白表達(dá)的載體為pMAL，其含有位于多克隆位點(diǎn)上游的麥芽糖結(jié)合蛋白的基因序列。SEQ ID NO6核酸插入到該多克隆位點(diǎn)。含有SEQ ID NO6表達(dá)載體的1％TB-1細(xì)胞接種物(innoculum)于37℃生長(zhǎng)于補(bǔ)充有1％葡萄糖和60μg/mL氨芐青霉素的Luria broth中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到A595值為0.8時(shí)(大約在接種后3小時(shí))，添加IPTG到終濃度為0.5mM。細(xì)胞收獲前再持續(xù)生長(zhǎng)5小時(shí)。一般，每升獲得5g細(xì)胞。
通過在10,000xg離心10分鐘對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沉淀，并重懸于1倍體積的10mM Tris-HCl，pH 8.0中。細(xì)胞如上所述的進(jìn)行再次旋轉(zhuǎn)(respin)，并于-70℃冷凍至少2小時(shí)。冷凍的沉淀重懸于兩倍體積的BPER大腸桿菌蛋白提取緩沖液中?；旌衔镉?0℃溫育20分鐘并進(jìn)行偶爾的混合。得到的提取物通過于12,000xg離心20分鐘進(jìn)行澄清，上清液對(duì)20mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM NaCl，1mM EDTA(緩沖液I)進(jìn)行透析。透析過的材料用緩沖液I稀釋到終濃度為2.5mg/mL，并命名為級(jí)分I。所有的后續(xù)層析步驟都于室溫進(jìn)行。
級(jí)分I用于已經(jīng)預(yù)先用緩沖液I平衡過的10cm×7.6cc2直鏈淀粉樹脂柱。然后柱子用緩沖液I(通常10倍的柱體積)充分洗滌，以除去未結(jié)合的材料。使用緩沖液I，10mM麥芽糖從柱子洗脫結(jié)合的融合蛋白。一般洗脫體積為大約2倍的柱體積。使用分光光度法測(cè)定級(jí)分的蛋白含量，合并含有蛋白的級(jí)分。該材料命名為級(jí)分II。通過Centricon(Amicon，Inc.)把蛋白濃度調(diào)整為1mg/mL。
級(jí)分II與凝血因子Xa蛋白酶以100∶1的重量/重量化學(xué)計(jì)量進(jìn)行混合(一般反應(yīng)物含有50mg的融合蛋白和0.5mg的凝血因子Xa)。切割反應(yīng)于室溫進(jìn)行24小時(shí)。切割程度通過對(duì)整個(gè)反應(yīng)過程的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出的等分試樣進(jìn)行SDS PAGE分析來(lái)進(jìn)行監(jiān)控。最終的混合物對(duì)20mM Tris-HCl(pH8.0)，25mM NaCl，3mM EDTA進(jìn)行透析，并命名為級(jí)分III。
級(jí)分III用于已經(jīng)在10mM Tris-HCl(pH8.0)，25mM NaCl(緩沖液II)中平衡過的Mono Q離子交換柱(6cm×7.6cc2)。柱子進(jìn)行如下操作緩沖液II，30mL；具有25mM到500mM NaCl線性梯度的緩沖液II，40mL。麥芽糖結(jié)合蛋白洗脫自125mM NaCl中的柱子，在250mM NaCl中洗脫均勻的蛋白抑制劑，在400mM NaCl中洗脫凝血因子Xa蛋白酶。合并含有蛋白抑制劑的級(jí)分。該材料對(duì)緩沖液II進(jìn)行透析，濃縮到10mg/mL，并命名為級(jí)分IV。蛋白以等分試樣儲(chǔ)存于-20℃。后面的所有實(shí)驗(yàn)都用級(jí)分IV蛋白進(jìn)行，除非具體說明。純化的SEQ ID NO5蛋白命名為DST。
MMP抑制使用的測(cè)定測(cè)量了MMP-9或其它基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)熒光素化膠原蛋白的酶促水解，其是時(shí)間的函數(shù)。將濃度為5μM的熒光素化膠原蛋白添加到反應(yīng)緩沖液中(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)，并置于Spectrosil石英熒光計(jì)比色皿中。濃度為0.1μM的MMP與各種量的多肽抑制劑(SEQ ID NO5或SEQ ID NO20)混合，并于25℃溫育10分鐘以實(shí)現(xiàn)結(jié)合。把蛋白混合物添加到膠原蛋白底物中，并進(jìn)行混合。使用495nm的激發(fā)波長(zhǎng)在Shimadzu RF5301熒光計(jì)中，測(cè)量了作為時(shí)間函數(shù)的520nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。根據(jù)Segel(1993)利用Dixon圖(1/v對(duì)[I])，使用熒光釋放測(cè)定來(lái)確定基于蛋白的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑([I])的抑制常數(shù)(Ki)，其中斜率＝Km/(VmaxKi[S]) (1)其中Km為米氏常數(shù)，Vmax為反應(yīng)最大速度，[S]為底物濃度。
多克隆抗體的生產(chǎn)多克隆抗血清由Genosys，Inc.生產(chǎn)。通過把與弗氏完全佐劑以1∶1均勻混合的均一性SEQ ID NO5多肽(300μg)皮下注射到雌性新西蘭白兔中，來(lái)誘導(dǎo)抗SEQ ID NO5多肽的多克隆抗體(pAb)。隨后以一周的間隔注射三次帶有不完全佐劑的抗原(200μg)。最后一次注射一周后，通過耳插管對(duì)兔取血。于14,000xg離心收集澄清的血漿，并儲(chǔ)存于-20℃直到使用。
多克隆抗體的純化通過在DEAE Affi-gel Blue上進(jìn)行親和層析把pAb純化成均一性的。來(lái)自BioRad Labs，Inc.的兔多克隆抗體分離試劑盒根據(jù)提供的說明書進(jìn)行使用，并帶有幾個(gè)小的修改。方案如下澄清的兔血清(5mL)通過Econo-Pac 10DG脫鹽柱。使用提供的工作緩沖液(0.02MTris HCl(pH8.0)，0.028M NaCl)從該柱子洗脫pAb，并收集作為單獨(dú)的級(jí)分。在該階段，使用Bradford測(cè)定來(lái)確定蛋白的濃度。全部血清樣品(通常為25mL)以5mL為一批通過柱子。每批之間用40mL工作緩沖液(兩倍柱體積)洗滌柱子。合并來(lái)自單個(gè)柱工作的最終脫鹽樣品。合并的樣品用于DEAE Affi-gel Blue柱作為單個(gè)上樣，用5倍柱體積的工作緩沖液(50mL)洗滌柱子，并使用5倍柱體積的洗脫緩沖液(0.025M Tris HCl(pH 8.0)，0.025M NaCl)從柱子洗脫pAb級(jí)分。收集洗脫的材料作為5mL的級(jí)分。IgG級(jí)分的純度通過SDS PAGE進(jìn)行估計(jì)。合并合適的級(jí)分，通過加壓過濾濃縮到2mg/mL，并儲(chǔ)存于-70℃直到需要。通過使用溶于工作緩沖液中的2M NaCl，1.5M硫氰酸鈉(10倍柱體積)洗滌柱子，接著在工作緩沖液中進(jìn)行再平衡，來(lái)使DEAE Affi-gel Blue柱再生。所有層析步驟的流速維持在1.0mL/min。
ELISA分析使用Kaiser和Pollard(1993)或Quirk等人(1996)所述的方法進(jìn)行ELISA。1μg的純化SEQ ID NO5或SEQ ID NO20多肽被吸附到96孔微量滴定板(Immulon 2，Dynatech Labs)表面。孔用補(bǔ)充10％BSA的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)封閉。封閉緩沖液中的多克隆抗體以各種稀度添加，并使其與結(jié)合的多肽抑制劑于室溫反應(yīng)1小時(shí)。在PBS中洗滌3次后，通過綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗-兔第二抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)進(jìn)行顯色。以1∶2000稀度于封閉緩沖液中添加第二抗體，并于室溫溫育1小時(shí)。在PBS中洗滌3次后，通過添加含有50mM檸檬酸鈉、50mM檸檬酸、1mg/mL鄰-苯二胺和0.006％ H2O2的溶液獲得顯色。在適當(dāng)?shù)娘@色(一般為室溫中溫育5到10分鐘)后，添加50μL 2M硫酸來(lái)終止反應(yīng)并穩(wěn)定產(chǎn)物。使用自動(dòng)ELISA平板讀數(shù)器(Molecular Dynamics，Inc.)，于490nm測(cè)量吸光度?？蛇x擇地，將熒光素化山羊抗-兔第二抗體(Molecular Probes，Inc.)用于ELISA。為了進(jìn)行這些測(cè)定，應(yīng)用了Dynex，Inc.熒光微量滴定板讀數(shù)器，其具有485nm(激發(fā))和510nm(發(fā)射)通帶濾光片設(shè)備。
內(nèi)在色氨酸熒光化學(xué)變性在存在尿素時(shí)，通過經(jīng)由ShimadzuRF5301熒光計(jì)中的內(nèi)在色氨酸熒光(Lakowicz，1983)測(cè)量蛋白解折疊，來(lái)進(jìn)行蛋白抑制劑的穩(wěn)定性測(cè)量。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為295nm和340nm。激發(fā)和發(fā)射單色儀狹縫設(shè)為1.5nm。蛋白(20μM)與增加量的尿素(濃度范圍為0到6.8M)混合，且樣品于室溫溫育10小時(shí)以確保獲得解折疊平衡。相對(duì)熒光根據(jù)關(guān)系式(Pace等人，1989)轉(zhuǎn)化成自由能值ΔG＝-RT ln[(yf-yi)/(yi-yu)] (2)其中yf和yu分別為完全折疊和完全解折疊SEQ ID NO5多肽的相對(duì)熒光值，yi為解折疊的中間物的相對(duì)熒光，T為絕對(duì)溫度，R為氣體常數(shù)。關(guān)系式ΔG對(duì)[尿素]的線性回歸和外推用于在存在變性劑時(shí)測(cè)定自由能值(ΔGH2O)。類似地，根據(jù)下面的關(guān)系式(Pace等人，1989)，從熒光數(shù)據(jù)計(jì)算解折疊蛋白的級(jí)分(Fu)Fu＝(yf-yi)/(Yf-yu) (3)熱變性在Shimadzu RF5301熒光計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)295nm，發(fā)射波長(zhǎng)340nm)中測(cè)量位于25mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM NaCl中的均一性SEQID NO5多肽的內(nèi)在色氨酸熒光。通過攪動(dòng)的水夾套密封石英熒光計(jì)比色皿，其連接到精確到+/-0.1℃的數(shù)字水浴鍋上，來(lái)控制溫度。干燥的氮?dú)獬掷m(xù)沖洗通過樣品隔室來(lái)控制濃縮。溫度改變?cè)O(shè)為以每分鐘0.2℃的速度。在讀取熒光之前使樣品于室溫溫育5分鐘，以確保系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到了熱平衡。從熱實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的熒光值使用上述的等式(3)進(jìn)行歸一化。計(jì)算的Fu值使用下述的等式(4)轉(zhuǎn)換成平衡常數(shù)(KD)KD＝(1-Fu)/Fu(4)通過設(shè)定ln KD＝0，下述的范托夫等式(5)可用于計(jì)算轉(zhuǎn)變溫度(Tm)值，以及轉(zhuǎn)變溫度時(shí)的相應(yīng)焓(ΔHm)(Arnold和Ulbrich-Hofmann，1997)d(ln KD)/d(1/T)＝-ΔH/R (5)如果Gibbs等式中ΔG設(shè)為0，那么可以如下計(jì)算轉(zhuǎn)變溫度時(shí)的熵(ΔSm)ΔSm＝ΔHm/Tm(6)轉(zhuǎn)變溫度區(qū)域的自由能值可從下面的等式計(jì)算ΔG＝-RT ln KD(7)這些自由能值替換到Gibbs-Helmholtz等式(8)中，來(lái)計(jì)算熱容。
ΔG＝ΔHm(1-T/Tm)-ΔCp[(Tm-T)+T ln(T/Tm)](8)最后，根據(jù)下面的等式(9)計(jì)算最大穩(wěn)定性的溫度(Tmax)Tmax＝Tmexp[-ΔHm/ΔCpTm] (9)表面等離子共振將BiaCore，Inc.BiaCore-X表面等離子共振(SPR)裝置用于測(cè)量SEQ ID NO5多肽(也稱作DST蛋白)與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)之間的相互作用。為了這些實(shí)驗(yàn)，羧甲基葡聚糖傳感器芯片(CM-5，Lofas等人，1993)，使用50mM N-羥基琥珀酰亞胺，0.2M N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)-碳二亞胺以每分鐘10μL的流速活化10分鐘。濃度為75ng/μL的SEQ ID NO5多肽，以每分鐘10μL的流速偶聯(lián)到活化的表面10分鐘。通過使1M乙醇胺-HCl以每分鐘10μL的速度流過傳感器表面5分鐘，對(duì)最終表面進(jìn)行滅活。MMP-9以每分鐘20μL的速度流過傳感器表面，濃度范圍為1到100nM。結(jié)合等溫線通過使正向(ka)和反向(kd)速度常數(shù)同時(shí)滿足以下關(guān)系式來(lái)估計(jì)d[DST～MMP-9]/dt＝(ka[DST][MMP-9])-(kd[DST～MMP-9]) (10)(Karlsson和Falt，1997)，其中[DST]、[MMP-9]和[DST～MMP-9]分別為游離SEQ ID NO5多肽(DST)、游離MMP-9和復(fù)合物的濃度。然后平衡親和常數(shù)(KA)定義為KA＝ka/kd(11)等式10合適地根據(jù)SPR信號(hào)(Morton等人，1995)表示為dR/dt＝kaCRmax-(kaC+kd)R(12)其中R為時(shí)間t時(shí)的SPR信號(hào)(反應(yīng)單位，RU)，Rmax為RU中的最大的MMP-9結(jié)合量，C為SEQ ID NO5多肽的濃度。使用來(lái)自的Microcal，Inc.的Origin進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析(O’Shannessy等人，1993)。
實(shí)施例2多肽抑制劑特性分子克隆基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和MMP～TIMP三維結(jié)構(gòu)的分子可視化分析，提供了設(shè)計(jì)SEQ ID NO5多肽的結(jié)構(gòu)信息。SEQ ID NO5多肽的最終氨基酸序列能結(jié)合各種基質(zhì)金屬蛋白酶分子。編碼SEQ ID NO5多肽的SEQ ID NO6核酸，使用了大腸桿菌的密碼子偏倚以使表達(dá)最大化。
構(gòu)建327個(gè)核苷酸的SEQ ID NO6序列需要一系列短寡核苷酸，因?yàn)橐獦?gòu)建長(zhǎng)度超過100個(gè)堿基的核酸在目前是非常困難的。此外，較長(zhǎng)的核酸分子難以有效地雜交。因此，使用一系列的雜交步驟進(jìn)行構(gòu)建。當(dāng)以等摩爾量混合到一起時(shí)，單個(gè)的寡核苷酸(SEQ ID NO8-19)通過“緩慢冷卻”雜交步驟能有效地轉(zhuǎn)變成雙鏈體分子。用數(shù)小時(shí)從95℃緩慢降低溫度，有利于形成短的雙鏈體。
得到的片段包含50到60個(gè)堿基對(duì)的中心雙鏈區(qū)域，其側(cè)面為10個(gè)核苷酸的單鏈末端。這些“粘性末端”可用于驅(qū)動(dòng)全長(zhǎng)核酸的裝配，也是通過雜交。通過于45℃加熱雙鏈體分子的等摩爾混合物10分鐘來(lái)形成全長(zhǎng)核酸。該步驟破壞了末端連接而形成的任何部分形成的雙鏈體結(jié)構(gòu)，但是不破壞完全形成的中心雙鏈體區(qū)域。通過將反應(yīng)試管置于冰上而對(duì)加熱過的材料進(jìn)行“快速冷卻”。該雜交步驟有利于DNA的短區(qū)域雜交(即，10個(gè)堿基的粘性末端)。使用酶T4 DNA連接酶進(jìn)行327bp DNA片段的磷酸二酯主鏈的閉合。
通過PCR擴(kuò)增從得到的片段混合物中選擇全長(zhǎng)核酸。該步驟遠(yuǎn)遠(yuǎn)有效于從瓊脂糖凝膠純化全長(zhǎng)核酸。該步驟也導(dǎo)致了大量用于后續(xù)克隆步驟的材料。通過使用T4 DNA聚合酶制備一個(gè)平頭末端，并使用位于另一個(gè)末端的Hind III來(lái)產(chǎn)生一個(gè)Hind III相容末端，從而制備用于克隆的SEQ ID NO6核酸的末端。這導(dǎo)致了能有效并定向地克隆到蛋白表達(dá)載體中的DNA分子。
圖1顯示了該克隆的結(jié)果。9個(gè)實(shí)驗(yàn)菌落中的3個(gè)包含具有正確插入片段(SEQ ID NO6)的載體?？赏ㄟ^DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)插入片段的正確性；幾個(gè)克隆具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO6的序列。
SEQ ID NO5多肽的物理特性SEQ ID NO5多肽蛋白長(zhǎng)度為108個(gè)氨基酸，而且總分子量為108kDa。使用SwissModel程序，使SEQ ID NO5序列穿過TIMP-2的三維α碳主鏈，來(lái)制備SEQ ID NO5多肽的三維模型。使用ProMod程序把最優(yōu)的穿過結(jié)果轉(zhuǎn)化成包含氨基酸側(cè)鏈位置的三維結(jié)構(gòu)。使這種起始模型進(jìn)行一輪模擬退火以使側(cè)鏈沖突最小化。幾輪SYBYL水平的幾何學(xué)最優(yōu)化使所有的二面角和扭轉(zhuǎn)變成合適的幾何學(xué)。采用的最后一輪能量最低化使用GROMOS96參數(shù)設(shè)置，而不應(yīng)用反應(yīng)場(chǎng)(reaction field)。這些結(jié)果顯示于表4中。最終的模型具有-3534kJ/mol的全部能量，并顯示于圖2。所有的氨基酸殘基都位于允許的Ramachandran空間內(nèi)(數(shù)據(jù)未顯示)，而且沒有空間沖突。
表4同源模型的GROMOS 96能量最低化結(jié)果(只顯示了來(lái)自forcefield的主要參數(shù))。
SEQ ID NO5多肽的幾種特性顯示于表5。
表5SEQ ID NO5多肽的各種特性。
單個(gè)內(nèi)部設(shè)計(jì)的色氨酸對(duì)內(nèi)在熒光實(shí)驗(yàn)有很大的幫助(參見下述)。蛋白設(shè)計(jì)成能形成六鏈的β桶的單個(gè)多肽(圖2)。分子的上部區(qū)域形成了分子扁平結(jié)構(gòu)，其通過在Cys2-Cys73和Cys4-Cys102殘基之間形成二硫鍵而部分結(jié)合到一起(圖2)。該區(qū)域形成了結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)。該區(qū)域側(cè)面為由橫跨Ser31到Lys41殘基的柔性環(huán)形區(qū)域形成的TIMP-2樣臂。通過一系列的氫鍵使環(huán)穩(wěn)定化為主要結(jié)構(gòu)。柔性環(huán)可充當(dāng)TIMP識(shí)別結(jié)構(gòu)域，且分子動(dòng)力學(xué)模擬(數(shù)據(jù)未顯示)表明它移動(dòng)性很大，偏轉(zhuǎn)超過4。SEQ ID NO5多肽的分子尺寸大約為21×18×25(總的分子體積為94553，總的溶劑可到達(dá)表面面積為98672)。
在大腸桿菌中表達(dá)純化的SEQ ID NO5多肽的氨基末端的氨基酸測(cè)序顯示，由于翻譯后修飾在大腸桿菌中除去了N-末端的甲硫氨酸。這種N-末端甲硫氨酸的除去產(chǎn)生了具有下述序列(SEQ ID NO20)的多肽1 CSCSPVHPQ QAFSNADVVI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP41 IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG81 GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPW純化純化來(lái)自大腸桿菌的SEQ ID NO5或SEQ ID NO20多肽，得到了每升誘導(dǎo)的培養(yǎng)物大約5mg的蛋白。表6中描述的純化方案需要大約3天來(lái)完成。SEQ ID NO5/SEQ ID NO20多肽在大腸桿菌中超量生產(chǎn)了大約27倍。雖然在純化實(shí)驗(yàn)過程中，SEQ ID NO5/SEQID NO20多肽只有通過SDS PAGE分析才能觀察到，但是它可用于定義活性單位。該計(jì)算有助于估計(jì)SEQ ID NO5/SEQ ID NO20多肽的產(chǎn)量，而且有助于量化活性。
SEQ ID NO5/SEQ ID NO20多肽作為麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合分離自細(xì)菌的事實(shí)有助于純化方案。因?yàn)镸BP是高可溶性并對(duì)麥芽糖有親和力，所以可以直接表達(dá)和純化該蛋白。通過細(xì)菌的化學(xué)裂解，接著通過離心使裂解物澄清，可有效獲得粗細(xì)菌提取物制劑。從而在單個(gè)步驟中把融合蛋白純化成均一性(圖3，泳道1)。用蛋白酶凝血因子Xa處理該混合物，在大約12小時(shí)獲得了融合產(chǎn)物的完全切割。沒有可檢測(cè)的SEQ ID NO5/SEQ ID NO20蛋白的蛋白水解。最終利用MonoQ離子交換的層析步驟可有效地分離MBP、SEQ ID NO5(SEQ ID NO20)多肽和凝血因子Xa。圖3(泳道2)顯示了從MonoQ柱洗脫后的均一性SEQ ID NO5/SEQ ID NO20多肽的最終制劑。
表6SEQ ID NO5/SEQ ID NO20多肽的純化起始材料為誘導(dǎo)后的5g大腸桿菌。
aSEQ ID NO5多肽的單位定義為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中抑制50％MMP-9蛋白所需的蛋白濃度(μg/mL)。
抗體生產(chǎn)在兔中制備抗SEQ ID NO5多肽的多克隆抗血清。獲得純化的抗體庫(kù)，其能在ELISA反應(yīng)中很容易地檢測(cè)純化的SEQ ID NO5多肽(圖4)。當(dāng)這些抗體被引入到慢性傷口環(huán)境中時(shí)，可用于檢測(cè)并示蹤SEQ ID NO5多肽。抗體庫(kù)使用大約1∶5,000的稀度常規(guī)檢測(cè)SEQID NO5多肽。
基質(zhì)金屬蛋白酶抑制SEQ ID NO5多肽可有效地抑制MMP-9對(duì)熒光素化膠原蛋白的水解。把蛋白添加到正在進(jìn)行的酶反應(yīng)物中時(shí)(圖5)，98％的膠原蛋白水解在45秒滯后期內(nèi)停止。用增加量的SEQ ID NO5多肽滴定MMP-9(圖6)，導(dǎo)致MMP-9以濃度依賴的方式失去水解活性。這些數(shù)據(jù)表明，抑制反應(yīng)是化學(xué)計(jì)量的，這是在后面的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)的觀察結(jié)果(參見下文)。
使用圖6所示的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，獲得MMP酶宿主的抑制常數(shù)(Ki)是可能的。熒光對(duì)時(shí)間圖的瞬時(shí)速度用于構(gòu)建線性Dixon圖，從該圖可能直接解決Ki。該分析假定SEQ ID NO5多肽通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)制發(fā)揮作用。
圖7示例了SEQ ID NO5多肽對(duì)于5種MMP酶的Ki值。所有的酶都在納摩爾范圍內(nèi)有效地被抑制。令人驚訝地，SEQ ID NO5多肽對(duì)MMP-1具有低于對(duì)MMP-9的Ki值(12對(duì)16nM)。不過，測(cè)試的所有基質(zhì)金屬蛋白酶獲得的Ki值都較低，說明SEQ ID NO5多肽能防止在慢性傷口中發(fā)現(xiàn)的所有主要MMP形式的酶活性。
抑制劑穩(wěn)定性圖8提供了SEQ ID NO5多肽的多肽主鏈和選擇的氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)模型。該圖示例了SEQ ID NO5多肽的兩個(gè)重要特征。第一個(gè)是對(duì)分子穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)的3個(gè)二硫鍵的位置(參見下文)。第二個(gè)是用作所有內(nèi)在熒光實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)的單個(gè)色氨酸分子的位置。
SEQ ID NO5多肽以高度協(xié)同的方式解折疊。通過內(nèi)在色氨酸熒光監(jiān)控的平衡解折疊提供了發(fā)射熒光強(qiáng)度總共60％的降低，以及發(fā)射峰最大值向較大波長(zhǎng)移動(dòng)了10nm(數(shù)據(jù)未顯示)。
如實(shí)施例1中所述，把熒光強(qiáng)度發(fā)射光譜轉(zhuǎn)換成解折疊蛋白級(jí)分。圖9顯示了天然SEQ ID NO5多肽的解折疊曲線中的中點(diǎn)，其出現(xiàn)在4.95M的尿素濃度中。解折疊轉(zhuǎn)變開始于4.4M尿素，并在5.4M尿素的變性濃度完成。該數(shù)據(jù)(未顯示)的第一個(gè)派生圖中單峰的存在支持了蛋白變性作為高度協(xié)同的兩種狀態(tài)過程的假說。
把解折疊曲線轉(zhuǎn)化成自由能對(duì)尿素濃度的圖(參見實(shí)施例1)，以及通過不存在尿素時(shí)通過對(duì)自由能的線性回歸進(jìn)行的外推，顯示多肽抑制劑具有7.4kcal mol-1的天然自由能。當(dāng)在變性實(shí)驗(yàn)之前，多肽抑制劑用二硫蘇糖醇進(jìn)行還原時(shí)，穩(wěn)定性明顯降低。然后解折疊轉(zhuǎn)變開始于2.4M尿素，并于4.4M尿素的變性濃度完成，轉(zhuǎn)變中點(diǎn)為2.75M尿素。解折疊過程仍然是高度協(xié)同的、兩種狀態(tài)過程。
還原的SEQ ID NO5多肽具有4.3kcal mol-1的天然自由能。從而SEQ ID NO5多肽中的3個(gè)二硫鍵貢獻(xiàn)了大約3.1kcal mol-1的穩(wěn)定化能量。
SEQ ID NO5蛋白在人類血清中是壽命長(zhǎng)的。在人類血清中溫育SEQ ID NO5多肽，以模擬該多肽暴露于慢性傷口中存在的液體類型中。用人類血漿于室溫溫育SEQ ID NO5多肽超過36小時(shí)導(dǎo)致SEQ ID NO5多肽僅僅降低了9％(圖10)。如果SEQ ID NO5預(yù)先結(jié)合到化學(xué)計(jì)算量的MMP-9上，那么在超過同樣36小時(shí)的過程中，該材料僅僅降低了4％。對(duì)照反應(yīng)，其中SEQ ID NO5多肽溫育于PBS中，溫育36小時(shí)后導(dǎo)致100％的該材料的剩余。通過化學(xué)變性研究進(jìn)一步顯示SEQ ID NO5多肽的穩(wěn)定性。但是血清穩(wěn)定性表明，SEQ ID NO5多肽對(duì)蛋白酶降解不敏感。穩(wěn)定性和蛋白酶抗性在慢性傷口環(huán)境中是重要的。
SEQ ID NO5多肽的熱解折疊轉(zhuǎn)化通過內(nèi)在色氨酸熒光進(jìn)行監(jiān)控。熱轉(zhuǎn)化曲線示于圖11中。SEQ ID NO5多肽的內(nèi)在色氨酸熒光顯示了在25到60℃較小的變異，與低于熱轉(zhuǎn)化點(diǎn)的溫度時(shí)的熱穩(wěn)定天然構(gòu)象一致。在高于60℃的溫度時(shí)，SEQ ID NO5多肽以高度協(xié)同的方式解折疊。熱誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化在該研究中進(jìn)行的加熱/冷卻率時(shí)是完全可逆的(數(shù)據(jù)未顯示)。SEQ ID NO5多肽的熔融性狀是焓過程而不是熵過程。熱力學(xué)穩(wěn)定性參數(shù)如表7所示。
表7熱力學(xué)穩(wěn)定性參數(shù)
SEQ ID NO5多肽作為溫度函數(shù)的穩(wěn)定性使用Gibbs-Helmholtz函數(shù)(等式7)進(jìn)行確定，表示為圖12中的ΔG對(duì)溫度。存在尿素時(shí)，包括通過化學(xué)變性于較低溫度測(cè)定的ΔG值用于比較。這些較低溫度的化學(xué)變性研究也可通過內(nèi)在色氨酸熒光進(jìn)行測(cè)定(參見圖9)。穩(wěn)定性差異在該研究測(cè)量的整個(gè)溫度范圍都持續(xù)。
范托夫圖提供于圖13中，其示例了通過內(nèi)在色氨酸熒光測(cè)定的平衡常數(shù)(KD)。37.8℃的最大穩(wěn)定性計(jì)算溫度，對(duì)將被引入到傷口中或其它生理學(xué)環(huán)境中的肽是理想的。
蛋白-蛋白間的相互作用BioSelect 125凝膠排阻柱上的SEQ ID NO5多肽的層析行為，與預(yù)期的單體蛋白一致。分析型凝膠過濾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖14中。在該實(shí)驗(yàn)中，SEQ ID NO5蛋白比肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物(12kDa)稍晚從柱子上洗脫。洗脫特征與分子量為大約11.8kDa的單體蛋白SEQ ID NO5多肽一致。
計(jì)算的斯托克斯半徑為22。該值與原子模型的尺寸非常一致。洗脫特征表明該蛋白實(shí)際上是基本對(duì)稱的，因?yàn)槠淠Σ料禂?shù)為1.2。但是摩擦系數(shù)為1.2表明SEQ ID NO5多肽具有扁球面特征，其可以表明環(huán)形區(qū)域在決定蛋白的流體動(dòng)力特性上起作用。
在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中確定了SEQ ID NO5多肽與MMP-9之間的復(fù)合物形成。
第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將兩種分子的原子坐標(biāo)文件用作FTDOCK程序(Gabb等人，1977)的輸入值。該程序計(jì)算了兩種分子的分子表面，然后固定一個(gè)分子，并使第二個(gè)分子對(duì)第一個(gè)分子進(jìn)行剛體旋轉(zhuǎn)?？紤]幾何學(xué)和靜電學(xué)因素計(jì)算每個(gè)取向的配合分?jǐn)?shù)。最后提供一系列最好的取向結(jié)構(gòu)用于檢查。這些兩個(gè)分子間最可能的分子締合顯示于圖15。注意SEQ ID NO5多肽與基質(zhì)金屬蛋白酶沿著設(shè)計(jì)者建議的結(jié)合區(qū)域顯著接觸。此外，SEQ ID NO5多肽的柔性環(huán)形區(qū)域也與基質(zhì)金屬蛋白酶有特異性的接觸。對(duì)復(fù)合物所確定的結(jié)構(gòu)測(cè)定用于隱藏了大約3002的SEQ ID NO5多肽表面區(qū)域。
第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，SEQ ID NO5多肽與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)之間的分子締合，使用表面等離子共振技術(shù)直接進(jìn)行測(cè)量。為了進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，MMP-9偶聯(lián)到羧甲基葡聚糖傳感器芯片上。使SEQ ID NO5多肽溶于PBS的溶液自由地流過MMP-9結(jié)合表面。圖16顯示了該相互作用的結(jié)合等溫線。該曲線適于締合-解離模型，其中同時(shí)符合正向(Ka)和反向(Kd)速度常數(shù)。這樣的符合得到了2×105M-1s-1的Ka值和1.3×10-3s-1的Ka值。這得到了平衡親和常數(shù)(KA)1.5×108M-1。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，分析型凝膠過濾用于觀察預(yù)先形成的SEQ ID NO5多肽-MMP-9復(fù)合物。兩種蛋白以化學(xué)計(jì)量混合到一起(1mM)，并于室溫進(jìn)行溫育。30分鐘后，整個(gè)反應(yīng)物注射到BioSelect 125凝膠過濾柱上?；旌衔镆?0kDa表觀分子量的單個(gè)分子量種類從該柱上進(jìn)行洗脫(圖17)。這些數(shù)據(jù)表明，SEQ ID NO5多肽與MMP-9按1∶1的化學(xué)計(jì)量結(jié)合。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將兩種蛋白混合到一起，并立即注射到柱子上以顯示單個(gè)的蛋白洗脫位置。如圖17中所示，在這些條件下，形成了可檢測(cè)量的復(fù)合物。
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所有的出版物和專利都在此引入作為參考，正如其單獨(dú)引入作為參考。本發(fā)明不局限于顯示和描述的精確細(xì)節(jié)，這是因?yàn)閼?yīng)當(dāng)理解可以進(jìn)行很多改變和修飾但仍然在權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)。
序列表<110>Kimberly-Clark Worldwide，Inc.
Stephen Quirk<120>傷口護(hù)理組合物<130>15,420<140>US 10/325,446<141>2002-12-19<160>21<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>207<212>PRT<213>智人<400>1Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Val Pro Pro His Pro Gln20 25 30Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe Val Gly35 40 45Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg Tyr Glu Ile Lys50 55 60Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp65 70 75 80Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe85 90 95His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu100 105 110Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp115 120 125Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr130 135 140Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys145 150 155 160
Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln165 170 175Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg180 185 190Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala195 200 205<210>2<211>220<212>PRT<213>智人<400>2Met Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Arg Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Thr Leu Leu Arg Pro Ala Asp Ala Cys Ser Cys Ser Pro Val20 25 30His Pro Gln Gln Ala Phe Cys Asn Ala Asp Val Val Ile Arg Ala Lys35 40 45Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser Gly Ash Asp Ile Tyr Gly Ash50 55 60Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys65 70 75 80Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Ser Ala85 90 95Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly Gly Lys Lys Glu Tyr Leu Ile100 105 110Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met His Ile Thr Leu Cys Asp115 120 125Phe Ile Val Pro Trp Asp Thr Leu Ser Thr Thr Gln Lys Lys Ser Leu130 135 140Asn His Arg Tyr Gln Met Gly Cys Glu Cys Lys Ile Thr Arg Cys Pro145 150 155 160Met Ile Pro Cys Tyr Ile Ser Ser Pro Asp Glu Cys Leu Trp Met Asp165 170 175Trp Val Thr Glu Lys Asn Ile Asn Gly His Gln Ala Lys Phe Phe Ala180 185 190Cys Ile Lys Arg Ser Asp Gly Ser Cys Ala Trp Tyr Arg Gly Ala Ala195 200 205Pro Pro Lys Gln Glu Phe Leu Asp Ile Glu Asp Pro210 215 220<210>3<211>211
<212>PRT<213>智人<400>3Met Thr Pro Trp Leu Gly Leu Ile Val Leu Leu Gly Ser Trp Ser Leu1 5 10 15Gly Asp Trp Gly Ala Glu Ala Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln20 25 30Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly35 40 45Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile50 55 60Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln65 70 75 80Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu85 90 95Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys100 105 110Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr115 120 125Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn130 135 140Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys145 150 155 160Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly165 170 175Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys180 185 190Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala195 200 205Thr Asp Pro210<210>4<211>224<212>PRT<213>智人<400>4Met Pro Gly Ser Pro Arg Pro Ala Pro Ser Trp Val Leu Leu Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Gly Leu Gly Glu Ala Cys Ser Cys
20 25 30Ala Pro Ala His Pro Gln Gln His Ile Cys His Ser Ala Leu Val Ile35 40 45Arg Ala Lys Ile Ser Ser Glu Lys Val Val Pro Ala Ser Ala Asp Pro50 55 60Ala Asp Thr Glu Lys Met Leu Arg Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Lys Met65 70 75 80Phe Lys Gly Phe Glu Lys Val Lys Asp Val Gln Tyr Ile Tyr Thr Pro85 90 95Phe Asp Ser Ser Leu Cys Gly Val Lys Leu Glu Ala Asn Ser Gln Lys100 105 110Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Gln Val Leu Ser Asp Gly Lys Val Phe Ile115 120 125His Leu Cys Asn Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Asp Leu Ser Leu Va1 Gln130 135 140Arg Glu Ser Leu Asn His His Tyr His Leu Asn Cys Gly Cys Gln Ile145 150 155 160Thr Thr Cys Tyr Thr Val Pro Cys Thr Ile Ser Ala Pro Asn Glu Cys165 170 175Leu Trp Thr Asp Trp Leu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala180 185 190Gln His Tyr Val Cys Met Lys His Val Asp Gly Thr Cys Ser Trp Tyr195 200 205Arg Gly His Leu Pro Leu Arg Lys Glu Phe Val Asp Ile Val Gln Pro210 215 220<210>5<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的多肽抑制劑<400>5Met Cys Ser Cys Ser Pro Val His Pro Gln Gln Ala Phe Ser Asn Ala1 5 10 15Asp Val Val Ile Arg Ala Lys Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser20 25 30Gly Asn Asp Ile Tyr Gly Asn Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile35 40 45Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile50 55 60
Tyr Thr Ala Pro Ser Ser Ala Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly65 70 75 80Gly Lys Lys Glu Tyr Cys Ile Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys85 90 95Met His Ile Thr Leu Cys Asp Phe Ile Cys Pro Trp100 105<210>6<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的多肽抑制劑的核酸序列<400>6atgtgcagct gcagcccggt gcatccgcag caggcgttta gcaacgcgga tgtggtgatt 60cgcgcgaaag cggtgagcga aaaagaagtc gatagcggca acgatattta tggcaacccg120attaaacgca ttcagtatga aattaaacag attaaaatgt ttaaaggccc ggaaaaagat180attgaattta tttataccgc gccgagcagc gcggtgtgcg gcgtgagcct ggatgtgggc240ggcaaaaaag aatattgcat tgcgggcaaa gcggaaggcg atggcaaaat gcatattacc300ctgtgcgatt ttatttgccc gtggtagaag cttatagac 339<210>7<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的多肽抑制劑<220>
<221>SITE<222>7，12，16，18-20，22，24-25，30，36，41，44，48，51，61，64，67，71-72，75，77，79，87-88，91，99，101，105<223>Xaa＝任何脂族氨基酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸<220>
<221>SITE<222>17，27，29，31，35，47，58，60，62，78，84，92，94，103<223>Xaa＝任何酸性氨基酸、天冬氨酸或谷氨酸<220>
<221>SITE
<222>2，4，73，86，102，106<223>Xaa＝任何半胱氨酸樣氨基酸或半胱氨酸<220>
<221>SITE<222>21，23，28，42-43，49，52，55，59，82-83，90，96<223>Xaa＝任何堿性氨基酸、賴氨酸或精氨酸<220>
<221>SITE<222>13，54，63，104<223>Xaa＝任何芳族氨基酸或苯丙氨酸<220>
<221>SITE<222>(1)...(1)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸、甲硫氨酸或無(wú)氨基酸<220>
<221>SITE<222>(53)...(53)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甲硫氨酸<220>
<221>SITE<222>(97)...(97)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甲硫氨酸<220>
<221>SITE<222>(6)...(6)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(9)...(9)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(33)...(33)
<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(38)...(38)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(40)...(40)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(56)...(56)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(57)...(57)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(68)...(68)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(74)...(74)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(80)...(80)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(81)...(81)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE<222>(89)...(89)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(93)...(93)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(95)...(95)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(107)...(107)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸或脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(3)...(3)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(5)...(5)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(10)...(10)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(11)...(11)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE
<222>(14)...(14)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(15)...(15)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(26)...(26)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(32)...(32)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(34)...(34)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(37)...(37)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或酪氨酸<220>
<221>SITE<222>(39)...(39)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(45)...(45)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(46)...(46)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或酪氨酸
<220>
<221>SITE<222>(50)...(50)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(65)...(65)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或酪氨酸<220>
<221>SITE<222>(66)...(66)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(69)...(69)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(70)...(70)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(76)...(76)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(85)...(85)<223>Xaa＝任何極性氨基酸或酪氨酸<220>
<221>SITE<222>(100)...(100)<223>Xaa＝任何極性氨基酸、絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>(8)...(8)<223>Xaa＝任何堿性氨基酸或組氨酸<220>
<221>SITE<222>(98)...(98)<223>Xaa＝任何堿性氨基酸或組氨酸<220>
<221>SITE<222>(108)...(108)<223>Xaa＝色氨酸<400>7Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70 75 80Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa85 90 95Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa100 105<210>8<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>8atgtgcagct gcagcccggt gcatccgcag caggcgttta gcaacgcgga tgtggtgatt 60cgcgcgaaag 70
<210>9<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>9cggtgagcga aaaagaagtc gatagcggca acgatattta tggcaacccg attaaacgca 60ttcagtatga 70<210>10<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>10aattaaacag attaaaatgt ttaaaggccc ggaaaaagat attgaattta tttataccgc 60gccgagcagc 70<210>11<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>11gcggtgtgcg gcgtgagcct ggatgtgggc ggcaaaaaag aatattgcat tgcgggcaaa 60gcggaaggcg 70<210>12<211>59<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成引物<400>12atggcaaaat gcatattacc ctgtgcgatt ttatttgccc gtggtagaag cttatagac 59<210>13<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>13tcgctcaccg ctttcgcgcg aatcaccaca tccgcgttgc taaacgcctg ctgcggatgc 60accgggctgc agctgcacat 80<210>14<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>14ctgtttaatt tcatactgaa tgcgtttaat cgggttgcca taaatatcgt tgccgctatc 60gacttctttt70<210>15<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>15cgcacaccgc gctgctcggc gcggtataaa taaattcaat atctttttcc gggcctttaa 60acattttaat70<210>16
<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>16attttgccat cgccttccgc tttgcccgca atgcaatatt cttttttgcc gcccacatcc 60aggctcacgc 70<210>17<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>17gtctataagc tt ctaccacg ggcaaataaa atcgcacagg gtaatatgc 49<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>18atgtgcagct gcagcccggt 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>19gtctataagc ttctaccacg 20
<210>20<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的多肽抑制劑<400>20Cys Ser Cys Ser Pro Val His Pro Gln Gln Ala Phe Ser Asn Ala Asp1 5 10 15Val Val Ile Arg Ala Lys Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser Gly20 25 30Asn Asp Ile Tyr Gly Asn Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile Lys35 40 45Gln Ile Lys Met Phe Lys Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile Tyr50 55 60Thr Ala Pro Ser Ser Ala Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly Gly65 70 75 80Lys Lys Glu Tyr Cys Ile Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met85 90 95His Ile Thr Leu Cys Asp Phe Ile Cys Pro Trp100 105<210>21<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的多肽抑制劑<220>
<221>SITE<222>7，12，16，18-20，22，24-25，30，36，41，44，48，51，61，64，67，71-72，75，77，79，87-88，91，99，101，105<223>Xaa＝丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸<220>
<221>SITE<222>17，27，29，31，35，47，58，60，62，78，84，92，94，103<223>Xaa＝天冬氨酸或谷氨酸
<220>
<221>SITE<222>3，5，14，26，32，66，69，70，76，100<223>Xaa＝絲氨酸或蘇氨酸<220>
<221>SITE<222>21，23，28，42-43，49，52，55，59，82-83，90，96<223>Xaa＝賴氨酸或精氨酸<220>
<221>SITE<222>33，38，56，74，80，81，89，93，95<223>Xaa＝甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(1)...(1)<223>Xaa＝甲硫氨酸<220>
<221>SITE<222>(53)...(53)<223>Xaa＝甲硫氨酸<220>
<221>SITE<222>(97)...(97)<223>Xaa＝甲硫氨酸<220>
<221>SITE<222>(2)...(2)<223>Xaa＝半胱氨酸<220>
<221>SITE<222>(4)...(4)<223>Xaa＝半胱氨酸<220>
<221>SITE
<222>(73)...(73)<223>Xaa＝半胱氨酸<220>
<221>SITE<222>(86)...(86)<223>Xaa＝半胱氨酸<220>
<221>SITE<222>(102)...(102)<223>Xaa＝半胱氨酸<220>
<221>SITE<222>(106)...(106)<223>Xaa＝半胱氨酸<220>
<221>SITE<222>(8)...(8)<223>Xaa＝組氨酸<220>
221>SITE<222>(98)...(98)<223>Xaa＝組氨酸<220>
<221>SITE<222>(6)...(6)<223>Xaa＝脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(9)...(9)<223>Xaa＝脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(40)...(40)<223>Xaa＝脯氨酸
<220>
<221>SITE<222>(57)...(57)<223>Xaa＝脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(68)...(68)<223>Xaa＝脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(107)...(107)<223>Xaa＝脯氨酸<220>
<221>SITE<222>(10)...(10)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(11)...(11)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(15)...(15)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(34)...(34)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(39)...(39)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE<222>(45)...(45)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(50)...(50)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(13)...(13)<223>Xaa＝苯丙氨酸<220>
<221>SITE<222>(54)...(54)<223>Xaa＝苯丙氨酸<220>
<221>SITE<222>(63)...(63)<223>Xaa＝苯丙氨酸<220>
<221>SITE<222>(104)...(104)<223>Xaa＝苯丙氨酸<220>
<221>SITE<222>(37)...(37)<223>Xaa＝酪氨酸<220>
<221>SITE<222>(46)...(46)<223>Xaa＝酪氨酸<220>
<221>SITE<222>(65)...(65)<223>Xaa＝酪氨酸<220>
<221>SITE<222>(85)...(85)<223>Xaa＝酪氨酸<220>
<221>SITE<222>(108)...(108)<223>Xaa＝酪氨酸<400>21Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70 75 80Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa85 90 95Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa100 10權(quán)利要求
1.一種分離的核酸，其編碼包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO20的多肽。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述的核酸包含SEQ ID NO6。
3.一種分離的核酸，其在嚴(yán)格雜交條件下能與包含SEQ ID NO6的核酸雜交。
4.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO20。
5.權(quán)利要求4的分離的多肽，其中所述的多肽能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性。
6.權(quán)利要求4的分離的多肽，其中所述的多肽在哺乳動(dòng)物血清或血漿中是穩(wěn)定的。
7.權(quán)利要求4的分離的多肽，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
8.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO7或SEQ ID NO21，具有β桶構(gòu)象而且能與基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合。
9.權(quán)利要求8的分離的多肽，其中所述的多肽能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性。
10.權(quán)利要求8的分離多肽，其中所述的多肽在哺乳動(dòng)物血清或血漿中是穩(wěn)定的。
11.權(quán)利要求8的分離多肽，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
12.一種組合物，其包含治療有效量的含有SEQ ID NO5或SEQID NO20的多肽抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的多肽抑制劑能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中任何一種的蛋白酶活性。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的多肽抑制劑能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中的超過一種。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的多肽抑制劑具有β桶構(gòu)象。
16.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的多肽在哺乳動(dòng)物血清中是穩(wěn)定的。
17.權(quán)利要求12的組合物，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
18.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的組合物包含洗劑、凝膠或乳膏。
19.一種組合物，其含有治療有效量的包含SEQ ID NO7或SEQID NO21的多肽抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體，其中所述的多肽抑制劑能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中任何一種的蛋白酶活性。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的多肽抑制劑能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中的超過一種。
21.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的多肽抑制劑具有β桶構(gòu)象。
22.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的多肽抑制劑在哺乳動(dòng)物血清中是穩(wěn)定的。
23.權(quán)利要求19的組合物，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
24.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的組合物包含洗劑、凝膠或乳膏。
25.一種傷口敷料，其含有包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO20的多肽與藥學(xué)上可接受的載體。
26.權(quán)利要求25的傷口敷料，其中所述的多肽能抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶中任何一種的蛋白酶活性。
27.權(quán)利要求25的傷口敷料，其中所述的多肽能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中的超過一種。
28.權(quán)利要求25的傷口敷料，其中所述的多肽具有β桶構(gòu)象。
29.權(quán)利要求25的傷口敷料，其中所述的多肽在哺乳動(dòng)物血清中是穩(wěn)定的。
30.權(quán)利要求25的傷口敷料，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
31.權(quán)利要求25的傷口敷料，其中所述的藥學(xué)上可接受的載體是繃帶。
32.一種傷口敷料，其含有包含SEQ ID NO7或SEQ ID NO21的多肽與藥學(xué)上可接受的載體，其中所述的多肽抑制劑能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶中任何一種的蛋白酶活性。
33.權(quán)利要求32的傷口敷料，其中所述的多肽抑制劑能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中的超過一種。
34.權(quán)利要求32的傷口敷料，其中所述的多肽抑制劑具有β桶構(gòu)象。
35.權(quán)利要求32的傷口敷料，其中所述的多肽抑制劑在哺乳動(dòng)物血清中是穩(wěn)定的。
36.權(quán)利要求32的傷口敷料，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
37.權(quán)利要求32的傷口敷料，其中所述的藥學(xué)上可接受的載體為繃帶。
38.一種治療傷口的方法，其包括對(duì)傷口施用治療有效量的包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO20的多肽。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述的多肽能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶中任何一種的蛋白酶活性。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述的多肽能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中的超過一種。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述的多肽具有β桶構(gòu)象。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述的多肽在哺乳動(dòng)物血清中是穩(wěn)定的。
43.權(quán)利要求38的方法，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
44.一種治療傷口的方法，其包括對(duì)傷口施用治療有效量的包含SEQ ID NO7或SEQ ID NO21的多肽，其中所述的多肽能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶中任何一種的蛋白酶活性。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述的多肽能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-4、基質(zhì)金屬蛋白酶-5、基質(zhì)金屬蛋白酶-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-7、基質(zhì)金屬蛋白酶-8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-10、基質(zhì)金屬蛋白酶-11、基質(zhì)金屬蛋白酶-12或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中的超過一種。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述的多肽具有β桶構(gòu)象。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述的多肽在哺乳動(dòng)物血清中是穩(wěn)定的。
48.權(quán)利要求44的方法，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶構(gòu)象折疊。
全文摘要
本發(fā)明提供了能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的多肽。這些多肽可用于治療傷口，例如，慢性傷口。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1826349SQ200380106681
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者S·奎爾克 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司