專利名稱：一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法及其專用引物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防治、分子診斷和昆蟲學(xué)領(lǐng)域中一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法及其專用引物與應(yīng)用，特別涉及一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法及其專用引物與包括該引物的鑒定松毛蟲赤眼蜂的試劑盒。
背景技術(shù)：
寄生蜂是作物害蟲最重要的死亡因子之一。生物防治最重要的微小卵寄生蜂--赤眼蜂是世界上應(yīng)用面積最廣，防治對象最多的天敵昆蟲，但赤眼蜂種一級的分類依據(jù)主要是雄蜂外生殖器，可是赤眼蜂許多種類在自然條件下僅能見到雌蟲，同時該蜂個體微小(約0.2mm)、形態(tài)難辨，而且其形態(tài)和生理特征易受環(huán)境條件的影響，因此赤眼蜂的準確鑒定一般需要赤眼蜂分類專家才能勝任。
赤眼蜂分子鑒定可以通過構(gòu)建赤眼蜂種穩(wěn)定和具有分類鑒定意義的分子標記來實現(xiàn)。國外報道了利用RAPD技術(shù)鑒別微小寄生蜂(纓小蜂)的遺傳變異性以及采用PCR技術(shù)探測寄主卵的被寄生情況，但都沒能注重研究寄生蜂種特異分子標記的構(gòu)建、篩選和開發(fā)，因此迄今對赤眼蜂種的鑒定只能通過采樣、飼養(yǎng)、取雄峰以及進行傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物。
本發(fā)明所提供的鑒定松毛蟲赤眼蜂引物，是下述核苷酸序列1)正向引物為序列表中的SEQ ID №1，由18個堿基組成，Tm＝56℃，GC％＝55.6；2)反向引物為序列表中的SEQ ID №2，由18個堿基組成，Tm＝52℃，GC％＝44.4。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法。
一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法，是用鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物PCR擴增昆蟲樣品的基因組DNA，擴增產(chǎn)物中檢測到320±5bp條帶的為松毛蟲赤眼蜂；所述鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列正向引物為序列表中的SEQ ID №1，反向引物為序列表中的SEQ ID №2。
所述昆蟲樣品可為成蟲、卵、幼蟲和蛹等其它蟲態(tài)。
所述昆蟲樣品經(jīng)裂解液處理、95℃-100℃熱變性、離心，取上清，即得到所述昆蟲樣品的基因組DNA；所述裂解液可為80-120mmol/L Tris，0.1-0.5mol/L KCl或5-50mmol/L EDTA，pH9-10，優(yōu)選為100mmol/L Tris，0.2mol/L KCl或10mmol/LEDTA，pH9.5。
所述PCR擴增的反應(yīng)體系除含有所述昆蟲樣品的基因組DNA外，還含有PCR預(yù)混液4.5mM[Mg2+]，0.2mM dNTP，上述鑒定松毛蟲赤眼蜂的正、反向引物各2.5mM，DNA聚合酶1U；所述PCR循環(huán)程序為第一循環(huán)95℃3min，隨后進行35個循環(huán)94℃45sec、54℃45sec、72℃45sec；最后一個循環(huán)72℃10min。
本發(fā)明還提供了一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的試劑盒。
本發(fā)明所提供的鑒定松毛蟲赤眼蜂的試劑盒為包括上述鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物的PCR試劑盒。
所述鑒定松毛蟲赤眼蜂的試劑盒還包括以下成分Mg2+，dNTP，DNA聚合酶。
本發(fā)明針對現(xiàn)有微小昆蟲傳統(tǒng)分類鑒定上的困難以及赤眼蜂田間放蜂應(yīng)用上種群監(jiān)測和生防效果評估的現(xiàn)實需要，采用特異分子標記技術(shù)而研制開發(fā)出一種能快速、簡易和準確地鑒定赤眼蜂成蟲(包括雌雄蜂)和其它蟲態(tài)(包括羽化前的卵、幼蟲和蛹)的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法及其專用引物和試劑盒不僅能提高松毛蟲赤眼蜂鑒定的效率和準確性，還能解決松毛蟲赤眼蜂田間釋放應(yīng)用中的種群監(jiān)測和生防效能評價問題。應(yīng)用本發(fā)明所開發(fā)的松毛蟲赤眼蜂鑒定試劑盒，普通人(而非赤眼蜂專家)就能快速準確地鑒定該蜂種，而且不要求完整的蟲體，也不要求雄峰，特別是在該蜂寄生20小時后就能診斷出是否寄生，從而計算出田間或室內(nèi)寄生率。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點A.能早期監(jiān)測田間寄生蜂的種群動態(tài)，特別是能準確估計田間不同寄生蜂的比例。對寄生蜂的早期檢測在生防上具有指導(dǎo)意義，因為早期監(jiān)測能預(yù)知天敵基數(shù)和放蜂數(shù)量以防止浪費；B.時間短PCR檢測僅需2-4h就能對傳統(tǒng)培養(yǎng)法難以處理的樣品作出行之有效的檢測，同時敏感性和特異性高；C.有利于蜂種鑒定在這方面，PCR檢測顯得特別有效，因為它不但可以鑒定活蜂，還可以鑒定已死亡變形的死蜂，這給鑒定工作帶來很大便利。傳統(tǒng)方法一般要求完整的樣本才能作出準確的鑒定。PCR檢測不僅能鑒定成熟期蟲體，還能鑒定其幼蟲期和卵期；鑒定工作不一定需要專家的介入，普通人員即可有效解決；D.生防效果評價對于生防效果的評價，以前的方法顯得不夠準確和迅速。PCR法則可以通過定期檢測，隨時掌握田間赤眼蜂種群動態(tài)；PCR法還可進行早期檢測，及時作出判斷，對進一步的生防措施具有極大指導(dǎo)意義；E.一般情況下，生物有機體死亡后，其體內(nèi)的蛋白系統(tǒng)很快崩潰，而DNA則能相對較長時間地保存下來。這些DNA在某種情況下又會復(fù)活，所以細胞的死亡最可靠的評價指標是其基因(DNA)的完全降解。特別是在許多問題未搞清楚以前，更應(yīng)該以DNA的降解來判定“死與活”。本發(fā)明的方法也為鑒定其它微小昆蟲提供了新思路。


圖1為鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物擴增多頭蜂、單頭蜂及被寄生卵的電泳圖譜圖2為鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物鑒定和檢測田間樣品的電泳圖具體實施方式
實施例1、鑒定松毛蟲赤眼蜂1、設(shè)計可鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物基于松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi ITS-2全序列(兩端包含部分18S和5S序列)(序列表中的SEQ ID №3，由596bp組成，GenBank注冊號AF453558；組成23％A；28％C；26％G；23％T；)，設(shè)計合成了可鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物對正向引物序列如序列表中的SEQ ID №1所示；反向引物序列如序列表中的SEQ ID №2所示。
2、松毛蟲赤眼蜂的鑒定(1)樣品處理分別將單頭或多頭(2-50頭)待測樣品A、B、C、D、E、F、G、H和I(A＝多頭松毛蟲赤眼蜂成蟲；B＝單頭松毛蟲赤眼蜂成蟲；C＝單粒被松毛蟲赤眼蜂寄生的米蛾卵；D＝單粒未被寄生的米蛾卵；E＝單粒未被寄生的亞洲玉米螟(ACB)卵；F＝單頭玉米螟赤眼蜂；G＝單頭擬澳洲赤眼蜂；H＝單頭廣赤眼蜂；I＝單頭甘藍夜蛾赤眼蜂)轉(zhuǎn)移到0.5mlPCR薄壁PCR管，加入10μl 100mmol/LTris裂解液，用微型研杵將樣品徹底研碎，然后置PCR儀98℃熱變性10分，5000g離心10秒，取上清，4℃保存待測；(2)PCR反應(yīng)從步驟(1)處理液中移取2μl加入包含可鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物的PCR反應(yīng)預(yù)混合液，其中含[Mg2+]4.5mM，dNTP 0.2mM，正、反向引物各2.5mM，DNA聚合酶1U，進入PCR循環(huán)程序第一循環(huán)95℃3min，隨后進行35個循環(huán)94℃45sec、54℃45sec、72℃45sec；最后一個循環(huán)72℃10min，4℃保存。將獲得的PCR產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并與標準Marker對比；結(jié)果如圖1所示，表明在多頭松毛蟲赤眼蜂成蟲；單頭松毛蟲赤眼蜂成蟲；單粒被松毛蟲赤眼蜂寄生的米蛾卵中檢測到320bp的特異片段，而其它樣品中未檢測到此特異條帶。
按照上述方法對樣品A’-L’從中國各地采集到的赤眼蜂樣品A’＝黑龍江土頭溝；B’＝廣東廣州；C’＝吉林長春；D’＝湖北武漢1；E’＝陜西長安；F’＝江蘇徐州；G’＝吉林仁和；H’＝河北衡水；I’＝北京延慶；J’＝黑龍江亞布力；K’＝河北武漢2；L’＝湖南長沙進行鑒定，結(jié)果如圖2所示，表明樣品A’、B’、C’、E’、F’、G’、H’、I’、J’和K’中檢測到320bp的特異片段，說明它們?yōu)樗擅x赤眼蜂，這與傳統(tǒng)分類鑒定的結(jié)果一致傳統(tǒng)分類鑒定A’、B’、C’、E’、F’、G’、H’、I’、J’和K’為松毛蟲赤眼蜂，D’和L’分別為甘藍夜蛾赤眼蜂(T.brassicae)和稻螟赤眼蜂(T.japonicum)。
序列表<160>3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcagcagtca agacgaca 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ttaaattcag cgggtggt 18<210>3<211>596<212>DNA<213>松毛蟲赤眼蜂(Trichogramma dendrolimi)
<400>3ttctcgcatc gatgaagaac gcagctaatt gcgcgtcaac ttgtgaactg caggacacat 60gaacatcgac atttcgaacg cacattgcgg tccacggatc tcgttcccgg accacgcctg 120gctgagggtc gtttataaaa acgaacccga ctgctcactc gcaagagaga gcgttgatct 180gggcgctcgt gtctctctgt ctgtctgtct gctgttgtat cctctcttcg agagtgtagc 240agcagcagca gcagcagcag cagtcaagac gacacgtcgc ctcaaacgaa acgcaagaaa 300aatgatgaat tcgttcgtct agctggcgcg cgcgcttacc gcttggagag tactcgttcg 360tcgagtactt ccgatcgttc tgcgtcgagt cccggagctt ctcgcctcgt cgagcagcgg 420accgacgtct agcacacgat caggctcgtc catgattcgg tcattgaacg cgcgcgcgcc 480cctcttaatc gacggccggc tagctcgaaa tttgtgaatg aatctttttt ctcgatcgac 540gacctcagag caggcgagac cacccgctga atttaagcat atcaataagc ggagga 59權(quán)利要求
1.一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列正向引物為序列表中的SEQ ID №1，反向引物為序列表中的SEQ ID №2。
2.一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法，是用鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物PCR擴增昆蟲樣品的基因組DNA，擴增產(chǎn)物中檢測到320±5bp條帶的為松毛蟲赤眼蜂；所述鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列正向引物為序列表中的SEQ ID №1，反向引物為序列表中的SEQ ID №2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述昆蟲樣品為成蟲、卵、幼蟲和蛹。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述昆蟲樣品經(jīng)裂解液處理、95℃-100℃熱變性、離心，取上清，即得到所述昆蟲樣品的基因組DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述裂解液為80-120mmol/L Tris，0.1-0.5mol/L KCl或5-50mmol/L EDTA，pH9-10。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增的反應(yīng)體系除含有所述昆蟲樣品的基因組DNA外，還含有PCR預(yù)混液4.5mM[Mg2+]，0.2mM dNTP，鑒定松毛蟲赤眼蜂的正、反向引物各2.5mM，DNA聚合酶1U；所述鑒定松毛蟲赤眼蜂的正向引物為序列表中的SEQ ID №1，反向引物為序列表中的SEQ ID №2。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR循環(huán)程序為第一循環(huán)95℃ 3min，隨后進行35個循環(huán)94℃ 45sec、54℃ 45sec、72℃ 45sec；最后一個循環(huán)72℃ 10min。
8.一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的試劑盒，它為包括鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物的PCR試劑盒；所述鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列正向引物為序列表中的SEQ ID №1，反向引物為序列表中的SEQ ID №2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法及其專用引物與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物，是下述核苷酸序列1)正向引物是序列表中的SEQ ID №1；2)反向引物是序列表中的SEQ ID №2。鑒定松毛蟲赤眼蜂的方法，是用上述鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物PCR擴增昆蟲樣品的基因組DNA，檢測擴增產(chǎn)物，確定所述昆蟲樣品是否為松毛蟲赤眼蜂。本發(fā)明還提供了一種包括上述鑒定松毛蟲赤眼蜂的引物的PCR試劑盒。本發(fā)明的方法及試劑盒不僅能提高松毛蟲赤眼蜂鑒定的效率和準確性，還能解決松毛蟲赤眼蜂田間釋放應(yīng)用中的種群監(jiān)測和生防效能評價問題，具有重要的理論意義和實際意義。
文檔編號C12Q1/68GK1556222SQ20041000018
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月7日
發(fā)明者沈佐銳, 李正西 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)