一株粉棒束孢h(yuǎn)s05及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株粉棒束孢HS05及應(yīng)用，粉棒束孢的分類命名為Isaria farinose HS05，該菌株于2016年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為：CGMCC No.12247，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。本發(fā)明的粉棒束孢HS05，產(chǎn)孢能力強(qiáng)，對櫟旋木柄天牛幼蟲殺蟲活性強(qiáng)，致死率大于80%。利用該菌株能有效控制櫟旋木柄天牛的種群數(shù)量。另外，該株粉棒束孢對其他林業(yè)害蟲松毛蟲、松褐天牛、美國白蛾等也具有很好的防效，具有很好的推廣應(yīng)用價值。CGMCC No.1224720160509
【專利說明】
-株粉棒束抱HS05及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)防治技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株粉棒束抱(Isaria farinosa) HS05及其菌劑的制備和在防治林業(yè)蟲害中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 林業(yè)有害生物是現(xiàn)代林業(yè)生產(chǎn)中，對林業(yè)產(chǎn)量影響最大的因素，據(jù)國家林業(yè)局資 料，我國現(xiàn)有林業(yè)有害生物8000余種，可造成嚴(yán)重危害的有200多種。自2007年W來，我國林 業(yè)有害生物每年發(fā)生面積均在1.75億畝W上，占林業(yè)災(zāi)害總面積的50.69%，是森林火災(zāi)面 積的數(shù)十倍，年均造成損失1101億元。隨著林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，蟲害的控制與防治越來越 為人們所重視。一些林業(yè)主要發(fā)生的蟲害如松材線蟲病、馬尾松毛蟲、油松毛蟲、美國白蛾、 棟旋木柄天牛等為主要的蟲害。長期W來，防治林業(yè)蟲害所使用的農(nóng)藥大多是化學(xué)殺蟲劑， 且殺蟲劑品種單一，多種害蟲對不少品種已產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性。此外，由于長期大量使用少 數(shù)幾種殺蟲劑，致使±壤中農(nóng)藥殘毒積累，導(dǎo)致環(huán)境污染，破壞了±壤和森林的生態(tài)平衡， 使得林業(yè)蟲害發(fā)生更為頻繁，甚至影響人類的身體健康。因此迫切需要開發(fā)具有不同作用 機(jī)理的、結(jié)構(gòu)新穎、安全有效環(huán)保的殺蟲劑，尤其是"無公害"的生物源殺蟲劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株新的粉棒束抱 服05,該菌株經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生具有強(qiáng)烈地、廣譜地殺死害蟲的產(chǎn)物，該菌株及其代謝產(chǎn)物可 用于制備廣譜殺蟲的生防制劑，用于防治林業(yè)害蟲。本發(fā)明的另一目的是提供上述粉棒束 抱服05的應(yīng)用。
[0004] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] -株粉棒束抱，其分類命名為Isaria farinose HS05,該菌株于2016年5月9日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，其保藏號為:CGMCC No. 12247,保藏 地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0006] 所述的粉棒束抱服05在防治林業(yè)害蟲中的應(yīng)用。
[0007] 所述的粉棒束抱HS05的發(fā)酵產(chǎn)物在防治林業(yè)害蟲中的應(yīng)用。
[000引所述的粉棒束抱HS05的抱子在防治林業(yè)害蟲中的應(yīng)用。
[0009] 所述的粉棒束抱服05在制備用于防治林業(yè)害蟲的生防制劑中的應(yīng)用。
[0010] 所述林業(yè)害蟲包括棟旋木柄天牛(A地rodisium sauteri)、松褐天牛(Monchamus alternatus)、馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus)、美國白蛾曲phantria cunea)。
[0011] 所述生防制劑由W下方法獲得:將所述粉棒束抱HS05用SDAY固體培養(yǎng)基活化后， 挑取少菌絲或抱子種到裝量為搖瓶20%-30%體積的504￥液體培養(yǎng)基中；251：，180以111111振 蕩培養(yǎng)72小時，所獲得的發(fā)酵液為種子液;將種子液轉(zhuǎn)接到滅菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，25Γ， 畑90%，1化:12D，培養(yǎng)7-10天，37°C烘干2-3天后粉碎所獲得的固體即為生防制劑。
[0012] 所述生防制劑由W下方法獲得:將所述粉棒束抱HS05用SDAY固體培養(yǎng)基活化后， 挑取少菌絲或抱子接種到裝量為搖瓶20 %-30 %體積的SDAY液體培養(yǎng)基中；25°C，180r/min 振蕩培養(yǎng)72小時，所獲得的發(fā)酵液為種子液;將種子液轉(zhuǎn)接到滅菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，25 °C，畑90 %，1化：12D，培養(yǎng)7-10天，37 °C烘干3-4天后，采用旋風(fēng)分離發(fā)酵產(chǎn)物，旋風(fēng)分離器 所獲得的粉末狀顆粒即為生防制劑。
[0013] 有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的粉棒束抱服05具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0014] 1)本發(fā)明所提供的粉棒束抱HS05具有強(qiáng)烈的廣譜致病性，對棟旋木柄天牛 (Aphrodisium sauteri)、松褐天牛（Monchamus alternatus)、馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus)、美國白蛾（Hy地antria cunea)效果突出。
[0015] 2)本發(fā)明所提供的粉棒束抱HS05的生防制劑能適應(yīng)較低溫環(huán)境，在5-10°C的低溫 環(huán)境下，該菌依然生長產(chǎn)抱。
【附圖說明】
[0016] 圖1是粉棒束抱服05的培養(yǎng)菌落圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法若無特殊說明，均為常規(guī)方法。所用的材料、試劑 等，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0018] 供試?yán)ハx:對棟旋木柄天牛(A地rodisium sauteri):黃山風(fēng)景區(qū)采集。松褐天牛 (Monchamus alternatus):牆州常山林場采集。馬尾松毛蟲（Den化olimus punctatus):南 京林業(yè)大學(xué)北大山試驗(yàn)基地采集。美國白蛾化y地antria州nea):中國科學(xué)院植保所購買。
[0019] SDAY培養(yǎng)基配方如下：1%酵母浸出粉，4%葡萄糖，1%蛋白腺，加無菌水定量至 100%，如若是固體培養(yǎng)基則加入1.5-2%的瓊脂，121°C滅菌20分鐘。
[0020] 固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:70%麥教，30%谷殼，121°C滅菌20分鐘。
[0021] 實(shí)施例1粉棒束抱服05的分離、鑒定
[0022] 粉棒束抱HS05,是從黃山風(fēng)景區(qū)死亡棟木中的棟旋木柄天牛幼蟲僵蟲上中分離得 到。方法如下：
[0023] 將在黃山采集的帶菌絲的棟旋木柄天牛幼蟲僵蟲，從蟲體身上挑取抱子，轉(zhuǎn)接到 加有抗生素的SDAY培養(yǎng)上，在25Γ條件下培養(yǎng)5天。待在培養(yǎng)基上形成菌落后，挑取菌落中 屯、的菌絲塊，轉(zhuǎn)到新加有抗生素的SDAY培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。將篩選獲得的一株細(xì)菌編 號為服05。
[0024] 1)形態(tài)學(xué)鑒定:將純化后得到的菌株接種到SDAY培養(yǎng)基上，放入25Γ溫箱中培養(yǎng) 5d后拿出，觀察其菌落正面及反面形態(tài)，并用透明膠帶粘取培養(yǎng)皿中的少數(shù)菌絲體，W蒸饋 水作浮載劑，制臨時玻片鏡檢，在蔡司顯微鏡下觀察產(chǎn)抱結(jié)構(gòu)并拍照。
[0025] 經(jīng)過SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)，其菌落形態(tài)、分生抱子梗、瓶梗、分生抱子等的形態(tài)特征如 下：菌落白色圓形，絨狀疏松或拉狀致密，中間凸起或略凸起，邊緣整齊或銀齒狀，反面黃 色、淺黃色或橘黃色，菌絲有隔，透明，光滑。分生抱子梗柱狀，基部膨大，向上變細(xì)，單生或 由3~5個瓶梗組成的輪生體的分枝。分生抱子楠圓形、圓形，光滑，透明或略著色，分生抱子 念珠狀、長鏈狀或疊瓦狀排成斜鏈，如圖1所示。
[00%] 2)分子生物學(xué)鑒定：
[0027] 服05菌株總DM的提取方法參照OMEGA bio-tek的化ngal DM Kit(50)試劑盒，得 至順取的DM樣本；W提取的菌株總DM作為基因擴(kuò)增模版，采用真菌ITS通用引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化并經(jīng)行DNA測序后，該序列如SEQ ID NO. 1所示。與GenBank中所有已 測定的真核生物的ITS序列比較同源性，構(gòu)建HS05菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明HS05菌株與 GZU4718(Isa;ria farinosa)聚為一類，并且其形態(tài)特征符合（Isaria farinosa)的特征，所 W可W鑒定服05菌株為Isaria farinosa，名為粉棒束抱服05。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] WSDAY培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，高壓滅菌后制成平板，在各平板中央移入(p=4mm的 目的生防菌的菌餅。分別在51：、101：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：共6個不同溫度梯度下培養(yǎng)，每 個重復(fù)4個平板，共3個重復(fù)，5d和lOd后取出，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算結(jié)果如表1。
[0030] 表1HS05菌株不同溫度環(huán)境菌落生長速度測定結(jié)果 「nmi 1
[0032] 結(jié)果表明，粉棒束抱HS05在5°C~30°C溫度下都能生長，最佳生長溫度為25°C，由 數(shù)據(jù)可W看出，該菌在5°C~10°C低溫環(huán)境下依然可W長出菌絲，結(jié)合林區(qū)氣候，該菌能夠 在林區(qū)定殖。
[0033] 實(shí)施例3
[0034] WSDAY培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，高壓滅菌后制成平板，在各平板中央移入φ=4ιιιηι的 目的生防菌的菌餅。分別在51：、101：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：共6個不同溫度梯度下培養(yǎng)，每 個重復(fù)4個平板，共3個重復(fù)，7d后取出，完全刮取平板上生長的菌絲，放入Ξ角瓶中，加50mL 無菌水在磁力攬拌器中打散，濾去菌絲，制成新鮮的抱子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板測量抱子 數(shù)，計(jì)算結(jié)果如表2。
[0035] 表2HS05菌株不同溫度環(huán)境菌落生長速度測定結(jié)果 Γ003Α1
[0037] 結(jié)果表明，粉棒束抱HS05 7d后不同溫度下平板產(chǎn)抱量差距很大，最佳培養(yǎng)溫度為 25°C左右，30°C其次，可W看出，在5~10°C的低溫環(huán)境下，該菌依然生長產(chǎn)抱，雖產(chǎn)抱量不 大，但是具有一定的抗寒性?？紤]到自然環(huán)境下，山區(qū)的氣溫普遍偏低，所w該菌作為生物 農(nóng)藥制劑，有一定的實(shí)際作用價值。
[003引實(shí)施例4
[0039] 將粉棒束抱服05在25°CSDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，完全刮取平板上生長的菌絲，放 入Ξ角瓶中，加0.05%吐溫-80溶液在磁力攬拌器中打散，濾去菌絲，制成新鮮的抱子懸浮 液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后配成濃度為1 X 1〇8抱子/mL抱子懸浮液待用。
[0040] 供試棟旋木柄天牛(Aphrodisium sauteri)幼蟲從安徽黃山風(fēng)景區(qū)采集于因棟旋 木柄天牛病致死的棟木中，劈出其中的棟旋木柄天牛幼蟲幼蟲，在新鮮的青岡棟木屑中飼 養(yǎng)7天后，挑取低齡、體長相近活力較強(qiáng)的幼蟲待用。
[0041 ] 供試松褐天牛(Monchamus alternatus)幼蟲從安徽牆州常山林場伐取因松材線 蟲病致死的馬尾松，劈出其中的松墨天牛幼蟲，在新鮮的木屑中飼養(yǎng)3天后，挑取5~6齡、體 長相近活力較強(qiáng)的幼蟲待用，其平均體長為30mm。
[0042] 供試美國白蛾化yphantria cunea)幼蟲由中國科學(xué)院植保所購買，購回后飼養(yǎng)1 天，選取2~3齡的活力較強(qiáng)的幼蟲待用，飼料由中國科學(xué)院植保所提供，滅菌后使用。
[0043] 供試馬尾松毛蟲化en化olimus punc化化S)幼蟲從南京林業(yè)大學(xué)北大山試驗(yàn)基地 的馬尾松上采集中，選取健康的馬尾松毛蟲幼蟲，在新鮮的馬尾松針葉上飼養(yǎng)3天后，挑取 體長相近活力較強(qiáng)的幼蟲待用。
[0044] 采用浸潰法接種，將試蟲在1 X 105抱子/mL抱子懸浮液中浸潰5s進(jìn)行接種，對照浸 潰0.05%吐溫-80溶液，接種12頭，每次實(shí)驗(yàn)3個重復(fù)，接種后的幼蟲置于25°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光 飼養(yǎng)，飼養(yǎng)濕度為90 %，第5d開始，每天定時觀察、記錄各處理的具體死亡情況，并將死亡幼 蟲放在放有己滅菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)在25°C用保濕棉球保濕培養(yǎng)，記錄死亡幼蟲所接種的 菌株及致死率，計(jì)算結(jié)果如表3。
[0045] 死亡率計(jì)算公式：
[0049] 結(jié)果表明，粉棒束抱HS05對所測試的幾種害蟲均具致病性，對棟旋木柄天牛、美國 白蛾的致死率超過70%。對馬尾松毛蟲，松褐天牛的致死率高于50%。
[0050] 表3服05〔61〇：齡.7996括抗真菌活性的測定結(jié)果
[0化1 ]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株粉棒束孢，其分類命名為Isaria /ari/3〇se HS05,該菌株于2016年5月9日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為:CGMCC No. 12247，保藏地 址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。2. 權(quán)利要求1所述的粉棒束孢HS05在防治林業(yè)害蟲中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的粉棒束孢HS05的發(fā)酵產(chǎn)物在防治林業(yè)害蟲中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的粉棒束孢HS05的孢子在防治林業(yè)害蟲中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的粉棒束孢HS05在制備用于防治林業(yè)害蟲的生防制劑中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述林業(yè)害蟲包括櫟旋木柄天牛、松褐天 牛、馬尾松毛蟲、美國白蛾。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述生防制劑由以下方法獲得： 將所述粉棒束孢HS05用SDAY固體培養(yǎng)基活化后，挑取少菌絲或孢子種到裝量為搖瓶 20%-30%體積的SDAY液體培養(yǎng)基中；25°C，180r/min振蕩培養(yǎng)72小時，所獲得的發(fā)酵液為種 子液;將種子液轉(zhuǎn)接到滅菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，25°C，RH90%，12L: 12D，培養(yǎng)7-10天，37 °C烘 干2-3天后粉碎所獲得的固體即為生防制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述生防制劑由以下方法獲得： 將所述粉棒束孢HS05用SDAY固體培養(yǎng)基活化后，挑取少菌絲或孢子接種到裝量為搖瓶 20%-30%體積的SDAY液體培養(yǎng)基中；25°C，180r/min振蕩培養(yǎng)72小時，所獲得的發(fā)酵液為種 子液;將種子液轉(zhuǎn)接到滅菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，25°C，RH90%，12L: 12D，培養(yǎng)7-10天，37 °C烘 干3-4天后，采用旋風(fēng)分離發(fā)酵產(chǎn)物，旋風(fēng)分離器所獲得的粉末狀顆粒即為生防制劑。
【文檔編號】A01N63/04GK106010985SQ201610476131
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】周立峰, 陳鳳毛, 吳小扁, 王文秀
【申請人】南京林業(yè)大學(xué)