專利名稱：一種檢測(cè)鑒定支原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物的檢測(cè)鑒定方法，特別是支原體的檢測(cè)鑒定方法，具體涉及使用新的支原體種特異性探針結(jié)合反向線點(diǎn)雜交(Reverse Line Blot Hybridisation)方法檢測(cè)和鑒定十種常見(jiàn)細(xì)胞污染和致病支原體。

背景技術(shù)：
支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、制藥工業(yè)和生物制劑生產(chǎn)中常見(jiàn)的問(wèn)題，它能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗和生物產(chǎn)品質(zhì)量下降。在不同實(shí)驗(yàn)室的報(bào)道中，15％-85％的細(xì)胞培養(yǎng)中存在支原體污染。在目前已知的20多種細(xì)胞污染支原體中，精氨酸支原體(Mycoplasma arginin)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)、豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)，口腔支原體(Mycoplasma orale)和萊氏無(wú)膽甾原體(Acholeplasma laidlawii)是最常見(jiàn)的。在細(xì)胞培養(yǎng)中，95％以上的支原體污染是由這五種支原體污染所致。生殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)、人型支原體(Mycoplasma hominis)、微小脲原體(Ureaplasma parvum)、解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)是五種臨床常見(jiàn)的致病支原體。生殖道支原體、人型支原體、微小脲原體和解脲脲原體寄生于人體泌尿道和生殖道，在臨床上它們能導(dǎo)致非淋菌性尿道炎、宮頸炎、不孕和不育等一系列疾病。肺炎支原體是導(dǎo)致人類尤其是兒童肺炎的病原體之一。由于支原體形態(tài)微小和生長(zhǎng)緩慢，它們的感染不易在臨床和實(shí)驗(yàn)室中被早期診斷、鑒定。且支原體種類繁多，約120多種。傳統(tǒng)的支原體診斷方法主要有支原體培養(yǎng)、支原體DNA熒光染色、核酸分子雜交和支原體種特異多聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)等方法。PCR方法是目前最常用的診斷方法(參考文獻(xiàn)Kong，F(xiàn).等2001.Species-specific PCR for identification of commoncontaminant mollicutes in cell culture.Appl.Environ.Microbiol.673195-3200)，但使用PCR檢測(cè)、鑒定多種支原體存在耗時(shí)長(zhǎng)、重復(fù)步驟多的缺點(diǎn)。目前沒(méi)有一個(gè)快速的、同時(shí)檢測(cè)多種支原體，且靈敏、特異性高和成本低的方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的檢測(cè)鑒定支原體的方法，使其具有能同時(shí)檢測(cè)鑒定多種支原體，且具有快速、靈敏、特異性高和成本低等特點(diǎn)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明提供的檢測(cè)鑒定支原體的方法，包括下列步驟 (1)提取待測(cè)樣品的DNA； (2)使用經(jīng)標(biāo)記的支原體通用引物，以PCR方法擴(kuò)增待測(cè)樣品之DNA； (3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與定位標(biāo)記在尼龍膜上的支原體種特異性探針雜交； (4)顯示和判別雜交結(jié)果。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案，包括設(shè)計(jì)出診斷支原體種的特異性探針和反向線點(diǎn)雜交。
在支原體屬中，它們的16S-23S rRNA間隔區(qū)的核酸序列是目前已知的最具支原體種間差異的核酸序列(參考文獻(xiàn)Harasawa，R.等.2000.Comparison of the 16S-23S rRNAintergenic spacer regions among strains of the Mycoplasma mycoides cluster，and reassessmentof the taxonomic position of Mycoplasma sp.bovine group 7.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.50 Pt31325-1329)。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中，尚無(wú)人在這一區(qū)域設(shè)計(jì)診斷支原體種的特異性探針。
反向線點(diǎn)雜交是建立在DNA多聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)基礎(chǔ)上的雜交鑒定方法。此方法最早應(yīng)用于結(jié)核的分種鑒定中(參考文獻(xiàn)Aranaz，A等.1996.Spoligotyping ofMycobacterium biovis strains from cattleand other animalsa tool for epidemiology oftuberculosis.J.Clin.Microbiol.342734-2740.)。它的優(yōu)點(diǎn)在于能靈敏、快速進(jìn)行微生物的分種、分型鑒定。因此我們?cè)O(shè)計(jì)支原體新的種特異性探針并結(jié)合反向線點(diǎn)雜交方法，建立一種新的、快速檢測(cè)鑒定多種支原體方法，為實(shí)驗(yàn)室和臨床工作提供有力的幫助，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
在支原體16S-23S rRNA間隔區(qū)設(shè)計(jì)、合成不同支原體種的特異性探針，5’端氨基酸標(biāo)記，將特異性探針標(biāo)記在尼龍膜上。再設(shè)計(jì)、合成前述常見(jiàn)十種支原體的16S-23S rRNA間隔區(qū)公共引物，5’端生物素標(biāo)記。使用標(biāo)記有生物素的公共引物擴(kuò)增十種常見(jiàn)的支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA。將PCR產(chǎn)物與定位標(biāo)記在尼龍膜上的支原體種特異性探針結(jié)合。在尼龍膜上加入顯影劑，顯影劑和PCR產(chǎn)物上標(biāo)記的生物素結(jié)合，激發(fā)熒光，使x光底片曝光，如有黑點(diǎn)，表示結(jié)果為陽(yáng)性，并通過(guò)底片上不同位置顯現(xiàn)的黑點(diǎn)鑒定支原體種；如無(wú)黑點(diǎn)，表示結(jié)果為陰性。
本發(fā)明提供的檢測(cè)鑒定支原體的方法，能敏感、快速檢測(cè)鑒定支原體，在2天時(shí)間內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)、鑒定多種支原體。這種方法的敏感性和特異性不低于目前常用的支原體PCR檢測(cè)方法，且一次可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)45個(gè)樣本，而探針標(biāo)記的尼龍膜可反復(fù)使用20次左右，即一張?zhí)结槝?biāo)記的尼龍膜可足夠檢測(cè)900個(gè)樣本，從而大大降低每一個(gè)樣本的檢測(cè)成本。
本發(fā)明的另一個(gè)任務(wù)是提供一種檢測(cè)鑒定支原體的試劑盒，其特征在于它含有 容器； 本發(fā)明提供的用于擴(kuò)增支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA的通用引物； 至少一種具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述堿基序列的支原體種特異性探針； 以及使用說(shuō)明。
該試劑盒還可含有PCR反應(yīng)所需要的試劑。



圖1為本發(fā)明支原體檢測(cè)鑒定方法底片暴光顯色結(jié)果。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例 使用的儀器有-20℃和4℃冰箱，常溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))，PCR儀(Eppendorf公司，德國(guó))，Miniblotter(Immunetic公司，美國(guó))，雜交箱(Thermo公司，美國(guó))，暗盒。
使用的試劑有羅氏呼吸道標(biāo)本DNA提取試劑盒(羅氏診斷試劑公司，美國(guó))，Taq酶，dNTP，10×PCR buffer，超凈水，0.5M NAHCO3(PH8.4)，0.1M NaOH，16％w/v 1Ethyl-3-(3 Dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDAC)(Sigma公司，美國(guó))，20×SSPE(0.2MNa2HPO4，3.6M NaCl，20mMEDTA，PH7.4)，2×SSPE/0.1％SDS，2×SSPE/0.5％SDS，2×SSPE，1％SDS，20mM EDTA，Biodyne C尼龍膜(Immunetic公司，美國(guó))，Streptavidin-peroxidase conjugate(羅氏診斷試劑公司，美國(guó))，Enhancedchemiluminescence(ECL)顯影劑(Amersham公司，英國(guó))，X光片(Amersham公司，英國(guó))。
操作步驟 一、使用羅氏呼吸道標(biāo)本DNA提取試劑盒提取DNA 將待測(cè)樣品在常溫下以13000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除上清液，保留10μl液體，加入500μl洗液(由羅氏呼吸道標(biāo)本DNA提取試劑盒配備)，混勻；再以13000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除上清液，加入50μl，在60℃孵育45分鐘，最后加入50μl平衡液(由羅氏呼吸道標(biāo)本DNA提取試劑盒配備)，混勻，將DNA提取液保存于-20℃，備用。
二、使用巢式PCR擴(kuò)增支原體16S-23S rRNA間隔區(qū) 本發(fā)明設(shè)計(jì)了兩對(duì)通用引物，即SPS1，SPA2；SPS2，SPA1，擴(kuò)增十種支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)。SPS1，SPA2為外引物；SPS2，SPA1為內(nèi)引物。SPS2和SPA1的5’端給予生物素標(biāo)記，如使用羧基丁二亞酰胺酯(biotinyl N hydroxy succinimide ester，BNHS)標(biāo)記。該引物由Sigma公司合成，其序列如下 外引物 SPS15’-CCCTACGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCT-3’(SEQ ID NO1) SPA25’-CSDDGCWTWTCGSWGDTWRDYVCGTCCTTCATCG-3’(SEQ IDNO4) 內(nèi)引物 SPS25’-CGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCTTTC-3’(SEQ ID NO2) SPA15’-CGTCCTTCATCGMCTNTYYDGWSCCAAGGCATYCAC-3’(SEQ IDNO3) PCR方案是第一次擴(kuò)增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、65℃10秒、74℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；第二次擴(kuò)增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、70℃10秒、74℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)。取20μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于反向線點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)。
三、反向線點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn) (一)標(biāo)記探針 使用的十種支原體種特異性探針序列如下，5’端給予hexylamino標(biāo)記，由Sigma公司合成 發(fā)酵支原體1A 5’-CCC ATA AAA AAG CCA CAT AAC-3’(SEQ ID NO5) 發(fā)酵支原體2S 5’-CAT CAT AAC AAA CTA TAA CAA TAG GAA-3’(SEQ ID NO6) 精氨酸支原體1A5’-AAA GAA CAA ATT GAG AGA TAG GTC-3’(SEQ ID NO 7) 精氨酸支原體2S5’-CAA TAG GTC TTA TAC TAC TAT TAA ACA AGA T-3’(SEQ ID NO8) 口腔支原體1A 5’-GAA TAT TGG GCC ATT AAC TAT TT-3’(SEQ ID NO9) 口腔支原體2S 5’-CAA TAG GTC AAA AAT ACT TAT ACG TAA-3’(SEQ ID NO10) 豬鼻支原體1A 5’-CTA GAC ACG AAT CGA TTA TGT AAT-3’(SEQ ID NO 11) 豬鼻支原體2S 5’-AAC GAT CTT TTT TAT AAC CGA G-3’(SEQ ID NO12) 人型支原體1A 5’-CAA AGA ACC GAG AGA TAA ATC T-3’(SEQ ID NO13) 人型支原體2S 5’-CAA TAG GTC ATA CAA TTA ACA AAA C-3’(SEQ ID NO14) 肺炎支原體1A 5’-ACC GAT AAA TAA ATG GAT TTT G-3’(SEQ ID NO15) 肺炎支原體2S 5’-ACA TTT CCG CTT CTT TCA A-3’(SEQ ID NO16) 生殖道支原體1A5’-CAC CGA AAA AAT TAA TGG G-3’(SEQ ID NO17) 生殖道支原體2S5’-AAG AAT GTT TTT GAA CAG TTC TTT-3’(SEQ ID NO 18) 解脲脲原體1A 5’-GGC TAA TAT TCA CAT GGA TTT TTA TA-3’(SEQ ID NO19) 解脲脲原體2S 5’-AAA TAT TTC AAA AGT TCA TAT GGT C-3’(SEQ ID NO20) 萊氏無(wú)膽甾原體1A 5’-AAG TGT TAG TTA GCC TTT CTC CT-3’(SEQ ID NO21) 萊氏無(wú)膽甾原體2S 5’-AAA TGA TGT CTG AAA AGA AAT AAG-3’(SEQ ID NO 22) 微小脲原體1A 5’-GGC TTA TAT TCA TAT GGA TTT TAA TA-3’(SEQ ID NO23) 微小脲原體2S 5’-TAT TTT TAA AAA TTC ATA TGG TCG-3’(SEQ ID NO 24) 1.使用0.5M NaHCO3(PH8.4)分別稀釋上述十種支原體種特異性探針至適宜濃度，(稀釋和適宜濃度的確定方法參見(jiàn)Vinje J，Koopmans MP.Simultaneous detectionand genotyping of″Norwalk-like viruses″by oligonucleotide array ina reverse line blot hybridization format.J Clin Microbiol.2000Jul；38(7)2595-601.)； 2.將Biodyne C尼龍膜裁剪為15×15厘米大??； 3.室溫下，16％w/v 1 Ethyl-3-(3 Dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDAC)孵育BiodyneC尼龍膜10分鐘； 4.去離子水漂洗Biodyne C尼龍膜1分鐘； 5.將Biodyne C尼龍膜放入Miniblotter中，蓋緊，吸除尼龍膜表面液體； 6.將十種己稀釋的支原體探針各取150μl分別依次加入Miniblotter槽的不同槽中，室溫下孵育5分鐘； 7.吸除尼龍膜表面液體； 8.打開(kāi)Miniblotter，取出尼龍膜，將尼龍膜放入0.1M NaOH液中滅活9分鐘； 9.100ml 2×SSPE漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘； 10.使用60℃2×SSPE/0.5％SDS液漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘； 11.在室溫下用200ml 20mM EDTA液清洗Biodyne C尼龍膜20分鐘； 12.將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，密封保存于4℃冰箱中，備用。
(二)反向線點(diǎn)雜交 1.將每一樣本的20μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和150μl 2×SSPE/0.1％SDS混勻加入EP管中，加熱至100℃10分鐘，將EP管快速放置于冰上； 2.用250ml 60℃2×SSPE/0.1％SDS液漂洗已標(biāo)記探針的Biodyne C尼龍膜5分鐘； 3.將洗后的Biodyne C尼龍膜放置于Miniblotter中，吸除尼龍膜表面液體； 4.在Miniblotter槽中分別依次加入150μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2×SSPE/0.1％SDS混液(其方向與探針?lè)较虼怪?，放入60℃雜交箱雜交60分鐘； 5.吸除Biodyne C尼龍膜表面液體； 6.從Miniblotter中取出Biodyne C尼龍膜。用250ml 60℃2×SSPE/0.5％SDS液洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次10分鐘； 7.將洗后的Biodyne C尼龍膜放入滾筒中，加入10ml 2×SSPE/0.5％SDS和1/5000Streptavidin-peroxidase conjugate混合液，在42℃雜交45分鐘； 8.用250ml 42℃2×SSPE/0.5％SDS液洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次10分鐘； 9.室溫下用250ml 2×SSPE液洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次5分鐘； 10.加入20ml Enhanced chemiluminescence(ECL)顯影劑于Biodyne C尼龍膜上，室溫孵育1分鐘； 11.將Biodyne C尼龍膜放入暗盒中，在暗盒中放入X光片，曝光5分鐘，洗片，觀察結(jié)果相應(yīng)探針區(qū)域顯現(xiàn)黑色圓點(diǎn)為陽(yáng)性，說(shuō)明有與探針相應(yīng)的支原體；如果相應(yīng)探針區(qū)域不顯現(xiàn)色則為陰性，說(shuō)明沒(méi)有與探針相應(yīng)的支原體。
將Biodyne C尼龍膜用80℃250ml 1％SDS洗兩次，每次30分鐘，再用200ml 20mMEDTA液清洗Biodyne C尼龍膜15分鐘，將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，密封保存于4℃冰箱中，可備下次使用。
用本發(fā)明支原體反向線點(diǎn)雜交方法檢測(cè)19株支原體ATCC標(biāo)準(zhǔn)株，包括M.hyorhinisATCC 17981，發(fā)酵支原體ATCC 19989，萊氏無(wú)膽甾原體ATCC 23206，肺炎支原體ATCC 29342(M129)，生殖器支原體ATCC 33530，14株微小脲原體和解脲脲原體ATCC標(biāo)準(zhǔn)株。同時(shí)也檢測(cè)了分別從澳大利亞和北京分離的精氨酸支原體、口腔支原體、人型支原體各一株。結(jié)果顯示使用支原體反向線點(diǎn)雜交方法能準(zhǔn)確的檢測(cè)19株支原體ATCC標(biāo)準(zhǔn)株及精氨酸支原體、口腔支原體、人型支原體各一分離株。(見(jiàn)附圖，在附圖中，對(duì)于微小脲原體和解脲脲原體，僅顯示微小脲原體以血清型3及解脲脲原體血清型8檢測(cè)結(jié)果)。
用支原體種PCR和用本發(fā)明支原體反向線點(diǎn)雜交方法同時(shí)檢測(cè)180個(gè)臨床樣本，包括80個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物樣本，86個(gè)泌尿、生殖道分泌物樣本，14個(gè)呼吸道分泌物樣本(表1、表2)，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示在臨床樣本檢測(cè)中，用支原體種特異性PCR和用本發(fā)明支原體反向線點(diǎn)雜交檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果是一致的。
表1細(xì)胞培養(yǎng)物中使用兩種方法檢測(cè)支原體結(jié)果比較 物種名稱及例數(shù)反向線點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果種特異性PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)酵支原體13例精氨酸支原體24例口腔支原體9例豬鼻支原體16例發(fā)酵支原體和精氨酸支原體5例發(fā)酵支原體、精氨酸支原體和口腔支原體2例精氨酸支原體和口腔支原體4例口腔支原體和豬鼻支原體7例總計(jì) 13例陽(yáng)性 24例陽(yáng)性 9例陽(yáng)性 16例陽(yáng)性 5例陽(yáng)性 2例陽(yáng)性 4例陽(yáng)性 7例陽(yáng)性 80例陽(yáng)性 13例陽(yáng)性 24例陽(yáng)性 9例陽(yáng)性 16例陽(yáng)性 5例陽(yáng)性 2例陽(yáng)性 4例陽(yáng)性 7例陽(yáng)性 80例陽(yáng)性 表2泌尿、生殖道、呼吸道分泌物樣本中使用兩種方法檢測(cè)支原體結(jié)果比較物種名稱及例數(shù) 反向線點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果 種特異性PCR檢測(cè)結(jié)果肺炎支原體14例14例陽(yáng)性14例陽(yáng)性生殖道支原體6例微小脲原體60例解脲脲原體20例總計(jì)6例陽(yáng)性60例陽(yáng)性20例陽(yáng)性100例陽(yáng)性6例陽(yáng)性60例陽(yáng)性20例陽(yáng)性100例陽(yáng)性 通過(guò)支原體種特異性PCR檢測(cè)方法和支原體反向線點(diǎn)雜交方法檢測(cè)臨床樣本的結(jié)果比較可以看出，本發(fā)明方法及所設(shè)計(jì)的支原體種特異性探針能靈敏、特異的檢測(cè)和鑒定支原體。本發(fā)明支原體反向線點(diǎn)雜交方法敏感性和特異性與支原體種特異性PCR檢測(cè)方法是相同的，此方法的優(yōu)勢(shì)在于能在短時(shí)間內(nèi)(2天)同時(shí)檢測(cè)多種支原體，而PCR方法則需要反復(fù)多次才能確定每一種支原體，說(shuō)明本發(fā)明是一種具有能同時(shí)檢測(cè)鑒定多種支原體，且具有快速、靈敏、特異性高和成本低的支原體檢測(cè)方法。
序列表
<110>武漢市第一醫(yī)院
<120>一種支原體的檢測(cè)鑒定方法
<130>
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>1
ccctacgrga acgtggggvt ggawyacctc ct32
<210>2
<211>30
<212>DNA
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cgrgaacgtg gggvtggawy acctcctttc 30
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>合成的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>n＝a或g或c或t
<400>3
cgtccttcat cgmctntyyd gwsccaaggc atycac36
<210>4
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<212>DNA
<213>合成的引物
<400>4
csddgcwtwt cgswgdtwrd yvcgtccttc atcg 34
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)
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cccataaaaa agccacataa c21
<210>6
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<212>DNA
<213>發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)
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caataggtct tatactacta ttaaacaaga t 31
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>口腔支原體(Mycoplasma orale)
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gaatattggg ccattaacta ttt 23
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<212>DNA
<213>口腔支原體(Mycoplasma orale)
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<213>豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)
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<211>22
<212>DNA
<213>豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)
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<211>22
<212>DNA
<213>人型支原體(Mycoplasma hominis)
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caaagaaccg agagataaat ct 22
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<212>DNA
<213>人型支原體(Mycoplasma hominis)
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caataggtca tacaattaac aaaac25
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<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)
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accgataaat aaatggattt tg 22
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<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)
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<211>19
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<213>生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)
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<213>解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)
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ggctaatatt cacatggatt tttata 26
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<212>DNA
<213>解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)
<400>20
aaatatttca aaagttcata tggtc25
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>萊氏無(wú)膽甾原體(Acholeplasma laidlawii)
<400>21
aagtgttagt tagcctttct cct 23
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>萊氏無(wú)膽甾原體(Acholeplasma laidlawii)
<400>22
aaatgatgtc tgaaaagaaa taag 24
<210>23
<211>26
<212>DNA
<213>微小脲原體(Ureaplasma parvum)
<400>23
ggcttatatt catatggatt ttaata 26
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>微小脲原體(Ureaplasma parvum)
<400>24
tatttttaaa aattcatatg gtcg 2權(quán)利要求
1.一種支原體的檢測(cè)鑒定方法，其特征在于包括下列步驟
(1)提取待測(cè)樣品的DNA；
(2)使用經(jīng)標(biāo)記的支原體通用引物，以PCR方法擴(kuò)增待測(cè)樣品之DNA；
(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與定位標(biāo)記在尼龍膜上的支原體種特異性探針雜交；
(4)洗去尼龍膜上未雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(5)顯示雜交結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支原體的檢測(cè)鑒定方法，其特征在于所述的支原體種特異性探針是具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述堿基序列的探針中的一種或數(shù)種或全部。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支原體的檢測(cè)鑒定方法，其特征在于所述的支原體通用引物包括
外引物
SPS15’-CCCTACGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCT-3’(SEQ ID NO1)
SPA25’-CSDDGCWTWTCGSWGDTWRDYVCGTCCTTCATCG-3’(SEQ IDNO4)；
內(nèi)引物
SPS25’-CGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCTTTC-3’(SEQ ID NO2)
SPA15’-CGTCCTTCATCGMCTNTYYDGWSCCAAGGCATYCAC-3’(SEQ IDNO3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支原體的檢測(cè)鑒定方法，其特征在于以生物素標(biāo)記所述的支原體通用引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支原體的檢測(cè)鑒定方法，其特征在于所述的顯示雜交結(jié)果的方法是在尼龍膜上加入顯影劑，顯影劑和PCR產(chǎn)物上標(biāo)記的生物素結(jié)合，激發(fā)熒光，使x光底片曝光。
6.用于檢測(cè)鑒定支原體的基因探針，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO5至SEQID NO24所述堿基序列中的任一堿基序列。
7.用于擴(kuò)增支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA的通用引物，其特征在于包括具有序列表中SEQ ID NO1所述堿基序列的外引物SPS1、具有序列表中SEQ ID NO4所述堿基序列的外引物SPA2、具有序列表中SEQ ID NO2所述堿基序列的內(nèi)引物SPS2和具有序列表中SEQ ID NO3所述堿基序列的內(nèi)引物SPA1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支原體的檢測(cè)鑒定方法，其特征在于PCR反應(yīng)條件是第一次擴(kuò)增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、65℃10秒、74℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；第二次擴(kuò)增變性、退火、延伸的條件分別為94℃10秒、70℃10秒、74℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)。
9.一種檢測(cè)鑒定支原體試劑盒，其特征在于它含有
容器；
用于擴(kuò)增支原體16S-23SrRNA間隔區(qū)DNA的通用引物；
至少一種具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述堿基序列的支原體種特異性探針；
以及使用說(shuō)明。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)鑒定支原體試劑盒，其特征在于該試劑盒還含有PCR反應(yīng)所需要的試劑。
全文摘要
一種支原體的檢測(cè)鑒定方法，包括提取待測(cè)樣品的DNA、使用經(jīng)標(biāo)記的支原體通用引物以PCR方法擴(kuò)增待測(cè)樣品之DNA、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與定位標(biāo)記在尼龍膜上的支原體種特異性探針雜交、洗去尼龍膜上未雜交的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、顯示雜交結(jié)果等步驟，同時(shí)，本發(fā)明還提供了支原體通用引物和支原體種特異性探針及檢測(cè)鑒定支原體試劑盒。本發(fā)明方法及所設(shè)計(jì)的支原體種特異性探針能靈敏、特異的檢測(cè)和鑒定支原體，具有快速、靈敏、特異性高和成本低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1676612SQ200410012940
公開(kāi)日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者王輝, 孔繁榮, 琳·吉爾伯特 申請(qǐng)人:武漢市第一醫(yī)院