一種用于檢測肺炎支原體的pcr引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測肺炎支原體的熒光定量PCR引物及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物對(duì)可為引物對(duì)1（序列1和序列2）或引物對(duì)2（序列3和序列4）或引物對(duì)3（序列5和序列6）。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的引物對(duì)對(duì)待測樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測，與其他商品化檢測引物以及IgM抗體檢測法和培養(yǎng)法相比，本發(fā)明方法能夠特異性檢測MP，不受MP親緣關(guān)系較近的4種常見病原支原體和呼吸道常見細(xì)菌和真菌病原菌的干擾。該方法除可以定性檢測MP外還可以很好的定量檢測MP，是一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合臨床使用的檢測所有株肺炎支原體的定量PCR檢測技術(shù)，在臨床檢測中具有非常好的檢測效果和應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種用于檢測肺炎支原體的PCR引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病原體檢測領(lǐng)域，涉及一種用于檢測肺炎支原體的PCR引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)是呼吸道感染(包括社區(qū)獲得性肺炎，CAP)中非常重要的病原體。肺炎支原體肺炎廣泛存在于全球范圍內(nèi)，多為散發(fā)病例，約3-6年發(fā)生一次地區(qū)性流行，流行時(shí)間可長達(dá)I年，流行年份的發(fā)病率可以達(dá)到非流行年份的數(shù)倍，容易在學(xué)校、幼兒園及軍隊(duì)等人員比較密集的環(huán)境中集中發(fā)病。最近的一項(xiàng)包括亞洲地區(qū)在內(nèi)的全球性CAP病原學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，肺炎支原體肺炎占CAP的12 %，在所有非典型病原體感染所導(dǎo)致的CAP中所占的比例超過了 50%。與大多數(shù)國外地區(qū)相比，我國肺炎支原體肺炎的發(fā)病率可能更高。有研究表明，肺炎支原體已經(jīng)超過了肺炎鏈球菌，成為成人CAP的首要致病原。
[0003]據(jù)報(bào)道，大于20%的社區(qū)獲得性肺炎由肺炎支原體(MP)引起。由于肺炎支原體缺乏細(xì)胞壁，造成社區(qū)常用的β -內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)其無效，因此，為避免濫用抗生素，早期診斷尤為重要。間接診斷MP感染的抗體檢測方法已廣泛應(yīng)用于臨床檢測，但是這些方法靈敏度不理想，且存在MP感染后持續(xù)陽性的現(xiàn)象。國外早已將PCR診斷技術(shù)應(yīng)用于MP感染的診斷，但由于普通的P CR操作過程中易污染，使得假陽性率較高，臨床應(yīng)用受到限制。
[0004]實(shí)時(shí)突光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative PCR, QPCR)是在 PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，1996年由美國Applied Biosystems公司首先推出，熒光定量PCR對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測原理做了很大的改進(jìn)，它利用熒光染料在激發(fā)光的作用下，所釋放的熒光光能的變化來動(dòng)態(tài)直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，因熒光信號(hào)變量和擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，通過足夠靈敏的自動(dòng)化儀器對(duì)熒光的采集和分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。Sybr Green I是一種和DNA結(jié)合的熒光染料，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增高與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。當(dāng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測時(shí)，可檢測到DNA聚合酶進(jìn)行DNA合成階段熒光信號(hào)增加，而在模板變性階段熒光信號(hào)減少。因此，在每一次PCR循環(huán)終點(diǎn)，可通過檢測熒光來檢測擴(kuò)增DNA的增加量。
[0005]此技術(shù)除了具有傳統(tǒng)PCR的特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測時(shí)間短等特點(diǎn)外，還具有以下特點(diǎn):全封閉反應(yīng)，無需凝膠電泳等PCR后處理，減小對(duì)環(huán)境的污染；不使用有毒試劑，操作安全；采用對(duì)數(shù)期分析，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確；定量范圍寬，可達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)；儀器在線實(shí)時(shí)監(jiān)測，結(jié)果直觀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的引物對(duì)。[0007]本發(fā)明所提供的引物對(duì)特異于肺炎支原體的ATPase基因。具體而言，所述引物對(duì)為如下引物對(duì)I或引物對(duì)2或引物對(duì)3:
[0008]所述引物對(duì)I為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)；所述引物對(duì)2為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)；所述引物對(duì)3為由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)。
[0009]進(jìn)一步，組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1:1。
[0010]制備所述引物對(duì)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011]該方法具體可包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝的步驟。
[0012]本發(fā)明是另一個(gè)目的是提供一種用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒。
[0013]本發(fā)明所提供的用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒，可為實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，具體可含有所述引物對(duì)和如下物質(zhì)中的至少一種:dNTP、DNA聚合酶和熒光染料。
[0014]在本發(fā)明中，所述熒光染料具體為SYBR green。
[0015]制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0016]該方法具體可包括如下步驟:將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與如下物質(zhì)中的至少一種包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi):dNTP、DNA聚合酶和熒光染料。
[0017]在本發(fā)明中，所述熒光染料具體為SYBR green。
[0018]所述引物對(duì)或所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測肺炎支原體的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]具體的，采用所述引物對(duì)或所述試劑盒通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肺炎支原體時(shí)，反應(yīng)體系中，反應(yīng)初始時(shí)上下游引物的終濃度均可為0.4μ M ;反應(yīng)條件均可為:50°C 2分鐘，I個(gè)循環(huán)；95°C 15分鐘，I個(gè)循環(huán)；94°C 15秒，56°C 31秒，72°C 20秒(單點(diǎn)采集熒光，SYBR green通道)，40個(gè)循環(huán)。
[0020]進(jìn)一步，在本發(fā)明中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的所述反應(yīng)體系如下:2倍定量PCR反應(yīng)液10μ 1,0.4μ I的引物混合液(上下游引物的濃度均為20 μ Μ)，以及7.6μ I的去離子水，DNA模板2 μ I。其中，所述2倍定量PCR反應(yīng)液為Qiagen公司產(chǎn)品，名稱為QuantiTectSYBR Green PCR kit,目錄號(hào):204141。
[0021]在本發(fā)明中，以上所有的所述肺炎支原體均為人肺炎支原體，如肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)菌株!7H (ATCC15531)。
[0022]實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的引物對(duì)對(duì)待測樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測，與其他商品化檢測引物以及IgM抗體檢測法和培養(yǎng)法相比，本發(fā)明檢測引物對(duì)及試劑盒能夠特異性檢測MP，不受MP親緣關(guān)系較近的4種常見病原支原體和呼吸道常見細(xì)菌和真菌病原菌的干擾。該方法除可以定性檢測MP外還可以很好的定量檢測MP，是一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合臨床使用的檢測所有株肺炎支原體的定量PCR檢測技術(shù)，在臨床檢測中具有非常好的檢測效果和應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明采用實(shí)施例1獲得的引物MPP7對(duì)不同樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線圖。其中，標(biāo)注Positive的曲線為肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15531)基因組DNA樣品，標(biāo)注P1-P4的曲線分別為將肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株!7H (ATCC15531)稀釋4倍、16倍、64倍、256倍后的樣品，其余曲線為四種支原體屬病原基因組DNA樣品和11種呼吸道常見細(xì)菌、真菌基因組DNA樣品。
[0024]圖2為本發(fā)明采用實(shí)施例1獲得的引物MPP7對(duì)不同樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的電泳圖。其中，Pl =Mp陽性對(duì)照4倍稀釋；P2:Mp陽性對(duì)照16倍稀釋；P3:Mp陽性對(duì)照64倍稀釋；P4:Mp陽性對(duì)照256倍稀釋；Mg:生殖支原體(ATCC33530) ；Mho:人型支原體(ATCC23114) ；UU:解脲脲原體(ATCC27618) ；Mp1:梨支原體(ATCC25960) ；Mp 和 O:肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株FH (ATCC15531)(濃度為4X108拷貝/ml) ；1:流感嗜血桿菌(hin) ；2:A型鏈球菌(gas) ；3:表皮葡萄球菌(sep) ；4:金黃色葡萄球菌(sau) ；5:大腸桿菌(eco) ；6:肺炎克雷伯菌(kpn) ；7:卡他莫拉菌(bca) ；8:鮑曼不動(dòng)桿菌(aba) ；9:肺炎鏈球菌(spn) ；10:銅綠假單胞菌(pae ) ; 11:白色念珠菌(cal) ;NC和N:陰性對(duì)照；M:分子量標(biāo)準(zhǔn)(由大到小依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)。
[0025]圖3為本發(fā)明采用實(shí)施例1獲得的引物對(duì)MPP7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026]圖4為采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司MP FQ-PCR產(chǎn)品(目錄號(hào):DA-B064)，對(duì)肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株FH (ATCC15531)，臨床陽性樣本，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細(xì)菌、真菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的擴(kuò)增曲線圖。其中，Mpi為梨支原體(ATCC25960)，Mg 為生殖支原體(ATCC33530)，UU 為解脲脲原體(ATCC27618)，sep 為表皮葡萄球菌(ATCC12228)，sau為金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，hin為流感嗜血桿菌(ATCC49247)，Mpl:肺炎支原體臨床陽性樣本1，Mp2:肺炎支原體臨床陽性樣本2。其余曲線為人型支原體(ATCC23114)、A型鏈球菌(gas) (ATCC19615)、大腸埃希氏菌(eco)(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(kpn) (ATCC700603)、卡他莫拉菌(bca) (ATCC25238)、鮑曼不動(dòng)桿菌(aba ) (ATCC19606 )、肺炎鏈球菌(spn ) (ATCC49619 )、銅綠假單胞菌(pae )(ATCC27853)和白色念珠菌(cal) (ATCC90028)。
【具體實(shí)施方式】`
[0027]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029]實(shí)施例1、用于檢測肺炎支原體的熒光PCR引物的獲得
[0030]一、引物對(duì)的設(shè)計(jì)與合成
[0031]根據(jù)已發(fā)表在GenBank上的人肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15531)的基因組DNA序列(GenBank序列號(hào):CP002077),最終確定以該菌株的16S rRNA (GenBank序列號(hào):AF132740)和ATPase基因序列(GenBank序列號(hào):U43738)為模板，利用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPrimierf.0，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。避開與其他病原體同源性較高的區(qū)域，手工調(diào)整參數(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在150~300bp范圍，引物的Tm值在54~64°C范圍，共設(shè)計(jì)選取20對(duì)引物，其中針對(duì)16S rRNA序列的引物6對(duì)，針對(duì)ATPase序列的引物14對(duì)。獲得的引物序列送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行引物合成。
[0032]二、引物對(duì)可靠性檢測
[0033]提取人肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15531)的基因組DNA，進(jìn)行QPCR實(shí)驗(yàn)，調(diào)整退火溫度等參數(shù)，并將QPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，驗(yàn)證所設(shè)計(jì)合成的20對(duì)引物的可靠性，淘汰擴(kuò)增效率低以及擴(kuò)增產(chǎn)物不特異的引物對(duì)。經(jīng)過初篩實(shí)驗(yàn)，保留16S rRNA引物4對(duì)，ATPase引物10對(duì)，并使用提取的臨床陽性MP培養(yǎng)株基因組DNA進(jìn)行驗(yàn)證，繼續(xù)進(jìn)入下一輪實(shí)驗(yàn)。
[0034]提取與肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)感染相似、臨床癥狀難以區(qū)分的多種常見病原體實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)株基因組DNA，作為模板，分別使用上述初篩后的14對(duì)引物，與MP基因組DNA同時(shí)進(jìn)行QPCR實(shí)驗(yàn)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，篩選出只對(duì)MP進(jìn)行特異性擴(kuò)增的引物序列。經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)過程，得到如下3對(duì)PCR引物。
[0035]引物對(duì)MPP7，特異于MP ATPase基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為291bp，序列如下:
[0036]MPP7F:5，-CCCAACTCAAGCGAATCGTAG-3’(序列 I)；
[0037]MPP7R:5，-CCATCAGCGACACTAATAACCTTG-3，(序列 2)。
[0038]引物對(duì)MPP8，特異于MP ATPase基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為292bp，序列如下:
[0039]MPP8F:5，-GGGGATTGCTGGGAAGTATGTC-3’(序列 3)；
[0040]MPP8R:5，-GCGCACGGTTATAGTTCAAACC-3’(序列 4)。
[0041]引物對(duì)MPP9，特異于MP ATPase基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為223bp，序列如下:
[0042]MPP9F:5， -GCCGTTGGGCAAGTAGTTCTC-3，(序列 5)；
[0043]MPP9R:5，-CGGTGGGGTTATCGGTGTCAC-3，(序列 6)。
[0044]實(shí)施例2、用于檢測肺炎支原體的熒光PCR引物的特異性檢測及最低檢測限的確
定
[0045]本實(shí)施例采用肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株ra (ATCC15531)，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細(xì)菌、真菌對(duì)實(shí)施例1得到的3個(gè)引物對(duì)進(jìn)行特異性檢測。其中，四種支原體屬病原為:生殖支原體(ATCC33530)、人型支原體(ATCC23114)、解脲脲原體(ATCC27618)和梨支原體(ATCC25960) ；11種呼吸道常見細(xì)菌、真菌為:流感嗜血桿菌(hin) (ATCC49247)、A 型鏈球菌(gas) (ATCC19615)、表皮葡萄球菌(sep) (ATCC12228)、金黃色葡萄球菌(sau) (ATCC25923)、大腸埃希氏菌(eco) (ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(kpn) (ATCC700603)、卡他莫拉菌(bca) (ATCC25238)、鮑曼不動(dòng)桿菌(aba) (ATCC19606)、肺炎鏈球菌(spn) (ATCC49619)、銅綠假單胞菌(pae) (ATCC27853)和白色念珠菌(cal)(ATCC90028)。
[0046]分別提取如上所述的肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株ra (ATCC15531)，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細(xì)菌、真菌的基因組DNA，并進(jìn)行純化后統(tǒng)一調(diào)整濃度為4X IO8拷貝/ml，以其為模板，分別采用實(shí)施例1得到的3個(gè)引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。同時(shí)設(shè)置以水代替DNA模板的陰性對(duì)照。另外，對(duì)于人肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株FH (ATCC15531)的基因組DNA再設(shè)置分別稀釋4、16、64和256倍的四個(gè)樣品。
[0047]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系:2倍定量PCR反應(yīng)液10μ 1，0.4μ I的引物混合液(上下游引物的濃度均為20 μ Μ),以及7.6 μ I的去離子水。上述成分混合均勻后，加入DNA模板2 μ I。該反應(yīng)體系中，反應(yīng)初始時(shí)，上下游引物以的濃度均為0.4 μ Μ。其中，2倍定量PCR反應(yīng)液為Qiagen公司產(chǎn)品，名稱為QuantiTect SYBR Green PCR kit,目錄號(hào):204141。
[0048]將樣品管放入上海宏石SLAN-96P熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng):50°C 2分鐘，I個(gè)循環(huán)；95°C 15分鐘，I個(gè)循環(huán)；94°C 15秒，56°C 31秒，72°C 20秒(單點(diǎn)采集熒光，SYBR green通道)，40個(gè)循環(huán)。
[0049]反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線及電泳圖譜判定結(jié)果。
[0050]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0051]結(jié)果顯示:采用3個(gè)引物對(duì)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測時(shí)，均只有肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株FH (ATCC15531)基因組DNA及其四個(gè)稀釋樣品可觀察到明顯的熒光強(qiáng)度變化，而其它樣品與陰性對(duì)照一樣，熒光強(qiáng)度均沒有變化。其中，采用引物對(duì)MPP7時(shí)，擴(kuò)增曲線如圖1所示。采用3個(gè)引物對(duì)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測時(shí)，均只有肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15531)基因組DNA及其四個(gè)稀釋樣品可觀察到預(yù)期大小的目的條帶，而其它樣品與陰性對(duì)照一樣，沒有目的條帶。其中，采用引物對(duì)MPP7時(shí)，PCR反應(yīng)后的電泳圖譜如圖2所示。以上擴(kuò)增曲線和電泳圖譜的結(jié)果表明，實(shí)施例1獲得的3個(gè)引物對(duì)肺炎支原體均具有良好的特異性。
[0052]另外，根據(jù)肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株-- (ATCC15531)基因組DNA稀釋4、16、64和256倍后樣品的檢測結(jié)果，以起始模板濃度(拷貝/ml)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以閾值循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為Ct=KXlgXJb (Ct為閾值循環(huán)數(shù)；K為斜率A為起始模板濃度(單位:拷貝/ml) ；b為截距)。
[0053]MPP7 的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 3 所示，公式為:Ct=-5.621gX0+58.79 (r2=0.99743)。利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以定量檢測待檢測樣品中的MP濃度，最低檢測限約達(dá)2188拷貝/ml (Ct為40時(shí)，X0的取值)。
[0054]本發(fā)明的發(fā)明人同時(shí)采用了中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司MP FQ-PCR產(chǎn)品(目錄號(hào):DA-B064)，對(duì)如上所述的肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15531)，臨床陽性樣本，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細(xì)菌、真菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，所有操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
`[0055]結(jié)果顯示:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司MP FQ-PCR產(chǎn)品對(duì)梨支原體(Mpi )，生殖支原體(Mg)，解脲脲原體(UU)，表皮葡萄球菌(s印)，金黃色葡萄球菌(sau)和流感嗜血桿菌(hin)等出現(xiàn)不同程度的交叉反應(yīng)，呈現(xiàn)出假陽性結(jié)果(圖4)。
[0056]實(shí)施例3、用于檢測肺炎支原體的熒光PCR引物的臨床樣本驗(yàn)證
[0057]本實(shí)施例中，發(fā)明人于發(fā)熱門診回顧性分析100例社區(qū)獲得性肺炎患者(年齡^ 14歲)的MP相關(guān)檢測結(jié)果，以雙份血清中MP-1gG抗體4倍及以上升高作為MP感染診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，分別評(píng)價(jià)中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司MP FQ-PCR產(chǎn)品(目錄號(hào):DA-B064)、采用實(shí)施例1獲得的引物對(duì)MPP7進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、IgM抗體檢測法和培養(yǎng)法的檢出率，靈敏度，特異性，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值和陽性似然比。
[0058]在每例患者第一次門診(即感染急性期)時(shí)，采集咽拭子放入2ml生理鹽水中保存，和非抗凝靜脈血2ml，其中，取咽拭子標(biāo)本200μ I兩份，分別進(jìn)行肺炎支原體培養(yǎng)，和肺炎支原體DNA提取(進(jìn)而進(jìn)行PCR檢測)，分離靜脈血血清，分別進(jìn)行IgM和IgG抗體檢測；在每例患者發(fā)病14-28天時(shí)(即感染恢復(fù)期)，采集非抗凝靜脈血2ml，分離靜脈血血清，進(jìn)行IgG抗體檢測。
[0059]肺炎支原體的培養(yǎng)法，具體如下:
[0060]采用經(jīng)典的變色培養(yǎng)基液體培養(yǎng)法(參考文獻(xiàn)“Waites KB, BebearCM，Robertson JAjet al.Cumitech34, laboratory diagnosis of mycoplasmalinfections.F.S.Noltej coordinating ed.Washington, DC:American Society forMicrobiology, 2001.”)。購買OXIOD公司的基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基(產(chǎn)品目錄號(hào)為CM0403)、葡萄糖(產(chǎn)品目錄號(hào)為LP0071)和培養(yǎng)添加劑(產(chǎn)品目錄號(hào)為SR0059C)，以及國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的苯酚紅(產(chǎn)品目錄號(hào)為71032594)，自行配制變色培養(yǎng)基(配方:每100ml中加入基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基2.lg，葡萄糖0.5g，培養(yǎng)添加劑I支，苯酚紅0.01g)。取200 μ I入組患者咽拭子標(biāo)本液，加入至2ml變色培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2-6周，以顏色由澄清紅變澄清黃判為陽性，否則判為陰性。
[0061]肺炎支原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測法，具體如下:
[0062]利用德國Qiagen公司DNA提取試劑盒(貨號(hào)51306)，提取咽拭子標(biāo)本的DNA核酸。采用本發(fā)明實(shí)施例1獲得的引物對(duì)MPP7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參見實(shí)施例2。而采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司MP FQ-PCR產(chǎn)品(目錄號(hào):DA-B064)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所有操作按照說明書進(jìn)行。以上兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR，均設(shè)置陽性對(duì)照——肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株FH (ATCC15531)基因組DNA (濃度為4X IO8拷貝/ml)。
[0063]肺炎支原體IgM和IgG抗體檢測法，具體如下:
[0064]采用德國維潤-賽潤公司商品試劑盒(貨號(hào):ESR127G和ESR127M)定量測定感染急性期血清中肺炎支原體IgM和IgG抗體，以及感染恢復(fù)期血清中肺炎支原體IgG抗體，所有標(biāo)本均由相同操作人員使用Thermo公司的Multiskan MK3型酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。所有操作按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行。具體的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為:抗體活性單位以U/ml表示，對(duì)于IgM抗體，>17U/ml判為IgM抗體陽性(即判為MP感染)，13-17U/ml判為灰區(qū)，<13U/ml判為IgM抗體陰性(即判為未MP感染)；對(duì)于單次IgG抗體，>30U/ml判為IgG抗體陽性，20-30U/ml判為灰區(qū)，<20U/ml判為IgG抗體陰性；當(dāng)感染恢復(fù)期血清IgG抗體陽性，且較感染急性期IgG抗體呈4倍或以上升高，定義為MP感染金標(biāo)準(zhǔn)(參考文獻(xiàn)“Burak Turgut, Fatma Uyar, Fulya Ilhan, et al.Mycoplasma Pneumoniae and ChlamydiaPneumoniae Sero-posit ivity in Patients With Age-Related Macular Degeneration.J Clin Med Res, 2010, 2 (2):85 - 89.[4]Jonathan J Deeks and Douglas G Altman.Diagnostic tests4: likelihood ratios.BMJ, 2004, 329 (7458): 168 - 169.，，)。
[0065]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0066]結(jié)果顯示:在100例肺炎患者中，利用雙份血清IgG抗體檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”診斷MP感染21例，陽性率21%。待評(píng)價(jià)4種方法的檢出率、靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值、性預(yù)測值和陽性似然比如表1和表2所示?？梢?，本發(fā)明所采用實(shí)施例1獲得的引物對(duì)MPP7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的方法，其陽性檢出率最高。對(duì)于靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值、性預(yù)測值和陽性似然比這5個(gè)指標(biāo)，本發(fā)明所采用實(shí)施例1獲得的引物對(duì)MPP7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的方法，均顯著高于其它三種對(duì)照方法。
[0067]表1不同方法陽性檢出率的比較
【權(quán)利要求】
1.用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)為引物對(duì)I或引物對(duì)2或引物對(duì)3 ; 所述引物對(duì)I為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)；所述引物對(duì)2為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)；所述引物對(duì)3為由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于:組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1:1。
3.制備權(quán)利要求1或2所述引物對(duì)的方法，包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝的步驟。
4.用于檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)和如下物質(zhì)中的至少一種:dNTP、DNA聚合酶和熒光染料。
5.制備權(quán)利要求4所述試劑盒的方法，包括如下步驟:將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與如下物質(zhì)中的至少一種包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi):dNTP、DNA聚合酶和熒光染料。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒或權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述熒光染料為 SYBR green ο
7.權(quán)利要求1或2所述引物對(duì)，或權(quán)利要求4所述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測肺炎支原體的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的引物對(duì)或方法或試劑盒或應(yīng)用，其特征在于:所述肺炎支原體為人肺 炎支原體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103740837SQ201410018489
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】高宇輝, 曲久鑫, 曹彬 申請(qǐng)人:高宇輝