專(zhuān)利名稱(chēng)：酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于中藥提取方法，尤其是一種酶法水解黃芩甙的葡萄糖醛酸基，制備黃芩素的方法。
背景技術(shù)：
黃芩(Baikalskullcap Rood)是常用的中藥，是Scutellaria屬的根莖。中華人民共和國(guó)藥典(2000年版)收載了黃芩Scutellaria baicalensis Georgi.，還有粘毛黃芩Scutellaria viscidula，甘肅黃芩Scutellaria rehderiana和慎黃芩Scutellaria amoena等。黃芩中的主要成分是黃芩甙(苷)，含量高達(dá)7-19％，只含有微量的漢黃芩甙、黃芩素和漢黃芩素(文獻(xiàn)6)。雖然記載黃芩具有消熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功能，可用于治療上呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、菌痢、肝炎、高血壓等，也可廣泛用于保健食品，但是對(duì)療效起主要作用的是黃芩中所含的微量黃芩素?？诜S芩后，其中的黃芩甙必須在消化系統(tǒng)中變成黃芩素，才能發(fā)揮其藥效。由于黃芩甙在人體內(nèi)很難吸收，加之體內(nèi)轉(zhuǎn)化低(文獻(xiàn)1)；而黃芩素容易吸收，生物利用度高(文獻(xiàn)2、3)，其藥理活性也遠(yuǎn)高于黃芩甙(文獻(xiàn)4)，如抗艾滋病毒、誘導(dǎo)感染鴨子病毒細(xì)胞的凋亡，抑制艾滋病毒逆轉(zhuǎn)錄酶等作用等均遠(yuǎn)高于黃芩甙(文獻(xiàn)5)。為此，人們致力于研究將黃芩甙變成黃芩素。由于黃芩甙是β-葡萄糖醛酸酶的抑制劑(文獻(xiàn)7)，市銷(xiāo)的一般β-葡萄糖醛酸酶不能水解黃芩甙β-葡萄糖醛酸基而變成黃芩素，因此曾有人提出利用強(qiáng)酸水解黃芩甙的葡萄糖醛酸基變成黃芩素的方法(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2129372.4)，但該方法對(duì)黃芩甙的破壞較大，環(huán)境污染嚴(yán)重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的對(duì)黃芩甙的破壞較大，環(huán)境污染嚴(yán)重的技術(shù)問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)便、無(wú)污染、酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，用酶水解黃芩甙葡萄糖醛酸基，制備黃芩素。
包括如下步驟
a.由微生物發(fā)酵制備能水解黃芩甙葡萄糖醛酸基的酶；b.將酶、黃芩甙及緩沖液混合反應(yīng)0.5～48小時(shí)，黃芩甙的濃度為0.01～15％，反應(yīng)條件為溫度5～85℃、PH值2～10；c.提取黃芩素。
也可以按如下方法a.在微生物培養(yǎng)基中加入黃芩或黃芩提取物培養(yǎng)；b.收集培養(yǎng)物并用低級(jí)醇類(lèi)溶液浸出；c.提取黃芩素。
所述的微生物發(fā)酵制備是用液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵法得到含酶混合液，在含酶混合液內(nèi)加入硫酸銨或者乙醇提取酶。
所述的微生物為細(xì)菌、鏈霉菌、霉菌、酵母菌、擔(dān)子菌。
所述的微生物發(fā)酵為有產(chǎn)酶誘導(dǎo)物參與發(fā)酵，其產(chǎn)酶誘導(dǎo)物為黃芩甙或黃酮甙或異黃酮甙。
所述的緩沖液為醋酸或磷酸。
所述的低級(jí)醇類(lèi)溶液為甲醇、乙醇或正丁醇。
所述的提取黃芩素為用乙醇沉淀或正丁醇萃取后在堿性條件下溶解，酸性條件下沉淀或乙醇重結(jié)晶方法提取。
本發(fā)明是利用能水解黃芩甙葡萄糖醛酸基的酶，水解黃芩中含量較高的黃芩甙葡萄糖醛酸基，制備黃芩素?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)所存在的對(duì)黃芩甙破壞性大、污染嚴(yán)重的缺點(diǎn)，具有無(wú)污染、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)。尤其是在微生物發(fā)酵中加入黃芩甙、黃酮甙、異黃酮甙等產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，可大大提高其產(chǎn)酶量，有助于充分水解黃芩甙葡萄糖醛酸基，更加提高了黃芩素的轉(zhuǎn)化率，對(duì)醫(yī)藥、保健食品開(kāi)發(fā)很有意義。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1a.以高溫好氧菌Bacillus sp.JF2菌(文獻(xiàn)8)在含3％玉米粉、0.05％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物——黃芩甙培養(yǎng)基中，在溫度60℃條件下振蕩培養(yǎng)30～90小時(shí)，離心除菌、除雜，得含酶混合液，往含酶混合液中加入65％飽和度的硫酸銨沉淀酶蛋白，用0.02M、pH5醋酸緩沖液透析，離心除雜，凍干，得到黃芩甙酶。
b.用0.2克上述黃芩甙酶、3克黃芩甙、150毫升醋酸緩沖液(0.2M，pH5.0)混合均勻，使黃芩甙濃度為0.01～15％，在溫度為70℃條件下攪拌反應(yīng)1～24小時(shí)。
c.反應(yīng)后加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，過(guò)濾除去蛋白沉淀，濾液減壓蒸干，得到2.1克粗品。在熱乙醇中溶解、冷乙醇中沉淀，得到純1.1克黃芩素，經(jīng)高效液相色譜方法(文獻(xiàn)6)檢測(cè)，純度為98％。
實(shí)施例2a.以高溫厭氧菌Clostridium thermocopriea JT3-4(文獻(xiàn)9)在含4％玉米粉、0.4％大豆浸出物培養(yǎng)基中，在溫度60℃條件下，厭氧攪拌培養(yǎng)30～90小時(shí)，離心除菌，得含酶混合液，往含酶混合液中加入加入乙醇沉淀酶蛋白，凍干，得到黃芩甙酶。
b.3克上述黃芩甙酶、2克黃芩甙、120毫升磷酸緩沖液(0.2M，pH5.0)混合均勻，使黃芩甙濃度為0.01～15％，在溫度60℃條件下攪拌反應(yīng)0.5～20小時(shí)。
c.反應(yīng)後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，過(guò)濾除去蛋白沉淀，濾液減壓蒸干，得到1.7克粗品。在堿性(加NaOH至pH12)中溶解、酸性(加鹽酸至pH2)中沉淀的方法精制，得到較純0.7克黃芩素(文獻(xiàn)6)，純度為90％以上。
實(shí)施例3a.以黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含4％麥芽浸出物、0.5％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物——黃芩浸出物的培養(yǎng)基中，在溫度28～30℃條件下攪拌，通風(fēng)培養(yǎng)50～100小時(shí)，離心除菌，用60～75％飽和度的硫酸銨沉淀酶蛋白，收集蛋白，溶于1/10發(fā)酵液體積的醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸銨，離心除渣，即為黃芩甙酶液。
b.用3克黃芩甙、100毫升醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)和20毫升上述黃芩甙酶液混合，使黃芩甙濃度為0.01～15％，在20～55℃反應(yīng)2～16小時(shí)。
c.加入1/2體積的正丁醇萃取四次，減壓蒸干，得到黃芩素粗品2克。經(jīng)高效液相色譜法檢驗(yàn)黃芩素轉(zhuǎn)化率85％，經(jīng)過(guò)乙醇重結(jié)晶得到黃芩素純品1.2克。
實(shí)施例4a.以米曲霉菌(Aspegillus oryzae)在含5％麥麩浸出物、1％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物—黃芩或者其他黃酮類(lèi)植物的浸出物的培養(yǎng)基中，溫度28～30℃條件下，攪拌通風(fēng)培養(yǎng)50～100小時(shí)，離心除菌，加入乙醇至70％沉淀酶蛋白，收集蛋白，加入1/5發(fā)酵體積的醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)，即為黃芩甙酶液。
b.上述黃芩甙酶液200毫升和黃芩浸出物的溶液800毫升(含浸出物150克)混合，使黃芩甙濃度為0.01～15％，在50℃攪拌反應(yīng)4小時(shí)，70％乙醇沉淀酶蛋白，上清液減壓濃縮，得到黃芩素含量高的黃芩浸出物150克左右，經(jīng)高效液相色譜法檢驗(yàn)70％以上的黃芩甙轉(zhuǎn)化成黃芩素。
實(shí)施例5a.假絲酵母在含黃芩粉10％的麥麩固體培養(yǎng)基(干物1000克)上接種，分裝在茄子瓶中30℃固體培養(yǎng)3～8天，收集培養(yǎng)物，在培養(yǎng)基干物中加入6000毫升的生理鹽水，浸泡一小時(shí)，離心取上清得含酶混合液，加入飽和度60～75％的硫酸銨，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸鈉緩沖液溶解，透析除去硫酸銨，離心除渣，即得500毫升左右的酶液。
上述酶液按實(shí)施例3的方法處理黃芩甙得到黃芩素。
實(shí)施例6假絲酵母在含黃芩粉100克和900克麥麩固體培養(yǎng)基上接種，分裝在茄子瓶中30℃固體培養(yǎng)2天，明顯看到微生物生長(zhǎng)，將滅菌的黃芩粉100克平分加入于茄子瓶中，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)物加入95％甲醇或乙醇或正丁醇20升浸出，過(guò)濾，濃縮，加NaOH至pH12溶解黃芩素，過(guò)濾，加鹽酸沉淀黃芩素，收集沉淀，乙醇中重結(jié)晶，得到純黃芩素6.1克。
本發(fā)明的酶轉(zhuǎn)化化學(xué)過(guò)程為(GlcAU為葡萄糖醛酸基) 黃芩苷 黃芩素Baicalin Baicalein參考文獻(xiàn)1、M.Ishihara et a1.Yakugaku Zasshi，122(9)，695-701，2002.
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權(quán)利要求
1.一種酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于用酶水解黃芩甙葡萄糖醛酸基，制備黃芩素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于包括如下步驟a.由微生物發(fā)酵制備能水解黃芩甙葡萄糖醛酸基的酶；b.將酶、黃芩甙及緩沖液混合反應(yīng)0.5～48小時(shí)，黃芩甙的濃度為0.01～15％，反應(yīng)條件為溫度5～85℃、PH值2～10；c.提取黃芩素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于a.在微生物培養(yǎng)基中加入黃芩或黃芩提取物培養(yǎng)；b.收集培養(yǎng)物并用低級(jí)醇類(lèi)溶液浸出；c.提取黃芩素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于所述的a步驟的微生物發(fā)酵制備是用液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵法得到含酶混合液，在含酶混合液內(nèi)加入硫酸銨或者乙醇提取酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于所述的微生物為細(xì)菌、鏈霉菌、霉菌、酵母菌、擔(dān)子菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備低枘基白頭翁皂甙的方法，其特征在于所述的微生物發(fā)酵為有產(chǎn)酶誘導(dǎo)物參與發(fā)酵，其產(chǎn)酶誘導(dǎo)物為黃芩甙或黃酮甙或異黃酮甙。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于所述的緩沖液為醋酸或磷酸緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于所述的低級(jí)醇類(lèi)溶液為甲醇、乙醇或正丁醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，其特征在于所述的c步驟為用乙醇沉淀或正丁醇萃取后在堿性條件下溶解，酸性條件下沉淀或乙醇重結(jié)晶方法提取。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種酶法水解黃芩甙葡萄糖醛酸基制備黃芩素的方法，用酶水解黃芩甙葡萄糖醛酸基，制備黃芩素?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)所存在的對(duì)黃芩甙破壞性大、污染嚴(yán)重的缺點(diǎn)，具有無(wú)污染、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)。尤其是在微生物發(fā)酵中加入黃芩甙、黃酮甙、異黃酮甙等產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，可大大提高其產(chǎn)酶量，有助于充分水解黃芩甙葡萄糖醛酸基，更加提高了黃芩素的轉(zhuǎn)化率，對(duì)醫(yī)藥、保健食品開(kāi)發(fā)很有意義。
文檔編號(hào)C12P17/02GK1584039SQ200410020649
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月31日
發(fā)明者金鳳燮, 魚(yú)紅閃, 張春枝, 蘆明春, 車(chē)慶明 申請(qǐng)人:金鳳燮