專利名稱：硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對于生產(chǎn)用于分解褐藻類含有的多種硫酸化多糖的酶有用的新型細(xì)菌、在糖鏈學(xué)(glycotechnology)領(lǐng)域有用的分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖(sulfated glucuronofucan)的酶、該酶的制備方法、活化該酶的各種因子、以及作為糖鏈學(xué)用試劑有用的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖、脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖(sulfated glucuronofucanoligosaccharide)及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
褐藻類含有多種硫酸化多糖。例如，已知①僅由巖藻糖和硫酸基構(gòu)成的硫酸化巖藻聚糖，②含有葡糖醛酸、甘露糖、巖藻糖和硫酸基的硫酸化巖藻葡糖醛酸甘露聚糖，例如WO97/26896號公報記載的含硫酸化巖藻糖的多糖-U(構(gòu)成糖及其摩爾比為巖藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸基＝約10∶7∶4∶5∶20，以下稱為U-巖藻依聚糖)，③由巖藻糖、半乳糖構(gòu)成的硫酸化巖藻半乳聚糖，例如PCT/JP00/00965號說明書中記載的硫酸化巖藻半乳聚糖(構(gòu)成糖及其摩爾比為巖藻糖∶半乳糖＝1∶1～6，以下稱為G-巖藻依聚糖)等含有硫酸化巖藻糖的多糖。
這些多糖總稱為巖藻依聚糖或巖藻多糖，其結(jié)構(gòu)大多根據(jù)作為來源的海藻而不同。例如，已知分別由墨角藻、海帶、沖繩海蘊(yùn)、海蘊(yùn)或裙帶菜提取的硫酸化多糖具有不同的結(jié)構(gòu)。而且，這些含有硫酸化巖藻糖的多糖由于幾乎均為高分子的陰離子，因此在各種純化步驟中理化性狀相同，難以分離。因此，多數(shù)情況下不分別分離褐藻類的含有硫酸化巖藻糖的多糖，直接考察生物活性。例如，有報道指出硫酸化巖藻聚糖級分具有很強(qiáng)的抗凝血活性，硫酸化巖藻葡糖醛酸甘露聚糖級分對癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的活性。但是，難以確定具有所發(fā)現(xiàn)的生物活性的物質(zhì)是哪一種含有硫酸化巖藻糖的多糖。
作為藥物開發(fā)這種具有生理活性的硫酸化多糖時，必須確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，分解具有生理活性的硫酸化多糖的酶變得很必要。另外，即使是由上述硫酸化多糖得到低聚糖的場合，也有必要獲得分解上述各種硫酸化多糖的酶。
但是，分解褐藻類的硫酸化多糖的酶沒有市售，而且褐藻類的硫酸化多糖大多根據(jù)海藻的種類而不同，因此確定1種硫酸化多糖的結(jié)構(gòu)時，特異地分解該硫酸化多糖的分解酶是必要的。例如，為了得到分解特定的硫酸化多糖的酶，大多是篩選利用該硫酸化多糖作為資源的微生物。這時，分離利用特定的硫酸化多糖作為資源的微生物，進(jìn)行鑒定，研究培養(yǎng)條件，能夠有效生產(chǎn)硫酸化多糖分解酶，但是分離、鑒定需要很長的時間。另外，1種微生物利用1種以上硫酸化多糖作為資源的實例較少，至于跨越若干目或科的利用褐藻類的硫酸化多糖作為資源的微生物更是幾乎不知道。
因此，期望使用已經(jīng)鑒定的分離菌生產(chǎn)硫酸化多糖分解酶，或者由一種菌株生產(chǎn)幾種硫酸化多糖分解酶。
另外，在最近關(guān)于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化多糖的研究中，報道了該多糖抑制胃潰瘍病因微生物幽門螺桿菌對胃粘膜的附著，可以使用該多糖和成纖維細(xì)胞增殖因子的復(fù)合體作為成纖維細(xì)胞增殖促進(jìn)劑，通過口服給予該多糖能夠預(yù)防細(xì)菌和病毒等引起的感染等。因此，對于與沖繩海蘊(yùn)有關(guān)的生理活性以及來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行研究。例如，對于該多糖有2篇報道，一篇是Glycoconjugate Journal，第16卷，19-26頁(1999)記載的巖藻糖∶葡糖醛酸∶硫酸基∶乙?；哪柋葹?.1∶1.0∶2.9∶1且分子量為約56000的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，另一篇是應(yīng)用糖質(zhì)科學(xué)，第43卷，143-148頁(1996)記載的巖藻糖∶葡糖醛酸∶木糖∶硫酸基∶乙?；哪柋葹?～4∶0.8～1.2∶0.1～0.3∶0.8～1.2∶0.5～1且分子量為約50萬～60萬的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。但是，現(xiàn)在也只不過是通過物理化學(xué)分析明確了其平均結(jié)構(gòu)。
另外，為了開發(fā)藥品等有必要得到結(jié)構(gòu)保持均一的低聚糖，但是由例如來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化多糖得到結(jié)構(gòu)保持均一的低聚糖很困難。
根據(jù)上述情況，需求分解多種來源于褐藻類的硫酸化多糖的微生物，特異地分解來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化多糖即硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的酶，以及利用酶制備的結(jié)構(gòu)均一的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供分解多種來源于褐藻類的硫酸化多糖的新型微生物、對糖鏈學(xué)有用的分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的3種酶、該酶的制備方法、以及使該酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用得到的低分子化物及其制備方法、以及硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解酶的活化因子。發(fā)明概述本發(fā)明人進(jìn)行了悉心研究，結(jié)果成功地分離了具有利用來源于多種褐藻類的多種硫酸化多糖作為資源的能力的細(xì)菌，命名為Fucophilus屬。另外，也發(fā)現(xiàn)屬于Fucophilus屬的細(xì)菌的1個菌株即Fucophilus fucoidanolytics SI-1234株生產(chǎn)3種硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解酶，即巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶以及內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶。另外，還發(fā)現(xiàn)了這些酶的制備方法。而且，還發(fā)現(xiàn)氯化鈉、鈣鹽以及蛋白質(zhì)對于有效利用這些酶有用。另外，還發(fā)現(xiàn)了可以用作糖鏈學(xué)用試劑的利用酶制備的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖、脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖、結(jié)構(gòu)均一的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖及其制備方法，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明的第1項發(fā)明涉及巖藻依聚糖脫乙酰酶，其特征在于具有下述理化性質(zhì)。該酶能夠作用于硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，水解乙酰基，使乙酸游離，最適pH在約6～9.1的范圍，最適溫度在約23～45℃的范圍。
本發(fā)明的第2項發(fā)明涉及α-D-葡糖醛酸酶，其特征在于具有下述理化性質(zhì)。該酶能夠作用于脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，水解α-D-葡糖醛酸鍵，使D-葡糖醛酸游離，最適pH在約5.8～7.8的范圍，最適溫度在約14～29℃的范圍。
本發(fā)明的第3項發(fā)明涉及內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，其特征在于具有下述理化性質(zhì)。該酶能夠作用于脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，內(nèi)切地水解α-L-巖藻糖苷鍵，生成還原性末端具有L-巖藻糖的低聚糖，最適pH在約4.5～7.5的范圍，最適溫度在約23～42℃的范圍。
在本發(fā)明的第1～第3項發(fā)明中，巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶或內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶能夠通過培養(yǎng)具有該酶的生產(chǎn)能力的微生物，并由其培養(yǎng)物采集該酶進(jìn)行制備。
本發(fā)明的第4項發(fā)明涉及脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的制備方法，其特征在于，使本發(fā)明的第1項發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，采集除去了至少1分子以上乙酰基得到的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。
本發(fā)明的第5項發(fā)明涉及通過本發(fā)明的第4項發(fā)明的方法得到的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖或其鹽。
本發(fā)明的第6項發(fā)明涉及脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的制備方法，其特征在于，使本發(fā)明的第2項發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶對脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，采集除去了至少1分子以上葡糖醛酸殘基得到的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。
本發(fā)明的第6項發(fā)明中，脫葡糖醛酸化可以在氯化鈉、鈣鹽和/或蛋白質(zhì)共存的條件下進(jìn)行。
本發(fā)明的第7項發(fā)明涉及通過本發(fā)明的第6項發(fā)明的方法得到的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖或其鹽。
本發(fā)明的第8項發(fā)明涉及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的制備方法，其特征在于，使巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，并采集。這時，可以使巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶同時作用，也可以按照巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶、內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的順序使之作用。
本發(fā)明的第9項發(fā)明涉及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的制備方法，其特征在于，使α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對通過堿處理脫乙?；玫降牧蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖作用，并采集。這時，可以使α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶同時作用，也可以首先使α-D-葡糖醛酸酶作用后，再使內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶作用。
本發(fā)明的第8和第9項發(fā)明中，可以在氯化鈉、鈣鹽和/或蛋白質(zhì)共存的條件下進(jìn)行。
本發(fā)明的第10項發(fā)明涉及通過本發(fā)明的第8～第9項發(fā)明的方法得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖或其鹽。
本發(fā)明的第11項發(fā)明涉及具有選自下述通式(I)～(III)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖化合物或其鹽。 (式中，R為H或SO3H或CH3CO。另外，n為0或1以上的整數(shù))。
本發(fā)明的第12項發(fā)明涉及硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖或其鹽，其特征在于具有下述理化性質(zhì)。該硫酸化多糖可以例舉作為構(gòu)成糖含有巖藻糖和葡糖醛酸，其摩爾比為35～44∶10，并以下述通式(VIII)表示的硫酸化糖作為構(gòu)成糖的必需成分的硫酸化多糖。 (式中，R為H或SO3H或CH3CO)。
本發(fā)明的第12項發(fā)明中，上述通式(VIII)中的n優(yōu)選在1～5000的范圍。
本發(fā)明的第13項發(fā)明涉及具有利用來源于褐藻類的多種硫酸化多糖作為資源的能力的Fucophilus屬細(xì)菌。
本發(fā)明的第13項發(fā)明中，該Fucophilus屬細(xì)菌包括電子傳遞鏈具有甲萘醌，且GC含量為約50％的細(xì)菌。另外，還包括具有16S核糖體DNA的細(xì)菌，所述16S核糖體DNA具有與序列表中序列號3記載的16S核糖體DNA的堿基序列具有90％以上同源性的堿基序列。沒有特別的限定，可以例舉Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株(FERMP-17517)。


圖1是表示本發(fā)明得到的巖藻依聚糖脫乙酰酶的pH和相對活性(％)的關(guān)系的圖。
圖2是表示本發(fā)明得到的巖藻依聚糖脫乙酰酶的溫度(℃)和相對活性(％)的關(guān)系的圖。
圖3是表示本發(fā)明得到的α-D-葡糖醛酸酶的pH和相對活性(％)的關(guān)系的圖。
圖4是表示本發(fā)明得到的α-D-葡糖醛酸酶的溫度(℃)和相對活性(％)的關(guān)系的圖。
圖5是表示本發(fā)明得到的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的pH和相對活性(％)的關(guān)系的圖。
圖6是表示本發(fā)明得到的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的溫度(℃)和相對活性(％)的關(guān)系的圖。
圖7是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)的1H-NMR波譜的圖。
圖8是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)的13C-NMR波譜的圖。
圖9是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)的質(zhì)譜的圖。
圖10是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(2)的質(zhì)譜的圖。
圖11是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的1H-NMR波譜的圖。
圖12是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的13C-NMR波譜的圖。
圖13是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的質(zhì)譜的圖。
圖14是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(4)的質(zhì)譜的圖。
圖15是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(5)的1H-NMR波譜的圖。
圖16是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(5)的13C-NMR波譜的圖。
圖17是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(5)的質(zhì)譜的圖。
圖18是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(6)的質(zhì)譜的圖。
圖19是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(7)的1H-NMR波譜的圖。
圖20是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(7)的13C-NMR波譜的圖。
圖21是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(7)的質(zhì)譜的圖。
圖22是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(8)的質(zhì)譜的圖。
圖23是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖2-(3)的1H-NMR波譜的圖。
圖24是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖2-(3)的13C-NMR波譜的圖。
圖25是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖2-(3)的質(zhì)譜的圖。
圖26是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖2-(5)的1H-NMR波譜的圖。
圖27是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖2-(5)的13C-NMR波譜的圖。
圖28是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖低分子化物——低聚糖2-(5)的質(zhì)譜的圖。
圖29是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(3)的1H-NMR波譜的圖。
圖30是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(3)的13C-NMR波譜的圖。
圖31是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖低分子化物——低聚糖3-(3)的質(zhì)譜的圖。
圖32是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(4)的1H-NMR波譜的圖。
圖33是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(4)的13C-NMR波譜的圖。
圖34是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖低分子化物——低聚糖3-(4)的質(zhì)譜的圖。
圖35是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(5)的1H-NMR波譜的圖。
圖36是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(5)的13C-NMR波譜的圖。
圖37是表示本發(fā)明得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖低分子化物——低聚糖3-(5)的質(zhì)譜的圖。
發(fā)明詳述以下，具體說明本發(fā)明。
本說明書中屬于Fucophilus屬的細(xì)菌只要是能夠利用來源于褐藻類的多種硫酸化多糖作為資源的細(xì)菌即可，例如適于使用能夠分別利用1種以上來源于龍目(Kjellmaniella crassifolia Miyabe)、海帶(Laminaria japonica Areschoug)、裙帶菜(Undariapinnatifida(Harvey)Suringar)、海蘊(yùn)(Nemacystus decipiens(Suringar)Kuckuck)、沖繩海蘊(yùn)(Cladosiphon okamuranusTokida)、黑巨藻(Lessonia nigrescens)、墨角藻(Fucusvesiculosus)、泡葉藻(Ascophyllum nodosum)等褐藻類的硫酸化多糖作為資源的細(xì)菌。本發(fā)明中，所謂“利用……作為資源”是指生物將添加到培養(yǎng)基中的物質(zhì)直接或者低分子化后攝取到生物體內(nèi)的過程，或者通過代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)的過程。本說明書中，能夠生產(chǎn)將來源于上述褐藻類的硫酸化多糖低分子化的酶的微生物包含在能夠利用來源于褐藻類的硫酸化多糖作為資源的微生物中。本發(fā)明的Fucophilus屬細(xì)胞是不可能僅僅通過以前的細(xì)菌學(xué)分類方法鑒定的細(xì)菌，有必要將分子遺傳學(xué)上分類的方法，例如基于與16S核糖體DNA(rDNA，編碼核糖體RNA的DNA)的堿基序列的同源性進(jìn)行分類的方法與以前的方法組合使用。也就是說，本發(fā)明的Fucophilus屬細(xì)菌包括細(xì)菌學(xué)上分類于Fucophilus屬的細(xì)菌，以及其16S rDNA堿基序列與本說明書中公開的Fucophilus屬細(xì)菌的16S rDNA堿基序列具有約90％以上的同源性的細(xì)菌。16S rDNA的堿基序列的同源性解析例如可以利用互聯(lián)網(wǎng)上的國際生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)主頁上能夠利用的AdvancedBLAST search。
作為上述Fucophilus屬細(xì)菌沒有特別的限定，例如適于使用本發(fā)明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株。該Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株是本發(fā)明人由海參消化管內(nèi)容物新檢索得到的細(xì)菌，其細(xì)菌學(xué)性質(zhì)如下所述。a.形態(tài)學(xué)性質(zhì)本細(xì)菌是直徑1.2～1.6μm的球菌。
孢子的有無 無革蘭氏染色性陰性b.生理學(xué)性質(zhì)(1)繁殖溫度在25℃下繁殖。
(2)對氧的態(tài)度 好氧性(3)過氧化氫酶 陽性(4)氧化酶 陰性(5)鹽類需求性在0％食鹽培養(yǎng)基上的繁殖陰性在1％食鹽培養(yǎng)基上的繁殖陰性在海水培養(yǎng)基上的繁殖 陽性(6)醌類甲萘醌7
(7)菌體內(nèi)DNA的GC含量52％(8)OF-試驗 不生成酸(9)菌落的色調(diào)不生成特征性菌落色素(10)運(yùn)動性 陰性(11)滑行性 陰性(12)鞭毛 無本菌株按照Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology，第9卷(1994)記載的基本分類屬于第4組(革蘭氏陰性好氧性桿菌和球菌)。但是本菌株在電子傳遞鏈上具有甲萘醌7且GC含量為52％，在這點(diǎn)上與屬于第4組的細(xì)菌不同。因此，為了確定本菌株的16S rDNA的堿基序列，使用具有序列表中序列號1和2記載的堿基序列的引物以及TaKaRa PCR Amplification Kit，擴(kuò)增16S rDNA區(qū)域，按照常規(guī)方法解析該擴(kuò)增片斷的堿基序列。該16S rDNA的堿基序列如序列表中序列號3所示。對于序列表中序列號3的堿基序列，比較與已知細(xì)菌的同源性，結(jié)果不存在與16S rDNA的整個區(qū)域(約1500個堿基)顯示約90％以上同源性的已知菌株。因此，本發(fā)明人斷定本菌株是不屬于已知屬的新屬的細(xì)菌，并將本菌株命名為Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株。另外，上述Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株根據(jù)布達(dá)佩斯條約于平成11年8月18日(原保藏日)以保藏號FERM BP-7495保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心〔日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番號305-8566)〕。
實際上，沒有特別的限定，例如以來源于龍目(Kjellmaniellacrassifolia Miyabe)、海帶(Laminaria japonica Areschoug)、裙帶菜(Undaria pinnatifida(Harvey)Suringar)、黑巨藻(Lessonianigrescens)、黑菜(Ecklonia maxima)等屬于海帶目(Laminariales)的褐藻類，或海蘊(yùn)(Nemacystu sdecipiens(Suringar)Kuckuck)、沖繩海蘊(yùn)(Cladosiphon okamuranusTokida)等屬于索藻目(Chordariales)的褐藻類，或墨角藻(Fucusvesiculosus)、泡葉藻(Ascophyllum nodosum)等屬于巖藻目(Fucales)的褐藻類的各種硫酸化多糖作為基質(zhì)培養(yǎng)上述Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株，則培養(yǎng)基中的各種硫酸化多糖被利用，而且如果將該菌體提取液與各種硫酸化多糖混合，則明顯可見硫酸化多糖的低分子化。
本發(fā)明的Fucophilus fucoidanolyticus 1234株是具有下述能力的微生物，即利用來源于上述褐藻類的多種硫酸化多糖作為資源的能力、分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的能力以及生產(chǎn)本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的能力。
本說明書中，硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖是主要含有巖藻糖和葡糖醛酸作為構(gòu)成糖且摩爾比為35～44∶10的硫酸化多糖，已知具有乙?；Ｗ鳛榱蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖，例如巖藻糖和葡糖醛酸及乙?；哪柋葹?∶1∶0.5的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。另外，平均分子量例如按照HPLC凝膠過濾法為約100萬(分子量分布為約10萬～200萬)。
本說明書中，硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)如下述通式(VIII)所示。上述硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖包括下述通式中n為1以上的整數(shù)，例如1～5000的范圍，更優(yōu)選1～1000的范圍的物質(zhì)。另外，只要在上述范圍內(nèi)，具有下述通式(VIII)連續(xù)重復(fù)的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)以及具有中間存在其它結(jié)構(gòu)非連續(xù)地含有下述通式(VIII)的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)均包括在上述硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖中。 (式中，R為H或SO3H或CH3CO。)
另外，上述硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的分子量、糖組成以及硫酸基含量根據(jù)該硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的原料的收獲期、該原料的干燥方法、該原料的保存方法、提取硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖時的加熱條件或pH條件等而不同。例如有時用酸水解該硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。因此，本說明書中記載的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的分子量、分子量分布、糖組成或硫酸基含量只不過是其中1個例子，根據(jù)該硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的提取處理條件能夠容易地改變其分子量、分子量分布、糖組成或硫酸基含量。例如，如果采用pH6.0、95℃、2小時的提取方法由沖繩海蘊(yùn)進(jìn)行提取，則能夠得到具有上述糖組成和分子量的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。也就是說，根據(jù)制備方法的條件，可以制備任意分子量、分子量分布、糖組成或硫酸基含量的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。例如，上述硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的主要構(gòu)成糖每4個巖藻糖就含有約2個硫酸基殘基，一般情況下通過酯鍵結(jié)合在糖上的硫酸基在化學(xué)上不穩(wěn)定，容易被酸、堿或熱切斷。例如，如果在酸性或堿性條件下進(jìn)行加熱處理，其硫酸含量或乙?；縿t會減少。也就是說，能夠由硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖有意圖地進(jìn)行脫硫酸或脫乙?；?。另外，脫硫酸或脫乙?；瘯r，如果調(diào)整酸或堿的種類或濃度、加熱處理時的溫度或時間，則能夠調(diào)整切斷的硫酸基或乙?；牧?。沒有特別的限定，例如用約0.5～1N氫氧化鈉溶液在25℃處理24小時得到的脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖適于用作本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶或內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的底物。
因此，本說明書的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖只要是具有上述特征的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖或者用本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解酶進(jìn)行低分子化得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，包括所有來源于褐藻類的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。其來源沒有特別的限定，例如沖繩海蘊(yùn)、石海蘊(yùn)(Sphaerotrichia divaricata(Agardh)Kylin)、頂毛藻(Eudesme viescens(Carmichael)J.Agardh)、面條藻(Tinocladia crassa(Suringar)Kylin)等索藻科(Chordariaceae)的褐藻類中硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的含量高，適于作為原料。
例如來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化多糖的主鏈由L-巖藻糖構(gòu)成，該L-巖藻糖與一般的糖相比對酸不穩(wěn)定，因此認(rèn)為在pH3.0或利用0.2N鹽酸進(jìn)行提取時，會發(fā)生硫酸化多糖的低分子化。也就是說，來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化多糖也和其它以硫酸化L-巖藻糖為主要構(gòu)成糖的多糖同樣，通過加熱或酸處理容易低分子化。
本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖在分子中具有硫酸基和/或羧酸基，該基團(tuán)與各種堿反應(yīng)形成鹽。本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖成鹽的狀態(tài)穩(wěn)定，通常以鈉和/或鉀和/或鈣等鹽的形態(tài)提供。這些物質(zhì)的鹽可以通過利用Dowex 50W等陽離子交換樹脂，獲得游離的本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。另外，這些物質(zhì)也可以根據(jù)需要進(jìn)行公知慣用的鹽交換，交換成所需的各種鹽。
作為本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的鹽，可以使用藥學(xué)上允許的鹽，例如鈉、鉀等堿金屬，鈣、鎂、鋅等堿土金屬、銨等的鹽。
制備本發(fā)明使用的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖時，首先得到褐藻類的水溶性級分提取液。這時，為了防止硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的低分子化，優(yōu)選在pH4～9、溫度100℃以下得到水溶性級分提取液。另外，上述提取液中的氨基酸或低分子性色素等可以通過超濾有效除去。而且，對于除去疏水性物質(zhì)，活性炭處理等也是有效的。這樣可以得到來源于褐藻類的硫酸化多糖級分。另外，如果采用陰離子交換柱分離該級分，則可以得到更高純度的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。
采用上述方法得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖顯示育發(fā)效果。因此，作為例如育發(fā)劑的構(gòu)成成分是有用的。
而且，按照上述方法得到的硫酸化多糖級分或用陰離子交換柱純化得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖均可以用作本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶以及內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的底物。另外，也可以用作純化本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶時的活性測定用底物，或者制備本發(fā)明的脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖、脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖時的原料。
本說明書中，硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖是指由硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖生成的低聚糖?；旧虾辛蛩峄?、葡糖醛酸基、巖藻糖基、乙?；?，但是僅僅由硫酸基和巖藻糖基構(gòu)成的場合、來源為硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的場合也稱為硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。
本說明書中，巖藻依聚糖脫乙酰酶是指對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖等作用，水解乙?；?，使醋酸游離的酶。本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的理化性質(zhì)如下所述。
(I)作用對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖等作用，水解乙?；勾姿嵊坞x。
(II)最適pH該酶的最適pH為約6～9.1的范圍(圖1)。
也就是說，圖1是表示該酶反應(yīng)時的pH和相對活性的關(guān)系的圖，縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示pH。
(III)最適溫度該酶的最適溫度為約23～45℃的范圍(圖2)。
也就是說，圖2是表示該酶反應(yīng)時的溫度和相對活性的關(guān)系的圖，縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示溫度(℃)。
(IV)分子量采用凝膠過濾法測定時，為約3萬～5萬。
本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的確認(rèn)可以通過測定熒光標(biāo)識了具有乙?；牧蛩峄咸侨┧釒r藻低聚糖及其還原性末端的化合物的分解活性進(jìn)行。通過使用這些熒光標(biāo)識低聚糖，能夠構(gòu)筑微量、高靈敏度的活性測定體系。另外，使巖藻依聚糖脫乙酰酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖作用后，分離反應(yīng)產(chǎn)物中含有的醋酸和脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻低聚糖，分別測定醋酸量和乙?；牧?，另外進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量分析，也能夠確認(rèn)巖藻依聚糖脫乙酰酶活性。本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的活性可以用其生產(chǎn)菌的無細(xì)胞提取液進(jìn)行測定，也可以用通過各種柱色譜純化后的酶液進(jìn)行測定。
在1種實施方式中，本發(fā)明的脫乙酰酶可以在氯化鈉和/或蛋白質(zhì)的存在下活化。這些因子單獨(dú)或者兩者組合均有效。首先對氯化鈉進(jìn)行說明，可以使用試劑級氯化鈉、食鹽、海水、人工海水等，只要含有氯化鈉任何物質(zhì)均可使用。本發(fā)明的脫乙酰酶的反應(yīng)液中添加的氯化鈉濃度優(yōu)選為0.1mM～1M的范圍，更優(yōu)選1mM～600mM的范圍。
其次說明蛋白質(zhì)，為了活化本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶在反應(yīng)液中添加的蛋白質(zhì)只要不分解本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶且不抑制其反應(yīng)，任何蛋白質(zhì)均可。優(yōu)選使用牛血清白蛋白等。另外，也可以使用例如由本發(fā)明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的菌體提取的蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的反應(yīng)液中添加的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選為0.001～10mg/ml的范圍，更優(yōu)選0.01～1mg/ml的范圍。
本說明書中，α-D-葡糖醛酸酶是指對脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖等作用，水解葡糖醛酸和巖藻糖之間的α-D-葡糖醛酸鍵，使D-葡糖醛酸游離的酶。本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的理化性質(zhì)如下所述。
(I)作用對脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖等作用，水解α-D-葡糖醛酸鍵，使D-葡糖醛酸游離。
(II)最適pH該酶的最適pH為約5.8～7.8的范圍(圖3)。
也就是說，圖3是表示該酶反應(yīng)時的pH和相對活性的關(guān)系的圖，縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示pH。
(III)最適溫度該酶的最適溫度為約14～29℃的范圍(圖4)。
也就是說，圖4是表示該酶反應(yīng)時的溫度和相對活性的關(guān)系的圖，縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示溫度(℃)。
(IV)分子量采用凝膠過濾法測定時，為約12～18萬。
本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的確認(rèn)可以通過測定脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的分解活性進(jìn)行。另外，使用2-氨基吡啶熒光標(biāo)識了硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖及其還原末端得到的化合物也可以作為該酶的底物，通過使用這些熒光標(biāo)識低聚糖，能夠構(gòu)筑微量、高靈敏度的活性測定體系。使α-D-葡糖醛酸酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖作用后，分離反應(yīng)產(chǎn)物中含有的葡糖醛酸和硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，分別測定總糖量和總糖醛酸量，另外進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量分析，也能夠確認(rèn)α-D-葡糖醛酸酶活性。本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的活性可以用其生產(chǎn)菌的無細(xì)胞提取液進(jìn)行測定，也可以用通過各種柱色譜純化后的酶液進(jìn)行測定。
在1種實施方式中，本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶可以在氯化鈉、鈣離子和/或蛋白質(zhì)的存在下活化。這些因子單獨(dú)或者2種或3種組合均有效。首先對氯化鈉進(jìn)行說明，可以使用試劑級氯化鈉、食鹽、海水、人工海水等，只要含有氯化鈉任何物質(zhì)均可使用。本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的反應(yīng)液中添加的氯化鈉濃度優(yōu)選為0.1mM～1M的范圍，更優(yōu)選1mM～600mM的范圍。
其次說明鈣離子，只要產(chǎn)生鈣離子任何物質(zhì)均可。優(yōu)選使用可溶性的鈣鹽，例如氯化鈣、醋酸鈣等。另外，即使是難溶性的鈣鹽，例如碳酸鈣、磷酸鈣、枸櫞酸鈣、硫酸鈣等，由于在硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖等硫酸化多糖溶解的狀態(tài)下緩慢產(chǎn)生鈣離子，因此也可以用于本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的活化。另外，硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的硫酸基或羧基的反荷離子含有鈣鹽時，由于底物本身可以作為鈣離子的發(fā)生源，因此為了活化添加的鈣離子源能夠相應(yīng)減少。根據(jù)情況，即使不添加鈣鹽，該酶也發(fā)生作用。本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的反應(yīng)液中添加的鈣離子濃度優(yōu)選為0.1～200mM的范圍，更優(yōu)選1～100mM的范圍。
其次說明蛋白質(zhì)，為了活化本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶在反應(yīng)液中添加的蛋白質(zhì)只要不分解本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶且不抑制其反應(yīng)，任何蛋白質(zhì)均可。優(yōu)選使用牛血清白蛋白等。另外，也可以使用例如由本發(fā)明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234的菌體提取的蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的反應(yīng)液中添加的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選為0.001～10mg/ml的范圍，更優(yōu)選0.01～1mg/ml的范圍。
本說明書中，內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶是指對脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖、硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖等作用，內(nèi)切地水解α-L-巖藻糖苷鍵，生成還原性末端具有L-巖藻糖的低聚糖的酶。本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對天然的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖幾乎不發(fā)生作用，但是對于預(yù)先用巖藻依聚糖脫乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶處理過的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，或者對于巖藻依聚糖脫乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶共存條件下的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖能很好地發(fā)揮作用。但是，即使是天然的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的場合，如果由于例如其它來源于海洋細(xì)菌的酶或物理、化學(xué)原因等任何理由除去了乙?；推咸侨┧幔瑒t也適于用作本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的底物。
本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的理化性質(zhì)如下所述。
(I)作用對脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖、硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖等作用，內(nèi)切地水解α-L-巖藻糖苷鍵，生成還原性末端具有L-巖藻糖的低聚糖。
(II)最適pH該酶的最適pH為約4.5～7.4的范圍(圖5)。
也就是說，圖5是表示該酶反應(yīng)時的pH和相對活性的關(guān)系的圖，縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示pH。
(III)最適溫度該酶的最適溫度為約23～42℃的范圍(圖6)。
也就是說，圖6是表示該酶反應(yīng)時的溫度和相對活性的關(guān)系的圖，縱軸表示相對活性(％)，橫軸表示溫度(℃)。
(IV)分子量采用凝膠過濾法測定時，為約15萬～20萬。
本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的確認(rèn)可以通過測定脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的分解活性進(jìn)行。另外，使用2-氨基吡啶熒光標(biāo)識了用本發(fā)明的α-I-葡糖醛酸酶處理硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖得到的低聚糖及其還原末端而成的化合物也可以作為該酶的底物，通過使用該熒光標(biāo)識低聚糖，能夠構(gòu)筑微量、高靈敏度的活性測定體系。例如，使用8Fuc-4S-PA(下述)作為底物使之反應(yīng)，采用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物，能夠測定內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活性。本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活性可以用其生產(chǎn)菌的無細(xì)胞提取液進(jìn)行測定，也可以用通過各種柱色譜純化后的酶液進(jìn)行測定。
在1種實施方式中，本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶可以在氯化鈉、鈣離子和/或蛋白質(zhì)的存在下活化。這些因子單獨(dú)或者2種或3種組合均具有活化作用。首先對氯化鈉進(jìn)行說明，可以使用試劑級氯化鈉、食鹽、海水、人工海水等，只要含有氯化鈉任何物質(zhì)均可使用。本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的反應(yīng)液中添加的氯化鈉濃度優(yōu)選為0.1mM～1M的范圍，更優(yōu)選1mM～600mM的范圍。
其次說明鈣離子，只要產(chǎn)生鈣離子任何物質(zhì)均可。優(yōu)選使用可溶性的鈣鹽，例如氯化鈣、醋酸鈣等。另外，即使是難溶性的鈣鹽，例如碳酸鈣、磷酸鈣、枸櫞酸鈣、硫酸鈣等，由于在硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖等硫酸化多糖溶解的狀態(tài)下緩慢產(chǎn)生鈣離子，因此也可以用于本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活化。另外，硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的硫酸基或羧基的反荷離子含有鈣鹽時，由于底物本身可以作為鈣離子的發(fā)生源，因此為了活化添加的鈣離子源能夠相應(yīng)減少。根據(jù)情況，即使不添加鈣鹽，該酶也發(fā)生作用。本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的反應(yīng)液中添加的鈣離子濃度優(yōu)選為0.1～200mM的范圍，更優(yōu)選1～100mM的范圍。
其次說明蛋白質(zhì)，為了活化本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶在反應(yīng)液中添加的蛋白質(zhì)只要不分解本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶且不抑制其反應(yīng)，任何蛋白質(zhì)均可。優(yōu)選使用牛血清白蛋白等。另外，也可以使用例如由本發(fā)明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的菌體提取的蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的反應(yīng)液中添加的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選為0.001～10mg/ml的范圍，更優(yōu)選0.01～1mg/ml的范圍。
作為制備本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶以及內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶時使用的微生物，只要是產(chǎn)生將上述硫酸化多糖級分或硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖低分子化的酶的微生物即可，并沒有特別的限定，例如適于使用Fucophilus屬細(xì)菌。上述Fucophilus屬細(xì)菌包括所有根據(jù)細(xì)菌學(xué)性質(zhì)分類為同一屬的細(xì)菌，或者基于16S rDNA的堿基序列的同源性分類為同一屬的細(xì)菌，只要是產(chǎn)生與本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶或內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶同樣分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的酶的微生物，包括所有的微生物。
培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的微生物時，加入到培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源只要是利用所使用的微生物，在其存在下生產(chǎn)該酶的物質(zhì)即可，作為碳源，可以利用例如硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖、沖繩海蘊(yùn)等海藻、海藻酸、昆布糖、巖藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥芽糖、淀粉等，作為氮源，例如酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米漿、肉膏、脫脂大豆、硫酸銨、氯化銨、尿素、尿酸等較為合適。此外，也可以加入鈉、鉀、鎂、鈣、鋅等的氯化物、磷酸鹽、硫酸鹽等。另外，該微生物的培養(yǎng)基也可以是海水或市售的人工海水的培養(yǎng)基。
另外，培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成等當(dāng)然是根據(jù)使用的微生物進(jìn)行設(shè)定，以便使本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的產(chǎn)量達(dá)到最大。例如，優(yōu)選培養(yǎng)溫度為15～30℃，培養(yǎng)基的pH為5～9，通氣攪拌培養(yǎng)5～72小時，在上述條件下，本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的產(chǎn)量能夠達(dá)到最大。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離分為菌體和培養(yǎng)上清液，由菌體和培養(yǎng)上清液分別可以得到本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶。
沒有特別的限定，例如用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株，收集其菌體，利用通常采用的細(xì)胞破碎方法，例如超聲波處理，將菌體破碎，得到無細(xì)胞提取液。接著，按照通常采用的純化方法能夠由該提取液得到純化酶制品。通過例如鹽析、離子交換柱色譜、疏水柱色譜、凝膠過濾等進(jìn)行純化，能夠得到純化的本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，實質(zhì)上不含有其它含硫酸化巖藻糖的多糖分解酶。另外，如果使用固定了硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的樹脂，也能夠容易地分離本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶。
而且，由于上述培養(yǎng)上清液中大量存在本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，因此可以采用與菌體內(nèi)的酶同樣的純化方法進(jìn)行純化。
上述Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株是利用硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作為資源的微生物，為了分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，在菌體內(nèi)和菌體外生產(chǎn)本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶。這3種酶可以通過柱純化操作分離。
本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶如果與本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶共存，則將硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解為硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，但是單獨(dú)使用時幾乎不能分解。另外，本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶能夠單獨(dú)分解本發(fā)明的脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。因此，可以得知為了將硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解成硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，不一定必須與本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶共存，但硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的脫乙?；兔撈咸侨┧崾潜匾?。
本說明書中，脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖是指使本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶對脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖作用，將至少1分子以上的α-D-葡糖醛酸鍵水解得到的物質(zhì)。如果由該脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖除去D-葡糖醛酸，最終葡糖醛酸含量達(dá)到零(即，為脫乙?；牧蛩峄瘞r藻聚糖)，但是通過調(diào)整酶反應(yīng)的條件，可以制備巖藻糖和葡糖醛酸的摩爾比為4∶1至4∶0的各種葡糖醛酸含量的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。
為了得到本發(fā)明的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖，可以使α-D-葡糖醛酸酶對脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖作用，通過例如超濾、凝膠過濾、陰離子交換柱處理等除去游離的D-葡糖醛酸。根據(jù)需要，也可以進(jìn)行脫鹽、冷凍干燥等處理。進(jìn)行脫葡糖醛酸化處理時，如果預(yù)先通過巖藻依聚糖脫乙酰酶處理或堿處理等對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖進(jìn)行脫乙?；?，則能夠有效進(jìn)行脫葡糖醛酸化。
例如，對來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖進(jìn)行脫乙?；玫降拿撘阴；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖中每4分子巖藻糖含有1分子左右的D-葡糖醛酸，利用α-D-葡糖醛酸酶除去D-葡糖醛酸，能夠制備各種葡糖醛酸含量的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。通過調(diào)整脫葡糖醛酸反應(yīng)中使用的酶的量或底物的量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、pH等條件，沒有特別的限定，例如在1g脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖中混合適量的氯化鈉、牛血清白蛋白以及500mU本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶，在20℃、pH7附近使之進(jìn)行各種時間的反應(yīng)，能夠制備巖藻糖和葡糖醛酸的摩爾比為4∶1至4∶0的各種葡糖醛酸含量的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。
脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖可以直接用作糖鏈學(xué)用試劑，除了可以作為本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的底物用于活性測定以外，其反應(yīng)產(chǎn)物本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖作為糖鏈學(xué)用試劑也是有用的。
制備本發(fā)明的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖時，脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖或脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖含有物的溶解可以采用常規(guī)方法進(jìn)行，溶解液中的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖或該脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖含有物的濃度可以是其最高溶解濃度，但通?？梢钥紤]其操作性、酶效價進(jìn)行設(shè)定。作為脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的溶解液，可以根據(jù)目的由水、緩沖液等進(jìn)行選擇。溶解液的pH通常為中性附近，酶反應(yīng)通常在20℃附近進(jìn)行。通過調(diào)整酶量、反應(yīng)液的組成、反應(yīng)時間等，也可以調(diào)整脫葡糖醛酸的程度。脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖可以根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行離子交換樹脂處理、超濾等純化操作，也可以根據(jù)需要進(jìn)行脫鹽處理、無菌處理、冷凍干燥處理。
本發(fā)明的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖在分子中具有硫酸基和/或羧基，該基團(tuán)與各種堿反應(yīng)形成鹽。本發(fā)明的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖成鹽的狀態(tài)穩(wěn)定，通常以鈉和/或鉀和/或鈣等的鹽的形態(tài)提供。這些物質(zhì)的鹽可以通過利用Dowex 50W等陽離子交換樹脂，獲得游離的本發(fā)明的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。另外，這些物質(zhì)也可以根據(jù)需要進(jìn)行公知慣用的鹽交換，交換成所需的各種鹽。
作為本發(fā)明的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的鹽，可以使用藥學(xué)上允許的鹽，例如鈉、鉀等堿金屬，鈣、鎂、鋅等堿土金屬、銨等的鹽。
本說明書中，硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖是指使本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶對上述硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用或者通過堿處理等脫乙酰后，使α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶作用得到的低聚糖，還原性末端糖為L-巖藻糖。沒有特別的限定，可以例舉具有選自下述通式(I)～(III)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖化合物。 (式中，R為H或SO3H或CH3CO。) (式中，R為H或SO3H或CH3CO。) (式中，R為H或SO3H或CH3CO。另外，n為0或1以上的整數(shù)。)
本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖能夠通過使本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖或硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖含有物作用有效制備，也可以通過使本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對預(yù)先經(jīng)堿處理等化學(xué)處理脫乙酰后的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用進(jìn)行制備。作為硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖含有物，適于使用例如硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的部分純化品、來源于褐藻類的含有硫酸化巖藻糖的多糖級分、褐藻類的水性溶劑提取物或褐藻類藻體。另外，當(dāng)然使本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對本發(fā)明的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖作用，也能夠得到本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。沒有特別的限定，例如將來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖脫乙?；?，使本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶作用，能夠得到具有選自上述通式(I)～(III)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖化合物或其鹽。
制備本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖時，硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖或硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖含有物的溶解可以采用常規(guī)方法進(jìn)行，溶解液中的本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖或該硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖含有物的濃度可以是其最高溶解濃度，但通?？梢钥紤]其操作性、反應(yīng)中使用的本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的量進(jìn)行設(shè)定。作為硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的溶解液，可以根據(jù)目的由水、緩沖液等進(jìn)行選擇。溶解液的pH通常為中性附近，酶反應(yīng)通常在25℃附近進(jìn)行。通過調(diào)整反應(yīng)中使用的本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的配合比例或用量、反應(yīng)液的組成、反應(yīng)時間等，也可以調(diào)整硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的分子量以及葡糖醛酸和乙?；暮俊Ａ蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖可以被3種酶，即本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶分解，這3種酶反應(yīng)可以同時進(jìn)行，也可以分別進(jìn)行。也就是說，如果預(yù)先用本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶將硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖脫乙?；兔撈咸侨┧峄?，然后通過熱處理或酸、堿處理等使本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶失活后，使本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶作用，則容易調(diào)整生成的本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的分子量分布以及葡糖醛酸和乙?；暮?。
通過分子量分級或陰離子交換柱將如上所述得到的本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖分級，能夠制備分子量更均勻或電荷密度分布更均勻的本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。分子量分級可以適用通常很好使用的方法，可以使用例如凝膠過濾法或分子量分級膜。低分子化物可以根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行離子交換樹脂處理、活性炭處理等純化操作，也可以根據(jù)需要進(jìn)行脫鹽處理、無菌處理、冷凍干燥處理。采用該方法，可以得到通過NMR分析能夠確定結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)均一的本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。
本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖在分子中具有硫酸基和羧基，該基團(tuán)與各種堿反應(yīng)形成鹽。本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖成鹽的狀態(tài)穩(wěn)定，通常以鈉和/或鉀和/或鈣等的鹽的形態(tài)提供。這些物質(zhì)的鹽可以通過利用Dowex 50W等陽離子交換樹脂，獲得游離的本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。另外，這些物質(zhì)也可以根據(jù)需要進(jìn)行已知的鹽交換方法，交換成所需的各種鹽。
作為本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的鹽，可以使用藥學(xué)上允許的鹽，例如鈉、鉀等堿金屬，鈣、鎂、鋅等堿土金屬、銨等的鹽。
另外，本發(fā)明硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖可以用作糖鏈學(xué)用試劑。例如如果按照特公平5-65108號公報記載的方法進(jìn)行2-氨基吡啶基化(PA化)，制備該低聚糖的PA-化物，則可以用作本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活性測定用底物。因而本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖作為糖鏈學(xué)用試劑是非常有用的物質(zhì)。
本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶由于將硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖低分子化，因而能夠用于硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)解析。而且，本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶通過在反應(yīng)液中共存氯化鈉、蛋白質(zhì)和/或鈣離子，能夠提高穩(wěn)定性和反應(yīng)速度，因此通過使這些硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解酶活化因子共存，能夠有效進(jìn)行上述低分子化。另外，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖、脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖和脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖可以用作糖鏈學(xué)用試劑，也可以用作本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活性測定用底物。
實施例以下結(jié)合實施例具體說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不僅限于以下實施例的范圍。參考例1(1)粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分的制備將市售的鹽腌沖繩海蘊(yùn)625g懸濁于4375ml的30mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，用勻漿機(jī)以8000轉(zhuǎn)/分鐘處理5分鐘后，在95℃下處理1小時，離心分離得到上清液。向得到的上清液中加入10g活性炭后，攪拌30分鐘，離心分離得到上清液。用裝有排除分子量10萬的中空纖維的超濾器將得到的上清液濃縮至2升后，用20mM氯化鈉更換溶劑，冷凍干燥，得到10.9g粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分的干燥物。
(2)硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性測定方法本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶單獨(dú)作用于硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖不能有效生成低聚糖，但是通過將其組合能夠分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，有效地使之低分子化。將上述3種酶在共存狀態(tài)下分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的活性稱為“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”，按照下述活性測定方法將其數(shù)值化。
也就是說，將10μl的1％粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶液、52.5μl的50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)、5.5μl的4M氯化鈉、2μl的1M氯化鈣、10μl的5mg/ml牛血清白蛋白、以及20μl的本發(fā)明巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶共存的酶液混合，在30℃下反應(yīng)3小時后，在100℃下處理反應(yīng)液10分鐘，離心分離后采用HPLC對90μl進(jìn)行分析，測定低分子化程度。作為對照，對于代替本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶共存的酶液，使用溶解該酶液的緩沖液使之反應(yīng)得到的產(chǎn)物，以及用水代替粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分使之反應(yīng)得到的產(chǎn)物，同樣采用HPLC進(jìn)行分析。1單位的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性為上述反應(yīng)體系中1分鐘切斷1μmol硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的巖藻糖苷鍵的酶量。切斷的巖藻糖苷鍵的量按照下式求出。公式1{(10×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.02)}＝U/ml10×1000×1/100反應(yīng)體系中添加的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分(μg)MG底物硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的平均分子量M反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量(MG/M)-1∶1分子硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖被酶切斷的部位數(shù)180反應(yīng)時間(分鐘)0.02酶液量(ml)另外，HPLC條件如下所述。
裝置L-6200型(日立制作所制)柱OHpak SB-806HQ(8×300mm，昭和電工社制)洗脫劑含有5mM疊氮化鈉的50mM氯化鈉檢測示差折射率檢測器(Shodex RI-71，昭和電工社制)流速1ml/分鐘柱溫25為了測定反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量，采用與上述HPLC分析相同的條件對市售的分子量已知的茁酶多糖(pullulan)(STANDARD P-82，昭和電工社制)進(jìn)行分析，用曲線表示茁酶多糖的分子量和保留時間的關(guān)系，作為用于測定上述反應(yīng)產(chǎn)物的分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，蛋白質(zhì)的定量通過測定酶液在280nm處的吸光度進(jìn)行。這時以1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液的吸光度為1.0進(jìn)行計算。實施例1將由含有按照參考例1(1)的方法制備的來源于沖繩海蘊(yùn)的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分0.2％和蛋白胨1％的人工海水(JamarineLaboratory公司制)pH8.0構(gòu)成的培養(yǎng)基50ml在120℃下進(jìn)行高壓滅菌器處理20分鐘，在得到的培養(yǎng)基中接種Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株，在24℃下培養(yǎng)72小時，得到種培養(yǎng)液。將由含有按照參考例1(1)的方法制備的來源于沖繩海蘊(yùn)的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分0.2％、蛋白胨1％和消泡劑(KM70，信越化學(xué)工業(yè)制)的人工海水(Jamarine Laboratory公司制)pH8.0構(gòu)成的培養(yǎng)基600ml裝入2升的錐形瓶中，在115℃下進(jìn)行高壓滅菌器處理10分鐘，準(zhǔn)備7瓶這樣的培養(yǎng)基，分別在各錐形瓶中接種上述種培養(yǎng)液5ml，以每分鐘90轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)速度，在24℃下培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液離心分離，得到菌體和培養(yǎng)上清液。
將得到的菌體懸濁于250ml含有100mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)中，超聲波破碎后，離心分離得到上清液。用相同的緩沖液對得到的上清液進(jìn)行充分透析，離心分離，將上清液作為粗酶液。
將得到的粗酶液裝入用相同緩沖液平衡后的300ml的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照100mM至400mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集活性級分。由此得到部分純化酶液。另外，測定上述培養(yǎng)上清液和粗酶液具有的“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”，結(jié)果確認(rèn)均有活性，在菌體提取液中檢測出每1ml培養(yǎng)基0.4mU的活性。實施例2(1)使實施例1記載的粗酶液對參考例1(1)記載的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分作用，制備本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。也就是說，將5g粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶解于1升含有250mM氯化鈉和20mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)中，然后加入35mU實施例1記載的粗酶液，在30℃下使之反應(yīng)6天。離心分離反應(yīng)液，對于得到的上清液使用安裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾裝置，回收分子量1萬以下的低聚糖級分，作為硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分1。
(2)用脫鹽裝置(Micro Acilyzer G3，旭化成工業(yè)制)對實施例2(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分1進(jìn)行脫鹽。向脫鹽后的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分1中添加咪唑達(dá)到5mM，并添加氯化鈉達(dá)到20mM，裝入預(yù)先用含有20mM氯化鈉的5mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液充分洗滌后，按照20mM至600mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫出的級分均采用苯酚-硫酸法測定總糖量，并采用咔唑-硫酸法測定總糖醛酸量。結(jié)果，由于洗脫級分中存在至少8個明顯的峰，因此收集各個峰部分，作為低聚糖1-(1)～(8)，用蒸發(fā)器分別濃縮至40ml后，裝入預(yù)先用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脫進(jìn)行脫鹽。由此得到本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)～(8)，即低聚糖1-(1)～(8)。
(3)對于實施例2(2)得到的低聚糖1-(1)～(8)，通過使用2-氨基吡啶的熒光標(biāo)識法分析還原末端糖和糖組成，再使用UFC測定試劑Takara(寶酒造)確定巖藻糖的絕對構(gòu)型，低聚糖1-(1)～(8)的還原性末端糖均為L-巖藻糖。另外，關(guān)于糖組成，低聚糖1-(1)僅為巖藻糖，低聚糖1-(2)～(8)由巖藻糖和葡糖醛酸構(gòu)成。其次，測定硫酸含量(采用使用氯化鋇的比濁法)、糖醛酸含量(采用咔唑-硫酸法)，通過質(zhì)量分析裝置(API-III，Perkin-Elmer Sciex公司制)分析質(zhì)量。另外，使用JNM-α500型核磁共振裝置(日本電子社制)進(jìn)行NMR分析。分析試樣按照常規(guī)方法用重水置換后，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。構(gòu)成糖的結(jié)合方式采用1H～異核檢測法即HMBC法進(jìn)行檢測。1H-NMR的歸屬采用DQF-COSY法以及HOHAHA法，13C-NMR的歸屬采用HSQC法。以下列出低聚糖1-(1)～(8)的物理性質(zhì)。
(a)低聚糖1-(1)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析和NMR分析的歸屬的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)的1H-NMR波譜如圖7所示，13C-NMR波譜如圖8所示，質(zhì)譜如圖9所示。在圖7、圖8中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖9中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。
分子量762MSm/z380.2〔M-2H+〕2-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表1所示。表1

糖組成 僅為L-巖藻糖(4分子)硫酸基 2分子 另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(IV)所示。
(b)低聚糖1-(2)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(2)的質(zhì)譜如圖10所示。在圖10中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。
分子量1456MS m/z 484.6〔M～3H+〕3-糖組成L-巖藻糖D-葡糖醛酸＝7∶1硫酸基3分子(c)低聚糖1-(3)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析和NMR分析的歸屬的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的1H-NMR波譜如圖11所示，13C-NMR波譜如圖12所示，質(zhì)譜如圖13所示。在圖11、圖12中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖13中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。
分子量1682MS m/z 873.4〔M+3Na+-5H+〕2-、862.4〔M+2Na+-4H+〕2-、574.4〔M+2Na+-5H+〕3-、567.2〔M+Na+-4H+〕3-、425.2〔M+Na+-5H+〕4-、419.8〔M-4H+〕4-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表2所示。表2

表2(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝8∶1硫酸基 4分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(V)所示。 (d)低聚糖1-(4)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(4)的質(zhì)譜如圖14所示。在圖14中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量2376MS m/z 598.8〔M+Na+-5H+〕4-、474.6〔M-5H+〕5-糖組成L-巖藻糖D-葡糖醛酸＝11∶2硫酸基5分子(e)低聚糖1-(5)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(5)的1H-NMR波譜如圖15所示，13C-NMR波譜如圖16所示，質(zhì)譜如圖17所示。在圖15、圖16中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖17中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量2602MS m/z 666.4〔M+3Na+-7H+〕4-、661.0〔M+2Na+-6H+〕4-、524.0〔M+Na+-6H+〕5-、433.0〔M-6H+〕6-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表3所示。表3

表3(續(xù))

表3(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝1 2∶2硫酸基 6分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(XI)所示。
另外，以下將本物質(zhì)稱為12Fuc-6S-2G1cUA。(f)低聚糖1-(6)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(6)的質(zhì)譜如圖18所示。在圖18中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量3296MS m/z 840.0〔M+3Na+-7H+〕4-、672.0〔M+3Na+-8H+〕5-、556.0〔M+2Na+-8H+〕6-、473.2M+Na+-8H+〕7-糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝15∶3硫酸基 7分子(g)低聚糖1-(7)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(7)的1H-NMR波譜如圖19所示，13C-NMR波譜如圖20所示，質(zhì)譜如圖21所示。在圖19、圖20中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖21中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量3522MS m/z 896.6〔M+3Na+-7H+〕4-、712.6〔M+2Na+-7H+〕5-、597.2〔M+3Na+-9H+〕6-、505.4〔M+Na+-8H+〕7-、439.6〔M-8H+〕8-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表4所示。表4

表4(續(xù))

表4(續(xù))

表4(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝16∶3硫酸基 8分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(XII)所示。
另外，以下稱為16Fuc-8S-3G1cUA。(h)低聚糖1-(8)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(8)的質(zhì)譜如圖22所示。在圖22中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量4216MS m/z 1092.0〔M+7Na+-11H+〕4-、869.0〔M+6Na+-11H+〕5-、713.0〔M+3Na+-9H+〕6-、611.0〔M+3Na+-10H+〕7-、529.2〔M+Na+-9H+〕8-、470.2〔M+Na+-10H+〕9-糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝19∶4硫酸基 9分子實施例3(1)使實施例1記載的部分純化酶液對參考例1(1)記載的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分作用，制備本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。也就是說，將3g粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶解于1升含有250mM氯化鈉、20mM氯化鈣及1g牛血清白蛋白的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)中，然后加入29mU實施例1記載的部分純化酶，在30℃下使之反應(yīng)3天。離心分離反應(yīng)液，對于得到的上清液使用安裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾裝置，回收分子量1萬以下的低聚糖級分，作為硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分2。
(2)用脫鹽裝置(Micro Acilyzer G3，旭化成工業(yè)制)對實施例3(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分2進(jìn)行脫鹽。向脫鹽后的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分2中添加咪唑達(dá)到5mM，并添加氯化鈉達(dá)到10mM，裝入預(yù)先用含有10mM氯化鈉的5mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液充分洗滌后，按照10mM至600mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫出的級分均采用苯酚-硫酸法測定總糖量，并采用咔唑-硫酸法測定總糖醛酸量。結(jié)果，由于洗脫級分中存在至少5個明顯的峰，因此收集各個峰部分，作為低聚糖2-(1)～(5)，用蒸發(fā)器分別濃縮至40ml后，裝入預(yù)先用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脫進(jìn)行脫鹽。由此得到低聚糖2-(1)～(5)。
(3)低聚糖的結(jié)構(gòu)解析對于實施例3(2)得到的低聚糖2-(1)～(5)的脫鹽物，通過使用2-氨基吡啶的熒光標(biāo)識法分析還原末端糖和糖組成，所有低聚糖的還原性末端糖均為L-巖藻糖。另外，關(guān)于糖組成，低聚糖2-(1)僅為巖藻糖，低聚糖2-(2)～(5)由巖藻糖和葡糖醛酸構(gòu)成。其次，測定硫酸含量(采用使用氯化鋇的比濁法)、糖醛酸含量(采用咔唑-硫酸法)，通過質(zhì)量分析裝置(API-III，Perkin-Elmer Sciex公司制)分析質(zhì)量。另外，使用JNM-α500型核磁共振裝置(日本電子社制)進(jìn)行NMR分析。分析試樣按照常規(guī)方法用重水置換后，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。構(gòu)成糖的結(jié)合方式采用1H-異核檢測法即HMBC法進(jìn)行檢測。1H-NMR的歸屬采用DQF-COSY法以及HOHAHA法，13C-NMR的歸屬采用HSQC法。
以下列出低聚糖2-(1)～(5)的物理性質(zhì)。
(a)低聚糖2-(1)的物理性質(zhì)上述分析結(jié)果判斷出該物質(zhì)是與低聚糖1-(1)相同的物質(zhì)。
(b)低聚糖2-(2)的物理性質(zhì)上述分析結(jié)果判斷出該物質(zhì)是與低聚糖1-(3)相同的物質(zhì)。
(c)低聚糖2-(3)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析和NMR分析的歸屬的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖2-(3)的1H-NMR波譜如圖23所示，13C-NMR波譜如圖24所示，質(zhì)譜如圖25所示。在圖23、圖24中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖25中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量1536MS m/z 800.2〔M+3Na+-5H+〕2-、789.2〔M+2Na+-4H+〕2-、526.0〔M+2Na+-5H+〕3-、518.6〔M+Na+-4H+〕3-、388.8〔M+Na+-5H+〕4-、383.2〔M-4H+〕4-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表5所示。表5

表5(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝7∶1硫酸基 4分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(VI)所示。

(d)低聚糖2-(4)的物理性質(zhì)上述分析結(jié)果判斷出該物質(zhì)是與低聚糖1-(5)相同的物質(zhì)。
(e)低聚糖2-(5)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖2-(5)的1H-NMR波譜如圖26所示，13C-NMR波譜如圖27所示，質(zhì)譜如圖28所示。在圖26、圖27中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖28中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量2456MS m/z 854.8〔M+5Na+-8H+〕3-、847.2〔M+4Na+-7H+〕3-、840.4〔M+3Na+-6H+〕3-、635.4〔M+4Na+-8H+〕4-、630.0〔M+3Na+-7H+〕4-、624.4〔M+2Na+-6H+〕4-、503.6〔M+3Na+-8H+〕5-、499.4〔M+2Na+-7H+〕5-、495.0〔M+Na+-6H+〕5-、416.0〔M+2Na+-8H+〕6-、412.4〔M+Na+-7H+〕6-、408.8〔M-6H+〕6-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表6所示。表6

表6(續(xù))

表6(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝11∶2硫酸基 6分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(XIII)所示。
另外，以下將該物質(zhì)稱為11Fuc-6S-2G1cUA。
觀察上述實施例2和實施例3得到的酶反應(yīng)產(chǎn)物，例如低聚糖1-(1)、1-(3)、1-(5)、1-(7)之重的質(zhì)量差相當(dāng)子4分子巖藻糖、2分子硫酸基和1分子葡糖醛酸的質(zhì)量。低聚糖1-(2)、1-(4)、1-(6)、1-(8)之重的質(zhì)量差、低聚糖2-(1)、2-(2)、2-(4)之重的質(zhì)量差、低聚糖2-(3)和2-(5)之重的質(zhì)量差也同樣。由此認(rèn)為實施例1得到的粗酶液以及部分純化酶液中包括以硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的重復(fù)單元進(jìn)行切割的酶，即以4分子巖藻糖、2分子硫酸基和1分子葡糖醛酸單元((-3F-3(4S)F1-3(4S)F1-3(GU1-2)F1-)，其中將α-L-巖藻糖簡記為F，將硫酸基簡記為S，將α-D-葡糖醛酸簡記為GU)進(jìn)行切割的酶。但是，反應(yīng)產(chǎn)物中沒有4分子巖藻糖、2分子硫酸基和1分子葡糖醛酸構(gòu)成的低聚糖，作為與該結(jié)構(gòu)近似的物質(zhì)，生成了4分子巖藻糖和2分子硫酸基構(gòu)成的低聚糖。也就是說，暗示實施例1(1)得到的粗酶液和部分純化酶液至少是葡糖醛酸酶和巖藻糖苷酶的混合物。實施例4(1)硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖-Cellulofine的制備為了制備用于分離實施例1(1)得到的部分純化酶液中含有的酶的親和(affinity)樹脂，將參考例1(1)記載的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分固定于Amino-Cellulofine(生化學(xué)工業(yè)制)。固定的方法按生化學(xué)工業(yè)的說明書。也就是說，將1.5g的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶解于80ml的水中后，用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至4.5，加入50ml的Amino-Cellulofine和3g的1-乙基-3-(二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽，在4℃下攪拌20小時，過濾后，用水充分洗滌，得到硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖-Cellulofine。
(2)用硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖-Cellulofine分離α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶將實施例1(1)得到的部分純化酶液用含有50mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)充分透析后，裝入用相同緩沖液平衡后的50ml硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖-Cellulofine中，用相同緩沖液洗滌后，按照50mM至1M氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。測定洗脫出的級分的“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”，結(jié)果活性的回收率為約2％，但是如果將僅殘留很少“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”的洗脫級分和硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖-Cellulofine非吸附級分混合，則“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”幾乎與上柱時的活性相等。
由于上述非吸附級分完全不能單獨(dú)將硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖低分子化，且僅具有很少“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”的洗脫級分也不能單獨(dú)將硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖完全低分子化，因而判斷出非吸附級分和洗脫級分分別通過不同的作用分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，而且如果洗脫級分不預(yù)先對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用則非吸附級分也不能發(fā)生作用。由此提示洗脫級分切斷硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的側(cè)鏈，即α-D-葡糖醛酸鍵或硫酸酯鍵等不會使硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的分子量大幅度改變的部分，而非吸附級分切斷主鏈，即α-L-巖藻糖苷鍵。實施例5
(1)按照利用2-氨基吡啶的熒光標(biāo)識(PA化)法標(biāo)識低聚糖為了確認(rèn)實施例4(2)記載的非吸附級分和洗脫級分的作用機(jī)理，進(jìn)行以下實驗。
取硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)～(8)以及2-(3)和2-(5)的干燥物各50nmole，使用GlycoTAG和GlycoTAG Reagent試劑盒(均為寶酒造社制)用2-氨基吡啶對還原性末端進(jìn)行熒光標(biāo)識(PA化)，制備該低聚糖的PA化物。
(2)利用下述反應(yīng)體系考察實施例4(2)記載的非吸附級分和洗脫級分對實施例5(1)記載的10種低聚糖的PA化物的作用。反應(yīng)體系50μl50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)23μl水5μl 4M氯化鈉2μl 1M氯化鈣5μl 5mg/ml牛血清白蛋白10μl2pmole/μl低聚糖的PA化物5μl 水或?qū)嵤├?(2)記載的非吸附級分或?qū)嵤├?(2)記載的洗脫級分將上述所有成分混合后在30℃下反應(yīng)3小時，在100℃下處理10分鐘后離心分離，在下述條件下用HPLC對上清液進(jìn)行分析，確認(rèn)對各低聚糖的PA化物的作用。裝置L-6200型(日立制作所制)柱OHpak SB-803(8×300mm，昭和電工社制)洗脫劑含有5mM疊氮化鈉和10％二甲基亞砜的0.2M氯化鈉檢測熒光檢測器F-1150(日立制作所制)激發(fā)波長320nm、熒光波長400nm流速1ml/分鐘柱溫50℃根據(jù)上述分析結(jié)果判斷出的實施例4(2)記載的非吸附級分和洗脫級分對各種硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的PA化物的作用的有無以及作用前后在SB803柱上的保留時間如表7所示。表7

如表7所示，實施例4(2)的非吸附級分對上述所有低聚糖的PA化物均不能發(fā)生作用。另一方面，實施例4(2)的洗脫級分對硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)不能發(fā)生作用，但對其它硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖發(fā)生作用。這一結(jié)果強(qiáng)有力地提示實施例4(2)的洗脫級分是切斷硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的葡糖醛酸的酶。例如由低聚糖1-(3)切斷1分子巖藻糖生成低聚糖2-(3)。認(rèn)為這時保留時間的變化是由8.94分鐘變?yōu)?.92分鐘。實施例4(2)的洗脫級分對低聚糖1-(3)的反應(yīng)中，保留時間由8.94分鐘變化為9.06分鐘。因此，認(rèn)為該反應(yīng)不是切斷巖藻糖的反應(yīng)。同樣，通過比較低聚糖2-(5)和1-(4)以及2-(3)和1-(2)，認(rèn)為實施例4(2)的洗脫級分的反應(yīng)不是切斷硫酸酯的反應(yīng)。而且，通過比較低聚糖1-(5)和1-(4)、1-(7)和1-(6)、以及1-(3)和1-(2)，認(rèn)為實施例4(2)的洗脫級分的反應(yīng)不是切斷硫酸化巖藻糖的反應(yīng)。
(3)為了確認(rèn)實施例4(2)記載的洗脫級分具有α-D-葡糖醛酸酶活性，使實施例4(2)記載的洗脫級分對實施例2記載的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)作用，分析其質(zhì)量變化。首先，構(gòu)筑下述反應(yīng)體系。反應(yīng)體系32.1ml 50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)2.0ml 4M氯化鈉0.8ml 1M氯化鈣4.0ml 5mg/ml牛血清白蛋白10mg實施例2記載的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)1.0ml 實施例4(2)記載的洗脫級分將上述所有成分混合后，在30℃下反應(yīng)5天，為了脫鹽，裝入用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱(4×90cm)中，每1級分分別收集9.1ml，對分別收集的級分測定總糖量(苯酚-硫酸法)以及總糖醛酸量(咔唑-硫酸法)。結(jié)果利用苯酚-硫酸法的顯色為強(qiáng)陽性的級分其利用咔唑-硫酸法的顯色為陰性。也就是說，強(qiáng)有力地提示由含有葡糖醛酸的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)切斷了葡糖醛酸。而且，為了確認(rèn)切斷了葡糖醛酸，對利用苯酚-硫酸法的顯色為強(qiáng)陽性的級分進(jìn)行質(zhì)量分析。結(jié)果，這些級分中存在質(zhì)量1506，即與由硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)切斷葡糖醛酸后的質(zhì)量(1506)一致的物質(zhì)。另外，由于不能檢測出與硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)一致的質(zhì)量(1682)的物質(zhì)，因而可以得知脫葡糖醛酸化反應(yīng)完全進(jìn)行。
根據(jù)以上結(jié)果，判斷出實施例4(2)記載的洗脫級分中存在α-D-葡糖醛酸酶。認(rèn)為與由硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)切斷葡糖醛酸后的質(zhì)量(1506)一致的物質(zhì)具有下述式(VII)的結(jié)構(gòu)。 另外，以下將該物質(zhì)稱為8Fuc-4S。
于是，研究本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶對實施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的PA化物的最適反應(yīng)條件。另外，欲求得本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的活性時，由下述反應(yīng)體系測定活性。反應(yīng)體系50μl含有100mM氯化鈉的50mM咪唑-鹽酸緩沖液(PH7.0)21μl水4μl 1M氯化鈣10μl3mg/ml牛血清白蛋白10μl4pmole/μl實施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的PA化物5μlα-D-葡糖醛酸酶溶液將上述所有成分混合后在22℃下反應(yīng)3小時，在100℃下處理10分鐘后離心分離，在下述條件下用HPLC對上清液進(jìn)行分析。裝置L-6200型(日立制作所制)柱L-柱(4.6×250mm，(財)化學(xué)品檢查協(xié)會制)洗脫劑含有0.3％丁醇的50mM醋酸-三乙胺緩沖液(pH5.0)檢測熒光檢測器F-1150(日立制作所制)激發(fā)波長320nm、熒光波長400nm流速1ml/分鐘柱溫40℃1單位的本發(fā)明α-D-葡糖醛酸酶為在上述反應(yīng)體系中1分鐘切斷1μmole的實施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的PA化物的葡糖醛酸鍵的酶量。切斷的葡糖醛酸鍵的量按照下式求出。公式2DGA/180×0.005＝U/mlDGA切斷的實施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的PA化物的量(μmole)180反應(yīng)時間(分鐘)0.005酶液量(ml)(4)利用2-氨基吡啶對實施例5(3)記載的8Fuc-4S進(jìn)行的熒光標(biāo)識(PA化)取實施例5(3)記載的8Fuc-4S 50nmole，使用GlycoTAG和GlycoTAG Reagent試劑盒(均為寶酒造社制)用2-氨基吡啶對還原性末端進(jìn)行熒光標(biāo)識(PA化)，制備該低聚糖的PA化物。以下將該物質(zhì)稱為8Fuc-4S-PA。
(5)使用8Fuc-4S-PA的實施例4(2)記載的非吸附級分和洗脫級分的作用的研究采用下述反應(yīng)體系考察實施例4(2)記載的非吸附級分和洗脫級分對實施例5(4)記載的8Fuc-4S-PA的作用。反應(yīng)體系50μl 50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)23μl 水5μl 4M氯化鈉2μl 1M氯化鈣5μl 5mg/ml牛血清白蛋白10μl2pmole/μl 8Fuc-4S-PA5μl水或?qū)嵤├?(2)記載的非吸附級分或?qū)嵤├?(2)記載的洗脫級分將上述所有成分混合后在30℃下反應(yīng)3小時，在100℃下處理10分鐘后離心分離，在實施例5(3)記載的條件下用HPLC對上清液進(jìn)行分析。
上述分析結(jié)果表明實施例4(2)記載的非吸附級分分解8Fuc-4S-PA，但是實施例4(2)記載的洗脫級分不分解8Fuc-4S-PA。另外，通過實施例4(2)記載的非吸附級分分解8Fuc-4S-PA得到的分解物在與實施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)的PA化物相同的洗脫位置洗脫出。這與實施例2和實施例3中得到大量與硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(1)相同的物質(zhì)并不矛盾。也就是說，判斷出實施例4(2)記載的非吸附級分是對脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖或硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖等作用的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶。
由該結(jié)果判斷出實施例4制備的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖-Cellulofine是對于分離本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶有用的樹脂。
(6)另外，研究本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對8Fuc-4S-PA的最適反應(yīng)條件。另外，欲求得本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活性時，采用下述反應(yīng)體系測定活性。反應(yīng)體系50μl 含有40mM氯化鈉的50mM醋酸緩沖液(pH5.5)23μl 水2μl 1M氯化鈣10μl 3mg/ml牛血清白蛋白10μl 4pmole/μl 8Fuc-4S-PA5μl 內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶溶液反應(yīng)在30℃下進(jìn)行3小時，反應(yīng)液的分析與上述同樣進(jìn)行。
1單位的本發(fā)明內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶為在上述反應(yīng)體系中1分鐘內(nèi)切地切斷1μmol的8Fuc-4S-PA的巖藻糖苷鍵的酶量。切斷的巖藻糖苷鍵的量按照下式求出。公式3DPA/180×0.005＝U/mlDPA切斷的8Fuc-4S-PA的量(μmole)180反應(yīng)時間(分鐘)0.005酶液量(ml)實施例6對于實施例4(2)記載的非吸附級分和洗脫級分分別通過預(yù)先用含有100mM氯化鈉、10mM氯化鈣和5mM疊氮化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡后的Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)進(jìn)行凝膠過濾，分別收集每13.5ml洗脫液。對于洗脫級分，實施例4(2)記載的非吸附級分按照實施例5(2)記載的方法，使用硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的PA化物作為底物，測定本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的活性，實施例4(2)記載的洗脫級分按照實施例5(5)記載的方法，測定本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活性。采用上述凝膠過濾法測定的本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的分子量為約12萬～18萬，本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的分子量為約15萬～20萬。實施例7通過DEAE-Cellulofine A-800純化參考例1(1)記載的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分。也就是說，在預(yù)先用含有50mM氯化鈉和10％乙醇的20mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH8.0)平衡后的5升DEAE-Cellulofine A-800柱中裝入用相同緩沖液溶解的5g參考例1(1)記載的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分，用相同緩沖液洗滌后，用含有100mM氯化鈉和10％乙醇的20mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH8.0)洗滌，按照100mM至2M氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫級分按每500ml為1級分，采用苯酚-硫酸法測定總糖量。收集在洗脫鹽濃度500mM附近洗脫出的認(rèn)為是硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的主成分的級分，用裝有排除分子量10萬的中空纖維的超濾裝置進(jìn)行脫鹽，冷凍干燥，得到純化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分0.9g。研究上述純化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分的葡糖醛酸含量的調(diào)整。首先構(gòu)筑下述反應(yīng)體系。反應(yīng)體系5ml50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)0.5ml 4M氯化鈉0.5ml 1M氯化鈣0.25ml 5mg/ml牛血清白蛋白3.35ml 實施例4(2)記載的洗脫級分2.4ml 1.25％純化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分水溶液將上述所有成分混合后，在25℃下使之反應(yīng)，經(jīng)時取樣，將樣品充分透析，除去切斷了的葡糖醛酸。表8中記載了透析后的各樣品中含有的巖藻糖量、葡糖醛酸量以及它們的比例。
表8

由上述結(jié)果判斷出如果使用實施例4(2)記載的洗脫級分，通過切斷除去硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的葡糖醛酸，能夠調(diào)整巖藻糖和葡糖醛酸的比例。實施例8(1)酶反應(yīng)中鈣鹽濃度的影響在測定本發(fā)明的“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”時，確認(rèn)如果降低反應(yīng)體系中含有的氯化鈣的濃度，則活性降低。因此，對于本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶以及本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，考察反應(yīng)體系中含有的氯化鈣的濃度和相對活性的關(guān)系。結(jié)果，判斷出兩種酶均被氯化鈣活化。另外，確認(rèn)采用醋酸鈣也同樣能夠活化。
(2)酶反應(yīng)中蛋白質(zhì)的影響在測定本發(fā)明的“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”時，確認(rèn)如果由反應(yīng)體系除去牛血清白蛋白，則活性降低。因此，對于本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶以及本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，考察反應(yīng)體系中含有的牛血清白蛋白的濃度和相對活性的關(guān)系。結(jié)果，判斷出兩種酶均被牛血清白蛋白活化。另外，確認(rèn)采用本發(fā)明的Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株生產(chǎn)的蛋白質(zhì)也同樣能夠活化。
(3)酶反應(yīng)中氯化鈉的影響在測定本發(fā)明的“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”時，確認(rèn)如果由反應(yīng)體系除去氯化鈉，則活性降低。因此，對于本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶以及本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，考察反應(yīng)體系中含有的氯化鈉的濃度和相對活性的關(guān)系。結(jié)果，判斷出兩種酶在以低分子的低聚糖作為底物時均不被氯化鈉活化。由此可以確認(rèn)氯化鈉在酶的底物為高分子的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖時活化兩種酶。實施例9將由含有按照參考例1(1)的方法制備的來源于沖繩海蘊(yùn)的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分0.2％和蛋白胨1％的人工海水(JamarineLaboratory公司制)pH8.0構(gòu)成的培養(yǎng)基600ml在120℃下進(jìn)行高壓滅菌器處理20分鐘，在得到的培養(yǎng)基中接種Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株，在24℃下培養(yǎng)72小時，得到種培養(yǎng)液。將由含有蛋白胨200g和消泡劑(KM70，信越化學(xué)工業(yè)制)的人工海水(Jamarine Laboratory公司制)pH8.0構(gòu)成的培養(yǎng)基18升用30升容量的發(fā)酵罐在120℃下進(jìn)行高壓滅菌器處理20分鐘，在得到的培養(yǎng)基中混合將按照參考例1(1)的方法制備的來源于沖繩海蘊(yùn)的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分40g溶解于2升人工海水并在95℃下處理1小時得到的物質(zhì)，接種上述種培養(yǎng)液，以每分鐘125轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)速度，在24℃下培養(yǎng)72小時。另外，在培養(yǎng)過程中自動控制培養(yǎng)基的pH為7以上。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液離心分離，得到菌體和培養(yǎng)上清液。
可以確認(rèn)象上述方法那樣對本培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的加熱溫度為95℃時，與在120℃附近加熱殺菌時相比，F(xiàn)ucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的利用率高，單位培養(yǎng)基的本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的產(chǎn)量多。
將上述培養(yǎng)得到的菌體懸濁于1升含有100mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)中，超聲波破碎后，離心分離，用相同緩沖液對得到的提取液進(jìn)行充分透析，離心分離，得到本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶共存的上清液。
按照參考例1(2)記載的方法測定得到的上清液中具有的“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”，并按照實施例14、實施例5(3)和實施例5(6)記載的方法分別測定本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的活性。結(jié)果，可以確認(rèn)“硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性”為每1ml培養(yǎng)液生產(chǎn)6mU，本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶為每1ml培養(yǎng)液生產(chǎn)1mU，本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶為每1ml培養(yǎng)液生產(chǎn)130μU，本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶為每1ml培養(yǎng)液生產(chǎn)6μU。實施例10(1)對于硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分研究育發(fā)效果由日本SLC社連同母鼠一起購入出生后2日齡的雄性C3H/He小鼠，在5日齡用于實驗。使小鼠脫血致死，使用剪刀和鑷子連同皮下組織一起采集觸須。接著，按照Ogawa等的方法(J.Invest.Dermatol103306-309，1994)，在顯微鏡下于培養(yǎng)皿中將觸須連同毛囊一起分離。由一只的左右兩側(cè)采集14～16根觸須。接著，將參考例1(1)記載的來源于沖繩海蘊(yùn)的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶解于RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制給定濃度的20倍濃度溶液，向培養(yǎng)體系中加入20分之1的量。對照組加入相同量的培養(yǎng)基。觸須的培養(yǎng)使用組織培養(yǎng)用皿Falcon 3037(Becton Dickinson Labware社制)，在中央的孔中裝入0.7mL添加有20％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基，并敷上滅菌后的不銹鋼網(wǎng)(池田理化株式會社制)和拭鏡紙(T.C.Ks株式會社制)。將觸須置于其上進(jìn)行培養(yǎng)。來源于沖繩海蘊(yùn)的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分預(yù)先添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)在35℃、5％CO2存在下進(jìn)行6天。觸須的長度在培養(yǎng)開始前和結(jié)束后，在顯微鏡下使用測徑規(guī)測定到0.1mm的位數(shù)。對于各試樣濃度的一組，使用3～5根觸須進(jìn)行測定，伸長的長度用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。另外，顯著性差異檢驗進(jìn)行Student′s t檢驗，相對于對照組求出P值。其結(jié)果如表9所示。表9添加試樣濃度檢測數(shù)觸須的伸長 P值(mg/mL) 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mm)沖繩海蘊(yùn)0.015 0.90±0.25 0.17對照0 6 0.38±0.23如表9所示，確認(rèn)來源于沖繩海蘊(yùn)的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分與對照相比，具有使小鼠的觸須伸長的效果。實施例11(1)酶的制備將按照實施例9的方法制備的Fucophilus fucoidanolyticusSI-1234株的菌體提取液用含有100mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)充分透析，離心分離，得到上清液，即本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶共存的粗酶液。將得到的粗酶液裝入用相同緩沖液平衡后的500ml的DEAE-CellulofineA-800柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照100mM至400mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫，每支分別收集67ml，收集硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分。將得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分用裝有分級分子量1萬的中空纖維的超濾器濃縮，用含有50mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)更換緩沖液。將得到的酶液裝入用相同緩沖液平衡后的實施例4(1)記載的50ml的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖-Cellulofine柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照50mM至600mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。按照每支10ml分別進(jìn)行收集，測定各級分的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性。結(jié)果，洗脫級分中僅檢測出很少的活性，而非吸附級分中未見活性。但是，如果將非吸附級分和洗脫級分混合，則硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性幾乎與上柱時的活性相等。
收集非吸附級分，通過超濾器濃縮至100ml，得到非吸附級分濃縮液。另一方面，洗脫級分使用濃縮的非吸附級分測定硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性，將其活性級分用超濾器濃縮至200ml，得到洗脫級分濃縮液。進(jìn)一步對這些酶進(jìn)行純化，嘗試制備硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。首先，構(gòu)筑用于測定各種級分的活性的反應(yīng)體系。
上述非吸附級分和洗脫級分單獨(dú)對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，均不能有效生成低聚糖，但是如果共存，則能夠分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，有效地使之低分子化。按照下述活性測定方法將兩種酶共存的狀態(tài)下分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的活性進(jìn)行數(shù)值化。
非吸附級分的活性測定方法如下所述進(jìn)行。也就是說，將10μl的1％粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶液、53μl的50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)、5μl的4M氯化鈉、2μl的1M氯化鈣、10μl的5mg/ml牛血清白蛋白、1μl的洗脫級分濃縮液以及19μl的欲測定活性的來源于非吸附級分的酶液混合，在30℃下反應(yīng)3小時后，在100℃下處理反應(yīng)液10分鐘，離心分離后采用HPLC對90μl進(jìn)行分析，測定低分子化程度。作為對照，對于代替來源于非吸附級分的酶液，使用溶解該酶液的緩沖液使之反應(yīng)得到的產(chǎn)物，以及用水代替粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分使之反應(yīng)得到的產(chǎn)物，同樣采用HPLC進(jìn)行分析。
1單位的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性為上述反應(yīng)體系中1分鐘切斷1μmol硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的巖藻糖苷鍵的酶量。切斷的巖藻糖苷鍵的量按照下式求出。公式4{(10×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.019)}＝U/ml10×1000×1/100反應(yīng)體系中添加的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分(μg)MG對照反應(yīng)液的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的平均分子量M反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量(MG/M)-1∶1分子硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖被酶切斷的部位數(shù)180反應(yīng)時間(分鐘)0.019酶液量(ml)
另外，HPLC條件如下所述。
裝置L-6200型(日立制作所制)柱OHpak SB-806HQ(8×300mm，昭和電工社制)洗脫劑含有5mM疊氮化鈉的50mM氯化鈉檢測示差折射率檢測器(Shodex RI-71，昭和電工社制)流速1ml/分鐘柱溫25℃為了測定反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量，采用與上述HPLC分析相同的條件對市售的分子量已知的茁酶多糖(pullulan)(STANDARD P-82，昭和電工社制)進(jìn)行分析，用曲線表示茁酶多糖的分子量和保留時間的關(guān)系，作為用于測定上述反應(yīng)產(chǎn)物的分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
另一方面，洗脫級分的活性測定如下所述進(jìn)行。也就是說，將10μl的1％粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶液、53μl的50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)、5μl的4M氯化鈉、2μl的1M氯化鈣、10μl的5mg/ml牛血清白蛋白、19μl的非吸附級分濃縮液以及1μl的欲測定活性的來源于洗脫級分的酶液混合，在30℃下反應(yīng)3小時后，在100℃下處理反應(yīng)液10分鐘，離心分離后采用HPLC對90μl進(jìn)行分析，測定低分子化程度。作為對照，對于代替來源于洗脫級分的酶液，使用溶解該酶液的緩沖液使之反應(yīng)得到的產(chǎn)物，以及用水代替粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分使之反應(yīng)得到的產(chǎn)物，同樣采用HPLC進(jìn)行分析。
1單位的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性為上述反應(yīng)體系中1分鐘切斷1μmol硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的巖藻糖苷鍵的酶量。切斷的巖藻糖苷鍵的量按照下式求出。公式5{(10×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.001)}＝U/ml10×1000×1/100反應(yīng)體系中添加的粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分(μg)MG對照反應(yīng)液的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的平均分子量M反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量(MG/M)-1∶1分子硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖被酶切斷的部位數(shù)180反應(yīng)時間(分鐘)0.001酶液量(ml)非吸附級分濃縮液的純化如下所述進(jìn)行。也就是說，向上述非吸附級分濃縮液中加入4M的氯化鈉，達(dá)到250mM，裝入用相同緩沖液平衡后的30ml的Phenyl-Cellulofine柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照250mM至0mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫，然后用含有10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)洗脫，接著用含有10％乙醇和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)洗脫，按照每支10ml分別進(jìn)行收集，收集按照上述方法測定的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分。
用Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)對得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分進(jìn)行分級，以含有100mM氯化鈉、10mM氯化鈣和5mM疊氮化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)作為洗脫劑。按照每支13.5ml分別進(jìn)行收集，以按照上述方法測定的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分作為純化非吸附級分。
而且，洗脫級分濃縮液的純化如下所述進(jìn)行。也就是說，通過裝有分級分子量1萬的中空纖維的超濾裝置，用含有100mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)交換上述洗脫級分濃縮液，裝入用相同緩沖液平衡后的45ml的DEAE-Cellulofine柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照100mM至400mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫，按照每支10ml分別進(jìn)行收集，收集按照上述方法測定的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分。
用Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)對得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分進(jìn)行分級，以含有100mM氯化鈉、10mM氯化鈣和5mM疊氮化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)作為洗脫劑。按照每支13.5ml分別進(jìn)行收集，以按照上述方法測定的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解活性級分作為純化洗脫級分。
(2)硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的制備使用上述純化非吸附級分和純化洗脫級分制備硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。
也就是說，將10g粗硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分溶解于1升含有250mM氯化鈉、20mM氯化鈣、5mM疊氮化鈉以及1g牛血清白蛋白的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)中，然后加入100mU的純化洗脫級分和600mU的純化非吸附級分，在30℃下使之反應(yīng)10天。離心分離反應(yīng)液，對于得到的上清液使用安裝有排除分子量1萬的中空纖維的超濾裝置，回收分子量1萬以下的低聚糖級分，作為硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分3。
(3)硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的純化用脫鹽裝置(Micro Acilyzer G3，旭化成工業(yè)制)對上述硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分3進(jìn)行脫鹽。向脫鹽后的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖酶消化物級分3中添加咪唑達(dá)到5mM，并添加氯化鈉達(dá)到10mM，裝入預(yù)先用含有10mM氯化鈉的5mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液充分洗滌后，按照10mM至400mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫出的級分均采用苯酚-硫酸法測定總糖量，并采用咔唑-硫酸法測定總糖醛酸量。結(jié)果，由于洗脫級分中存在至少5個明顯的峰，因此收集各個峰部分，作為低聚糖3-(1)～(5)，用蒸發(fā)器分別濃縮至40ml后，裝入預(yù)先用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脫進(jìn)行脫鹽。由此得到本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(1)～(5)，即低聚糖3-(1)～(5)。
(4)低聚糖的結(jié)構(gòu)解析對于得到的上述低聚糖3-(1)～(5)的脫鹽物，通過使用2-氨基吡啶的熒光標(biāo)識法分析還原末端糖和糖組成，所有低聚糖的還原性末端糖均為巖藻糖。另外，關(guān)于糖組成，低聚糖3-(2)僅為巖藻糖，低聚糖3-(1)和3-(3)～(5)由巖藻糖和葡糖醛酸構(gòu)成。其次，測定硫酸含量(采用使用氯化鋇的比濁法)、糖醛酸含量(采用咔唑-硫酸法)，通過質(zhì)量分析裝置(API-III，Perkin-Elmer Sciex公司制)分析質(zhì)量。另外，使用JNM-α500型核磁共振裝置(日本電子社制)進(jìn)行NMR分析。分析試樣按照常規(guī)方法用重水置換后，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。構(gòu)成糖的結(jié)合方式采用1H-異核檢測法即HMBC法進(jìn)行檢測。1H-NMR的歸屬采用DQF-COSY法以及HOHAHA法，13C-NMR的歸屬采用HSQC法。以下列出低聚糖3-(2)～(5)的物理性質(zhì)。
(a)低聚糖3-(2)的物理性質(zhì)上述分析結(jié)果判斷出該物質(zhì)是與上述低聚糖1-(1)相同的物質(zhì)。
(b)低聚糖3-(3)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析和NMR分析的歸屬的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(3)的1H-NMR波譜如圖29所示，13C-NMR波譜如圖30所示，質(zhì)譜如圖31所示。在圖29、圖30中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖31中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量1230MS m/z 1273.4〔M+2Na+-3H+〕-、625.2〔M+Na+-3H+〕2-、409.2〔M-3H+〕3-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表10所示。表10

表10(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝6∶1硫酸基 2分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(XIV)所示。

另外，以下將該物質(zhì)稱為6Fuc-2S-1G1cUA。(c)低聚糖3-(4)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析和NMR分析的歸屬的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(4)的1H-NMR波譜如圖32所示，13C-NMR波譜如圖33所示，質(zhì)譜如圖34所示。在圖32、圖33中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖34中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量1724MS m/z 894.1〔M+3Na+-5H+〕2-、588.7〔M+2Na+-5H+〕3-、435.6〔M+Na+-5H+〕41H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表11所示。表11

表11(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝8∶1硫酸基 4分子乙酰基 1分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(IX)所示。 另外，以下將該物質(zhì)稱為8Fuc-4S-1G1cUA-1乙?；?。(d)低聚糖3-(5)的物理性質(zhì)質(zhì)量分析及NMR分析的歸屬的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖3-(5)的1H-NMR波譜如圖35所示，13C-NMR波譜如圖36所示，質(zhì)譜如圖37所示。在圖35、圖36中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。另外，在圖37中，縱軸表示相對強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。分子量2689MS m/z 924.0 〔M+4Na+-7H+〕3-、687.3〔M+3Na+-7H+〕4-、545.3〔M+2Na+-7H+〕5-、450.5〔M+Na+-7H+〕6-1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表12所示。表12

表12(續(xù))

表12(續(xù))

糖組成 L-巖藻糖∶D-葡糖醛酸＝12∶2硫酸基 6分子乙酰基 2分子另外，1H-NMR和13C-NMR中峰歸屬的序號如下述式(X)所示。
另外，以下將該物質(zhì)稱為12Fuc-6S-2C1cUA-2乙酰基。實施例12(1)α-D-葡糖醛酸酶以及內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的純化按照實施包例9的方法將Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株培養(yǎng)3次，由每次培養(yǎng)得到的菌體按照實施例9的方法制備菌體提取液，用含有100mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)充分透析，離心分離，得到上清液，即本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶共存的粗酶液。以下，按照實施例5(3)記載的方法測定本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性，按照實施例5(6)記載的方法測定本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶活性，對各種酶進(jìn)行純化。
將得到的粗酶液裝入用相同緩沖液平衡后的3L的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照100mM至400mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫，每支分別收集200ml，收集本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性級分和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶活性級分。在這一時刻本發(fā)明的兩種酶顯示幾乎相同的性質(zhì)，不能分離。
將上述兩種酶活性級分用裝有分級分子量1萬的中空纖維的超濾器濃縮，用含有100mM氯化鈉和10mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)更換緩沖液。
將得到的酶液裝入用相同緩沖液平衡后的240ml的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照100mM至300mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。按照每支25ml分別進(jìn)行收集，收集本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性級分和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶活性級分。在這一時刻本發(fā)明的兩種酶顯示幾乎相同的性質(zhì)，不能分離。
將上述兩種酶活性級分用裝有分級分子量1萬的中空纖維的超濾器濃縮，用含有50mM氯化鈉和5mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)更換緩沖液。
將得到的酶液裝入用相同緩沖液平衡后的50ml的硫酸化-Cellulofine(生化學(xué)工業(yè)制)柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照50mM至1M氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。按照每支50ml分別進(jìn)行收集，收集本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性級分和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶活性級分。這里，由于兩種酶完全分離，因此以下對各種酶分別進(jìn)行純化。
(2)內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的純化使用分級分子量1萬的超濾膜將上述(1)得到的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶活性級分濃縮，裝入用含有100mM氯化鈉、10mM氯化鈣和5mM疊氮化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡后的Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)中，用相同緩沖液洗脫。按照每支13.3ml分別進(jìn)行收集，收集內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶活性級分。
將得到的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶活性級分裝入用含有10mM氯化鈉和5mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)與乙醇的混合比為85∶15的緩沖液平衡后的Phenyl-Cellulofine柱(2.4×44cm)中，用相同緩沖液進(jìn)行洗脫。按照每支30ml分別進(jìn)行收集。得到的活性級分通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷是均一的。由此得到本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的純化物。
(3)α-D-葡糖醛酸酶的純化使用分級分子量1萬的超濾膜將上述(1)得到的本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性級分濃縮，裝入用含有100mM氯化鈉、10mM氯化鈣和5mM疊氮化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡后的SephacrylS-200柱(4.4×100cm)中，用相同緩沖液洗脫。按照每支13.3ml分別進(jìn)行收集，收集本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性級分。
將得到的本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶級分用含有300mM氯化鈉和5mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液充分透析，裝入用相同緩沖液平衡后的20ml的硫酸化-Cellulofine柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照300mM至900mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。按照每支10ml分別進(jìn)行收集，收集本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性級分。
將得到的本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶級分用含有200mM氯化鈉和5mM氯化鈣的10mM咪唑-鹽酸緩沖液充分透析，裝入用相同緩沖液平衡后的20ml的硫酸化-Cellulofine柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照200mM至800mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。按照每支7ml分別進(jìn)行收集，收集本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶活性級分。得到的活性級分通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷是均一的。由此得到本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的純化物。實施例13使用實施例12(2)得到的本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的純化物以及實施例12(3)得到的本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶的純化物，嘗試硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的低分子化。首先為了考察乙酰基對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解的影響，制備脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。
(1)脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的制備將按照參考例1(1)的方法制備的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖200mg溶解于20ml的1N氫氧化鈉中，在25℃下處理20小時，接著用含有200mM氯化鈉和50mM氯化鈣的20mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.6)充分透析，得到脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖。
(2)各種底物的分解對于按照參考例1(1)的方法制備的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及按照上述(1)的方法制備的脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，每200mg添加本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶150μU和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶1mU，在25℃下進(jìn)行分解反應(yīng)。另外，這些反應(yīng)液中各成分的最終濃度為硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖6.7mg/ml、牛血清白蛋白0.1mg/ml、氯化鈉200mM、氯化鈣50mM、咪唑20mM，pH調(diào)節(jié)至6.6。結(jié)果，反應(yīng)開始時硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖與脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的分子量幾乎相同，但是反應(yīng)2天后的平均分子量是硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖為約195萬，脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖為約27000。
也就是說，確認(rèn)為了通過本發(fā)明的α-D-葡糖醛酸酶和本發(fā)明的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，有效得到硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，有必要進(jìn)行脫乙?；?。另外，使實施例1記載的粗酶以及部分純化酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，則得到的低聚糖幾乎不帶有乙?；?，如果使實施例11(1)記載的純化非吸附級分和純化洗脫級分對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，則生成帶有乙?；牡途厶牵纱送茰y本發(fā)明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株生產(chǎn)使硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的乙?；坞x的巖藻依聚糖脫乙酰酶。實施例14對Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株生產(chǎn)的使硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的乙?；坞x的巖藻依聚糖脫乙酰酶進(jìn)行研究。
(1)巖藻依聚糖脫乙酰酶的純化首先，確立用于測定按照實施例11(1)的方法制備的本發(fā)明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的粗酶溶液中存在的巖藻依聚糖脫乙酰酶活性的反應(yīng)體系。
也就是說，在100μl的50mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.5)、10μl的4M氯化鈉、1μl的1M氯化鈣、40μl的1％硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖和29μl的水中，加入20μl的巖藻依聚糖脫乙酰酶溶液，在30℃下反應(yīng)3小時，采用市售的醋酸定量用試劑盒(F-試劑盒醋酸，RocheDiagnostics制)測定游離出的乙烯基的量。結(jié)果，每1ml培養(yǎng)液中本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的活性為約2mU。
另外，作為其他方法，使用將低聚糖3-(4)的還原性末端用2-氨基吡啶熒光標(biāo)識得到的物質(zhì)作為底物，采用下述反應(yīng)體系，測定巖藻依聚糖脫乙酰酶的活性。反應(yīng)體系75μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)28.5μl 水9μl 4M氯化鈉15μl3mg/ml牛血清白蛋白15μl4pmole/μl低聚糖3-(4)的熒光標(biāo)識物7.5μl 巖藻依聚糖脫乙酰酶溶液將上述所有成分混合后在30℃下反應(yīng)1小時，在100℃下處理10分鐘后離心分離，在下述條件下用HPLC對上清液進(jìn)行分析，測定脫乙?；?。裝置L-6200型(日立制作所制)柱L-柱(4.6×250mm，(財)化學(xué)品檢查協(xié)會制)洗脫劑含有0.5％丁醇的50mM醋酸-三乙胺緩沖液(pH5.0)檢測熒光檢測器F-1150(日立制作所制)激發(fā)波長320nm、熒光波長400nm流速1ml/分鐘柱溫40℃1單位的本發(fā)明巖藻依聚糖脫乙酰酶為在上述反應(yīng)體系中1分鐘切斷1μmole的乙?；拿噶俊Ａ硗?，在上述反應(yīng)體系中，如果切斷底物的乙?；?，則變成與實施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖1-(3)的PA化物相同的結(jié)構(gòu)，因此為了確認(rèn)切斷了乙?；牡孜锏闹Ａ魰r間，使用該P(yáng)A化物。切斷的乙?；牧堪凑障率角蟪?。公式6DA/60×0.015＝U/mlDA切斷的乙?；牧?μmole)60反應(yīng)時間(分鐘)0.015酶液量(ml)采用上述方法測定時，每1ml培養(yǎng)液中本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的活性為0.8mU/ml。
將上述粗酶溶液50ml裝入用含有100mM氯化鈉、10mM氯化鈣和5mM疊氮化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡后的SephacrylS-200柱(4.4×100cm)中，用相同緩沖液進(jìn)行洗脫。按照每支13ml分別進(jìn)行收集，按照上述方法測定各級分中含有的本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的活性。由洗脫液量計算出的本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的分子量為約3萬～5萬。
收集上述活性級分，考察本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的性質(zhì)。其結(jié)果如圖1～圖2所示。即，圖1表示最適pH，圖2表示最適溫度。
如圖1所示，本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶的最適pH為約6～9.1的范圍，最適溫度為23～45℃的范圍。
(2)使用巖藻依聚糖脫乙酰酶由各種巖藻依聚糖脫乙?；姆磻?yīng)構(gòu)筑下述反應(yīng)體系，測定各種巖藻依聚糖中含有的乙?；牧?。
反應(yīng)中使用下述表13所示的來源于海藻的巖藻依聚糖。反應(yīng)體系60μl1％巖藻依聚糖50μl100mM磷酸鈉緩沖液pH7.510μl4M氯化鈉20μl3mg/ml牛血清白蛋白30μl水30μl巖藻依聚糖脫乙酰酶將上述所有成分混合后在30℃下反應(yīng)21小時，采用上述醋酸定量試劑盒測定生成的醋酸量。另外，將各巖藻依聚糖在1N的氫氧化鈉中在25℃下處理18小時，采用上述醋酸定量試劑盒測定生成的醋酸量。其結(jié)果如表13所示。表13

mg·乙?；?g·巖藻依聚糖n.d.未檢測(not detected)如表13所示，可以確認(rèn)本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶是對各種來源于海藻的巖藻依聚糖作用水解乙?；拿浮Ａ硗?，可以確認(rèn)與使用氫氧化鈉非特異性地脫乙酰化的場合相比，本發(fā)明的巖藻依聚糖脫乙酰酶對來源于沖繩海蘊(yùn)的巖藻依聚糖即硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的乙酰基的特異性高。實施例15(1)本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的主要結(jié)構(gòu)的解析為了確定實施例7制備的純化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖級分的整體結(jié)構(gòu)和硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖分解酶的切斷部位，進(jìn)行NMR分析。NMR的歸屬的結(jié)果如下所示，本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的1H-NMR波譜如圖38所示，13C-NMR波譜如圖39所示。圖38和圖39中，縱軸表示信號強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。而且，紅外吸收波譜如圖40所示。在圖40中，縱軸表示透過率(％)，橫軸表示波數(shù)(cm-1)。1H-NMR和13C-NMR的分析結(jié)果如表14所示。表14

根據(jù)表14所示的歸屬，可以確認(rèn)本發(fā)明的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖如下式(假XV)所示，F(xiàn)1的巖藻糖通過α鍵結(jié)合在另一重復(fù)5糖的F4的巖藻糖的3位上。另外，乙?；敲總€重復(fù)5糖有1個殘基主要結(jié)合在F1的巖藻糖的4位上。也就是說，判斷出硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖 具有以下所示的主骨架的重度結(jié)結(jié)構(gòu)。
工業(yè)實用性按照本發(fā)明，提供能夠用于硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)解析和再現(xiàn)性良好地制備硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的低分子化物的新型巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶。另外，還提供該酶的制備方法。另外，通過使用該酶，提供作為糖鏈學(xué)用試劑有用的以各種比例脫乙酰化得到的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖、以各種比例脫葡糖醛酸化得到的脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。另外，還提供用于有效使用該酶的添加物。另外，還提供生產(chǎn)來源于各種褐藻類的硫酸化多糖分解酶的微生物。
序列表獨(dú)立文本(Sequence Listing Free Text)序列號1為擴(kuò)增16S fDNA區(qū)域設(shè)計的低聚核苷酸引物序列號2為擴(kuò)增16S rDNA區(qū)域涉及的低聚核苷酸引物序列表序列表<110>寶酒造株式會社<120>硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖(Sulfated glucuronofucan)<130>662466<150>JP 2000-121116<151>2000-04-21<150>JP 2000-186346<151>2000-06-21<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為擴(kuò)增16S rDNA區(qū)域設(shè)計的低聚核苷酸引物<400>1agagtttgat cctggctcag<210>2<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為擴(kuò)增16S rDNA區(qū)域設(shè)計的低聚核苷酸引物<400>2ggctaccttg ttacgactt 19<210>3<211>1535<212>DNA<213>Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234<400>3agtgaacgct ggcggcgtgg ttaagacatg caagtcgaac gagattcttt gtattgaagc 60ctcggtggat ttataaagat gaaagtggca aacgggtgcg taacacgtga gcaatctgcc 120ctaaagatcg gaatagctcg aggaaactcg aattaatgcc ggatgtgata cgccaactca 180tgttggtagt attaaagctt gtaatggcgc tttaggagga gctcgcggcc tatcagcttg 240ttggtgaggt aaaggctcac caaggcaaag acgggtagct ggtctgagag gatgatcagc 300cacactggaa ctgagacacg gtccagacac ctacgggtgg cagcagtttc gaatcattca 360caatgggggc aaccctgatg gtgcaacgcc gcgtgaggga tgaaggcctt cgggtcgtaa 420acctctgtca ccagggagca acaagcaggt tcatagcctg ccctgagtta acctggagag 480gaagcagtgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagactgca agcgttactc 540ggattcactg ggcgtaaagg gtgcgtaggc ggatagatgt gtcaggtgtg aaatctcggg 600gctcaacctc gaaactgcgc ctgaaactgt ctatctagag tattggaggg gtaagcggaa 660tttctggtgt agcggtgaaa tgcgtagata tcagaaggaa caccaatggc gaaggcagct 720tactggacaa atactgacgc tgaggcacga aagcatgggt agcgaaaggg attagatacc 780cctgtagtcc atgccgtaaa cgttgcacac taggtcttgg gggtttcgac cctttcagga 840
ccccagctaa cgcgataagt gtgccgcctg aggactacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 900ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa 960gaaccttacc taggcttgac atgtaatgga cgattttcag agatgaattt ttcccttcgg 1020ggctgttaca caggtgctgc atggccgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg tttggttaag 1080tccagcaacg agcgcaaccc tcgtccttag ttgccagcac gtaatggtgg ggactctaag 1140gagacaaact ctctttgaga gtgggaaggt ggggatgacg tcaggtcagt atggccctta 1200cgcctagggc tacacacgtg ctacaatgcc cggtacaata ggacgcaata ccgcgaggtg 1260gagcaaatcc tcaaaaccgg gcccagttcg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag 1320tcggaatcgc tagtaatgac gtatcagcta tgacgtcgtg aatacgttcc cgggccttgt 1380acacaccgcc cgtcacatca tgaaagccgg ttttgcccga agtacgtgag ctatccctcg 1440ggaggcagcg tcctaaggca gggctggtga ttgggatg 1478
權(quán)利要求
1.巖藻依聚糖脫乙酰酶，其特征在于，具有下述理化性質(zhì)(I)作用于硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，水解乙?；挂宜嵊坞x；(II)在約6～9.1的范圍具有最適pH；(III)在約23～45℃的范圍具有最適溫度。
2.α-D-葡糖醛酸酶，其特征在于，具有下述理化性質(zhì)(I)作用于脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，水解α-D-葡糖醛酸鍵，使D-葡糖醛酸游離；(II)在約5.8～7.8的范圍具有最適pH；(III)在約14～29℃的范圍具有最適溫度。
3.內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶，其特征在于，具有下述理化性質(zhì)(I)作用于脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖，內(nèi)切地水解α-L-巖藻糖苷鍵，生成還原性末端具有L-巖藻糖的低聚糖；(II)在約4.5～7.5的范圍具有最適pH；(III)在約23～42℃的范圍具有最適溫度。
4.權(quán)利要求1所述的巖藻依聚糖脫乙酰酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)具有巖藻依聚糖脫乙酰酶生產(chǎn)能力的微生物，由其培養(yǎng)物采集該酶。
5.權(quán)利要求2所述的α-D-葡糖醛酸酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)具有α-D-葡糖醛酸酶生產(chǎn)能力的微生物，由其培養(yǎng)物采集該酶。
6.權(quán)利要求3所述的內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)具有內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶生產(chǎn)能力的微生物，由其培養(yǎng)物采集該酶。
7.脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的制備方法，其特征在于，使權(quán)利要求1所述的巖藻依聚糖脫乙酰酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，采集除去了至少1分子以上乙酰基得到的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法得到的脫乙?；蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖或其鹽。
9.脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的制備方法，其特征在于，使權(quán)利要求2所述的α-D-葡糖醛酸酶對脫乙酰化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，采集除去了至少1分子以上葡糖醛酸殘基得到的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖。
10.如權(quán)利要求9所述的脫乙?；撈咸侨┧峄蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖的制備方法，其特征在于，在氯化鈉、鈣鹽和/或蛋白質(zhì)共存的條件下進(jìn)行脫葡糖醛酸化。
11.按照權(quán)利要求9或10所述的方法得到的脫乙酰化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖或其鹽。
12.硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的制備方法，其特征在于，使巖藻依聚糖脫乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖作用，采集硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。
13.硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的制備方法，其特征在于，使α-D-葡糖醛酸酶和內(nèi)切-α-L-巖藻糖苷酶對通過堿處理脫乙?；玫降牧蛩峄咸侨┧釒r藻聚糖作用，采集硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖。
14.如權(quán)利要求12或13所述的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖的制備方法，其特征在于，在氯化鈉、鈣鹽和/或蛋白質(zhì)共存的條件下進(jìn)行。
15.按照權(quán)利要求12～14中任意一項所述的方法得到的硫酸化葡糖醛酸巖藻低聚糖或其鹽。
16.具有選自下述通式(I)～(III)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖化合物或其鹽 式中，R為H或SO3H或CH3CO，n為0或1以上的整數(shù)。
17.硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖或其鹽，其特征在于，具有下述理化性質(zhì)(1)構(gòu)成糖含有巖藻糖和葡糖醛酸，其摩爾比為35～44∶10，(2)以下述通式(VIII)表示的硫酸化糖作為構(gòu)成糖的必需成分。
18.如權(quán)利要求17所述的硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖，其特征在于，n為1～5000的范圍。
19.具有利用來源于褐藻類的多種硫酸化多糖作為資源的能力的Fucophilus屬細(xì)菌。
20.如權(quán)利要求19所述的Fucophilus屬細(xì)菌，電子傳遞鏈具有甲萘醌，且GC含量為約50％。
21.如權(quán)利要求19所述的Fucophilus屬細(xì)菌，具有16S核糖體DNA，所述16S核糖體DNA具有與序列表中序列號3記載的16S核糖體DNA的堿基序列具有90％以上同源性的堿基序列。
22.如權(quán)利要求20所述的Fucophilus屬細(xì)菌，細(xì)菌為Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株(FERM P-17517)。
全文摘要
本發(fā)明提供分解硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖的3種酶、該酶的制備方法、該酶的活化因子、硫酸化葡糖醛酸巖藻聚糖及其分解物、新型微生物。
文檔編號C12N1/21GK1437650SQ01811618
公開日2003年8月20日 申請日期2001年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月21日
發(fā)明者酒井武, 石塚久美子, 児島薰, 嵨中一夫, 豬飼勝重, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶生物工程株式會社