專利名稱：家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人vegf的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)、蛋白質(zhì)的純化與活性分析，尤其涉及一種家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF的方法。
背景技術(shù)：
人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促細(xì)胞分裂劑和血管生成誘導(dǎo)物，也是血管通透的媒介物質(zhì)。人VEGF是一個(gè)165個(gè)氨基酸的多肽，分子量為19kDa，pI7.3，它是一種糖蛋白，含有兩個(gè)相同的多肽鏈，彼此間以二硫鍵相連。VEGF特有的生物學(xué)活性是血管內(nèi)皮特異性的，包括強(qiáng)大的促細(xì)胞分裂作用和滲透性誘導(dǎo)性質(zhì)。此外，VEGF還與腫瘤血管生成，傷口愈合以及間接刺激動(dòng)脈阻塞處的血管形成有關(guān)。最新的證據(jù)表明，VEGF對(duì)于胚胎血管形成和血管發(fā)生也是很重要的。此外，VEGF對(duì)于女性生殖管道的血管循環(huán)增殖和骨骼的縱向生長(zhǎng)及軟骨內(nèi)骨化是必需的。VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生有利于治療幾種模式動(dòng)物的心肌或四肢的局部缺血。目前的研究是在將重組VEGF或VEGF轉(zhuǎn)基因用于治療性的血管發(fā)生抑制VEGF介導(dǎo)的血管病理發(fā)生兩個(gè)方面。因此VEGF在血管發(fā)生、傷口愈合和處理組織的局部缺血的治療性應(yīng)用的研究一直非常廣泛。在藥物的應(yīng)用方面也很有前景。在這些應(yīng)用中需要大量的具有生物活性的VEGF，因此有必要開(kāi)發(fā)一種高效且經(jīng)濟(jì)的方法進(jìn)行生產(chǎn)。用基因工程的方法在大腸桿菌中可以生產(chǎn)，然而，在大腸桿菌中VEGF以包含體的形式表達(dá)，需要對(duì)其重新折疊恢復(fù)其生物活性。額外的處理使得該過(guò)程效率很低且不經(jīng)濟(jì)。為了克服這個(gè)問(wèn)題，其他人曾試著用酵母和腺病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)。然而，酵母的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定，哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本又太高。因此申請(qǐng)人用桿狀病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)VEGF。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是最有效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。該系統(tǒng)利用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV和昆蟲(chóng)細(xì)胞系，如Spodoptera frugiperdaIPLB-Sf21-AE，Sf21和Trichoplusia ni，Tn-5，由于Sf21，Sf9細(xì)胞和Tn-5細(xì)胞易于無(wú)血清大規(guī)模培養(yǎng)，該系統(tǒng)被廣泛地用于生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。另一個(gè)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)利用家蠶核型多角體病毒BmNPV，在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)，具有成本低、方便和表達(dá)水平高的優(yōu)點(diǎn)。申請(qǐng)人構(gòu)建了介于BmNPV和AcNPV之間的雜交桿狀病毒HyNPV(專利申請(qǐng)已授權(quán)，專利號(hào)ZL01125605.2)，它具有擴(kuò)大的寄主域，可以感染家蠶，草地貪夜蛾和秋粘蟲(chóng)。這樣，可以在Sf21細(xì)胞中構(gòu)建重組病毒，然后在家蠶幼蟲(chóng)中低成本、高效地生產(chǎn)重組蛋白。我們用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主，高水平表達(dá)了具有生物活性的人VEGF。
基因工程生物產(chǎn)業(yè)被稱為21世紀(jì)的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)。隨著我國(guó)“WTO”的加入，建立起適合于我國(guó)國(guó)情并具有特色的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)迫在眉捷。我國(guó)具有極為豐富的家蠶資源，家蠶個(gè)體大、極易飼養(yǎng)且便于管理，非常適合利用它作為“生物工廠”進(jìn)行重組蛋白表達(dá)生產(chǎn)，在工程疫苗和藥物生產(chǎn)、蛋白質(zhì)研究、生物殺蟲(chóng)劑等領(lǐng)域具有很大潛在的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF的方法。利用HyNPV構(gòu)建含有人VEGF基因的重組病毒，并利用家蠶作為宿主，表達(dá)生產(chǎn)具有生物活性的重組人VEGF。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案其步驟如下1、利用家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF的方法，其特征在于(1)VEGF基因的克隆以人肺部組織抽提的總RNA為模板，利用Roche的Titan One Tube RT-PCR系統(tǒng)一步擴(kuò)增得到人VEGF基因；引物設(shè)計(jì)如下正向引物5’-AGGGATCCCCCATGGCAGAAGGAG-3’，含有BamHI酶切位點(diǎn)，反向引物5’-GAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下一個(gè)循環(huán)，94℃模板變性2分鐘；10個(gè)循環(huán)，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘；25個(gè)循環(huán)，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，每個(gè)循環(huán)后次循環(huán)增加延伸時(shí)間5秒；最后1個(gè)循環(huán)，68℃延伸7分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆VEGF基因順序正確性；(2)含有人VEGF基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-VEGF得到VEGF基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis獲得重組體pBlueBacHis-VEGF；通過(guò)共轉(zhuǎn)染在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)與雜交桿狀病毒HyNPV DNA同源重組產(chǎn)生重組病毒。然后在聚苯乙烯錐形管中加入1μgpBlueBacHis-VEGF DNA和15μg HyNPV DNA，混勻，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞；用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲(chǔ)存原液，用來(lái)篩選重組病毒。重組病毒通過(guò)幾輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml。申請(qǐng)人將此重組病毒命名為HyNPV-VEGF；(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組VEGF純化使用家蠶幼蟲(chóng)5齡起蠶，接種上述重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲(chóng)浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時(shí)后給桑，在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天，幼蟲(chóng)開(kāi)始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后地五天或第六天，感染的幼蟲(chóng)大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲(chóng)。
將幼蟲(chóng)的血淋巴作為重組人VEGF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲(chóng)向背面彎曲，用一只手固定幼蟲(chóng)的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊。用石蠟?zāi)っ芊獾?5號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L；由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲(chóng)收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，進(jìn)行稀釋；樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱，最后，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過(guò)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白；(4)重組VEGF活性分析鑒定用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC分析重組人VEGF的生物活性；細(xì)胞在含有Earle’s鹽的培養(yǎng)基199中37℃培養(yǎng)，補(bǔ)充5％的CO2，培養(yǎng)基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml鏈霉素，4.0mg/ml兩性霉素B，20％熱滅活補(bǔ)加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物質(zhì)ECGS；細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于24孔組織培養(yǎng)板，細(xì)胞密度大約為1.0×104cells/well，每孔加1ml同樣的培養(yǎng)基。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鮮培養(yǎng)基199；純化的重組VEGF經(jīng)梯度稀釋后用0.22μm滅菌過(guò)濾器過(guò)濾滅菌，加入到培養(yǎng)板孔中，每孔體積不超過(guò)10μl；72小時(shí)后，用PBS洗兩次，用胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，重懸于200μl PBS中，0.4％臺(tái)酚藍(lán)染色后，用血球計(jì)計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)；結(jié)果表明，重組VEGF能夠刺激HUVEC增殖，這表明家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)的VEGF具有生物學(xué)活性。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益效果是本發(fā)明較好地解決了VEGF在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)，家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)重組人VEGF安全、生物活性高，且大部分被分泌進(jìn)血淋巴中，非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取。重組VEGF可以大量生產(chǎn)為VEGF在醫(yī)藥上的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的前景。
具體實(shí)施例方式
1、材料RNA抽提試劑盒購(gòu)于Qiagene。DNA處理和PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于Takara Biomedicals(Kyoto，Japan)。TA克隆試劑盒、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis、lipofectin和Ni-NTA樹(shù)脂均為Invitrogen公司產(chǎn)品。DNA測(cè)序試劑盒購(gòu)于PE Applied Biosystems。介于BmNPV和AcNPV之間的雜交病毒HyNPV由我們自己最新構(gòu)建。胎牛血清FCS、草地貪夜蛾細(xì)胞系Sf21的培養(yǎng)基TC-100和用于培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的含有Earle’s鹽的培養(yǎng)基199均為GibcoBRL的產(chǎn)品。秋粘蟲(chóng)細(xì)胞系Tn-5的培養(yǎng)基ESF921購(gòu)于Expressionsystems。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、SCS和ECGS均為Technoclone GmbH的產(chǎn)品。草地貪夜蛾細(xì)胞Sf21用添加10％(v/v)FCS和0.26％細(xì)菌用胰蛋白胨的TC-100培養(yǎng)基在27℃培養(yǎng)。Tn-5利用無(wú)血清的ESF921培養(yǎng)基于27℃瓶中培養(yǎng)。本試驗(yàn)使用家蠶雜交種，家蠶幼蟲(chóng)桑葉飼養(yǎng)，溫度為23～25℃。
2、工作流程1、利用家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF的方法，其特征在于(1)VEGF基因的克隆以人肺部組織抽提的總RNA為模板，利用Roche的Titan One Tube RT-PCR系統(tǒng)一步擴(kuò)增得到人VEGF基因；引物設(shè)計(jì)如下正向引物5’-AGGGATCCCCCATGGCAGAAGGAG-3’，含有BamHI酶切位點(diǎn)，反向引物5’-GAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下一個(gè)循環(huán)，94℃模板變性2分鐘；10個(gè)循環(huán)，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘；25個(gè)循環(huán)，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，每個(gè)循環(huán)后次循環(huán)增加延伸時(shí)間5秒；最后1個(gè)循環(huán)，68℃延伸7分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆VEGF基因順序正確性；(2)含有人VEGF基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-VEGF得到VEGF基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis獲得重組體pBlueBacHis-VEGF；通過(guò)共轉(zhuǎn)染在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)與雜交桿狀病毒HyNPV DNA同源重組產(chǎn)生重組病毒。然后在聚苯乙烯錐形管中加入1μgpBlueBacHis-VEGF DNA和15μg HyNPV DNA，混勻，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞；用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲(chǔ)存原液，用來(lái)篩選重組病毒。重組病毒通過(guò)幾輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml。申請(qǐng)人將此重組病毒命名為HyNPV-VEGF；(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組VEGF純化使用家蠶幼蟲(chóng)5齡起蠶，接種上述重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲(chóng)浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時(shí)后給桑，在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天，幼蟲(chóng)開(kāi)始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后地五天或第六天，感染的幼蟲(chóng)大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲(chóng)。
將幼蟲(chóng)的血淋巴作為重組人VEGF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲(chóng)向背面彎曲，用一只手固定幼蟲(chóng)的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊。用石蠟?zāi)っ芊獾?5號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1 mmol/L；由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲(chóng)收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，進(jìn)行稀釋；樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱，最后，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過(guò)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白；(4)重組VEGF活性分析鑒定用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC分析重組人VEGF的生物活性；細(xì)胞在含有Earle’s鹽的培養(yǎng)基199中37℃培養(yǎng)，補(bǔ)充5％的CO2，培養(yǎng)基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml鏈霉素，4.0mg/ml兩性霉素B，20％熱滅活補(bǔ)加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物質(zhì)ECGS；細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于24孔組織培養(yǎng)板，細(xì)胞密度大約為1.0×104cells/well，每孔加1ml同樣的培養(yǎng)基。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鮮培養(yǎng)基199；純化的重組VEGF經(jīng)梯度稀釋后用0.22μm滅菌過(guò)濾器過(guò)濾滅菌，加入到培養(yǎng)板孔中，每孔體積不超過(guò)10μl；72小時(shí)后，用PBS洗兩次，用胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，重懸于200μl PBS中，0.4％臺(tái)酚藍(lán)染色后，用血球計(jì)計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)；結(jié)果表明，重組VEGF能夠刺激HUVEC增殖，這表明家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)的VEGF具有生物學(xué)活性。
權(quán)利要求
1.一種家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF的方法，其特征在于(1)VEGF基因的克隆以人肺部組織抽提的總RNA為模板，利用Roche的Titan One Tube RT-PCR系統(tǒng)一步擴(kuò)增得到人VEGF基因；引物設(shè)計(jì)如下正向引物5’-AGGGATCCCCCATGGCAGAAGGAG-3’，含有BamHI酶切位點(diǎn)，反向引物5’-GAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下一個(gè)循環(huán)，94℃模板變性2分鐘；10個(gè)循環(huán)，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘；25個(gè)循環(huán)，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，每個(gè)循環(huán)后次循環(huán)增加延伸時(shí)間5秒；最后1個(gè)循環(huán)，68℃延伸7分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆VEGF基因順序正確性；(2)含有人VEGF基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-VEGF得到VEGF基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHis獲得重組體pBlueBacHis-VEGF；通過(guò)共轉(zhuǎn)染在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)與雜交桿狀病毒HyNPV DNA同源重組產(chǎn)生重組病毒。然后在聚苯乙烯錐形管中加入1μgpBlueBacHis-VEGF DNA和15μg HyNPV DNA，混勻，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf 21培養(yǎng)細(xì)胞；用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲(chǔ)存原液，用來(lái)篩選重組病毒。重組病毒通過(guò)幾輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml。申請(qǐng)人將此重組病毒命名為HyNPV-VEGF；(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組VEGF純化使用家蠶幼蟲(chóng)5齡起蠶，接種上述重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲(chóng)浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時(shí)后給桑，在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天，幼蟲(chóng)開(kāi)始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后地五天或第六天，感染的幼蟲(chóng)大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲(chóng)。將幼蟲(chóng)的血淋巴作為重組人VEGF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲(chóng)向背面彎曲，用一只手固定幼蟲(chóng)的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊。用石蠟?zāi)っ芊獾?5號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L；由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲(chóng)收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，進(jìn)行稀釋；樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱，最后，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過(guò)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白；(4)重組VEGF活性分析鑒定用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC分析重組人VEGF的生物活性；細(xì)胞在含有Earle’s鹽的培養(yǎng)基199中37℃培養(yǎng)，補(bǔ)充5％的CO2，培養(yǎng)基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml鏈霉素，4.0mg/ml兩性霉素B，20％熱滅活補(bǔ)加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物質(zhì)ECGS；細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于24孔組織培養(yǎng)板，細(xì)胞密度大約為1.0×104cells/well，每孔加1ml同樣的培養(yǎng)基。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鮮培養(yǎng)基199；純化的重組VEGF經(jīng)梯度稀釋后用0.22μm滅菌過(guò)濾器過(guò)濾滅菌，加入到培養(yǎng)板孔中，每孔體積不超過(guò)10μl；72小時(shí)后，用PBS洗兩次，用胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，重懸于200μl PBS中，0.4％臺(tái)酚藍(lán)染色后，用血球計(jì)計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)；結(jié)果表明，重組VEGF能夠刺激HUVEC增殖，這表明家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)的VEGF具有生物學(xué)活性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的方法。利用構(gòu)建的AcNPV和BmNPV的雜交桿狀病毒HyNPV作為載體，構(gòu)建了重組含有人VEGF基因的重組病毒。利用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主，高水平表達(dá)了具有很高生物活性的重組人VEGF。解決了VEGF在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)，家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)的重組人VEGF大部分被分泌進(jìn)血淋巴中，非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用重組桿狀病毒以家蠶作為“生物工廠”生產(chǎn)重組人VEGF安全、實(shí)用、可行。重組VEGF可以大量生產(chǎn)為VEGF在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的前景。
文檔編號(hào)C12N15/866GK1594566SQ20041002540
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月17日
發(fā)明者吳小鋒, 姚慧鵬, 曹翠平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)