專利名稱：使用絨氈層特異的鋅指轉(zhuǎn)錄因子使花粉受育性降低的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在雄蕊花藥中特異表達(dá)的基因及其應(yīng)用。本發(fā)明特別涉及在花藥的絨氈層中特異表達(dá)的來自矮牽?；ǖ匿\指型轉(zhuǎn)錄因子(ZPT3-2)基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
花粉的受育性在農(nóng)業(yè)和園藝的各個方面都是個問題。例如在雜交育種的交配時為了避免自花授粉，要使用很多勞力進(jìn)行除雄(除去雄蕊)作業(yè)。在種苗產(chǎn)業(yè)中，為了將雜交育種得到的優(yōu)良品種在商業(yè)上進(jìn)行保護(hù)，需要沒有花粉受育性的性狀。從這樣的要求出發(fā)，迫切需要控制花粉受育性的技術(shù)(pollination control)。以往，特定的作物進(jìn)行雜交育種時一直使用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，并獲得了一定的成功。然而細(xì)胞質(zhì)不育性狀在很多場合下伴隨著抗病性低下等不希望有的副作用，另外還存在著性狀不穩(wěn)定、種子的大量生產(chǎn)困難等問題。雖然也研究了通過化學(xué)藥品處理使受育性降低的方法，但安全性評價和作用機(jī)制的闡明還很緩慢，沒有達(dá)到實(shí)用化程度。因此，需要利用基因工程的優(yōu)良雄性不育技術(shù)。
絨氈層位于花藥壁的最里層，是包圍造孢細(xì)胞(花粉細(xì)胞)的組織。絨氈層的作用對花粉的發(fā)育是必需的，不僅僅是作為花粉細(xì)胞的支撐體，而且還涉及花粉發(fā)育所必需的營養(yǎng)的供給、包含四分體(tetrad)的胼胝質(zhì)層的分解、構(gòu)成花粉細(xì)胞表面的外壁層等的化合物的供給等多方面的作用?；ㄋ幍陌l(fā)育分為以下各個階段，造孢細(xì)胞減數(shù)分裂后的四分體期、四分體的小孢子釋放期、花粉細(xì)胞的擴(kuò)大和空泡形成為特征的單核期，經(jīng)有絲分裂向營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞分化的有絲細(xì)胞分裂期，以及隨后的雙核期。通過這些階段，花藥最終開裂，釋放出成熟的花粉粒。已知在以上發(fā)育過程中，絨氈層的功能的一部分受到損傷時，多數(shù)情況下將導(dǎo)致正常花粉的發(fā)育受到抑制、失去花粉受育性。
如上所述，人們對于通過基因工程使雄性不育的技術(shù)寄予了很大的希望。特別是利用在象絨氈層那樣的不暴露在外部的小區(qū)域特異表達(dá)的基因，不僅不會賦予植物不好的性狀，而且有可能做到雄性不育。絨氈層特異的啟動子和包含啟動子的使雄性不育的基因構(gòu)建物的例子已有幾個報道(Shivanna和Sawhney編，Pollen biotechnology for cropproduction and improvement(Cambrigge University Press)pp.237-257，1997)。然而人們?nèi)匀黄诖磉_(dá)的組織特異性和時期特異性高、對花粉受育性控制有用的新的基因的出現(xiàn)。
本發(fā)明人等最近對來自矮牽?；ǖ男滦娃D(zhuǎn)錄因子、含有PEThyZPT3-2(以下，略作ZPT3-2)的7個鋅指(ZF)型轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列進(jìn)行了確定。Northern blot分析結(jié)果顯示，各個轉(zhuǎn)錄因子在花藥發(fā)育不同階段表現(xiàn)出對花藥特異性的瞬時表達(dá)(Kobayashi等，PlantJ.13571，1998)。然而對這些轉(zhuǎn)錄因子在植物中的生理功能和作用、以及轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的正確表達(dá)部位和其表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不是很清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供利用對以雄性不育為代表的植物性狀的改變有用的、花藥的組織特異性基因的基因工程技術(shù)。
本發(fā)明人將以前從矮牽?；ǚ蛛x出的編碼花藥特異性轉(zhuǎn)錄因子之一的基因再導(dǎo)入了矮牽牛。結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入基因通過抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)阻礙了花粉的正常發(fā)育，花粉的受育性顯著下降。另外本發(fā)明人等從ZPT3-2的基因組基因分離出上游區(qū)，研究了其啟動子活性的組織特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在從四分體期到單核期的絨氈層中，啟動子活性表現(xiàn)出組織和時期特異性。本發(fā)明是根據(jù)這些認(rèn)識完成的。
本發(fā)明的第一個方面是制作雄性不育植物的方法，涉及包括以下步驟的方法提供含有(i)具有序列號1所示的堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA、(ii)在嚴(yán)格條件下與具有(i)的堿基序列的DNA雜交并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA、或(iii)(i)或(ii)的DNA片段中任一DNA的核酸，和與上述核酸有效連接的啟動子的植物表達(dá)序列組合的步驟；提供具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細(xì)胞的步驟，其中，編碼內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因在嚴(yán)格條件下與上述核酸雜交；將表達(dá)序列組合導(dǎo)入植物細(xì)胞的步驟；導(dǎo)入了表達(dá)序列組合的植物細(xì)胞再生為植物體的步驟；以及對于再生的植物體，通過表達(dá)上述核酸篩選內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)被抑制的植物體的步驟。本發(fā)明的上述方法可作為賦予植物雄性不育性的方法加以利用。
在一種實(shí)施方式中，上述核酸相對于上述啟動子正向連接，在上述植物細(xì)胞內(nèi)可按照有義方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
在一種實(shí)施方式中，上述核酸相對于上述啟動子反向連接，在上述植物細(xì)胞內(nèi)可按照反義方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
在一種實(shí)施方式中，上述植物是雙子葉植物。雙子葉植物優(yōu)選茄科植物，更優(yōu)選矮牽牛屬植物。
在一種實(shí)施方式中，上述表達(dá)序列組合被整合到植物表達(dá)載體中。
本發(fā)明第一個方面還提供通過上述任一所述的方法制作的雄性不育性植物。
本發(fā)明的第二個方面是制作雄性不育植物的方法，涉及包括以下步驟的方法提供包含含有(a)具有序列號3所示的堿基序列中第1位到第1991位序列的DNA、或(b)具有(a)的一部分序列并表現(xiàn)出花藥的絨氈層特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，和與上述啟動子有效連接的異源基因的植物表達(dá)序列組合的步驟；將表達(dá)序列組合導(dǎo)入植物細(xì)胞的步驟；以及使導(dǎo)入了表達(dá)序列組合的植物細(xì)胞再生為植物體的步驟。本發(fā)明的上述方法可作為賦予植物雄性不育性的方法加以利用。
在一種實(shí)施方式中，上述植物是雙子葉植物。雙子葉植物優(yōu)選茄科植物，更優(yōu)選矮牽牛屬植物。
在一種實(shí)施方式中，上述表達(dá)序列組合被整合到植物表達(dá)載體中。
本發(fā)明的第二個方面還可提供通過上述任一項(xiàng)所述的方法制作的雄性不育性植物。
本發(fā)明的第三個方面涉及包含以下(I)或(II)的DNA的啟動子(I)具有序列號3所示的堿基序列中第1位到第1991位序列的DNA；或(II)具有(I)的一部分序列，表現(xiàn)出對花藥的絨氈層特異性啟動子活性的DNA。
本發(fā)明的第四個方面涉及包含上述啟動子和與上述啟動子有效連接的異源基因的、對賦予植物雄性不育性有用的植物表達(dá)序列組合。
附圖的簡單說明

圖1給出了ZPT3-2編碼基因(以下，也略作ZPT3-2)的cDNA序列及其對應(yīng)的氨基酸序列。用下劃線標(biāo)出了3個鋅指基序以及DLNL序列(氨基酸411位～425位)。
圖2是表達(dá)ZPT3-2cDNA序列的植物表達(dá)載體(pBIN-35S-ZPT3-2)結(jié)構(gòu)的概略圖。
圖3是表示ZPT3-2基因編碼區(qū)的上游序列的圖。粗箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(1721位)，下劃線表示翻譯起始密碼(ATG)。
圖4是用于解析ZPT3-2cDNA基因的啟動子的植物表達(dá)載體(pBIN-ZPT3-2-GUS)結(jié)構(gòu)的概略圖。
圖5是對野生型矮牽牛花的花粉和導(dǎo)入pBIN-35S-ZPT3-2的矮牽?；ǖ幕ǚ圻M(jìn)行拍攝，并表現(xiàn)生物形態(tài)的照片(放大倍數(shù)為240)。所有花粉都進(jìn)行了黃酮醇染色。圖5(a)～(d)表示野生型矮牽?；ǖ幕ɡ僭诓煌L階段的花粉，圖5(e)～(h)表示轉(zhuǎn)化矮牽?；ǖ幕ɡ僭诓煌L階段的花粉。圖5(a)和(e)是花蕾大小為5mm的花粉，圖5(b)和(f)是花蕾大小為35mm的花粉，圖5(c)和(g)是花蕾大小為50mm的花粉，圖5(d)和(h)是成熟期的花粉。
圖6是對導(dǎo)入pBIN-ZPT3-2-GUS的矮牽牛花進(jìn)行GUS染色的花的器官進(jìn)行拍攝，并表現(xiàn)生物形態(tài)的照片。以花藥處于四分體期的花(花蕾)為拍攝對象。圖6(a)是放大倍數(shù)為2.5的花蕾的外觀照片，圖(b)表示花藥在低倍數(shù)(60)時的截面圖，圖6(c)表示花藥絨氈層周邊在高倍數(shù)(280倍)時的截面圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下進(jìn)一步詳細(xì)地對本發(fā)明進(jìn)行說明。
(來自ZPT3-2基因的轉(zhuǎn)錄因子)本發(fā)明第一個方面的制作雄性不育性植物的方法中有用的核酸是(i)具有序列號1所示的堿基序列中第1位到第1886位序列的DNA，(ii)在嚴(yán)格條件下與具有(i)的堿基序列的DNA雜交，并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，或(iii)(i)或(ii)中的任一DNA片段。本發(fā)明中上述核酸優(yōu)選(i)的DNA，即，優(yōu)選編碼ZPT3-2的DNA或其片段，更優(yōu)選(i)的DNA。
本說明書中的“轉(zhuǎn)錄因子”是指與基因調(diào)控區(qū)的DNA結(jié)合并控制mRNA合成的蛋白質(zhì)。已知某一種轉(zhuǎn)錄因子是在其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有稱之為鋅指基序的保守性高的氨基酸序列。ZPT3-2是Cys2/His2型(EPF家族)的鋅指蛋白質(zhì)，是在由444個氨基酸構(gòu)成的全長氨基酸序列內(nèi)含有3個鋅指基序，另外還含有稱之為DLNL序列的疏水區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子(Kobayashi等，同上)。圖1同時給出了編碼ZPT3-2的cDNA序列(序列號1)以及對應(yīng)的推測氨基酸序列(序列號2)。
在本說明書中核酸或DNA的“片段”是指導(dǎo)入植物體并以適當(dāng)方式表達(dá)時，能抑制該植物內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的片段。該片段可以是從上述(i)或(ii)的DNA的編碼鋅指基序區(qū)以外選擇，并具有至少約40個堿基對以上長度，優(yōu)選約50個堿基對以上長度，更優(yōu)選約70個堿基對以上長度、進(jìn)而優(yōu)選約100個堿基對以上長度。
在本說明書中，所謂用于雜交的“嚴(yán)格條件”是指使特定的堿基序列(例如，來自矮牽?；ǖ木幋aZPT3-2的DNA)和與該序列同源性高的其它堿基序列(例如，存在于矮牽?；ㄒ酝庵参锏木幋aZPT3-2類似物的DNA)形成聚核苷酸雙鏈所需要的充分條件。作為適用于本發(fā)明的嚴(yán)格條件的代表性例子，例如以下條件。在含有1M NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、32P標(biāo)記探針DNA(1×107cpm)和50μg/ml鮭精DNA的溶液中，于60℃雜交16小時后，用2×SSC/1％SDS于60℃洗30分鐘，反復(fù)2次。
在本發(fā)明中，為了分離編碼ZPT3-2的DNA、以及在嚴(yán)格條件下與它雜交并編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA，可以使用與公知的轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的氨基酸序列的保守區(qū)相對應(yīng)的簡并引物對。使用該引物對，以植物的cDNA或基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，然后以得到的擴(kuò)增DNA片段作為探針，可以篩選同一植物的cDNA文庫或基因文庫。作為這種引物對的例子，如5’-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3’(序列號4)和3’-RTGNCCNCCNARNGCYTG-5’(序列號5)的組合(這里，N是次黃嘌呤核苷，R為G或A，而Y為C或T)。上述引物序列分別對應(yīng)包含在ZPT3-2的鋅指基序中的氨基酸序列QALGGH。
因此，適用于本發(fā)明的嚴(yán)格雜交條件也可作為PCR的條件，代表性例子中可以使用上述簡并引物(序列號4和5)。此時的PCR反應(yīng)條件為于94℃變性5分鐘后，一循環(huán)94℃30秒，50℃30秒，然后72℃1分鐘共進(jìn)行30個循環(huán)，最后于72℃溫育7分鐘。
PCR按照市售的試劑盒和儀器制造廠家的指導(dǎo)進(jìn)行，或按照業(yè)內(nèi)人士已知的方法進(jìn)行?；蛭膸斓闹谱鞣椒ㄒ约盎虻目寺》椒ǖ纫捕际菢I(yè)內(nèi)人士已知的方法。例如可參照Sambrook等《分子克隆 實(shí)驗(yàn)指南》第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1989)的方法。得到的基因的堿基序列可以利用該領(lǐng)域內(nèi)公知的核苷酸序列解析法或市售的自動測序儀確定。
在本說明書中，所謂轉(zhuǎn)錄因子“控制花粉的發(fā)育”主要是指該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到抑制時，在花粉的形態(tài)或功能方面可觀察到明顯的變化。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)錄因子主要是通過抑制編碼該轉(zhuǎn)錄因子的基因的表達(dá)，使約60％以上，優(yōu)選使約75％以上，更優(yōu)選使約90％以上的花粉細(xì)胞在成熟之前死亡。這里，抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是指通過Northern blot法測定時，與野生型的對照植物相比，mRNA的量約為十分之一以下。
通過上述篩選而分離、鑒定的基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子(即，ZPT3-2和ZPT3-2類似物)對于花粉發(fā)育的控制情況，可根據(jù)本說明書的內(nèi)容制作轉(zhuǎn)化植物，并通過對該花粉的發(fā)育特性進(jìn)行觀察來加以確認(rèn)。
利用本發(fā)明中編碼控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段，可以抑制植物細(xì)胞中含有與該DNA同一或相同堿基序列的內(nèi)源性基因的表達(dá)。這種靶內(nèi)源性基因也可以是控制花粉發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。按照本發(fā)明的方法，最好是不抑制控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子以外的基因的表達(dá)，而只是通過有選擇地抑制內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，賦予植物雄性不育性。
即，本發(fā)明的表達(dá)抑制技術(shù)適用的植物細(xì)胞是具有控制花粉發(fā)育的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的植物細(xì)胞，編碼該內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的基因規(guī)定為在嚴(yán)格條件下與上述ZPT3-2或ZPT3-2類似物雜交的基因。這里“嚴(yán)格條件”的定義是與ZPT3-2類似物鑒定有關(guān)的上述條件相同的條件。雖沒有限定本發(fā)明范圍的意思，但通過上述方法可賦予雄性不育性的植物希望是與分離出ZPT3-2的矮牽?；?、或分離出編碼ZPT3-2類似物的基因的植物在進(jìn)化系統(tǒng)學(xué)上近緣的植物。這里，進(jìn)化系統(tǒng)學(xué)上近緣主要是指分在同一目中，優(yōu)選分在同一科的，更優(yōu)選分在同一屬的，最優(yōu)選是分在同一種的植物。另外，花藥的最里層存在絨氈層并對花粉的發(fā)育起著不可缺少的作用，由于是大部分種子植物中普遍的事實(shí)，所以如果考慮到這一點(diǎn)，起著與ZPT3-2相同或類似功能的轉(zhuǎn)錄因子廣泛地存在于其它植物中也容易被理解。
作為用于抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的方法，代表性的可以利用共抑制和反義技術(shù)。共抑制是指在將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞時，抑制該基因本身以及含有與該基因一部分相同的序列的內(nèi)源性基因兩者的表達(dá)。利用共抑制時，本發(fā)明的表達(dá)序列組合包含相對于啟動子以正向連接形式連接的編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段。編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段以表達(dá)序列組合形式導(dǎo)入植物細(xì)胞后，在啟動子的控制下按照有義方向轉(zhuǎn)錄。通過該導(dǎo)入DNA的作用，有可能抑制所期望的基因的表達(dá)。共抑制可以在轉(zhuǎn)化植物的一部分個體中觀察到，而在其它個體中往往不能充分起作用。因此，通常按照意愿方式對基因表達(dá)進(jìn)行抑制的個體可以通過慣用程序進(jìn)行篩選。
反義技術(shù)是指在將重組基因?qū)胫参锛?xì)胞時，導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)與內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)的互補(bǔ)序列形成雜交體，并抑制內(nèi)源性基因編碼的蛋白質(zhì)的翻譯。利用反義技術(shù)時，本發(fā)明的表達(dá)序列組合包含相對于啟動子以反向連接形式連接的編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段。將編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA或其片段作為表達(dá)序列組合導(dǎo)入植物細(xì)胞后，在啟動子的控制下按照反義方向轉(zhuǎn)錄。通過該反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的作用有可能抑制目的基因的表達(dá)。
(來自ZPT3-2基因的啟動子)本發(fā)明第二個方面，即制作性狀改變的植物的方法中有用的啟動子是具有(a)序列號3所示的堿基序列中第1位到第1991位序列的DNA，或(b)具有(a)的一部分序列，并表現(xiàn)出對花藥絨氈層特異的啟動子活性的任一DNA的啟動子。在本發(fā)明的上述啟動子中，優(yōu)選(a)的啟動子，即ZPT3-2基因的啟動子。
除去ZPT3-2基因啟動子區(qū)的對組織特異性表達(dá)活性非必需的序列后得到的、對絨氈層具有特異的啟動子活性的序列屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的序列按照常規(guī)方法通過啟動子的缺失實(shí)驗(yàn)獲得。簡單地講，使用ZPT3-2基因啟動子區(qū)的各種各樣缺失突變體(例如，使ZPT3-2基因啟動子區(qū)從5’上游一側(cè)缺失不同長度的突變體)與適當(dāng)?shù)膱蟾婊?例如GUS基因)融合的質(zhì)粒，并通過測定缺失突變體的組織特異的啟動子活性，可以鑒定對其活性所必需的區(qū)域。
一旦鑒定出對啟動子活性必需的區(qū)域，還可改變其區(qū)域內(nèi)的序列或相鄰序列，進(jìn)而提高啟動子表達(dá)活性的程度。這樣獲得的突變體只要對絨氈層表現(xiàn)出特異的啟動子活性，也都屬于本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明中，“對絨氈層表現(xiàn)出特異的啟動子活性”是指啟動子在天然植物中或以與任意結(jié)構(gòu)基因連接的表達(dá)序列組合形式導(dǎo)入植物時，通過起始DNA的轉(zhuǎn)錄在絨氈層特異地表現(xiàn)出指導(dǎo)基因表達(dá)的能力。這里，“特異的”是指與同一植物體的花的其它所有組織(包括花粉、花絲、花柱、花頭、花瓣、花萼等)相比啟動子的表達(dá)活性更高。上述特異的啟動子優(yōu)選在絨氈層的表達(dá)活性比同一植物體的花的其它所有組織和花以外的部分(根、葉、莖等)更高，更優(yōu)選在同一植物體的花的其它所有組織和花以外的部分實(shí)質(zhì)上不表現(xiàn)活性。表達(dá)活性的程度按照常規(guī)方法通過比較啟動子在絨氈層中的表達(dá)水平和同一啟動子在花的其它組織的表達(dá)水平進(jìn)行評價。啟動子的表達(dá)水平通常是由在該啟動子的調(diào)控下表達(dá)的基因產(chǎn)物的產(chǎn)量來進(jìn)行確定。
利用上述特異的啟動子賦予植物雄性不育性的過程，通過與本發(fā)明啟動子有效連接的任意異源基因在導(dǎo)入該基因的轉(zhuǎn)化植物中，于啟動子的調(diào)控下在絨氈層進(jìn)行特異表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。已知許多組織特異性啟動子的組織特異性超越種屬被保存下來，所以也可以認(rèn)為本發(fā)明的啟動子適用于范圍廣泛的植物種屬。
本發(fā)明的啟動子，例如可以將公知的cDNA用作探針，對植物基因組文庫進(jìn)行篩選，并通過從與之相對應(yīng)的基因組克隆中分離出編碼區(qū)上游序列獲得。作為cDNA，例如來自上述矮牽?；ǖ霓D(zhuǎn)錄因子ZPT3-2的cDNA。
本發(fā)明中的啟動子并沒有限定在天然分離的啟動子，也包括合成的多核苷酸。合成多核苷酸，例如可以通過業(yè)內(nèi)人士已知的手法合成或改變象上述那樣序列確定的啟動子序列或其活性區(qū)域來獲得。(表達(dá)序列組合和表達(dá)載體的構(gòu)建)編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子的DNA可以利用業(yè)內(nèi)人士公知的方法做成與適當(dāng)啟動子有效連接的表達(dá)序列組合，然后利用公知的基因重組技術(shù)導(dǎo)入植物細(xì)胞。同樣，本發(fā)明的絨氈層特異的啟動子能夠以與所希望的異源基因有效連接的表達(dá)序列組合形式導(dǎo)入植物細(xì)胞。
可與上述轉(zhuǎn)錄因子連接的“啟動子”是指在植物中進(jìn)行表達(dá)的任意啟動子，也包括組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子中的任一種。
“組成型啟動子”是指與植物細(xì)胞內(nèi)外的刺激無關(guān)以一定水平表達(dá)結(jié)構(gòu)基因的啟動子。在植物的其它組織或器官表達(dá)異源基因不會給植物帶來不良性狀時，使用組成型啟動子比較簡便，也比較理想。作為組成型啟動子的例子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(P35S)、以及胭脂氨酸合成酶的啟動子(Tnos)，但不限定于這些啟動子。
“組織特異性啟動子”在本發(fā)明中是指至少在包括絨氈層在內(nèi)的花藥的組織中使結(jié)構(gòu)基因特異表達(dá)的啟動子。在這樣的組織特異性啟動子中，除了來自本發(fā)明ZPT3-2基因的啟動子，也包括表現(xiàn)出花藥特異表達(dá)活性的其它公知啟動子。因此，將含有絨氈層特異啟動子和編碼轉(zhuǎn)錄因子的序列的、天然ZPT3-2基因的表達(dá)序列組合本身，根據(jù)需要與其它的調(diào)節(jié)元件組合使用也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
“誘導(dǎo)型啟動子”是指給予化學(xué)試劑、物理應(yīng)力等特定刺激時使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，而無刺激時不表現(xiàn)表達(dá)活性的啟動子。作為誘導(dǎo)型啟動子的例子，例如可用植物生長素誘導(dǎo)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)啟動子(van der Kop，D.A.等，Plant Mol.Biol，39979，1999)，但并不限定于此。
在本說明書中，用語“表達(dá)序列組合”或“植物表達(dá)序列組合”是指含有編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子的DNA和與該DNA有效連接(即，可以控制該DNA的表達(dá))的植物表達(dá)啟動子的核酸序列，以及含有本發(fā)明的絨氈層特異啟動子和與啟動子有效連接(即，符合讀框的)的異源基因的核酸序列。
可與上述絨氈層特異啟動子連接的“異源基因”是指ZPT3-2基因以外的矮牽牛花中的內(nèi)源性基因，或者是矮牽?；ㄒ酝庵参镏械膬?nèi)源性基因，或是相對于植物來說是異源基因(如來自動物、昆蟲、細(xì)菌和真菌的基因)、且其基因產(chǎn)物的表達(dá)是絨氈層所希望的任意基因。本發(fā)明中的異源基因的優(yōu)選例子是編碼的基因產(chǎn)物表現(xiàn)出細(xì)胞毒性且通過它的表達(dá)抑制花粉發(fā)育的基因。作為這樣的基因的具體例子，如barnase基因(Beals，T.P.和Goldberg，R.B.，Plant Cell 91527，1997)，但不限定于此例。
“植物表達(dá)載體”是指除了含有表達(dá)序列組合外，還以在宿主植物細(xì)胞中可發(fā)揮作用的形式連接了各種調(diào)節(jié)元件的核酸序列。這樣的表達(dá)載體優(yōu)選含有終止子、抗藥基因和增強(qiáng)子。植物表達(dá)載體的類型以及使用的調(diào)節(jié)元件的種類可按照宿主細(xì)胞的不同進(jìn)行變化，這是業(yè)內(nèi)人士已知的事情。本發(fā)明使用的植物表達(dá)載體還可以含有T-DNA區(qū)。特別是在用土壤桿菌對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，T-DNA區(qū)可以提高基因的導(dǎo)入效率。
“終止子”位于基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的下游，是參與DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA時的轉(zhuǎn)錄終止，以及附加多聚A序列的序列。已知終止子對mRNA穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)，而且還影響基因的表達(dá)量。作為終止子的例子，如胭脂氨酸合成酶的終止子(Tnos)，和花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S終止子，但并不限定于這些例子。
“抗藥性基因”是使得轉(zhuǎn)化植物的篩選更容易進(jìn)行的基因。優(yōu)選應(yīng)用可賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因，以及可賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等，但本發(fā)明并不限定于這些基因。
本發(fā)明的植物表達(dá)載體可以使用業(yè)內(nèi)人士公知的基因重組技術(shù)制作。在植物表達(dá)載體的構(gòu)建中，例如可以優(yōu)選使用pBI系列的載體或pUC系列的載體，但不限定于這些載體。
(轉(zhuǎn)化植物的制作)象上述那樣構(gòu)建的表達(dá)序列組合或含有表達(dá)序列組合的載體，可用公知的基因重組技術(shù)導(dǎo)入目的植物細(xì)胞。導(dǎo)入的表達(dá)序列組合整合在植物細(xì)胞中的DNA。這里，植物細(xì)胞中的DNA不僅包括染色體DNA，也包括植物細(xì)胞中各種器官(如線粒體、葉綠體)中含有的DNA。
在本說明書中，用語“植物”既包括單子葉植物，也包括雙子葉植物。優(yōu)選的植物是雙子葉植物。雙子葉植物可以包括原始花被亞綱和合瓣花亞綱中任意一種。優(yōu)選的亞綱是合瓣花亞綱。合瓣花亞綱包括以下各個目龍膽目、茄目、紫蘇目、朱櫻花目、車前目、風(fēng)鈴草目、玄參目、茜草目、川續(xù)斷目和紫菀目。優(yōu)選的目是茄目。茄目包括茄科、田基麻科、花蔥科、菟絲子亞科和旋花科中的任意一種。優(yōu)選的科是茄科。茄科包括矮牽牛屬、曼陀羅屬、煙草屬、茄屬、番茄屬、辣椒屬、酸漿屬、枸杞屬等。優(yōu)選的屬是矮牽牛屬、曼陀羅屬和煙草屬，更優(yōu)選的屬是矮牽牛屬。矮牽牛屬包括P.hybrida種、P.axillaries種、P.inflata種和P.violacea種等。優(yōu)選的種是P.hybrida種。只要不特別說明，“植物”是指從帶有花的植物體和植物體得到的種子。
作為“植物細(xì)胞”的例子，如花、葉和根等植物器官中各個組織的細(xì)胞、愈傷組織以及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
在將植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞時，可以使用業(yè)內(nèi)認(rèn)識公知的方法，例如借助于土壤桿菌的方法以及直接導(dǎo)入細(xì)胞的方法。作為借助于土壤桿菌的方法，如可以使用Nagel等人的方法(FEMS Microbiol.Lett.，67325(1990))。該方法是首先用植物表達(dá)載體(例如，通過電穿孔)轉(zhuǎn)化土壤桿菌，然后通過leaf disk法等已知的方法將被轉(zhuǎn)化的土壤桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。作為直接將植物表達(dá)載體等導(dǎo)入細(xì)胞的方法，例如電穿孔法、土壤桿菌法、磷酸鈣法和聚乙二醇法等。這些方法在該領(lǐng)域內(nèi)是已知的，適于轉(zhuǎn)化植物的方法可由操作者適宜選擇。
導(dǎo)入了植物表達(dá)載體的細(xì)胞例如能夠以卡那霉素抗性等抗藥性作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。篩選出的細(xì)胞可以通過常規(guī)方法再生成植物體。
導(dǎo)入的植物表達(dá)載體是否能在再生的植物體中起作用，可以利用業(yè)內(nèi)人士公知的手法加以確認(rèn)。例如，以抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)為目的時，可通過利用Northern blot解析的轉(zhuǎn)錄水平測定進(jìn)行確認(rèn)。這樣就可以篩選出內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)受到抑制的目的轉(zhuǎn)化植物體。在利用組織特異性啟動子表達(dá)異源基因時，通常也可以從靶組織提取RNA作為樣品，并通過Northern blot解析對異源基因的表達(dá)加以確認(rèn)。
通過本發(fā)明的方法抑制內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)以及降低花粉的受育性，例如可以用含有編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后，將得到的植物的花粉形態(tài)根據(jù)需要進(jìn)行組織化學(xué)染色，然后進(jìn)行顯微鏡觀察來確認(rèn)。
另外，通過本發(fā)明的方法使啟動子在絨氈層特異表達(dá)，例如可以用啟動子與GUS基因有效連接的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，對于轉(zhuǎn)化所得植物的花藥組織中GUS活性的分布，通過常規(guī)方法進(jìn)行組織化學(xué)染色來確認(rèn)。
實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。本發(fā)明的范圍并不限定在實(shí)施例。實(shí)施例中使用的限制酶、質(zhì)粒等可以由商業(yè)供給源獲得。
實(shí)施例1含有編碼ZPT3-2的多核苷酸的植物表達(dá)載體的構(gòu)建將以前報道的花藥特異性ZF基因(Kobayashi等，同前)中的PEThyZPT3-2(ZPT3-2)的cDNA連接在花椰菜花葉病毒的35S啟動子下游，做成植物表達(dá)載體。
具體來說，將質(zhì)粒pBI221(從CLONTECH Laboratories Inc.購入)中含有花椰菜花葉病毒35S啟動子的DNA片段(HindIII-XbaI片段)和含有NOS終止子的DNA片段(SacI-EcoRI片段)依次插入到質(zhì)粒pUCAP(van Engelen，F(xiàn).A.等，Transgenic Res.，4288，1995)的多克隆位點(diǎn)，制作pUCAP35S。另外，將含有ZPT3-2 cDNA的pBluescript載體在KpnI位點(diǎn)和SacI位點(diǎn)(均為載體中的位點(diǎn))切斷，插入到上述pUCAP35S的KpnI位點(diǎn)和SacI位點(diǎn)之間。然后，將該重組質(zhì)粒用EcoRI和HindIII酶切，將編碼ZPT3-2的DNA片段導(dǎo)入雙載體pBINPLUS(vanEngelen，F(xiàn).A.等，同前)的EcoRI和HindIII位點(diǎn)之間。構(gòu)建的ZPT3-2基因如圖2所示，由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子區(qū)(P35S；0.9kb)、編碼本發(fā)明ZPT3-2的多核苷酸(ZPT3-2；約1.9kb)、以及胭脂氨酸合成酶的終止子區(qū)(Tnos；0.3kb)構(gòu)成。圖2中的Pnos表示胭脂氨酸合成酶的啟動子區(qū)，而NPTII表示新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因。
實(shí)施例2ZPT3-2啟動子區(qū)的分離以及與GUS報告基因的連接以ZPT3-2的cDNA作為探針，從矮牽牛花基因組DNA文庫中分離出對應(yīng)的基因組克隆，對轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的DNA片段(啟動子區(qū)；約2.0kb)進(jìn)行亞克隆。將該DNA片段連接在GUS報告基因的上游，克隆于雙載體。
具體來說，通過常規(guī)的隨機(jī)引物法(Sambrook等，同前)用[α-32P]dCTP對ZPT3-2的cDNA進(jìn)行標(biāo)記，制作放射性標(biāo)記探針，用該探針對在EMBL3載體(Stratagene生產(chǎn))中制作的矮牽?；?Petuniahabrida var.Mitchell)的基因組文庫進(jìn)行篩選。將得到的克隆中含有基因上游區(qū)的約2.0kb基因組DNA片段亞克隆于pBluescriptSK載體的EcoRI位點(diǎn)(pBS-ZPT3-2-E)，確定堿基序列(圖3)。然后，將含有SalI識別序列的連接DNA插入到ZPT3-2基因上游序列中的BglII位點(diǎn)(堿基號2006)，導(dǎo)入SalI位點(diǎn)(堿基號2016)。然后，將經(jīng)EcoRI和SalI酶切得到的DNA片段插入到pUCAPGUSNT的GUS編碼區(qū)上游(pUCAP-ZPT3-2-GUSNT)。由此，在ZPT3-2基因編碼區(qū)的N末端附近區(qū)域按照閱讀框架與GUS編碼區(qū)相連。然后，將pUCAP-ZPT3-2-GUSNT經(jīng)EcoRI和HindIII酶切得到的DNA片段(含有ZPT3-2啟動子、GUS編碼區(qū)和NOS終止子)插入到pBINPLUS載體中，得到pBIN-ZPT3-2-GUS(圖4)。
實(shí)施例3各融合基因向矮牽牛花細(xì)胞的導(dǎo)入將上述各表達(dá)載體按照以下順序，通過土壤桿菌導(dǎo)入矮牽牛(Petuniahybrida var.Mitchell)。
(1)將根癌土壤桿菌LBA4404株(從CLONTECH Laboratories Inc.購入)在含有250mg/ml的鏈霉素和50mg/ml的利福平的L培養(yǎng)基中于28℃進(jìn)行培養(yǎng)。按照Nagel等(同前)的方法制備細(xì)胞懸浮液，利用電穿孔將實(shí)施例1和2中構(gòu)建的質(zhì)粒載體導(dǎo)入上述菌株。
(2)利用以下方法將編碼各個融合基因的多核苷酸導(dǎo)入矮牽?；?xì)胞。將上述(1)中得到的根癌土壤桿菌LBA4404株在YEB培養(yǎng)基(《DNA克隆》第2卷、78頁、Glover D.M.編IRL Press、1985)中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)(28℃、200rpm)。將得到的培養(yǎng)液用滅菌水稀釋20倍，與矮牽?；?Petunia hybrida var.Mitchell)的葉片一起培養(yǎng)。2～3天后，用含有抗生素的培養(yǎng)基除去上述細(xì)菌，每隔2周用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，根據(jù)是否具有將上述2種融合基因一起導(dǎo)入的pBINPLUS的NPTII基因表達(dá)產(chǎn)生的卡那霉素抗性，篩選轉(zhuǎn)化的矮牽牛花細(xì)胞。篩選出的細(xì)胞通過常規(guī)方法誘導(dǎo)愈傷組織后，再分化為植物體(Jorgensen R.A.等，PlantMol.Biol.，31957，1996)。
實(shí)施例4導(dǎo)入ZPT3-2基因后轉(zhuǎn)化矮牽?；ǖ谋硇屠脤?dǎo)入實(shí)施例1的載體得到的轉(zhuǎn)化體，通過ZPT3-2的表達(dá)量的測定和對花粉形態(tài)的觀察，研究ZPT3-2 cDNA的導(dǎo)入對植物產(chǎn)生的作用和效果。
具體來說，在35S啟動子調(diào)控下導(dǎo)入ZPT3-2 cDNA的轉(zhuǎn)化體(15個)通過Norther blot解析篩選出由于共抑制導(dǎo)致基因表達(dá)被抑制的個體(4個)。Norther blot解析的條件如下7％SDS、50％甲酰胺、5×SSC、2％封閉試劑(Boehringer Mannheim生產(chǎn))、50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.1％月桂基肌氨酸鈉、50μg/ml酵母tRNA和32P標(biāo)記探針DNA(1×107cpm)的溶液中，于68℃雜交16小時后，用2×SSC/0.1％SDS于68℃洗30分鐘。
在上述4個共抑制轉(zhuǎn)化體中，可觀察到約90％的花粉細(xì)胞在成熟之前就死掉了。按照常規(guī)方法進(jìn)行黃酮醇染色，結(jié)果在這些轉(zhuǎn)化體的破裂細(xì)胞中幾乎沒有檢測出應(yīng)當(dāng)包含在花粉細(xì)胞表面外壁層的黃酮醇(圖5轉(zhuǎn)化植物的花粉的照片中，藍(lán)白色不規(guī)則形狀的粒子是破裂的細(xì)胞)。
從上述觀察結(jié)果可以推測，在基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)化體的花粉細(xì)胞中，由于外壁層的蓄積異常導(dǎo)致細(xì)胞壁發(fā)育不全，對滲透壓敏感的細(xì)胞破裂了。四分體之前，花粉細(xì)胞的發(fā)育與正常植物之間沒有什么差別。花粉出現(xiàn)異常時期、與外壁層蓄積時期及ZPT3-2基因正常表達(dá)時期非常吻合，這些現(xiàn)象支持上述作用機(jī)制?；虮磉_(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)化體中，花粉以外的性狀沒有產(chǎn)生變化。而在過表達(dá)ZPT3-2基因的個體中，花粉以及其它性狀都沒有產(chǎn)生變化。
如上所述，通過導(dǎo)入編碼ZPT3-2的基因，可以高效抑制花粉的發(fā)育，使受育性喪失。通過最優(yōu)化導(dǎo)入基因時所用的啟動子，該效率可以進(jìn)一步提高。例如，替代實(shí)施例1載體中所用的單一CaMV35S啟動子，可以利用將2個CaMV35S啟動子串聯(lián)起來并使活性提高的啟動子(即，E2啟動子)等。另外，ZPT3-2基因的導(dǎo)入，其效果對花粉是特異的，而對植物的其它性狀沒有影響，因此可用作選擇性的性狀改變技術(shù)。
實(shí)施例5ZPT3-2啟動子活性的組織特異性利用導(dǎo)入實(shí)施例2載體得到的轉(zhuǎn)化體，通過GUS活性進(jìn)行組織化學(xué)染色，檢測上述DNA片段具有的組織特異啟動子活性。
具體來說，利用導(dǎo)入ZPT3-2基因上游區(qū)和GUS的融合基因得到的轉(zhuǎn)化體的花，以X-GUS為底物，研究GUS活性的分布(Gallagher，S.R.編、GUS protocolsusing the GUS gene as a reporter of gene expressin、Academic Press，Inc.pp.103-114，1992)。其結(jié)果，在花藥的絨氈層中特異地檢測出GUS活性(圖6)。表達(dá)的時期是瞬時的，活性峰出現(xiàn)時期與花粉細(xì)胞減數(shù)分裂剛結(jié)束后的四分體期大致相當(dāng)。由此可知ZPT3-2基因的啟動子對花藥的絨氈層表現(xiàn)出特異的活性。
如上所述，ZPT3-2基因的啟動子對四分體期前后的絨氈層表現(xiàn)出特異的活性。絨氈層如上所述，是在花粉發(fā)育中起著關(guān)鍵作用的組織。因此，該啟動子作為花粉發(fā)育相關(guān)詳細(xì)研究的工具是有用的。另外，利用該啟動子或其活性片段，使具有細(xì)胞毒性的基因等特異表達(dá)，通過破壞絨氈層的組織或使其功能喪失，可以阻礙花粉的發(fā)育。
產(chǎn)業(yè)上的實(shí)用性利用來自ZPT3-2基因并編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA、以及來自ZPT3-2基因的啟動子的本發(fā)明的方法，作為利用基因工程有選擇地改變植物性狀的技術(shù)，特別是賦予植物雄性不育性狀的技術(shù)是有用的。
序列表<110>農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所所長(DIRECTOR GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCS，MINISTRY OF AGROCULTURE，F(xiàn)ORESTRY AND FISHERIES)<120>使用絨氈層特異的鋅指轉(zhuǎn)錄因子使花粉受育性降低的方法<130>AR018<140>
<141>
<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1886<212>DNA<213>雜交矮牽牛(Petunia hybrida)<220>
<221>CDS<222>(283)..(1617)<400>1cccacgcgtc cgcatgtgca gagataaata taaaccaaca tgacctacca ttaagatgag 60acgatgatca tctaaaattt tggagctcag atgattttat tcgacaaatt tcctattttc 120tcgctatggg tttccttttc agctaagcta cctccctcct tcttcttgat ttgattttct 180tgggtttctt gtttcttctt gttttagggt ttttgataca catatatagt tgcttagtta 240cgtagctaag taaggtgggt tatttcattt cttgaacttt ca atg gtt gat tat294Met Val Asp Tyr1caa gat ctt caa gtt ggg atg agc gga aca ctg tgg ata caa ctc aag 342Gln Asp Leu Gln Val Gly Met Ser Gly Thr Leu Trp Ile Gln Leu Lys5 10 15 20
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35 40 45Ile Cys Glu Val Cys Asn Lys Gly Phe Ser Ser Gly Lys Ala Leu Gly50 55 60Gly His Met Arg Ile His Val Gln Ala Ala Lys Lys Leu Leu Ser Val65 70 75 80Gly Lys Lys Cys Lys Lys Leu Asn Pro Phe Gly Ser Arg Tyr Tyr Lys85 90 95Lys Arg Ile Leu Leu Gln Gln Asp Asp His Gln Asp Asn Tyr Asn Asn100 105 110Asp Ile Lys Asn Gln Leu Ala Pro Ile Cys Ser Val Cys Gly Lys Asn115 120 125Phe Pro Ser Met Lys Ser Leu Phe Gly His Met Arg Ser His Pro Glu130 135 140Arg Ala Trp Arg Gly Ile Gln Pro Pro Ala Pro Asn Lys Asn Ser Cys145 150 155 160Leu Ser Ser Ala Ser Asn Glu Ile Ala Ala Thr Thr Lys Ser Gly Asp165 170 175Leu Ser Val Pro Gly Trp Ser Val Lys Ala Lys Arg Gly Arg Lys Gly180 185 190Thr Ile Ala Glu Ala Ser Ser Asn Ser Ser Leu Gly Ser Arg Ser Phe195 200 205Ser Phe Asp Gln Glu Lys Asp Asp Glu Glu His Glu Leu His Asp Ala210 215 220Val Gly His Leu Met Leu Leu Ala Asn Gly Asn Lys Thr Ser Ala Asp225 230 235 240Gln Glu Leu Glu Ile Thr Asn Ser Asn Ser Leu Thr Ser Lys Ala Glu245 250 255Thr Glu Gln Val Asp Glu Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu260 265 270Arg Arg Leu Gly Ser Val Gln Asp Leu Val Ser Pro Val Ser Val His275 280 285His Asp Gln Lys Leu Val Met Asp Thr Pro Glu Lys Tyr Lys Cys Asn290 295 300Thr Cys Glu Lys Ser Phe Ala Thr His Gln Ala Leu Gly Gly His Arg305 310 315 320Ser Ser His Asn Lys Phe Arg Met Val Ile Gln Asn Ser Val Glu Asp325 330 335Asp Val Val Thr Asn Val Ala Thr Ser Ser Ile Ile Gly Pro Val Glu340 345 350Glu Arg Glu Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ser Lys Leu Leu Val Asp His355 360 365Asn Lys Asn Ala Ser Ala Ser Gln Val Leu Gly Val Gln Asn Arg Cys370 375 380Gln Trp Gly Ser Pro Ile Asp His Gln Ala Gly Pro Ser Thr Ser Gln
385 390 395 400Leu Thr Ser Pro Gly Glu Val Ser His Ser Ile Gly Arg Gln Ile Leu405 410 415Asp Phe Asp Leu Asn Glu Leu Pro Pro Gln Glu Asp Glu Ile Ala Gly420 425 430Gly Arg Asp His Gln Tyr Phe Thr Phe Phe Pro Ile435 440<210>3<211>2200<212>DNA<213>雜交矮牽牛(Petunia hybrida)<220>
<221>啟動子<222>(1).(1991)<400>3gaattcaggg agtagaacgc ttgacaatat acctgttgct ccaaacttat aaattggggc 60gacgatgaat gaagttaatc gatatgatta aattccatca cacagttatt gtttcaattc 120ttgttaccta attttagtta cacttgcttc acttcttttt agtggcgctt tacaaaaata 180atctagtcct cacattgaaa aaataatgcg atattagttt gacaataatt cagaagtact 240tttgaatata tgcaaaaata attatttcta ctgttaagga aaagctgcaa atttctgttt 300tttttttttt cagaagcaga agaaatttat taaattttca agataaaata atttttttaa 360aagactatat caatttattt caactgttat atatctcaaa tataaataaa actctattct 420tcttgtccat ctttatattt aaatttattc ctaccgatta aagaccttaa taatattttt 480atactacatt ttaaatttta atcaaatgaa taaataatta aatagattaa ataaaaattt 540tcttgatttt tttaaaaatc tttcacattt aaacaataat atcagccaca aatacaactt 600tagtgctgtt tttttgcact atttttaaaa taagcagtct tttgcagcta gacagacaag 660ttcatccaag tcaaatgcat cttaggtaaa ccaatgggcg tgaataattt tttttttcgc 720gtaactttat atttctaaaa tcacttttcg tagtaaaatt ccaaaggata gaaggaaagt 780ttgacgttat agcaaaatta tatgaaaaga tgatttctat ccttttataa gtgagtgaaa 840tcaaagttca tatcatggtt gagaagattt ttattaatgg taaaacaaat taagggcttt 900attgaaatat aagatggata ttatagcatt gatgtgggaa ttttggccgg tgtaaatgtg 960gcatgaatat gatcggatcg gataaaattg ggcagaaaca cggcaagcta agattaaaaa 1020acgcgcaang caaacacntc ancagtcaat gcaccactca agtagggtaa ttaatgacaa 1080attttacatt caaactaaat taaatgcaca cggttaaaat ctctgttaaa agttttggta 1140actttcagac tccttgaaca aactttccat ttggctaaag gtttgaacca aatgaatggg 1200aatacctatg agatatacac cactggaaag tccaagataa tttgaaatta caagagtttc 1260catttgatta ggctacttgt aatcttttga tttaattggt agtcaaattt taaaagatca 1320gaatgatctt ccatttcaca ccatcactta tcccatatct ttatttacaa ttcaaaatac 1380attaatatgt aaaacaaatt aaataactaa taatttcagt aaaactgttg gataattaaa 1440
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<221>修飾堿基<222>(6)<223>i<220>
<221>修飾堿基<222>(9)<223>i<220>
<221>修飾堿基<222>(12)<223>i<220>
<221>修飾堿基<222>(15)<223>i<220>
<223>人工序列的說明引物<400>4
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<221>修飾堿基<222>(15)<223>i<220>
<223>人工序列的說明引物<400>5gtycgnranc cnccngtr18
權(quán)利要求
1.一種制作雄性不育性植物的方法，該方法包括以下步驟提供包含含有(a)具有序列號3所示的堿基序列中第1位到第1991位序列的DNA、以及(b)具有(a)的一部分序列并表現(xiàn)出花藥的絨氈層特異性啟動子活性的DNA中任一DNA的啟動子，和與該啟動子有效連接的異源基因的植物表達(dá)序列組合的步驟；將該表達(dá)序列組合導(dǎo)入植物細(xì)胞的步驟；以及導(dǎo)入了表達(dá)序列組合的植物細(xì)胞再生為植物體的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述植物是雙子葉植物。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中，上述植物是茄科植物。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中，上述植物是矮牽牛屬植物。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述表達(dá)序列組合被整合到植物表達(dá)載體中。
6.一種通過權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的方法制作的雄性不育性植物。
7.一種含有以下(I)或(II)DNA的啟動子(I)具有序列號3所示的堿基序列中第1位到第1991位序列的DNA；以及(II)具有(I)的一部分序列，并表現(xiàn)出對花藥的絨氈層特異性啟動子活性的DNA。
8.一種用于賦予植物雄性不育性的植物表達(dá)序列組合，其中，包含權(quán)利要求7所述的啟動子和與該啟動子有效連接的異源基因。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制作雄性不育植物的方法，該方法是利用包含來自ZPT3－2基因的啟動子、和與該啟動子有效連接的異源基因的植物表達(dá)序列組合，制作雄性不育植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1611607SQ20041003242
公開日2005年5月4日 申請日期1999年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月19日
發(fā)明者S·卡普爾, 小林晃, 高辻博志 申請人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)·生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究機(jī)構(gòu)