一種基于hcr信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器及檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器及檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用轉(zhuǎn)錄因子對(duì)特定序列DNA的識(shí)別，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA從三鏈中分離，脫附下來的目標(biāo)鏈引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過Ru(phen)32+(1,10?鄰二氮菲釕)可以插入雙鏈作為信號(hào)進(jìn)行檢測，制備出無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的靈敏性，特異性，穩(wěn)定性的檢測。
【專利說明】
一種基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器及檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器及檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，轉(zhuǎn)錄因子(Transcript1n factors，TFs)與RNA聚合酶II形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過程。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可分為二類;第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子，它們與RNA聚合酶II共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體時(shí)，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置開始。除TFII D以外，還發(fā)現(xiàn)TFII A，TFII F，TFII E，TFII H等，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始復(fù)合體組裝的不同階段起作用。第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，這些TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類固醇激素\生長因子或其它刺激后，開始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí)，才需要的一類轉(zhuǎn)錄因子。
[0003]TFs(轉(zhuǎn)錄因子)是一種管理蛋白質(zhì)，通過綁定特定的DNA序列，在調(diào)節(jié)各種重要的細(xì)胞過程中，例如:基因復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞分裂以及DNA修復(fù)起著非常重要的作用。
[0004]然而，TFs(轉(zhuǎn)錄因子)的誤調(diào)節(jié)及突變可能會(huì)導(dǎo)致各種疾病，例如，癌癥，糖尿病，先天性心臟病，自身免疫病以及發(fā)展性綜合征。
[0005]如何實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測轉(zhuǎn)錄因子成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于，提供一種基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器及檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法，利用轉(zhuǎn)錄因子對(duì)特定序列DNA的識(shí)別，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA從三鏈中分離，脫附下來的目標(biāo)鏈引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過Ru(phen)32+(1，10-鄰二氮菲釕)可以插入雙鏈作為信號(hào)進(jìn)行檢測，制備出無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的靈敏性，特異性，穩(wěn)定性的檢測。
[0007]—種基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器，其制備方法包括以下步驟:
[0008]a、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris_HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈DNA，冷卻至室溫；
[0009]b、取得到的雙鏈DNA、目標(biāo)DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，加入轉(zhuǎn)錄因子培養(yǎng)，得到混合溶液；
[0010]C、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-1和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru (phen) 32+溶液在修飾電極上，培育，得到基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器。
[0011 ] 在步驟a之前，首先將購買的DNA探針、目標(biāo)DNA、單鏈DNA-1、單鏈DNA-2、輔助DNA-
1、輔助DNA-2分別溶解在Tris-HCl緩沖溶液中，得到濃度均為ΙΟΟμΜ的DNA探針緩沖溶液、目標(biāo)DNA緩沖溶液、單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液、輔助DNA-1緩沖溶液、輔助DNA-2緩沖溶液，并在4°C下保存?zhèn)溆?；后續(xù)使用時(shí)根據(jù)需要稀釋;所述Tris-HCl緩沖溶液，具體為:0.0lM pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液。
[0012]進(jìn)一步的，巰基化DNA(SH-CP)序列為:5’-SH-GAAAGGG-3’；
[0013]目標(biāo)DNA序列為:5’-TTTTTTTTCCCTTTC-3’；
[0014]單鏈DNA-1序列為:5’-TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3’；
[0015]單鏈DNA-2序列為:5，-AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3，；
[0016]輔助DNA-1序列為:5’-AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3’；
[0017]輔助DNA-2序列為:5’ -TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3 ’。
[0018]步驟a具體為:將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液稀釋至濃度為5μΜ，各取5yL，混合在1yL濃度為0.0lM的Tris-HCl雜交緩沖液中，在95°C加熱5min，單鏈DNA-1和單鏈DNA-2通過堿基互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈DNA，然后冷卻至室溫;所述的Tris-HCl雜交緩沖液為:pH為7.4，含有10mM NaCl和ImM EDTA。
[0019]步驟b具體為:取2yL步驟b制備的雙鏈DNA、10yL 2.5μΜ目標(biāo)DNA緩沖溶液，2yL 500μΜ的硝酸銀溶液混合在I OmM磷酸緩沖液中，37 °C下混合30分鐘，然后加入I OyL的轉(zhuǎn)錄因子，37 °C下培育I Omin，終體積為50yL;得到混合溶液；
[0020]步驟b中所述磷酸緩沖液pH為7.4，含有200mM亞硝酸鈉；
[0021]步驟c處理后的電極具體為:將金電極先浸入食人魚洗液30分鐘，然后用去離子水徹底清洗，再依次用直徑0.3和0.5mm的鋁粉進(jìn)行拋光處理，再依次用去離子水、乙醇溶液、超純水超聲清洗5分鐘，之后，再將電極浸入0.5M的硫酸溶液中進(jìn)行電化學(xué)清洗，掃描電壓為0.2-1.6V，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的伏安圖，最后在氮?dú)庵懈稍?，得到處理后的電極;所述食人魚洗液為體積比3:1的濃硫酸與過氧化氫混合溶液。
[0022]步驟c具體為:滴1yL濃度為2μΜ的DNA探針緩沖溶液在處理后的金電極上，室溫培育一夜，然后，電極表面用去離子水清洗，放在ImM 6-巰基己-1-醇中2小時(shí)，以去除非特異性綁定的巰基DNA，然后用1mM pH為7.4磷酸洗液清洗后，修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收I小時(shí)，再次用1mM pH為7.4的磷酸洗液清洗，氮?dú)飧稍?，然后，?yL濃度為IμΜ輔助DNA-1緩沖溶液和5yL濃度為ΙμΜ的輔助DNA-2混合，修飾電極在其中培育2小時(shí)，然后，滴1yL 2mM的Ru(phen)32+溶液在修飾電極上培育7小時(shí)，得到基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器。
[0023]—種檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法，包括以下步驟:
[0024](I)、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris-HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈DNA，冷卻至室溫；
[0025](2)、取得到的雙鏈DNA、目標(biāo)DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，分別加入濃度為O、50、100、200、300、600、1000、2000pM的轉(zhuǎn)錄因子培養(yǎng)，分別得到混合溶液；
[0026](3)、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟(2)中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-1和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(phen)32+溶液滴在修飾電極上，培育；利用電致化學(xué)發(fā)光分析儀檢測制備的修飾電極的發(fā)光強(qiáng)度;構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性關(guān)系；
[0027](4)根據(jù)待檢測轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)光強(qiáng)度及所得到的線性關(guān)系，得到待檢測轉(zhuǎn)錄因子的濃度。
[0028]步驟(I)具體為:ECL電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度利用MP1-E型電致化學(xué)發(fā)光分析儀在0.1M磷酸緩沖液(pH 7.4，20mM三丙胺)掃描修飾電極，掃描電壓從O到1.2V，掃速為0.lV/s，光電倍增管高壓設(shè)置為400-600V，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性關(guān)系；
[0029]由于RU(Phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)的信號(hào)強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度有關(guān)，也就與轉(zhuǎn)錄因子的濃度有關(guān)，隨著NF-kB p50(轉(zhuǎn)錄因子)濃度的增加，ECL(電致化學(xué)發(fā)光)的峰強(qiáng)度即RU(phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)隨之增加，因此，此傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同濃度的NF-kB p50(轉(zhuǎn)錄因子)進(jìn)行檢測。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本生物傳感器的制備方法，利用RU(Phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)插入雙鏈DNA作為信號(hào)分子，步驟簡單，無標(biāo)記。通過轉(zhuǎn)錄因子與雙鏈DNA的特異性結(jié)合，使得目標(biāo)DNA從三鏈脫附下來，將脫附下的目標(biāo)DNA引發(fā)HCR雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，實(shí)現(xiàn)更多的Ru(phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)插入，從而使得ECL電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)得到放大，構(gòu)建ECL電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)與轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p50濃度的線性關(guān)系，ECL強(qiáng)度的測量是在5mL，濃度為0.1M含有20mM的三丙胺的磷酸緩沖液中進(jìn)行。掃描電壓以0.lV/s的掃速從OV掃到1.2V，光電倍增管電壓設(shè)置至400-60(^，所得線性關(guān)系為1 = 1066.5+7.9200(:(?1)，線性范圍為0-2000pM，檢測限為0.017nM，相關(guān)系數(shù)為0.9990。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的檢測具有靈敏度高，檢測限低，選擇性好，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0032]圖1為基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光檢測轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器的制備不意圖；
[0033]圖2A為有轉(zhuǎn)錄因子的傳感器組裝各步驟的循環(huán)伏安圖；
[0034]圖2B為無轉(zhuǎn)錄因子的傳感器組裝各步驟的循環(huán)伏安圖；
[0035]a為裸金電極;b為SH-CP修飾的金電極；c為Target DNA/SH-CP修飾的金電極;d為Hi/H2/Target DNA/SH-CP修飾的金電極；
[0036]圖3A為有轉(zhuǎn)錄因子的傳感器組裝各步驟的阻抗圖；
[0037]圖3B為無轉(zhuǎn)錄因子的傳感器組裝各步驟的阻抗圖；
[0038]a為裸金電極;b為SH-CP/裸金電極；c為Target DNA/SH-CP/裸金電極；(!為出/出/Target DNA/SH-CP/裸金電極；e為Ru(phen)32+/Target DNA/SH-CP/裸金電極；
[0039]圖4A為有轉(zhuǎn)錄因子傳感器組裝各步驟的循環(huán)伏安圖；
[0040]圖4B為無轉(zhuǎn)錄因子傳感器組裝各步驟的循環(huán)伏安圖；
[0041 ] a為裸金電極;b為裸金電極/TPrA;c為SH-CP/裸金電極/TPrA;d為Target DNA/SH-CP/裸金電極/TPrA ； eSHi/U/Target DNA/SH-CP/裸金電極/TPrA ； f為Ru (phen) 32+/Ηι/Η2/Target DNA/SH-CP/裸金電極/TPrA
[0042]圖5為傳感器可行性圖；
[0043]a為裸金電極；b為SH-CP/裸金電極；c為Ru(phen)32+/Target DNA/SH-CP/裸金電極;d為Ru(phen) 32+/Hi/H2/Target DNA/SH-CP/裸金電極；
[0044]圖6A為基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器對(duì)不同濃度轉(zhuǎn)錄因子的電致化學(xué)發(fā)光圖；(電壓-強(qiáng)度)
[0045]圖6B為基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器對(duì)不同濃度轉(zhuǎn)錄因子的電致化學(xué)發(fā)光圖；(時(shí)間-強(qiáng)度)
[0046]圖6C為轉(zhuǎn)錄因子的濃度和電信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系圖；
[0047]圖7A基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的穩(wěn)定性圖；
[0048]圖7B基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的選擇性圖;a為對(duì)人凝血酶的信號(hào)強(qiáng)度;b為對(duì)人免疫球蛋白的信號(hào)強(qiáng)度;c為對(duì)牛血清蛋白的信號(hào)強(qiáng)度;d為NF-kBp50的信號(hào)強(qiáng)度
[0049]圖8為基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的實(shí)樣檢測圖；a為未處理的核提取物加入NF-kB p50;b為TNF-α處理的核提取物；c為未處理的核提取物;d為不加核提取物。
【具體實(shí)施方式】
[0050]本領(lǐng)域公知的以下簡稱對(duì)應(yīng)為:巰基化DNA:SH-CP、目標(biāo)DNA:Target DNA、單鏈DNA-1: sDNA-Ι、單鏈DNA-2: sDNA-2、輔助DNA-1: Hl、輔助DNA-2: H2。
[0051 ] 實(shí)施例1
[0052]—種檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法，包括以下步驟:
[0053](1)將購買的所有0難探針(巰基化0難:3!1-0?:5’-3!1-6444666-3’；目標(biāo)DNA:Target DNA:5’-TTTTTTTTCCCTTTC_3’ ；單鏈DNA-l:sDNA_l:5’-TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3 ’ ；單鏈DNA-2: sDNA-2: 5 ’ -AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3 ’ ；輔助DNA-1-U-AAAAAAAAGTACTATTTTTTm ;輔助DNAUd’-TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3，)分別溶解在0.0lM Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液)(pH 7.4)緩沖溶液中，其中，巰基化DNA所用緩沖液體積為119yL，目標(biāo)DNA所用緩沖液體積為88yL，單鏈DNA-1所用緩沖液體積為46yL，單鏈DNA-2所用緩沖液體積為38yL，輔助DNA-1所用緩沖液體積為106yL，輔助DNA-2所用緩沖液體積為11OyL，均得到IΟΟμΜ的原液，并在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0054](2)、相應(yīng)的互補(bǔ)配對(duì)的sDNA-Ι和sDNA-2各取5yL，濃度為5μΜ，混合在10yL，濃度為
0.0lM Tris-HCK三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液)雜交緩沖液中(pH 7.4 ,10mM NaCl(氯化鈉)，ImM EDTA(二乙胺四乙酸))，sDNA-1，sDNA_2終濃度均為1.25μΜ，將上述混合物在95°C加熱5分鐘，兩條單鏈DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)成dsDNA(雙鏈DNA)，然后緩慢冷卻至室溫。
[0055](3)、取2yL上述dsDNA(雙鏈DNA)與10μ?，2.5μΜ目標(biāo)DNA、2yL 500μΜ的硝酸銀溶液混合在1mM磷酸緩沖液中(pH 7.4，200mM亞硝酸鈉)，37°C下混合30分鐘，將1yL濃度分別為O，50，100，200，300，600，1000，2000pM的轉(zhuǎn)錄因子NF_kB p50分別加入上述體系中，37°C下培育10分鐘;得到混合溶液；
[0056](4)、將金電極先進(jìn)入食人魚洗液(濃硫酸與過氧化氫體積比3:1混合溶液)30分鐘，然后用去離子水徹底清洗，再依次用直徑0.3和0.5_的鋁粉進(jìn)行拋光處理，再依次用去離子水、乙醇溶液、超純水超聲清洗5分鐘。之后，再將電極浸入0.5M的硫酸溶液中進(jìn)行電化學(xué)清洗，掃描電壓為0.2-1.6V，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的伏安圖，最后在氮?dú)庵懈稍铮玫教幚砗蟮碾姌O；
[0057](5)、一滴1yL的SH-CP (巰基DNA)滴在處理后的電極上，室溫培育一夜，然后電極表面用去離子水清洗，放在ImM MCH( 6-巰基己-1 -醇)中2小時(shí)以去除非特異性綁定的巰基DNA，用I OmM磷酸洗液(pH 7.4)清洗后，修飾電極浸入步驟(3)得到的混合溶液中吸收I小時(shí)，得到的修飾電極再次用1mM的磷酸洗液(pH 7.4)清洗，氮?dú)飧稍?，然后，在含?yL濃度為ΙμΜ HjP5yL濃度為ΙμΜ H2的混合反應(yīng)溶液中培育2小時(shí)，然后，一滴1yL 2mM的Ru(phen)32+(l，10-鄰二氮菲釕)溶液滴在修飾電極上培育7小時(shí)，最后，ECL強(qiáng)度利用MP1-E型電致化學(xué)發(fā)光分析儀在0.1M磷酸緩沖液(pH 7.4，20mM三丙胺)掃描修飾電極，掃描電壓從O至IJ1.2V，掃速為0.lV/s，光電倍增管高壓設(shè)置為400-600V，得到轉(zhuǎn)錄因子濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性關(guān)系。
[0058](6)重復(fù)步驟(1)-(5)，將步驟(3)中的濃度分別為0，50，100，200，300，600，1000，2000pM的轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p50替換為相同體積待檢測的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)步驟(5)構(gòu)建的線性關(guān)系，得到待檢測的轉(zhuǎn)錄因子的濃度。
[0059]實(shí)施例1以轉(zhuǎn)錄因子NF-kBp50為例，其他種類的轉(zhuǎn)錄因子檢測，通過改變轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別序列，檢測其他的轉(zhuǎn)錄因子。
[0060]實(shí)施例2
[0061 ]電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的選擇性分析實(shí)驗(yàn)
[0062]重復(fù)實(shí)施例1中步驟(1)-(5)，將步驟(3)中的轉(zhuǎn)錄因子分別替換為相同體積的人凝血酶、人免疫球蛋白或牛血清蛋白，其他條件不變，得到的基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的選擇性圖，如圖7B。
[0063]實(shí)施例3實(shí)樣檢測
[0064]重復(fù)實(shí)施例1中步驟(1)-(5)，將步驟(3)中的轉(zhuǎn)錄因子分別替換為a含有InM的NF-kB p50的未處理的，濃度為50ngAiL的海拉細(xì)胞核提取物，b TNF-α處理的海拉細(xì)胞核提取物，c未處理的海拉細(xì)胞核提取物以及d，沒有加入細(xì)胞核提取物，其他實(shí)驗(yàn)條件相同，得到基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的實(shí)樣檢測圖，如圖8。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: a、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris-HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈DNA，冷卻至室溫； b、取得到的雙鏈DNA、目標(biāo)DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，加入轉(zhuǎn)錄因子培養(yǎng)，得到混合溶液； C、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-1和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(Phen)32+溶液在修飾電極上，培育，得到基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟a具體為:將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液稀釋至濃度為5μΜ，各取5yL，混合在1yL濃度為0.0lM的Tris-HCl雜交緩沖液中，在95°C加熱5min，單鏈DNA-1和單鏈DNA-2通過堿基互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈DNA，然后冷卻至室溫。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟b具體為:取2yL步驟b制備的雙鏈DNA、1yL 2.5μΜ目標(biāo)DNA緩沖溶液，2μ?500μΜ的硝酸銀溶液混合在1mM磷酸緩沖液中，37°C下混合30分鐘，然后加入1yL的轉(zhuǎn)錄因子，37 V下培育1min，終體積為50yL;得到混合溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟c具體為:滴1yL濃度為2μΜ的DNA探針緩沖溶液在處理后的金電極上，室溫培育一夜，然后，電極表面用去離子水清洗，放在ImM 6-巰基己-1-醇中2小時(shí)，以去除非特異性綁定的巰基DNA，然后用1mM pH為7.4磷酸洗液清洗后，修飾電極浸入步驟b中所得的混合溶液中吸收I小時(shí)，再次用I OmM pH為7.4的磷酸洗液清洗，氮?dú)飧稍?，然后，?Λ濃度為ΙμΜ輔助DNA-1緩沖溶液和濃度為ΙμΜ的輔助DNA-2混合，修飾電極在其中培育2小時(shí)，然后，滴1yL 2mM的Ru(phen)32+溶液在修飾電極上培育7小時(shí)，得到基于HCR信號(hào)放大的無標(biāo)記電致發(fā)光生物傳感器。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，巰基化DNA (SH-CP)序列為:5 ’ -SH-GAAAGGG-3 ’ ；目標(biāo)DNA序列為: 5 ’ -TTTTTTTTCCCTTTC-3 ’ ；單鏈DNA-1 序列為: 5 ’ -TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3 ’ ；單鏈DNA-2序列為: 5 ’ -AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3 ’ ；輔助DNA-1 序列為: 5 ’ -AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3 ’ ；輔助DNA-2序列為: 5’-TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3’。6.—種檢測轉(zhuǎn)錄因子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (I )、將單鏈DNA-1緩沖溶液、單鏈DNA-2緩沖溶液混合在Tris-HCl雜交緩沖液中，加熱，使其互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈DNA，冷卻至室溫； (2)、取得到的雙鏈DNA、目標(biāo)DNA緩沖溶液和硝酸銀溶液混合在磷酸緩沖液中，混合，分別加入濃度為O、50、100、200、300、600、1000、2000pM的轉(zhuǎn)錄因子培養(yǎng)，分別得到混合溶液； (3)、將探針DNA滴在處理后的金電極上，室溫培育一夜，清洗后，去除非特異性綁定的巰基DNA，將制備的修飾電極浸入步驟(2)中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有輔助DNA-I和輔助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(Phen)32+溶液滴在修飾電極上，培育；利用電致化學(xué)發(fā)光分析儀檢測制備的修飾電極的發(fā)光強(qiáng)度;構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性關(guān)系;(4)根據(jù)待檢測轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)光強(qiáng)度及所得到的線性關(guān)系，得到待檢測轉(zhuǎn)錄因子的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK105842232SQ201610158660
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月18日
【發(fā)明人】王廣鳳, 熊云芳
【申請(qǐng)人】安徽師范大學(xué)