花生MYB類轉錄因子AhMYB32及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了花生R2R3?MYB類轉錄因子AhMYB32及其應用，屬于基因工程領域。該基因的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼氨基酸序列為SEQ ID NO.2。本發(fā)明的AhMYB32基因是花生中首次報道，熒光定量表達分析顯示該基因受干旱、高鹽誘導表達，通過轉擬南芥進行功能驗證，結果顯示過表達的轉基因植株與野生型相比表現出耐旱、耐鹽性增強。因此，AhMYB32可作為目的基因導入植物，提高植物的耐旱、耐鹽性。
【專利說明】
花生MYB類轉錄因子AhMYB32及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明公開了花生MYB類轉錄因子AhMYB32及其應用，屬于生物基因工程領域。
【背景技術】
[0002] MYB類轉錄因子作為植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物脅迫應答過程中起 著重要的調控作用。Paz-Ares等（1987)首次從玉米谷粒糊粉中克隆了 COLOREDl(Cl)基因， 編碼一個具有MYB結構域的蛋白，參與花青素合成。擬南芥基因組測序成功后，第一次全面 地對植物MYB基因家族進行描述和分類。根據所含MYB結構域的數目不同，大體分為四類，只 含一個MYB結構域，R1亞類;含兩個MYB結構域為R2R3亞類;R1R2R3亞類成員含三個MYB結構 域;最后一個亞類為非典型MYB，該亞族含有4或5個MYB結構域，植物中數量稀少，一般只有 1-2個（Du et al.，2009)。目前玉米（Hai et al.，2012)、甘薯（Mona et al.，2007)、棉花 (房棟等，2008)、大豆(李曉薇等，2011)等作物均有MYB類轉錄因子的報道?；ㄉ性擃愞D錄 因子鮮有報道，山東花生所陳娜等（2013)通過分析花生36741條ESTs序列，獲得了30個MYB 基因序列，命名為AhMYBl~30,但它們的具體功能還未見報道。
[0003] MYB類轉錄因子參與眾多生物學過程，如：初生和次生代謝反應、細胞形態(tài)與模式 建成、植物生長發(fā)育、對生物和非生物脅迫的應答等。在脅迫響應方面，根據基因表達及功 能研究發(fā)現，參與植物干旱、鹽脅迫調控的MYB蛋白以R2R3類型居多。Hoeren等（1998)從擬 南芥中分離出了可與MYB識別位點特異結合的MYB相關蛋白基因 AtMYB2,受干旱及ΑΒΑ誘導 表達，并能與干旱應答基因 AtADHl特異結合。擬南芥AtMYB60(Cominelli et al.，2005)和 FLP/AtMYB88(Xie et al. ,2010)、馬鈴薯StMYBlR-l(Shin et al. ,2011)、葡萄VvMYB60 (Galbiati et al.，2011)等都通過調節(jié)氣孔及逆境相關基因的表達，來提高作物抗旱性。 擬南芥中AtMYB44/AtMYBRl、AtMYB41、AtMYB15和AtMYB20在mRNA水平上均對鹽脅迫有響應， 在擬南芥中超表達均能提高轉基因植株對鹽脅迫的抗性（Jung etal.，2008;Lippold etal.，2009;Ding etal.，2009;Cui et al.，2013)。小麥中的TaMYB32、TaMYB33、TaMYB56-B 和TaMYB73均受鹽脅迫誘導表達，超表達這些基因的轉基因擬南芥植株耐鹽能力均有所增 強（Zhang et al.，2011and2012;He etal.，2012;Qin et al· ,2012)。此外，水稻的0sMYB2 (Yang etal. ,2012)、蘋果的Md-SMYBl(Wang et al· ,2014)、甘蔗的PScMYBASl(Prabu et al.，2012)及毛竹的PeMYB2(肖冬長等，2013)，在植物中超表達均能夠提高轉基因植株的耐 鹽能力。另外，一些MYB蛋白可能對植物鹽脅迫抗性有負調控作用。如擬南芥的AtMyb73 (Kim et al.，2013)，atmyb73缺失突變體植株在鹽脅迫下的存活率高于野生型植株。以上研究皆 表明MYB類轉錄因子在植物非生物脅迫的調控過程中起作用。

【發(fā)明內容】

[0004] 技術問題
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種花生MYB轉錄因子基因 AhMYB32及其應用。
[0006] 技術方案
[0007] 本發(fā)明提供了一種花生MYB轉錄因子基因 AhMYB32,所述基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述的花生MYB轉錄因子AhMYB32基因編碼的蛋白質，具有序列表中SEQ ID NO.2 所述的氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明所述AhMYB32基因的應用。具體指AhMYB32基因不具有轉錄自激活活性，將 其通過植物表達載體轉入目的植物內，能提高植物的耐旱、耐鹽性。所述植物優(yōu)選是模式植 物擬南芥。
[0010] 有益效果
[0011 ] 本發(fā)明公開了花生R2R3-MYB類轉錄因子基因 AhMYB32及其所編碼的蛋白質，該基 因在花生中為首次報道。熒光定量表達分析表明該基因受干旱及高鹽脅迫誘導;轉擬南芥 功能驗證顯示該基因的過量表達提高了擬南芥植株對干旱及高鹽脅迫的抗性。因此有望作 為目的基因導入植物，提高植物耐鹽、耐旱性，從而進行植物品種改良。
【附圖說明】
[0012] 圖1:PCR擴增后的凝膠電泳結果
[0013] 圖中M: DL2000marker; 32: AhMYB32
[0014] 圖2 :qPCR分析AhMYB32基因在高鹽和干旱下的表達情況 [0015]圖3: AhMYB32基因的轉錄自激活活性驗證
[0016] 圖中 A為陽性對照:pGBKT7+pGADT7 ;B 為陰性對照:pGBKT7 ;C為pGBKT7-AhMYB32。
[0017] 圖4:MS培養(yǎng)基法幼苗期耐鹽性鑒定結果
[0018] 圖A:耐鹽性鑒定的對照培養(yǎng)基；圖B:耐鹽性鑒定的鹽處理培養(yǎng)基。
[0019]圖5: 土培法耐鹽、耐旱性鑒定結果
[0020]圖A:對照正常澆清水處理；圖B:鹽脅迫處理后；圖C:干旱脅迫處理后恢復澆水。
【具體實施方式】
[0021] 實施例l:AhMYB32基因的獲得
[0022] 選用花生較抗旱品種:豐花1號(公知公用，市場購買），光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長，待 生長至3葉期幼苗，進行干旱（20%PEG6000)及高鹽（l%NaCl)處理，處理24h后分別取部分 葉片等量混合放入研缽中，在液氮下快速研磨成粉狀，利用RNA提取試劑盒（E.Z.N.A.? Plant RNAKit，購自OMEGA公司）提取樣品的總RNA，并用DNAsel進行消化處理。利用1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，NanoDrop-2000型分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。再 通過反轉錄試劑盒將總RNA反轉合成cDNA。
[0023] 根據花生抗旱耐鹽相關轉錄組測序結果，挑選了具有完整0RF、差異表達的MYB序 列，根據其預測序列的5'和3'端的非編碼區(qū)分別設計了特異性引物P1、P2(表1)，以上述的 cDNA為模板，以94 °C預變性5min; 94 °C變性30 s，58-60 °C退火30 s，72 °C延伸60s，32個循環(huán)； 72°C延伸lOmin為反應條件進行PCR擴增。擴增片段經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1)，回收 后連接到質粒載體pGEM-Τ，然后轉化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細胞，經選擇性LB培養(yǎng)基 (IPTG、X-gal、Amp)得到陽性克隆，菌液培養(yǎng)后測序分析。測得序列與預測序列一致，命名為 AhMYB32，AhMYB32的cDNA序列如SEQIDN0.1所示，編碼的蛋白序列如SEQIDN0.2所示；結 構域分析顯示其具有2個Μ Y B - D N A結構域（R 2、R 3 );系統(tǒng)進化樹分析表明與擬南芥的 AtMYB44、70、73、77 親緣關系近。
[0024] 實施例2:AhMYB32基因的表達分析
[0025] 選用花生品種：豐花1號，光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長，待生長至3葉期幼苗，分別進行 干旱（20 %PEG6000)及高鹽（1 %NaCl)處理，分別取Oh、4h、8h、12h的葉片樣品，液氮冷凍 后，-80°C冰箱保存。再利用RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit，購自OMEGA公司） 分別提取樣品的總RNA，并反轉成cDNA。
[0026] 基于AhMYB32序列設計定量引物P3、P4(表1)，以花生18S RNA基因引物為內參對 照，根據Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒(TaKaRa)操作說明配制反應體系，每個反應 3次重復;反應程序為:94°C變性5min; 94°C變性20s，55°C退火30s，72°C延伸40s，40個循環(huán)； 于ABI PRISM 7000實時定量PCR儀上檢測表達量。采用2-ΛΛα算法(Livak KJ，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ ACt method.Methods, 2001,25:402-408)分析試驗結果，其中 Δ ACT = (CT樣本-CTiss)Time x-(CT稱-CTiss)Time 0，其中CT樣本和CTiss分別是AhMYB31 和內參基因 18S 的CT值;Time x和Time 0分別為處理的不同時間點（脅迫處理4、8、12h)和對照（脅迫處理 Oh)。結果如圖2所示，AhMYB32表現出對干旱、高鹽脅迫有響應，其中干旱脅迫響應更為顯 著。隨著脅迫處理時間的延長，干旱及高鹽脅迫下的表達量都不斷增加，在脅迫處理12h后 分別上調了近5倍、2倍。
[0027] 實施例3: AhMYB32基因的轉錄自激活活性分析
[0028] 根據AhMYB32序列設計分別帶EcoRl、BamHl酶切位點的引物P5、P6 (表1)，PCR擴增 獲得目的片段，同時利用EcoRl和BamHl對載體pGBKT7質粒進行雙酶切，再經過同源重組酶 (購自上海捷瑞生物工程有限公司）反應后轉化大腸桿菌Transl-Tl感受態(tài)細胞(購自北京 全式金生物技術有限公司），陽性克隆進行測序分析，以確保表達載體中編碼區(qū)閱讀框架正 確，從而獲得了 pGBKT7-AhMYB32誘餌載體。再將該誘餌載體質粒轉化酵母Y2H感受態(tài)(購自 上海邁其生物科技有限公司），轉化菌液按1、10、1〇 2、1〇3梯度稀釋，再分別取l〇〇yL的菌液涂 布轉化菌液分別涂布在SD/-Trp及SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上，同時設陽性對照：pGBKT7+ PGADT7，陰性對照:pGBKT7，30°C倒置培養(yǎng)，3~5d后觀察酵母菌落的生長狀況和顏色反應。 [0029] 從結果（圖3)來看，AhMYB32轉化菌在SD/-Trp培養(yǎng)基中正常生長，而在SD/-Trp- His-Ade篩選培養(yǎng)基上未長出酵母菌落，說明AhMYB32轉錄因子不具有轉錄自激活活性，可 以用酵母雙雜交系統(tǒng)進行其互作蛋白的篩選。
[0030]實施例4:轉化擬南芥及轉基因功能驗證
[0031] 植物表達載體采用載體pSuperl300,根據AhMYB32序列分別設計帶HindIII、SpeI 酶切位點的引物P7、P8(表1)，重組載體構建方法參考實施例3中pGBKT7-AhMYB32誘餌載體 的構建。將獲得的重組表達載體質粒轉入農桿菌EHA105感受態(tài)，經選擇性LB培養(yǎng)基(50mg/L Rif、100mg/L Kan)得到陽性克隆，菌液培養(yǎng)后通過浸花法侵染擬南芥植株(Colombia)。收 獲的To代種子分別經潮霉素及基因引物進行陽性鑒定。獲得的陽性株系繼續(xù)種植，單株收 獲。
[0032]耐鹽性鑒定：（1)MS培養(yǎng)基法:先分別將T2代轉基因種子及野生型種子進行春化處 理3-4天，再用次氯酸鈉進行消毒后，點播于含不同濃度NaCl (0mM/L、100mM/L)的MS固體培 養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱中生長，觀察表型差異。整個生長過程中，MS平板垂直放置。（2)土培 法:將T2代轉基因種子及野生型種子進行春化處理3-4天，再用次氯酸鈉進行消毒后，分別 將MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的轉基因及野生型幼苗移植到裝有定量營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，每缽移植 4株，光照培養(yǎng)箱中緩苗10d，進行脅迫處理，每組每個株系3缽，重復3次。鹽脅迫處理組用 300mmol/LNaCl水溶液澆灌營養(yǎng)土，對照同期澆清水，溫室中繼續(xù)培養(yǎng)至第15天，觀察幼苗 生長情況。
[0033]耐旱性鑒定:將!^代轉基因種子及野生型種子進行春化處理3-4天，再用次氯酸鈉 進行消毒后，分別將MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的轉基因及野生型幼苗移植到裝有定量營養(yǎng)土的營 養(yǎng)缽中，每缽移植4株，光照培養(yǎng)箱中緩苗10d，停止?jié)菜?-4周，有脅迫反應后恢復澆水5天， 期間記錄幼苗生長情況。
[0034] 結果如圖4所示，幼苗期耐鹽鑒定顯示，在不添加 NaCl的對照平板上(A)，野生型和 轉基因植株無明顯差異；而在添加了 100mM/LNaCl處理的平板上(B)，轉基因擬南芥植株的 根長明顯長于野生型植株。
[0035] 從圖5可見，與清水對照（圖A)相比，鹽處理及干旱處理后，野生型及轉基因植株生 長都受到了明顯的抑制，其中野生型較轉基因植株抑制程度更重（圖B、C)。表明轉AhMYB32 基因能提尚植株的耐鹽、耐旱性。
[0036]綜上所述本發(fā)明人提供的AhMYB32基因是首次在花生中分離的新基因，為花生中 首次報道，其功能與花生耐鹽、耐旱相關，可作為目的基因導入植物，提高植物耐鹽、耐旱 性，以進行植物品種改良?？衫帽景l(fā)明AhMYB32基因作為目的基因構建植物表達載體，其 中可用任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟 動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉化 細胞的鑒定可使用選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如B-葡糖醛 酸糖苷酶GUS)或發(fā)光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用無標記選擇。所用的 表達載體可使用Ti質粒，Ri質粒，植物病毒載體等。轉化方法可用經農桿菌介導法、基因槍 法、花粉管通道法或其它方法轉化植物。
[0037] 本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下：
[0038] SEQ ID N0.1(762bp)
[0041] SEQ ID N0.2(253aa)[0043]表1:說明書中涉及的引物相關信息

【主權項】
1. 花生R2R3-MYB類轉錄因子AhMYB32，該基因的cDNA序列如SEQIDN0.1所示。2. 根據權利要求1所述的花生R2R3-MYB類轉錄因子AhMYB32,該基因 AhMYB32所編碼氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3. 權利要求1或2所述花生R2R3-MYB類轉錄因子AhMYB32的應用。4. 根據權利要求3所述的應用，是指花生R2R3-MYB類轉錄因子AhMYB32的是指在植物耐 旱或耐鹽方面的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，是指花生R2R3-MYB類轉錄因子AhMYB32的是指在擬南芥 耐旱或耐鹽方面的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK105949296SQ201610567403
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月18日
【發(fā)明人】劉永惠, 陳志德, 沈, 沈一, 沈悅
【申請人】江蘇省農業(yè)科學院