專利名稱：一種提取β－1，3－葡聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母多糖的提取方法，特別是涉及一種提取β-1，3-葡聚糖的方法。
背景技術(shù)：
β-1，3-葡聚糖普遍存在于多種細(xì)菌、真菌、植物和酵母細(xì)胞壁中。近來(lái)發(fā)現(xiàn)真菌細(xì)胞壁中β-1，3-葡聚糖作為免疫佐劑、抗癌藥等使用時(shí)，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)表現(xiàn)出非特異性免疫調(diào)節(jié)作用。在機(jī)體感染疾病時(shí)，β-1，3-葡聚糖通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，酵母β-1，3-葡聚糖能提高小鼠對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)的抵抗能力(Reynold J A，Kastello M D，Harrington D G，et al.Glucan-induced enhancement of host resistance to selected infections diseases.Infect Immun，1980，3051~57；Di Luzio N R.Immunopharmacology of glucanabroad spectrum enhancer of host defense mechanisms.Thends Pharmacol Sci，1983，4344~347；Chihar G.Immunopharmacology of lentinan as the glucan.Immunol Immunopharmacol，1984，485~96；Buddle B M，Pul ford H D，Ralston M.Protect effect of glucan against experimentally induced staphylococcalmastitis in ewes.Vet Microbiol，1988，1667~76；Benkova M，Boroskova Z，SoltysJ，et al.Effect of glucan preparation on immunocompetent cells and phagocyticability of blood leucocytes in experimental ascariosis of pigs.Vet Parasitol，1992，41157~166.)。
酵母細(xì)胞壁中有3種高分子多糖聚合物，占細(xì)胞壁干重40％，β-1，3-葡聚糖占多糖的50～60％(Jesus Ortuno，Alberto Cuesta，Alejandro Rodriguez，M.AngelesEsteban，and Jose Meseguer.Oral administration of yeast，Saccharomycescerevisiae，enhances the cellular innate immune response of giltheadseabream(Sparus aurata L.).Vet.Immunol.Immunopathol.2002，8541-50)，β-1，3-葡聚糖的含量約為細(xì)胞壁干重的22％左右，表明酵母細(xì)胞壁是較好的提取材料。我國(guó)的酵母年產(chǎn)量很高，1980年產(chǎn)量為10,000噸(以干物質(zhì)計(jì))，20年來(lái)酵母產(chǎn)量增長(zhǎng)近10倍。酵母細(xì)胞壁是食品和啤酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，目前尚未有效利用。
Manners等(Manners，D.J.，A.J.Masson，J.A.Patterson，H.Bjorndal，andB.Lindberg.1973.The structure of aβ-1，6-glucan from yeast cellwalls.Biochem.J.1973，13531-36.)、Fleet(Fleet G.H.，and D.J.Manners.1976.Isolation and composition of an alkali-soluble glucan from the cell wallsof Saccharomyces cerevisiae.J.Gen.Microbiol.1976，94180-192.)根據(jù)酵母細(xì)胞壁化學(xué)成分和相似相溶原理，采用堿、酸處理的化學(xué)方法從酵母中提取β-1，3-葡聚糖，但工藝耗時(shí)長(zhǎng)，得率低，僅為2.4％。Suphantharika等(Suphantharika，M.，P.Khunrae，P.Thanardkit，and C.Verduyn.2003.Preparation of spent brewer’syeast β-glucans with a potential application as an immunostimulant for blacktiger shrimp，Penaeus momodon.Bioresource Technology.2003，8855-60.)采用堿提取一步法提取β-1，3-葡聚糖，此工藝比較簡(jiǎn)單，提取物得率可高達(dá)19～22％，產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量也較低，但所得β-1，3-葡聚糖純度低，僅為51％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種工藝較簡(jiǎn)單、產(chǎn)率較高的提取β-1，3-葡聚糖的方法。
本發(fā)明所提供的提取β-1，3-葡聚糖的方法，包括如下步驟1)堿處理向酵母中加入NaOH，使溶液中NaOH濃度為2-3％，升溫到85-95℃，反應(yīng)2-3-h，過(guò)濾收集沉淀物；2)酸處理向沉淀物中加入酸溶液，調(diào)節(jié)pH到4.5，升溫到70-80℃，反應(yīng)1-2h，過(guò)濾收集沉淀物；3)有機(jī)溶劑浸提將沉淀物洗滌后用有機(jī)溶劑浸提，冷凍干燥得到β-1，3-葡聚糖。
在提取過(guò)程中，常用的酸有鹽酸、硫酸等；常用的抽提有機(jī)溶劑有異丙醇和丙酮等。
提取過(guò)程的優(yōu)選條件為步驟1)所述NaOH濃度為3％；溫度為90℃；反應(yīng)時(shí)間為2h。步驟2)反應(yīng)溫度為75℃；反應(yīng)時(shí)間為1h。產(chǎn)物純度和總糖得率最高，分別可以達(dá)到91.7％和17.31％。
本發(fā)明的工藝流程如圖1所示，所獲得的β-1，3-葡聚糖分子量比較高，在水中不溶。在靜脈注射或腹腔注射使用時(shí)，需要降低其分子量，使其能溶解于水。降解過(guò)程包括甲酸水解、超濾、退火過(guò)程等過(guò)程，其工藝流程如圖2所示。
其中，所述甲酸水解溫度為75-80℃；水解時(shí)間為1h。所述超濾為以截留分子量為100KD的超濾膜和以截留分子量為10KD的超濾膜的兩次超濾。所述退火溫度為70℃；退火時(shí)間為20min。
本發(fā)明所提供的提取β-1，3-葡聚糖的方法制備工藝簡(jiǎn)單，工藝參數(shù)易于操作控制，產(chǎn)物β-1，3-葡聚糖的得率和純度都比較高。所得到的β-1，3-葡聚糖能夠顯著提高肉仔雞的生長(zhǎng)和免疫功能，可廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，調(diào)節(jié)畜禽的免疫機(jī)能。


圖1為提取β-1，3-葡聚糖的工藝流程2為降解β-1，3-葡聚糖的工藝流程圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、β-1，3-葡聚糖的制備取1kg啤酒干酵母加入5L水，混合均勻后，加入NaOH，使NaOH終濃度為3％，加熱到90℃，攪拌反應(yīng)2h后過(guò)濾，水洗滌，保留沉淀物；向沉淀物中加水1L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH到4.5，加熱到75℃，攪拌反應(yīng)1h，過(guò)濾、洗滌得到沉淀。將沉淀用有機(jī)溶劑異丙醇浸提4次，丙酮浸提2次，將浸提物冷凍干燥，得到173gβ-1，3-葡聚糖，得率為17.31％。
β-1，3-葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定采用苯酚-硫酸法，3，5-二硝基水楊酸法顯色反應(yīng)及紅外光譜法，結(jié)果表明其為D-葡萄糖聚合成的多糖，紅外光譜提示多糖糖苷鍵是β-型，連接方式為1→3連接。
采用薄層層析(TLC)來(lái)鑒定所得產(chǎn)物的純度，層析結(jié)果僅有1個(gè)斑點(diǎn)，其Rf值與D-葡萄糖相同，表明產(chǎn)物的單糖組成僅有葡萄糖，產(chǎn)物純度為91.17％。
通過(guò)測(cè)定β-葡聚糖聚合度(DPn)的方法測(cè)定產(chǎn)物分子量，其方法是用硼氫化鈉還原葡聚糖，將其末端醛糖基還原為糖醇基。還原產(chǎn)物完全酸水解，此末端糖醇基即生成為山梨糖醇，葡聚糖末端外的葡萄糖殘基水解產(chǎn)物為葡萄糖。因?yàn)樯嚼嫣谴荚谏嚼嫣谴济摎涿复呋瘯r(shí)存在以下可逆反應(yīng)山梨糖醇+NAD+D-果糖+NADH+H+。當(dāng)pH9～10，并存在過(guò)量的NAD+時(shí)，此反應(yīng)中山梨糖醇的氧化情況可通過(guò)測(cè)定NAD+的還原情況定量測(cè)定。在340nm處采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定10mins，每隔1min讀數(shù)1次，求出平均每分鐘吸光度的變化值(ΔA/min)。因?yàn)镹ADH在340nm處的摩爾吸光系數(shù)是6.22×106cm2/mol，測(cè)定時(shí)反應(yīng)液的總體積是3mL，山梨糖醇含量計(jì)算公式為ΔA/min×3/6.22(μmol)。用葡萄糖氧化酶法測(cè)定還原產(chǎn)物中葡萄糖含量(μmol)。聚合度DPn＝(D-葡萄糖含量/D-山梨糖醇含量)+1(Manners.D.J.，A.J.Masson andR.J.Sturgeon.An enzyme method for the determination of the degree ofpolymerization of glucans.Carbohyd.Res.，1971，17109-114)。所得β-1，3-葡聚糖平均分子量為820000。
實(shí)施例2、β-1，3-葡聚糖的制備取10kg啤酒干酵母加入50L水，混合均勻后，加入NaOH，使NaOH終濃度為2％，加熱到85℃，攪拌反應(yīng)3h后過(guò)濾，水洗滌，保留沉淀物；向沉淀物中加水5L，用硫酸調(diào)節(jié)pH到4.5，加熱到75℃，攪拌反應(yīng)1h，過(guò)濾、洗滌得到沉淀。將沉淀用有機(jī)溶劑異丙醇浸提4次，丙酮浸提2次，得到1628g β-1，3-葡聚糖，得率為16.28％。產(chǎn)品純度為91.89％，平均分子量為885000。
實(shí)施例3、β-1，3-葡聚糖作為飼料添加劑的應(yīng)用以基礎(chǔ)日糧為對(duì)照組，在肉仔雞日糧中添加12.5，25.0mg·kg-1β-1，3-葡聚糖，試驗(yàn)測(cè)定了肉仔雞的生產(chǎn)性能，免疫器官重量，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率，綿羊紅細(xì)胞(SRBC)和新城疫疫苗(NDV)抗體水平。
結(jié)果是，β-葡聚糖能提高21日齡肉雞法氏囊相對(duì)重量達(dá)2.98(P＜0.05)，42日齡外周血淋巴細(xì)胞(PBL)對(duì)脂多糖(LPS)的反應(yīng)達(dá)3.40(P＜0.05)。添加β-葡聚糖，使SRBC抗體水平和IgG含量在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高水平，一免11d后差異顯著，分別達(dá)到5.8和4.2個(gè)滴度(P＜0.05)。β-葡聚糖提高了肉仔雞新城疫疫苗(NDV)的抗體水平，同時(shí)還增強(qiáng)了肉仔雞對(duì)NDV的免疫應(yīng)答，二免9d后達(dá)4.3個(gè)抗體滴度，差異顯著(P＜0.05)。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明，β-1，3-葡聚糖能提高肉仔雞的體液免疫和細(xì)胞免疫功能。
實(shí)施例4、β-1，3-葡聚糖作為飼料添加劑的應(yīng)用以基礎(chǔ)日糧和林肯霉素為兩個(gè)對(duì)照，在肉仔雞日糧中添加12.5，25，50，100mg·kg-1β-1，3-葡聚糖，測(cè)定指標(biāo)包括生產(chǎn)性能，免疫器官重量，淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)、吞噬中性紅能力，血清中抗SRBC、BSA、BA和NDV抗體水平。
結(jié)果表明，與基礎(chǔ)對(duì)照相比，肉仔雞攝食添加β-1，3-葡聚糖配合飼料后，出欄重提高15％，飼料轉(zhuǎn)化效率提高3％，肉仔雞法氏囊相對(duì)重量提高到3.04，B淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)增加至4.41，綿羊紅細(xì)胞(SRBC)抗體提高1個(gè)滴度、牛血清白蛋白(BSA)抗體為0.414(吸光值)，新城疫疫苗(NDV)抗體提高1個(gè)滴度。與抗生素相比，β-1，3-葡聚糖能使肉仔雞出欄重提高6％，飼料轉(zhuǎn)化效率提高3％，法氏囊相對(duì)重量提高26％，吞噬細(xì)胞吞噬能力顯著提高至0.226(吸光值)。BA抗體水平提高1個(gè)滴度，BSA抗體水平提高37％，新城疫疫苗抗體提高1個(gè)滴度。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明，β-1，3-葡聚糖能提高肉仔雞生產(chǎn)性能和免疫功能。
實(shí)施例5、β-1，3-葡聚糖作為免疫佐劑的應(yīng)用β-1，3-葡聚糖作為免疫佐劑應(yīng)用時(shí)，需要降低其分子量，成為可溶性的β-1，3-葡聚糖。降解步驟可按如下過(guò)程進(jìn)行甲酸水解(甲酸與高分子β-1，3-葡聚糖稀釋比例為1g∶15ml，降解溫度為75-80℃，降解時(shí)間為1h)→加熱，揮發(fā)除去甲酸→調(diào)節(jié)pH至11～12→用100KDa超濾膜超濾收集超濾液，除去分子量大于100000的β-1，3-葡聚糖→用10KDa超濾膜超濾所得超濾液收集濃縮液，除去分子量小于10000的水溶性β-1，3-葡聚糖→將所得超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH至7，加熱到70℃，退火20mins即可。
采用實(shí)施例1的方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行化學(xué)鑒定，所得水溶性β-1，3-葡聚糖分子量為10KDa-100KDa，并能保持β-1，3-葡聚糖的構(gòu)型，含量達(dá)10mg/mL。
本發(fā)明通過(guò)不同途徑，在肉仔雞體內(nèi)使用小分子水溶性β-葡聚糖，研究其對(duì)肉仔雞體液免疫功能的影響。試驗(yàn)采用4×3因子安排的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)(4個(gè)β-葡聚糖使用劑量，3種β-葡聚糖使用途徑)，研究不同劑量的水溶性β-葡聚糖通過(guò)不同使用途徑(靜脈注射途徑，肌肉途徑以及與新城疫疫苗免疫的相同途徑)時(shí)，測(cè)定肉仔雞體內(nèi)新城疫抗體水平的變化。采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，研究肌肉注射BSA(濃度為5mg/mL)同時(shí)注射不同劑量水溶性β-葡聚糖后，測(cè)定肉仔雞BSA抗體總量。
從試驗(yàn)結(jié)果得知，水溶性β-1，3-葡聚糖與使用途徑存在顯著的交互效應(yīng)。通過(guò)佐劑途徑與新城疫疫苗同時(shí)使用，能提高新城疫抗體1個(gè)滴度；肌肉注射BSA同時(shí)注射水溶性β-1，3-葡聚糖，能顯著提高肉仔雞抗BSA抗體水平(吸光值提高50％)。
結(jié)果表明，水溶性β-1，3-葡聚糖可作為佐劑使用，增強(qiáng)特異性抗體水平。
權(quán)利要求
1.一種提取β-1，3-葡聚糖的方法，包括如下步驟1)堿處理向酵母細(xì)胞壁中加入NaOH，使溶液中NaOH濃度為2-3％，升溫到85-95℃，反應(yīng)2-3h，過(guò)濾收集沉淀物；2)酸處理向沉淀物中加入酸溶液，調(diào)節(jié)pH到4.5，升溫到70-80℃，反應(yīng)1-2h，過(guò)濾收集沉淀物；3)有機(jī)溶劑浸提將沉淀物洗滌后，用有機(jī)溶劑浸提，冷凍干燥得到β-1，3-葡聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取β-1，3-葡聚糖的方法，其特征在于步驟1)所述NaOH濃度為3％；溫度為90℃；反應(yīng)時(shí)間為2h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取β-1，3-葡聚糖的方法，其特征在于步驟2)所述酸溶液為鹽酸或硫酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取β-1，3-葡聚糖的方法，其特征在于步驟2)反應(yīng)溫度為75℃；反應(yīng)時(shí)間為1h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取β-1，3-葡聚糖的方法，其特征在于步驟3)所述有機(jī)溶劑為異丙醇或丙酮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取β-1，3-葡聚糖的方法，其特征在于所述β-1，3-葡聚糖經(jīng)過(guò)甲酸水解、超濾、退火過(guò)程降解為水溶性β-1，3-葡聚糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述甲酸水解溫度為75-80℃；水解時(shí)間為1h。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述超濾為以截留分子量為100KD的超濾膜和截留分子量為10KD的超濾膜的兩次超濾。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述退火溫度為70℃；退火時(shí)間為20min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提取β－1，3－葡聚糖的方法。本發(fā)明所提供的提取β－1，3－葡聚糖的方法，包括如下步驟1)堿處理向酵母細(xì)胞壁中加入NaOH，使溶液中NaOH濃度為2－3％，升溫到85－95℃，反應(yīng)2－3h，過(guò)濾收集沉淀物；2)酸處理向沉淀物中加入酸溶液，調(diào)節(jié)pH到4.5，升溫到70－80℃，反應(yīng)1－2h，過(guò)濾收集沉淀物；(3)有機(jī)溶劑浸提將沉淀物洗滌后，用有機(jī)溶劑浸提，冷凍干燥得到β－1，3－葡聚糖。本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單，工藝參數(shù)易于操作控制，產(chǎn)物β－1，3－葡聚糖的得率和純度都比較高。所得到的β－1，3－葡聚糖能夠顯著提高肉仔雞的生長(zhǎng)和免疫功能，可廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，調(diào)節(jié)畜禽的免疫機(jī)能。
文檔編號(hào)C12P19/08GK1583802SQ20041004614
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月2日
發(fā)明者咼于明, 劉影 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)