專利名稱：一種具有α-1,4-葡聚糖鏈的海膽黃多糖的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有a—l,4一葡聚糖鏈的海膽黃多糖的用途，屬于天然高分子領(lǐng)域，也 屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
海膽黃多糖是從產(chǎn)于黃渤海的光棘球海膽(分/w^Woce加rW^ /7w/"s)中提取出來的 一種多糖。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，海膽不但是一種珍貴的水產(chǎn)品，而且含有具有抗腫瘤、抗 菌和抗病毒等多種活性的天然產(chǎn)物，是一種有開發(fā)前途的海洋資源。國外對海膽活性成分的 研究取得了一些可喜的成果，從海膽中分離出了一些活性成分。同時(shí)，近二十年來，由于分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到糖及其復(fù)合物分子具有極 其重要的生物功能，糖類化合物特別是糖綴合物上的糖鏈參與了多種生命現(xiàn)象的調(diào)解，如細(xì) 胞識別、粘連與融合；信號傳導(dǎo)；免疫與應(yīng)答；細(xì)胞轉(zhuǎn)化、分化與反分化、細(xì)胞的生長和衰 老都離不開糖鏈的參與，有時(shí)糖鏈的作用更為直接和重要。在糖蛋白新生肽鏈折疊、聚合時(shí)， 糖鏈往往是不可缺少的。多糖是由糖甙鍵連接起來的醛糖或酮糖組成的一類天然大分子化合 物，而藥用多糖的研究始于20世紀(jì)50年代末對真菌多糖抗癌效果的發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們從大 量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，從天然產(chǎn)物中分離出來的多糖往往是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活 免疫細(xì)胞而對正常細(xì)胞沒有毒副作用。多糖作為免疫治療藥物正越來越受到重視，已成為新 藥研究的熱點(diǎn)之一。多糖不但能治療機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷的癌癥，又能治療多種免 疫缺損疾病，如慢性病毒性肝炎和某些耐藥細(xì)菌或病毒引起的慢性疾病，而且多糖作為藥物 對細(xì)胞毒性小在治療腫瘤時(shí)，它不像化療藥物直接殺死生長著的癌細(xì)胞，而是作為一種生 物免疫反應(yīng)或加強(qiáng)抗體生成及激活劑補(bǔ)體等，以達(dá)到抑制和消滅腫瘤細(xì)胞的效果，對正常細(xì) 胞的影響極小。自1986年日本批準(zhǔn)香菇多糖(Lentinan)上市以來，國內(nèi)外已批準(zhǔn)臨床應(yīng)用 的多糖有香菇多糖、云芝多糖、裂褶多糖、牛膝多糖和豬苳多糖。研究范圍涉及多糖的分 離純化、結(jié)構(gòu)分析、生物學(xué)活性、藥理作用、構(gòu)效關(guān)系、新藥評價(jià)、臨床應(yīng)用等，其中一些 多糖組分的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成己經(jīng)清楚，藥理學(xué)作用研究已達(dá)到分子水平、受體水平和基 因調(diào)控水平。隨著對多糖結(jié)構(gòu)的逐步深入了解，多糖化合物的生物活性研究得以迅速發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是鑒定光棘球海膽黃中所分離出的多糖的結(jié)構(gòu)，并確定其具體活性用途。 本發(fā)明涉及海膽黃多糖的結(jié)構(gòu)鑒定，即從光棘球海膽的海膽黃中分離純化得到的海膽黃 多糖，經(jīng)酸水解和GC分析表明，海膽黃多糖為首次從海膽中分離到的一種結(jié)構(gòu)新穎的葡聚 糖，并通過化學(xué)分析和光譜分析推斷出本發(fā)明中的海膽黃多糖的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)見圖1，含1 —4和1—6兩種糖苷鍵，主鏈由1—4糖苷鍵組成，側(cè)鏈由1—6糖苷鍵組成，糖殘基為a構(gòu) 型。上述海膽黃多糖在濃度25 ix g/mL時(shí)可協(xié)同ConA顯著地刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖；不同濃 度下(25-200yg/mL)可協(xié)同亞適量的LPS刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖。另外，在25-200 w g/mL 的濃度范圍內(nèi)，海膽黃多糖對小鼠脾T、 B淋巴細(xì)胞的增殖均具顯著的刺激作用，且其作用 呈一定的劑量依賴性。而RT-PCR法測定上述海膽黃多糖對脾細(xì)胞中各細(xì)胞因子基因表達(dá)的 影響，結(jié)果初步表明小鼠脾細(xì)胞經(jīng)不同濃度的海膽黃多糖處理6h后，IL-ie、 TNF-a基因表 達(dá)上調(diào)。同時(shí)，它可顯著地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖，在25 200ug/mL的濃度范圍內(nèi)， 與對照組相比有顯著差異(/><0.05)，并且可以顯著地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能 力。


圖1是海膽黃多糖的重復(fù)單元圖2是海膽黃多糖水解產(chǎn)物薄層層析3是海膽黃多糖的糖醇乙酸酯的氣相色譜4是Nal04溶液的濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5是海膽黃多糖消耗NaI04的量曲線圖6是海膽黃多糖的Sm池降解產(chǎn)物的氣相色譜7是海膽黃多糖的糖醇乙酸酯GC，MS聯(lián)機(jī)分析中的GC圖譜圖8是海膽黃多糖的紫外分光圖譜圖9是海膽黃多糖的紅外分光圖譜圖10是海膽黃多糖的^NMR圖譜圖11是海膽黃多糖的13CNMR圖譜圖12是海膽黃多糖的H-H COSY圖譜圖13是海膽黃多糖的HSQC圖譜圖14是海膽黃多糖的NOESY圖譜圖15是海膽黃多糖協(xié)同ConA對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響圖 圖16是海膽黃多糖協(xié)同LPS對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響圖 圖17是海膽黃多糖對T、 B淋巴細(xì)胞增殖的影響18是脾細(xì)胞總RNA電泳19是海膽黃多糖對iNOS、 IL-1 e 、 IFN- Y 、 TNF- a基因表達(dá)的影響 圖20是海膽黃多糖對巨噬細(xì)胞增殖的影響
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:1、 取本發(fā)明中的海膽黃多糖10mg置于安培管中，加入2 mL 2.0 mol/L三氟乙酸，充 N2封管后置于ll(TC水解2h，減壓濃縮除去三氟乙酸(<40°C)，然后加入甲醇蒸干，重復(fù)操 作三次以完全除去TFA，再向樣品中加入0.5mL左右的水使樣品溶解。用微晶纖維素板作薄層分析，水解后的樣品在下列不同的展開劑中層析:①乙酸乙酯吡啶水乙酸=5:5:3: l，②正丁醇吡啶水=6 :4:3，③正丁醇水乙酸=4 :5: i。顯色劑為苯胺-鄰苯二酸，顯色溫度為ll(TC， 10min。，顯色后與葡萄糖，鼠李糖，甘露糖、半乳糖、木糖和糖醛酸標(biāo) 準(zhǔn)品對照以確定糖組成。結(jié)果從圖2可以看出本發(fā)明中的海膽黃多糖僅有一個(gè)棕色斑點(diǎn)，且 其Rf值與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品一致，表明其可能為一種由葡萄糖組成的多糖。2、 本發(fā)明中的海膽黃多糖經(jīng)水解成單糖后，在硼氫化鈉的作用下還原成相應(yīng)的糖醇，經(jīng) 乙酰反應(yīng)，得到相應(yīng)的糖醇乙酸酯衍生物，使不揮發(fā)多糖變成易揮發(fā)、對熱穩(wěn)定的衍生物。 通過氣相色譜分析，色譜條件為進(jìn)樣口 split-splitless，溫度260°C;柱HP-5， 5% phenyl methyl siloxane規(guī)格30mX 0.25mmX 0.25 u m，流量1.3mL/min;升溫程序150。C至22(TC每分鐘 升溫2'C， 22(TC至280。C每分鐘升溫3(TC，共39分鐘。見圖3，表明本發(fā)明中的海膽黃多糖 水解產(chǎn)物僅產(chǎn)生一個(gè)峰，其保留時(shí)間為33.834min，表明此海膽黃多糖由一種單糖組成；3、 NaKV溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用重蒸水精確配制30mM、 15mM、 10mM、 8mM、 6mM、 4mM、 2mM的Nal04溶液，均稀釋250倍后以重蒸水作對照調(diào)零測定其在223nm處的吸光值，繪制吸光值A(chǔ)223-濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。稱取10mg上述海膽黃多糖，置于棕色反應(yīng)瓶中，加入30mL 15mM的NaI04，振蕩令其 溶解，加塞置于4"C冰箱黑暗處氧化，見圖5，在96h后達(dá)到平衡，接著將反應(yīng)液稀釋250倍 測定其在223nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NaI04的消耗量為0.058mmo1，以溴甲酚紫 作指示劑，0.01M NaOH滴定計(jì)算得甲酸的釋放量為0.0892mmo1，[己糖基]:[1041 : [HC00H]=1 : 1. 15 : 0. 18。根據(jù)原理可推知，此海膽黃多糖每摩爾己糖基含1—4或(和)1 —2糖苷鍵約0.81摩爾；1—6糖苷鍵或(和)非還原末端約0.19摩爾；不含1—3糖苷鍵。 1—4或(和)1—2糖苷鍵與1—6糖苷鍵或(和)非還原末端的比例為4.2: 1。4、 Smith降解是將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后進(jìn)行酸水解或部分酸水解，經(jīng)酸水解后用TLC 或GC鑒定水解產(chǎn)物，由降解的產(chǎn)物可以推斷糖苷鍵的位置。取9.0mg本發(fā)明中的海膽黃多糖，經(jīng)Nal04完全氧化后，加入2mL乙二醇并并攪拌30min使反應(yīng)終止，反應(yīng)液對流水透析3 天，再對蒸餾水透析l天。袋內(nèi)液體減壓濃縮至10mL，加入30mgNaBH4，室溫下暗處攪拌反 應(yīng)24h，再用0. 1M醋酸調(diào)PH二4 5，以除去過量的NaBH4，依次用流水、蒸餾水透析至徹底 脫鹽，冷凍千燥得多糖醇。取多糖醇置于安培管中，加入2 mL 2.0 mol/L三氟乙酸，充N2 封管后置于110。C水解2h，減壓濃縮除去三氟乙酸(〈40°C)，然后加入甲醇蒸干，重復(fù)操作 三次以完全除去三氟乙酸。水解后的樣品溶于3mL左右的蒸餾水中，加入20mg硼氫化鈉，于 室溫下還原2h (不時(shí)地?fù)u振一下)，用冰醋酸破壞過量的NaBH4，調(diào)節(jié)溶液的pH值至4-5之 間，減壓蒸干，加入l-3mL甲醇及一滴冰醋酸，再減壓蒸干，如此重復(fù)三次(最后一次不加 冰醋酸)，真空干燥(PA) 5-6h。還原后的樣品加入2mL醋酸酐，密塞，IO(TC反應(yīng)lh，減 壓蒸干，加入2mL甲苯，再蒸干，重復(fù)三次以完全除去過剩的醋酸酐。乙?；蟮漠a(chǎn)物用氯 仿和蒸餾水交替溶解轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，振搖后靜止，分層，去除水層，再以等體積的蒸餾 水洗滌一次，去除水層，氯仿層以無水硫酸鈉干燥，振搖后放置10min，再過濾除去硫酸鈉 固體，將氯仿濃縮至0. lmL后進(jìn)行氣相色譜(GC)分析。見圖6，表明此海膽黃多糖的Smith降解產(chǎn)物中有甘油(保留時(shí)間為6.538min)和赤蘚 醇(保留時(shí)間為13.610rain)，峰面積歸一化后得出二者的比例為1 :4。因此，1—4糖苷鍵 與1—2、 1—6糖苷鍵及非還原末端1—的摩爾比為4 : 1。5、多糖的甲基化稱取本發(fā)明中的海膽黃多糖8mg于反應(yīng)瓶中，真空干燥5-6h，干燥 后的樣品加入用干燥4A分子篩處理過的3mLDMS0，室溫磁力攪拌直至多糖樣品完全溶解后加 入研磨過的千燥的NaOH粉末20mg，室溫?cái)嚢?0min，然后改用冰浴5min，待反應(yīng)瓶中的溶 液完全冰凍后，逐滴加入0.6mL碘甲烷(此過程大約需要15-20min)，同時(shí)反應(yīng)物會(huì)慢慢地解 凍，并逐漸澄清，直至成為亮黃色溶液，恢復(fù)至室溫，繼續(xù)磁力攪拌反應(yīng)30min，室溫減壓 蒸餾，去盡過量的碘甲烷，然后用蒸餾水透析兩天，減壓蒸至2mL左右，進(jìn)行冷凍干燥，然 后真空干燥5h，再重復(fù)上述操作3次后，取少量樣品進(jìn)行紅外檢測。當(dāng)IR譜上原樣品的3300 cm—'處強(qiáng)而寬的羥基峰消失，而2900cm—'處的甲基峰相對增強(qiáng)時(shí)，說明樣品己完全被甲基化。將已完全甲基化后的樣品溶于3niL90y。的甲酸溶液中，密塞，10(TC下水浴解聚6h，減壓蒸干，加入2-3mL甲醇，蒸干，重復(fù)三次以除盡過量的甲酸。然后向解聚后的樣品中加入4mL2mol/LTFA,密封后ll(TC下水解3-4h，反應(yīng)瓶中的溶液減壓蒸干，再加入2-3mL甲醇，蒸干，重復(fù)三次以除盡過量的TFA。水解后的樣品用2mL水溶解，加入20mg NaBH,于室溫下反應(yīng)2h，然后用冰醋酸調(diào)pH值至5左右，加l-2mL甲醇及一滴冰醋酸再減壓蒸干，重復(fù)三次，以除盡過量的醋酸。于ll(TC下干燥10-15min后，加入3mL的醋酸酐，IO(TC下反應(yīng)lh，減壓蒸去未反應(yīng)的醋酸酐，加入2mL甲苯，減壓蒸干，如此重復(fù)三次以除盡醋酸酐。最后將乙?；蟮臉悠啡苡诼确?，再加入等體積的水洗滌氯仿層三次，除去水層，氯仿層加入無水硫 酸鈉干燥，放置10min，過濾，將氯仿溶液濃縮至O. lmL左右，作氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析，升 溫方式為T =140(3)-250/5。見圖7，此海膽黃多糖出現(xiàn)了三個(gè)甲基化衍生物離子峰，其保留時(shí)間分別為10.77min、 14.13min和18.17min。聯(lián)機(jī)檢索各質(zhì)譜圖，初步確定各質(zhì)譜的歸屬；根據(jù)部分甲基化糖醇乙 酸酯衍生物的裂解規(guī)律歸屬質(zhì)譜圖中的初級碎片和次級碎片，通過解析，GC譜圖中三個(gè)組成 依次應(yīng)為1，5-二-氧-乙?；?2,3,4,6-四-氧-甲基-葡萄糖(簡寫為2,3,4，6-Me4-Glc)、 1,4,5-三-氧-乙酰基-2，3,6-三-氧-甲基-葡萄糖(簡寫為2,3,6-Me3-Glc)、 1,4,5,6-四-氧-乙?；?2,3-二-氧-甲 基-葡萄糖(簡寫為2，3,-Me2-Glc)，三個(gè)組分摩爾比約為1 : 7.80 : 1.15?？梢钥闯?，上述海 膽黃多糖為一種含有非還原末端1 —，由1—4及1—6糖苷鍵組成的葡聚糖，三者的比例為1 : 7.8 : 1.15。6、 部分酸水解稱取一定量的上述海膽黃多糖，置于安培管中，加入0.3M的TFA，封 管，100'C水解18-20h，用NaOH中和多余的TFA，透析，冷凍干燥得水解產(chǎn)物。水解產(chǎn)物 經(jīng)Nal04氧化和NaBH4還原后得相應(yīng)的糖醇，糖醇經(jīng)水解和衍生4fc生成糖乙醇酯的衍生物后 進(jìn)行氣相色譜分析，僅檢出赤蘚醇，表明其僅含有1—4糖苷鍵，即上述海膽黃多糖的主鏈由 1—4糖苷鍵組成。7、 紫外光譜分析將本發(fā)明中的海膽黃多糖配成1.0mg/mL水溶液，用紫外分光光度計(jì) 在600 200nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。見圖8，其在260nm和280nm處均無特征吸收峰，表明該海膽黃多糖均無蛋白質(zhì)和核酸。8、 紅外光譜分析取干燥的上述海膽黃多糖l.Omg，以KBr壓片，在4000 400cm—1的 范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。見圖9，其在3600 3200cm"處(3384.54cm—"出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的寬 峰，為羥基(-OH)的伸縮振動(dòng)，存在著分子間和分子內(nèi)的氫鍵；在3000 2800cm—1處(2929.43 cm")出現(xiàn)的吸收峰較弱，為C-H的伸縮振動(dòng)，1400~1200cm-1處(1364.06cm-1)的峰是C-H 的變角振動(dòng)。這兩組峰為多糖的特征吸收峰。1646.88cm—1處出現(xiàn)的吸收峰是由于溶劑(水) 引起的[174]。 1154~1022cm"范圍為C-0的伸縮振動(dòng)，1022.51cm—1處的強(qiáng)吸收說明本發(fā)明中的 海膽黃多糖的主要組成單糖為葡萄糖；852.41cm"有吸收峰且在898 884cm"處無吸峰表明 海膽黃多糖僅含a糖苷鍵；在932.72 cm"處的吸收峰以及1022.51、 1080.17及1155.13cm-1 表明其由a -D-吡喃葡萄糖組成。9、 核磁共振(NMR)分析取冷凍干燥后的本發(fā)明中的海膽黃多糖約25mg，室溫下真 空干燥1-2天后溶于0.5mL D20中，在AVANCE500核磁共振儀上測定其& NMR和13C NMR 譜，以DSS為內(nèi)標(biāo)(SHO.OOppm， Sc21.74ppm )，測定溫度為30。C。另外，還測定了上述海膽黃多糖的'H」HCOSY、 HSQC和NOESY等2DNMR譜，其中，NOESY譜的混合時(shí)間 為200ms。見圖10，其在S〉4.5ppm的低場區(qū)有兩個(gè)異頭質(zhì)子信號，其化學(xué)位移分別為S 5.3857ppm和S4.9713ppm，提示該多糖含有兩種a糖苷鍵，由于兩類異頭質(zhì)子H信號比例不 同，說明兩種糖苷鍵在該多糖中不均衡。見圖ll，該海膽黃多糖在S〉100ppm的低場區(qū)出現(xiàn)兩個(gè)信號峰，為異頭碳的信號峰，其 化學(xué)位移分別是S 102.495和100.363ppm，與NMR譜中的兩個(gè)異頭氫信號峰相對應(yīng)，說 明組成其的基本重復(fù)單元中確實(shí)含有兩種糖苷鍵的連接方式，且糖殘基構(gòu)型為a型，再根據(jù) 甲基化分析等化學(xué)分析方法可確定該海膽黃多糖含1—4和1—6兩種連接方式，因此，兩個(gè) 異頭碳及異頭質(zhì)子的信號峰分別歸屬于1—4和1—6。根據(jù)海膽黃多糖的H-H COSY (見圖12)及HSQC譜(見圖13)可得出相對應(yīng)C-H信 號的化學(xué)位移，根據(jù)前面的^NMR、 "CNMR分析結(jié)果，將對應(yīng)的C-H信號時(shí)行部分歸屬 見表1。表1 ，海膽黃多糖的H-H COSY及HSQC譜的具體各信號歸屬化學(xué)位移(ppm) 歸屬 化學(xué)位移(卵m) 歸屬102.495-5.386C1/H176.076-3.560100.363-4.971C函75週-—3.711579.683-3.915 (弱)C4/H474.495-3.737沒歸屬68.282-3.947， 3.750C6服74.080.3.54663.243-3.767， 3.843C6/H672.863-3.88972.220-3.421見圖14，此海膽黃多糖在異頭氫產(chǎn)生NOE信號的非異頭氫及其化學(xué)位移見表2。表2，海膽黃多糖的NOESY圖中部分?jǐn)?shù)據(jù)異頭氫NOE化學(xué)位移S 5.386".546， 3.915S 4.9715 3.421， 3.750， 3.947多糖中與異頭氫具有NOE信號分別為C-2上氫信號(分子內(nèi))和與C-l相連的另一糖殘 基的碳上的氫信號(分子間)，由于S 3.915ppm歸屬C4， S 3.750、 3.947ppm歸屬C6，因此， 本發(fā)明中的海膽黃多糖為一主鏈為1—4糖苷鍵，側(cè)鏈含1—6糖苷鍵的多糖。同時(shí)S 3.546、 S 3.421ppm應(yīng)分別歸屬于1—4、 1—6位鍵合的糖殘基上C-2的氫信號。因此通過對1DNMR及2DNMR譜的全面分析，此海膽黃多糖糖殘基的C、 H信號亦可 完成全歸屬見表3。_表3，海膽黃多糖在^and"CNMR中的化學(xué)位移_S"C"H(叩m)a殘基 _1 2 3 4 5 6(6a) 6b75.801 ~"63.243 ^3.7115 3.767 3.84376.076 68.282 -3.656 3.947 3.75010、綜合上述分析可得出如下結(jié)論(1) 糖組成分析結(jié)果表明，本發(fā)明中的海膽黃多糖為葡聚糖；(2) 高碘酸氧化、Sm池降解及甲基化分析表明，上述海膽黃多糖含有1—4， 1—6兩種糖苷 鍵和非還原末端1 —，三者的比例約為8:1:1;(3) 部分酸水解結(jié)果表明此多糖糖鏈的主鏈由1—4糖苷鍵組成；(4) UV分析本發(fā)明中的海膽黃多糖不含蛋白質(zhì)和核苷酸，IR結(jié)果表明它由a -D —吡喃葡萄 糖組成的葡聚糖。(5) NMR分析表明該多糖的重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)中含1—4和1—6兩種糖苷鍵，主鏈由1—4糖 苷鍵組成，側(cè)鏈由1—6糖苷鍵組成，糖殘基為a構(gòu)型。因此，本發(fā)明中的海膽黃多糖的重復(fù)單元可能的結(jié)構(gòu)如圖1，是首次從海膽中分離到的 一種結(jié)構(gòu)新穎的葡聚糖。(1—4)- a -D-Glcp,殘基1(1—6)-a -D-Glcp:殘基2102.495 74.0805.386 3.546100.363 72.2204.971 3.42172.863 79.6833.889 3.91572.863 74.4953.889 3.737實(shí)施例2:試劑與藥品海膽黃多糖(自制經(jīng)HPLC、聚丙烯酰胺凝膠電泳及薄層層鑒定為均一多 糖組分)，脂多糖(LPS, Sigma公司)，噻唑藍(lán)(MTT， Sigma公司)，刀豆蛋白A (ConA， Sigma公司)，脂多糖(LPS, Sigma公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，新生小牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司)。動(dòng)物清潔級ICR小鼠(中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。儀器超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)，C02培養(yǎng)箱(美國ThermoForma公司)，DM-IRB 熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)，Model 680型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)。海膽黃多糖協(xié)同ConA/LPS對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 取6~8周齡ICR小鼠，頸椎脫臼處死，無菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為6~8X106/mL，將細(xì)胞分為兩部分， 一部分直接加入96 孔板中，每孔加入100ixL細(xì)胞懸液，再加100ixL培養(yǎng)液(空白對照)以及含有不同濃度的 海膽黃多糖溶液；另一部分細(xì)胞加入亞適量的ConA或LPS混勻，于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100n L細(xì)胞懸液，再加入100uL培養(yǎng)液(亞適量的ConA/LPS對照)、含有不同濃度 的海膽黃多糖溶液，最后于酶標(biāo)儀上測各孔的吸光值。根據(jù)不同濃度該海膽黃多糖單獨(dú)作用 及ConA/LPS-海膽黃多糖共同作用孔的吸光值(分別記為As、 Ac—S/L-S)，計(jì)算As+Ac。nA/1_PS 及Ac-S/L.s+Ac。ntrol，若后者大于前者表明該海膽黃多糖與ConA/LPS有協(xié)同增殖的作用，否則無。見圖15,高濃度(200u g/mL、 100u g/mL)的海膽黃多糖與2 n g/mL的ConA對小鼠脾 淋巴細(xì)胞增殖未表現(xiàn)出協(xié)同作用；該多糖的低濃度(25"g/mL)與2 n g/mL的ConA對小鼠 脾淋巴細(xì)胞增殖則具有明顯的協(xié)同作用。見圖16，可以看出不同濃度的海膽黃多糖與g/mL的LPS對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖均 具有一定的協(xié)同作用，其中l(wèi)OOix g/mL的該海膽黃多糖與LPS對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的協(xié)同 能力最強(qiáng)，50ug/mL的次之，200ug/mL的海膽黃多糖協(xié)同增殖能力最弱。 海膽黃多糖對T、 B淋巴細(xì)胞增殖的影響取脾細(xì)胞及T、 B細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5~6 X106/mL。于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100"L細(xì)胞懸液，再加100 " L培養(yǎng)液(空白對照)、 10ug/mL ConA及10ug/mL LPS (陽性對照)及含有不同濃度的樣品溶液，置5。/qC02， 37'C培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，于每孔加入5mg/mL的MTT 20n L，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加 入酸化的20%的SDS溶液120ixL裂解細(xì)胞過夜，在酶標(biāo)儀上測各孔的吸光值(測定波長570nm，參比波長630nm)，計(jì)算增殖指數(shù)SI (si = ^f^^^f^)。見圖17，表明陰性對照孔的吸光值不同濃度的海膽黃多糖對小鼠脾臟的T、 B淋巴細(xì)胞具有顯著的刺激增殖的作用，且均呈現(xiàn) 一定劑量依賴性。RT-PCR法測定海膽黃多糖對脾細(xì)胞中各細(xì)胞因子基因表達(dá)影響1. 海膽黃多糖處理脾細(xì)胞取6 8周齡的ICR小鼠，頸椎脫臼處死，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度為 6~8X106/mL。于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 u L細(xì)胞懸液，再加500uL培養(yǎng)液(空白對 照)、10ug/mLConA (陽性對照)及含有不同濃度的樣品溶液，置5%C02， 37。C培養(yǎng)6h。2. 總RNA的提取采用經(jīng)典的異硫氰酸胍方法提取脾細(xì)胞總RNA。3. 總RNA濃度測定及電泳鑒定取4u L總RNA，用DEPC水稀釋到1000PL，用分光光度計(jì)測定總RNA的00260及OD28()。另取0.5g瓊脂糖，加入30mL0.P/。DEPC水，在微波爐中熔化，再加5mL10X甲醛變性電泳緩沖液，冷卻至約50。C，加入8.9mL甲醛溶液，再加6.1mL0.1% DEPC水，混勻后將膠加到制膠槽內(nèi)，取5yL總RNA上樣，電泳，紫外燈觀察并拍照以鑒定RNA的完整性， 結(jié)果見圖18，可以發(fā)現(xiàn)28S和18S兩條明顯的條帶，并且28S的亮度是18S的兩倍左右，且 260/280紫外吸收值之比為1.86，表明RNA的抽提效果比較好，沒有明顯的降解。 4. RT—PCR由Genebank獲取小鼠細(xì)胞因子IL-1 0 、 IFN- Y 、 TNF- a及內(nèi)標(biāo)GAPDH基因全序列。 PCR系統(tǒng)如下模板cDNA5uL， 4XdNTPlwL， 10Xbuffer2.5 U L，上下游弓l物各1.5 u L， T叫DNA聚合酶0.3uL， MgCl22.2uL，最后用無菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25 u L，每管加入一 滴液體石蠟封口，離心分層，94T:變性5min后按下列程序循環(huán)30次，94°C 30s， 53°C 45s， 72°C 45s。然后72"C延伸10min。 PCR產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad凝膠成像系 統(tǒng)測定各條帶的掃描積分值。結(jié)果見圖19，可以看出，用濃度為25 200ug/mL的范圍內(nèi)的 海膽黃多糖處理脾細(xì)胞6h，可使脾細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-1 e 、 TNF-a的基因表達(dá)上調(diào)，而IFN-Y的基因表達(dá)與培養(yǎng)液對照組比沒有明顯的變化。實(shí)施例31、 取處于對數(shù)生長期的小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7，胰酶消化收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào) 整細(xì)胞濃度為5XH)^/mL，加入96孔板，100uL/ L，貼壁2h后，棄上層培養(yǎng)液，加入不同 濃度的上述海膽黃多糖、培養(yǎng)液(陰性對照)和LPS (陽性對照)，于37'C、 5%的(302培養(yǎng) 24h。吸棄上層培養(yǎng)液，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)液100yL/ L，同是加入5mg/mL的MTT20tiL/孔， 同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h后，輕輕吸棄上清，加入150uLDMSO震蕩10min，充分混勻，置 室溫10min后，用酶標(biāo)儀在570nm處測定吸光值。結(jié)果如圖20可見該海膽黃多糖可顯著地 促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖，在25 200yg/mL的濃度范圍內(nèi)，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。2、 于96孔板中制備細(xì)胞濃度為lXl(yVmL腹腔巨噬細(xì)胞單層，棄上層培養(yǎng)液，加入不 同濃度的上述海膽黃多糖各100uL/孔，于37。C、 5X的C02培養(yǎng)24h。取上清液，加入等量 的Griess試齊J，室溫反應(yīng)10min，于酶標(biāo)儀上測定540nm處的吸光值。以培養(yǎng)液作空白對照， 以20ug/mL的LPS作陽性對照。根據(jù)回歸方程為A540=0.01052[NO] + 0.01365 (R=0.9991) 的NaN02標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO的含量。如表4，可以看出，在25 200U g/mL的濃度范圍內(nèi)， 上述海膽黃多糖可明顯地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，并呈一定的劑量依賴性，隨著濃 度的升高，誘生NO的能力增強(qiáng)；100H g/mL的海膽黃多糖誘生NO的能力略高于同濃度的 香菇多糖。表4，不同濃度海膽黃多糖對腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響組別_劑量(Pg/mL)_NOOmol/mL)對照組 ^ 15.954±0.319香蔬多糖 100 26.007 ±0.797**200 26.1%±0.527**海膽黃多糖 目 26，±0'992*50 25.24 ±0.396**_^__19.842±0.504***尸<0.05; **P<0.01相對與對照組3、制備細(xì)胞濃度為1Xl(^/mL腹腔巨噬細(xì)胞單層，加入96孔板，100uL/孑L;加入不同 濃度的上述海膽黃多糖100y L/孔，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h;然后向每孔中加入0.1%中 性紅生理鹽水液，繼續(xù)培養(yǎng)20min，傾去上清液，用溫PBS緩沖液洗3遍，每孔加入細(xì)胞溶 解液(為體積分?jǐn)?shù)50 %的乙酸和體積分?jǐn)?shù)50 %的無水乙醇)0.2 mL，室溫下放置2 3h，待細(xì) 胞溶解后，即在酶聯(lián)免疫檢測儀上測540nm處的吸光度，不加藥物，加培養(yǎng)基作為對照組， 每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果如表5，在25 100ug/mL濃度范圍，該海膽黃多糖處理組的吸光 值明顯高于培養(yǎng)液對照組，其中，濃度為50ug/mL時(shí)，對巨噬細(xì)胞吞噬功能的增強(qiáng)作用最 強(qiáng)，與LPS對照組無顯著差異(/>>0.05)。說明上述海膽黃多糖可以顯著地促進(jìn)小鼠腹腔巨噬 細(xì)胞吞噬中性紅的能力。表5，海膽黃多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的影響組別_ 計(jì)量Og/mL)_A540對照 - 0.214±0.005LPS 5 0.251 ±0.008**200 0.216±0.007海胛黃多糖 100 0.242±0,008**50 0.247 ±0賴**__^_0.231 ±0.008**/><0.05; **尸<0.01相對于對照組因此從實(shí)例2與實(shí)例3可以看出，海膽黃多糖是一種免疫增強(qiáng)劑，可顯著增強(qiáng)免疫活性， 而且它可通過多途徑、多方式進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)從而達(dá)到抗腫瘤的目的。
權(quán)利要求
1. 一種具有α-1，4-葡聚糖鏈的海膽黃多糖，其重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)中含1→4和1→6兩種糖苷鍵，主鏈由1→4糖苷鍵組成，側(cè)鏈由1→6糖苷鍵組成，糖殘基為α構(gòu)型，其為首次從海膽中分離到的一種結(jié)構(gòu)新穎的葡聚糖。
2、 權(quán)利要求1所述的海膽黃多糖具有主鏈由1—4糖苷鍵組成，側(cè)鏈由1—6糖苷鍵組 成，糖殘基為a構(gòu)型的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)。
3、 權(quán)利要求1所述的海膽黃多糖是一種具有a —1，4一葡聚糖鏈的葡聚糖。
4、 權(quán)利要求1所述的海膽黃多糖的用途。
5、 權(quán)利要求4所述的用途，包括免疫增強(qiáng)劑，抗腫瘤藥物，抗氧化藥物。
6、 權(quán)利要求5所述，優(yōu)先保護(hù)兔疫增強(qiáng)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海膽黃多糖結(jié)構(gòu)鑒定以及用途。利用化學(xué)分析和波譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中的海膽黃多糖的重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)中含1→4和1→6兩種糖苷鍵，主鏈由1→4糖苷鍵組成，側(cè)鏈由1→6糖苷鍵組成，糖殘基為α構(gòu)型，即其為首次從海膽中分離到的一種結(jié)構(gòu)新穎的葡聚糖。同時(shí)，本發(fā)明中的海膽黃多糖可協(xié)同ConA或LPS刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖，也可通過不同的方式激活巨噬細(xì)胞，因此表明本發(fā)明中的海膽黃多糖具有免疫增強(qiáng)劑的作用。
文檔編號A61P39/00GK101280026SQ200710022928
公開日2008年10月8日 申請日期2007年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月28日
發(fā)明者劉純慧, 濤 奚, 楊奇珍, 邢瑩瑩 申請人:中國藥科大學(xué)