專利名稱：一種斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說是一種斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)，屬鱸形目、鮨科、石斑魚亞科，石斑魚屬。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，為餐桌中的上等佳肴。由于其生長快、市場價(jià)格高而穩(wěn)定，是目前我國沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。斜帶石斑魚是一種雌性先熟的雌雄同體魚類，開始為雌性，在體長為250～400mm時(shí)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，雄性需6齡左右才成熟，在人工繁殖時(shí)常會(huì)遇到難以同時(shí)得到功能性雄性和雌性親魚的問題，給種苗生產(chǎn)造成很大困難。因此，如何使斜帶石斑魚提早性轉(zhuǎn)變，盡早獲得功能性的雄魚顯得非常重要。目前，在誘導(dǎo)斜帶石斑魚提前性逆轉(zhuǎn)的研究中，主要還是應(yīng)用性類固醇激素，如甲基睪酮(MT)。但MT是一種禁藥，不易購買，而且使用后可能會(huì)造成環(huán)境激素污染。
動(dòng)物性腺分化發(fā)育受多種內(nèi)在和外在因素調(diào)節(jié)，歸根結(jié)底，它是受到基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。有關(guān)哺乳動(dòng)物的研究表明SRY基因是雄性決定基因，它編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，含有一個(gè)與DNA結(jié)合的HMG區(qū)域。隨后的研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)存在一大類這樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它們的HMG區(qū)域與SRY的HMG區(qū)域有高度的同源性，這一類轉(zhuǎn)錄因子被命名為SRY盒相關(guān)基因，即Sox基因。目前，根據(jù)HMG區(qū)域同源性的高低，Sox基因分為10大類(包括SRY)，即A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J類。不同的Sox有不同的功能，它們參與動(dòng)物體多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，軟骨和血的生成，性腺的分化發(fā)育等。在魚類中，目前還沒有找到一種決定性別分化的SRY盒基因。如能找到與性腺分化發(fā)育相關(guān)的基因，則可以通過多種方法，如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)等，調(diào)控該基因的表達(dá)，從而達(dá)到控制性腺分化發(fā)育的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與斜帶石斑魚性腺分化發(fā)育相關(guān)的功能基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的提供該基因在斜帶石斑魚性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明從4齡斜帶石斑魚性腺(III期早期卵巢)中提取總RNA，然后用SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Invitrogen)構(gòu)建了斜帶石斑魚卵巢cDNA文庫。根據(jù)Sox基因的保守序列，設(shè)計(jì)了一對簡并引物，以斜帶石斑魚卵巢反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條220bp的擴(kuò)增片段，測序結(jié)果表明它是一種Sox基因的片段。然后，分別進(jìn)行3’和5’RACE，獲得了該Sox基因的全長cDNA序列。
根據(jù)該Sox基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)了特異性引物，應(yīng)用RT-PCR方法分析了Sox基因表達(dá)的組織分布和處于不同發(fā)育階段的斜帶石斑魚性腺Sox基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明斜帶石斑魚Sox基因表達(dá)水平在性腺比在其他組織高，另外，Sox基因在IV期早期的卵巢表達(dá)量比II期卵巢高，而當(dāng)性腺處于間性初期時(shí)表達(dá)量開始下降，在雄性時(shí)表達(dá)量進(jìn)一步下降。這些結(jié)果顯示了該Sox基因參與了斜帶石斑魚性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)。因此，可以應(yīng)用該基因的產(chǎn)品或調(diào)控該基因的表達(dá)來控制斜帶石斑魚的性腺發(fā)育。
目前，在誘導(dǎo)斜帶石斑魚提前性逆轉(zhuǎn)的研究中，主要還是應(yīng)用性類固醇激素，如甲基睪酮(MT)。但MT是一種禁藥，不易購買，而且使用后可能會(huì)造成環(huán)境激素污染。而應(yīng)用該Sox基因的產(chǎn)品或調(diào)控該Sox基因的表達(dá)來控制斜帶石斑魚的性腺發(fā)育，具有高特異性和敏感性，以及無環(huán)境激素污染等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為用于構(gòu)建卵巢cDNA文庫的卵巢組織切片圖；圖2為卵巢總RNA電泳圖；圖3為克隆斜帶石斑魚Sox基因初始cDNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖4為斜帶石斑魚Sox基因5’RACE產(chǎn)物電泳圖；圖5為斜帶石斑魚Sox基因3’RACE產(chǎn)物電泳圖；圖6為一步法RT-PCR分析斜帶石斑魚Sox基因表達(dá)的組織分布圖；
圖7為兩步法RT-PCR分析斜帶石斑魚Sox基因在不同發(fā)育狀況的性腺中的表達(dá)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 Sox基因的獲得(1)取樣4齡斜帶石斑魚購自廣東省大亞灣水產(chǎn)養(yǎng)殖中心海水養(yǎng)殖基地。解剖魚體，取出性腺，一部分性腺樣品凍于液氮，另一部分性腺樣品用Bouin’s固定液固定，石蠟切片，組織切片觀察發(fā)現(xiàn)性腺為III期早期卵巢，如圖1所示。
(2)RNA提取用TrizolReagent提取性腺總RNA，在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，檢查RNA質(zhì)量。電泳顯示18S和28S核糖體RNA條帶清晰，表明所提取的卵巢RNA質(zhì)量較高。如圖2所示，圖中已標(biāo)出18S和28S核糖體RNA的位置。
(3)cDNA文庫構(gòu)建取1μg性腺總RNA，應(yīng)用SMARTTTMcDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Invitrogen)，構(gòu)建了斜帶石斑魚卵巢cDNA文庫。文庫擴(kuò)增后的滴度為1.2×1010pfu/ml，文庫的重組率達(dá)到99％，表明cDNA文庫質(zhì)量較高。
(4)Sox基因的克隆以性腺反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，應(yīng)用簡并引物F1(5’cac at(ca)aa(ag)cg(ag)cc(cga)atg aa(tc)gc 3’)和R1(5’gc ttt ggttt(ct)ttc(tc)t(gc)gg(tc)c 3’)進(jìn)行PCR，獲得一個(gè)220bp的擴(kuò)增片段，如圖3所示，把該片段克隆到T-載體pUCm-T，測序分析表明該片段為一種Sox基因cDNA片段。以性腺cDNA文庫為模板，引物5’LDAMP(5’CTC GGG AAG CGC GCC ATT GTG TTG GT 3’)和基因特異性引物Qo-SOXRl(5’ACC GCT TCC CGA GCC GTT TAG AG3’)進(jìn)行5’RACE，獲得Sox cDNA的5’端序列，如圖4所示，箭頭所示400bp左右的擴(kuò)增片段；以性腺反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板(Promega試劑盒)，基因特異性引物QO-SOX-F3(5’ACA CCG AGA AGA TCC CGTTCA TCC 3’)和3’接頭引物BRL2(5’GGC CAC GCG GCG ACTAGT AC3’)進(jìn)行3’RACE，獲得Sox cDNA的3’端序列，如圖5所示，箭頭所示2.0kb左右的擴(kuò)增片段；然后，拼接3’RACE和5’RACE的測序結(jié)果，得出斜帶石斑魚的Sox全長cDNA核苷酸序列，并推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列，如序列表所示。
實(shí)施例2 Sox基因的應(yīng)用(1)斜帶石斑魚Sox基因表達(dá)的組織分布從斜帶石斑魚不同組織中提取總RNA，用RNase-free的DNaseI去除其中可能存在的基因組DNA的污染，然后取0.5ug RNA，應(yīng)用一步法反轉(zhuǎn)錄PCR(One-stepRT-PCR)分析試劑盒(Invitrogen)分析Sox基因在不同組織的表達(dá)，所用引物為QOSOXFl(5’GAT CAT GGT TCA ACA CAC GGA AC3’)和QOSOXRl(5’ACC GCT TCC CGA GCC GTT TAG AG3’)，PCR循環(huán)數(shù)為39，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為220bp。一步法RT-PCR結(jié)果表明斜帶石斑魚Sox基因表達(dá)水平在性腺比在其他組織高，如圖6所示，M，100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為陰性對照(模板為水)；2為4齡斜帶石斑魚性腺(III期早期卵巢)；3-10分別為2齡斜帶石斑魚性腺(II期卵巢)、垂體、延腦、下丘腦、后腦、中腦、前腦、和嗅球。
(2)斜帶石斑魚Sox基因在處于不同發(fā)育時(shí)期的性腺中的表達(dá)選取處于不同發(fā)育階段(雌性、間性和雄性)的性腺，提取總RNA，然后取5ug RNA，用DNaseI處理去除基因組DNA污染后，用Thermoscript RT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen)進(jìn)行RT-PCR分析，研究Sox基因表達(dá)狀況，PCR循環(huán)數(shù)為28。RT-PCR分析結(jié)果表明IV期早期的卵巢表達(dá)量比II期卵巢高，另外，性腺處于間性初期時(shí)表達(dá)量開始下降，在雄性時(shí)表達(dá)量進(jìn)一步下降，表示該基因參與了調(diào)控斜帶石斑魚性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)，如圖7所示，M，100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，II期卵巢；2，IV期早期卵巢；3，間性早期性腺；4，雄性精巢；5，陰性對照(模板為水)。
在所檢測的二齡斜帶石斑魚各組織中，性腺表達(dá)Sox基因的水平最高。在斜帶石斑魚處于間性期，該Sox基因表達(dá)量下降，而在雄性階段，表達(dá)量進(jìn)一步下降，表明該Sox基因在斜帶石斑魚性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。因此，可以通過調(diào)節(jié)該Sox基因的表達(dá)來控制斜帶石斑魚的性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)，人工誘導(dǎo)斜帶石斑魚提前性逆轉(zhuǎn)。
SOXST2~1.TXTSEQUENCE LISTING<110>中山大學(xué)<120>一種斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox及其應(yīng)用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2253<212>DNA<213>斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)<220>
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1.一種斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox，其核苷酸序列如序列表所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox，其特征在于所述基因Sox的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列如序列表所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox，其特征在于所述基因Sox在石斑魚性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox，其特征在于所述基因Sox在斜帶石斑魚性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
一種斜帶石斑魚SRY盒相關(guān)基因Sox及其應(yīng)用。本發(fā)明從斜帶石斑魚性腺中發(fā)現(xiàn)了基因Sox，該基因在斜帶石斑魚的性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)中有重要的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK1587409SQ200410051198
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者張為民, 林丹, 張利紅, 張勇 申請人:中山大學(xué)