專利名稱：含斜帶石斑魚促性腺激素Ⅰ成熟肽基因的真核表達載體、重組菌株和重組蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種含有斜帶石斑魚促性腺激素I 成熟肽基因的克隆載體、表達載體、重組菌株和重組蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促性腺激素(gonadotropin hormone, GTH)是由腦下垂體產(chǎn)生的兩個亞單位的糖 蛋白，其作用的靶組織是精巢和卵巢，其生理功能主要是增加性腺類固醇激素的生成與分 泌，促進配子生成，性腺發(fā)育成熟和排精排卵。促性腺激素(gonadotropin hormone, GTH) 分為兩種類型，即促性腺激素I (GTH I，又稱卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone, FSH))與促性腺激素II (GTH II，又稱黃體生成素(luteinizing hormone, LH))，促性腺激 素I是由GTHa與FSHii組成的異二聚體，促性腺激素II是由GTHα與LHi3組成的異二 聚體。斜帶石斑魚促性腺激素α亞基含有10個Cys殘基，形成5個分子內(nèi)二硫鍵，成熟肽 含有94個氨基酸，第一個氨基酸殘基是Ala，信號肽含有23個氨基酸殘基；FSH β亞基含 有11個Cys殘基，形成5個分子內(nèi)二硫鍵，成熟肽含有99個氨基酸，信號肽含有21個氨基 酸殘基，N-連接糖基化位點和0-連接糖基化位點不保守。一般認為，促性腺激素I即卵泡 刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)主要在性腺發(fā)育早期起作用，即卵黃生成期 和精子生成期由腦垂體大量分泌產(chǎn)生，并對刺激性腺組織分泌產(chǎn)生雌二醇和睪酮起主要作 用，經(jīng)學者研究，F(xiàn)SH在促排精排卵中同樣起著重要的作用。斜帶石斑魚(Epinephelus coioides (orange-spotted grouper))屬 S盧 形目(Perciformes)，鯧科(Serranidae)，石斑魚亞科(Epinephelinae)石斑魚屬 (Epinephelus)，主要分布于沿海近礁水域，為雌性先熟的雌雄同體魚類。繁殖季節(jié)為4 10月間，以4 5月為盛期。斜帶石斑魚是我國華南沿海一帶及東南亞地區(qū)重要的海水養(yǎng) 殖魚類，肉質(zhì)細嫩，味美，經(jīng)濟價值較高。石斑魚性腺發(fā)育與排精排卵的不同步制約了石斑 魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)，目前現(xiàn)有的催產(chǎn)劑如使用hCG或魚類腦垂體提取物等，成本較高而且效果 不穩(wěn)定。因此，利用生物技術(shù)開發(fā)高效安全的魚類催產(chǎn)劑具有重要的經(jīng)濟價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種含有斜帶石斑魚促性腺激素GTH α或FSH β成 熟肽基因的克隆載體。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種由大腸桿菌和斜帶石斑魚促性腺激素GTHa 或FSHii成熟肽基因構(gòu)建而成的重組菌株。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種含有斜帶石斑魚促性腺激素GTHa和/或 FSH^成熟肽基因的真核表達載體。本發(fā)明的第四個目的在于提供一種由含有斜帶石斑魚促性腺激素GTHa和/或 FSH^成熟肽基因的真核表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母構(gòu)建制成的重組菌株。
本發(fā)明的第五個目的在于提供一種重組促性腺激素成熟肽基因及其制備方法。本發(fā)明的最后一個目的在于提供上述重組促性腺激素成熟肽基因在魚類催產(chǎn)中 的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種克隆載體，含有斜帶石 斑魚促性腺激素GTH α或FSH β成熟肽基因。本發(fā)明用于表達斜帶石斑魚GTHa、FSHii及FSH重組蛋白的GTH α與FSH β成 熟肽基因序列是以斜帶石斑魚腦垂體總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴增得到 的，它們分別來源于斜帶石斑魚FSH單亞基基因GTH α與FSHi^的相應(yīng)基因片段。上述GTHa與FSHi^成熟肽基因序列，它們分別為斜帶石斑魚FSH單亞基基因 GTHa全長基因70bp至354bp (相當于對位氨基酸至終止密碼子)的片段以及單亞基基因 FSH^全長基因64bp至363bp (相當于22位氨基酸至終止密碼子)的片段，它們的堿基序 列如序列表SEQ IDN0. 1和SEQ ID NO. 2所示。上述克隆載體的構(gòu)建方法是按照常規(guī)方法，將通過PCR方法擴增的目的片段即斜 帶石斑魚促性腺激素GTHa或FSHii的成熟肽基因，經(jīng)過凝膠電泳鑒定與試劑盒回收后， 通過連接反應(yīng)將目的片段連入表達載體中，即構(gòu)建成含有斜帶石斑魚促性腺激素GTHa或 FSH^成熟肽基因的克隆載體。本發(fā)明提供的一種克隆載體，優(yōu)選為由含有斜帶石斑魚促性腺激素GTHa或 FSH^的成熟肽基因和大腸桿菌構(gòu)建制得pPTZ 57R/T-GTH α或pPTZ 57R/T_FSH3。本發(fā)明的第二個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種重組菌株，由克隆載 體 pPTZ57R/T-GTH α 或 pPTZ 57R/T-FSH β 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α 構(gòu)建制得 pPTZ 57R/ T-GTH a -DH5 α 或 pPTZ 57R/T—F SH β _DH5 a。本發(fā)明的第三個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種含有斜帶石斑魚促性腺 激素GTHa和/或FSHii成熟肽基因的真核表達載體。該真核表達載體可以為含有斜帶石斑魚促性腺激素GTHa成熟肽基因的單亞基 表達載體，其含有斜帶石斑魚GTHa成熟肽基因以及6Xhis標簽；該真核表達載體還可以 為含有斜帶石斑魚促性腺激素FSHβ成熟肽基因的單亞基表達載體，其含有FSHi3成熟肽 基因以及6Xhis標簽；該真核表達載體還可以為含有斜帶石斑魚促性腺激素FSHii成熟肽 基因的單亞基表達載體，其含有FSHβ成熟肽基因、6Xhis標簽及myc標簽；該真核表達載 體還可以為含有GTHa和FSHii成熟肽基因的雙亞基串聯(lián)表達載體，其含有GTH α成熟肽 基因、FSH β成熟肽基因、以及4X (gly-ser)-gly-thr的柔性肽和6 Xhis標簽。通過在PCR引物中加入酶切位點與標簽，然后通過PCR方法擴增目的片段即斜帶 石斑魚促性腺激素GTHa或FSHii的成熟肽基因，經(jīng)鑒定回收后，基因片段與畢赤酵母表達 載體分別經(jīng)過相應(yīng)的內(nèi)切酶處理和分離純化后，然后通過連接反應(yīng)將目的片段連入畢赤酵 母表達載體中，即構(gòu)建分別含有斜帶石斑魚促性腺激素GTHa或FSHii成熟肽基因的單亞 基表達載體。其中，短肽連接橋是一個4X (gly-ser)-gly-thr的柔性肽，它可以將兩個多肽連 接起來而不影響各自結(jié)構(gòu)域和功能域的形成，同時可以使多聚體蛋白更好的折疊，通過短 鏈多肽連接橋?qū)⑿睅唪~促性腺激素I兩個單亞基GTHα和FSHi3成熟肽基因連接起 來，同時在PCR引物中引入酶切位點、標簽及多肽連接橋，通過引物搭橋PCR將兩個單亞基GTHa和FSHii連接成一個片段，基因片段與畢赤酵母表達載體分別經(jīng)過相應(yīng)的內(nèi)切酶處 理和分離純化后，然后通過連接反應(yīng)將目的片段連入畢赤酵母表達載體中，即構(gòu)建含有斜 帶石斑魚促性腺激素GTHa和FSHii成熟肽基因的雙亞基串聯(lián)表達載體。本發(fā)明所述的真核表達載體可以優(yōu)選為由含有斜帶石斑魚促性腺激素GTHa 和/或FSH^的成熟肽基因和畢赤酵母pPICZ a A構(gòu)建而得的pPICZ a A-GTHa h、 pPICZ a A-FSH β h、pPICZ a A-FSH β hm、pPICZ a A-FSH β a h。其中pPICZ a A-GTH ah含有斜帶石斑魚GTH α成熟肽基因以及6Xhis標簽； pPICZ a A-FSH β h 含有 FSH β 成熟肽基因以及 6 Xhis 標簽；pPICZ a A-FSH β hm 含有 FSH β 成熟肽基因、6Xhis標簽及myc標簽；pPICZ a A-FSH^ ah含有GTHa成熟肽基因、FSH3 成熟肽基因、以及4X (gly-ser)-gly-thr的柔性肽和6Xhis標簽。本發(fā)明的第四個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的由真核表達載 體 pPICZ a A—GTH a h、pPICZ a A—FSH^ h、pPICZ a A—FSH^ a h、pPICZ a A—GTH a h 與pPICZ a A-FSH β hm分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33構(gòu)建制成的pPICZ a A-GTH a h_X33、 pPICZ a A-FSH β h_X33、pPICZ a A-FSH (β -a ) h_X33 與 pPICZ a A-FSH ( β + a ) hm_X33。本發(fā)明利用上述斜帶石斑魚促性腺激素GTH α或FSH β的成熟肽基因相應(yīng)真核表 達載體分別構(gòu)建了能高效表達斜帶石斑魚促性腺激素單亞基蛋白的畢赤酵母重組菌株和 雙亞基串聯(lián)共表達和并聯(lián)共表達的畢赤酵母重組菌株。本發(fā)明的第五個目的是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種重組促性腺激 素成熟肽基因的制備方法，將真核表達載體pPICZ a A-GTH a h、pPICZ a A-FSH β h、 pPICZ a A-FSH β a h、pPICZ a A-GTH a h 與 pPICZ a A-FSH β hm 分另lj轉(zhuǎn)化的寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn) 化體，從培養(yǎng)物中獲得相應(yīng)的重組rGTH a、rFSH β、rFSH( β - a )、rFSH( β + a )成熟肽。其中，冗11!^、^^!^、評5!1(0 + (1)、^^!1(3-(1)成熟肽基因的序列表見序列表 SEQ ID NO. 3、SEQ IDN0. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6。上述重組促性腺激素成熟肽的具體制備過程是先將重組菌種單克隆接種于 BMGY液體培養(yǎng)基中，280C，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6，換培養(yǎng)基BMMY稀釋0D600至1. 0，每 24h向培養(yǎng)基中補加0. 5%的甲醇，培養(yǎng)4^1-7 后2000rpm離心5min，4°C收集上清。上述的重組成熟肽需經(jīng)純化處理，所述的純化處理過程是利用硫酸銨沉淀的方 法沉淀總蛋白，然后利用鎳柱親和層析分離純化目的蛋白，鎳柱親和層析采用Tris-HCl PH7. 9緩沖系統(tǒng)，緩沖系統(tǒng)中洗脫緩沖液咪唑濃度為IOOmM,最后利用脫鹽柱脫鹽以除去蛋 白中殘留的咪唑與其它鹽類，經(jīng)分離純化后得到純化的重組蛋白產(chǎn)品。本發(fā)明提供的一種重組促性腺激素成熟肽，將表達載體pPICZ a A-GTHa h、 pPICZ a A-FSH β h、pPICZ a A-FSH β a h、pPICZ a A-GTH a h 與 pPICZ a A-FSH β hm 分另lj 轉(zhuǎn) 化的寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得相應(yīng)的重組rGTHa、rFSH β、rFSH(i3-a)、 rFSH(^ + a)成熟肽的步驟的方法制備。其中，所述的寄主細胞為畢赤酵母菌，rGTHa的分子量約為45kD、rFSH β約為 2OkD、rFSH(0-a)約為 55kD、rFSH( β + a )由約 45kD 與 22kD 的兩個多肽組成。本發(fā)明的最后一個目的在于提供上述重組促性腺激素成熟肽基因在制備魚類催 產(chǎn)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點是斜帶石斑魚為名貴海產(chǎn)魚類，具有重大的經(jīng)濟價值，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，生產(chǎn)重組斜帶石斑魚促性腺激素I的重組蛋白，可用作制備成本低廉，效果 顯著的魚類催產(chǎn)劑。


圖1是克隆載體構(gòu)建中斜帶石斑魚GTHa、FSH^成熟肽的PCR擴增圖，其中M marker, NC 陰性對照，1 =GTHa成熟肽基因，2 :FSHi3成熟肽基因；圖2-1是克隆載體pPTZ 57R/T-GTH α雙酶切(EcoRI、HindIII)驗證圖，其中Μ: marker, NC :pPTZ 57R/T-GTH α，1 :ΡΡΤΖ 57R/T-GTH α EcoRI、HindIII 雙酶切產(chǎn)物；圖2-2是克隆載體pPTZ 57R/T-FSH β雙酶切驗證圖，其中M :marker，NC :ρΡΤΖ 57R/T-FSH β，1 :pPTZ 57R/T-FSH β 雙酶切產(chǎn)物；圖3是表達載體構(gòu)建中斜帶石斑魚GTH α、FSH β成熟肽PCR擴增圖，其中M marker，NC:陰性對照，1 =GTH α成熟肽基因(加his標簽)，2 :FSH β成熟肽基因(加his 標簽)，3FSH β成熟肽基因(加myc與his標簽)；圖4是FSH雙亞基共表達載體構(gòu)建中GTHa、FSHi3成熟肽PCR擴增圖，M :marker, NC 陰性對照，1 =GTHa成熟肽基因(加his標簽),2 =FSH^成熟肽基因(加gly-ser-gly -ser-gly-ser-gly-ser-gly-thr 連接妝)；圖5是表達載體雙酶切(EcoRI、XbaI)驗證圖，其中M :marker，NC :pPICZ α A 雙酶切產(chǎn)物，1 :pPICZaA_GTHah雙酶切產(chǎn)物，2 :pPICZ a A-FSHβ h雙酶切產(chǎn)物，3 pPICZ a A-FSHMm 雙酶切產(chǎn)物；4 :pPICZ a A_FSH( β - a )h 雙酶切產(chǎn)物；圖6-1是pPICZ a A-GTH a h畢赤酵母表達載體構(gòu)建示意圖；圖6-2是pPICZ a A-FSH β h畢赤酵母表達載體構(gòu)建示意圖；圖6-3是pPICZ a A-FSH β hm畢赤酵母表達載體構(gòu)建示意圖；圖 6-4 是 pPICZaA-FSH(0-a)h 即 pPICZaA-FSH0 a h 畢赤酵母表達載體構(gòu)建 示意圖；圖7是重組斜帶石斑魚促性腺激素I基因表達產(chǎn)物的western-blot鑒定 圖，其中 M:marker，NC :pPICZ α A-X33 表達產(chǎn)物，1 :pPICZ α A-GTH α h_X33 表達產(chǎn) 物，2 :pPICZa A-FSH3h_X33 表達產(chǎn)物，3 :pPICZ a A_FSH( β - a )h_X33 表達產(chǎn)物，4: pPICZ a A-FSH ( β + a ) h_X33 表達產(chǎn)物；圖8是重組斜帶石斑魚促性腺激素I基因表達產(chǎn)物純化脫鹽前后圖其中 M :marker, NC :pPICZ α Α-Χ33 表達產(chǎn)物，1 :pPICZ α A-GTH α h_X33 表達產(chǎn)物純化前，2 : pPICZ α A-GTH α h_X33表達產(chǎn)物純化后，3 :pPICZ α A-FSH β h_X33表達產(chǎn)物純化前，4 : pPICZa A-FSH^h-X33表達產(chǎn)物純化后，5 :pPICZ a A_FSH( β + a )h_X33表達產(chǎn)物純化前， 6 :pPICZ a A-FSH( β + a ) h_X33 表達產(chǎn)物純化后，7 :pPICZ a A-FSH( β - a ) h_X33 表達產(chǎn)物 純化前，8 :pPICZaA-FSH(^-a)h-X33表達產(chǎn)物純化后；圖9是BCA蛋白測定標準曲線；圖10-1是重組斜帶石斑魚促性腺激素I基因表達產(chǎn)物性腺碎片靜態(tài)孵育實驗 (時間梯度)睪酮分泌圖；圖10-2是重組斜帶石斑魚促性腺激素I基因表達產(chǎn)物性腺碎片靜態(tài)孵育實驗 (時間梯度)雌二醇分泌圖10-3是重組斜帶石斑魚促性腺激素I基因表達產(chǎn)物性腺碎片靜態(tài)孵育實驗 (濃度梯度)睪酮分泌圖；圖10-4是重組斜帶石斑魚促性腺激素I基因表達產(chǎn)物性腺碎片靜態(tài)孵育實驗 (濃度梯度)雌二醇分泌圖；圖10-5是重組斜帶石斑魚促性腺激素 泌圖；圖10-6是重組斜帶石斑魚促性腺激素 分泌圖；圖10-7是重組斜帶石斑魚促性腺激素 泌圖；圖10-8是重組斜帶石斑魚促性腺激素 分泌圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。以 下試劑如無特殊說明均為市售。實施例1斜帶石斑魚促性腺激素I單亞基基因GTH α、FSH β成熟肽的合成根據(jù)GeneBank中上已登錄的斜帶石斑魚促性腺激素α (登錄號ΑΥ129308/ ΑΥ129309)基因序列與FSHi3 (登錄號AY553982/AY679087)基因序列，設(shè)計特異性引物 Pa 1 5, -taccccaacattgacttacc—3,, Pa 2 :5, -tcatatcttgtggaaatagcaggtgc—3, ；P I β 1 5, -gactgtcatctgaccagcat-3, ,PI β 2 :5, -ttaaaaggac agacag ctgg at~3,以斜 帶石斑魚腦垂體總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，分別擴增目的片段，反應(yīng)條件為預(yù)變性 94°C，4min ；變性 94°C，30s ；退火 cga 為 50°C /FSH^ 為 50°C，30s ；延伸 72°C，30s ；反應(yīng) 30個循環(huán)；72°C保溫，lOmin。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖1，目的片段GTHa大小為 285bp, FSH^ 為 300bp。實施例2含斜帶石斑魚促性腺激素I單亞基成熟肽基因克隆載體pPTZ 57R/ T-GTH α 與 pPTZ 57R/T-FSH β 以及重組菌株 pPTZ 57R/T-GTH α -DH5 α 與 pPTZ 57R/ T-FSH β -DH5 α 的構(gòu)建。將實施例1所獲得目的基因片段分離純化，然后與TA載體pPTZ 57R/T按照摩爾 比3 1混合，利用Τ4連接酶(ferminant公司)，22°C連接過夜(約16h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)Amp+抗性和藍白斑篩選出陽性克隆，通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒， 質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切驗證以及測序驗證，證明斜帶石斑魚促性腺激素I單亞基成熟肽基因克隆 到載體中，分別命名為pPTZ 57R/T-GTHa與pPTZ 57R/T-FSHβ，克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a 所得到的重組菌株命名為 pPTZ 57R/T-GTH a-DH5 α 與 pPTZ 57R/T-FSH β _DH5 a。酶 切圖譜分別見圖2-1與圖2-2，序列見序列表。實施例3含斜帶石斑魚促性腺激素I單亞基成熟肽基因表達載體 pPICZ a A-GTH a h、pPICZ a A-FSH β h、pPICZ a A-FSH β hm 的構(gòu)建根據(jù)GeneBank中上已登錄的斜帶石斑魚促性腺激素α (登錄號ΑΥ129308/ ΑΥ129309)基因序列與FSHi3 (登錄號AY553982/AY679087)基因序列，設(shè)計特異性引
分 醇分醇 7物P α 3 :5，-RRaattc taccccaacattgacttacc-3，，P α 4 :5，-tcc ccrcrr ttaat_gat_g atgatgatgatgtatcttgtggaaat-3，,其中 Gaattc 為 EcoRI 酶切位點，g 為其保護堿基； ccgcgg為SacII酶切位點，tcc為其保護堿基；tctaga為)(ba I酶切位點，gc為其保護 M 基；atgatgatgatgatgatg 為 6Xhis 標簽；PI β 3 :5，-ggaattcgactgtcatctgaccagca t-3'，PI β 4 :5，-gg ￡￡tac￡ttaatgatgatgatgatgatgaaaggacagacag-3'，PI β 5 :5，-gc tctagaaaggacagacagctggat-3', ^1=I11 Gaattc 為 EcoRI 酶切位點，g 為其保護堿基；ggtacc 為Kpn I酶切位點，tcc為其保護堿基，tctaga為)(ba I酶切位點，gc為其保護堿基； atgatgatgatgatgatg 為 6Xhis分別以克隆載體pPTZ 57R/T-GTHa與pPTZ 57R/T_FSHi3為模板，擴增目的片 段，反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C，^iin ；變性94°C，30s ；退火GTHa為59 °C /FSH^ (PI β 3與 PI β 4)為 60°C/FSH3 (PI β 3 與 PI β 5)為 55°C，30s ；延伸 72°C，30s ；反應(yīng) 30 個循環(huán)；72°C 保溫，lOmin。PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖3，目的片段GTHa大小為315bp，F(xiàn)SHβ分別 為 330bp、3(^bp。將PCR擴增產(chǎn)物分離純化，分離純化產(chǎn)物與表達空載體pPICZ a A分別用相應(yīng)的限 制性內(nèi)切酶(Toyobo 公司)處理(GTHa :EcoRI 與 SacII，F(xiàn)SHβ =EcoRI 與 Kpn I/EcoRI 與 Xba I)，然后經(jīng)過連接反應(yīng)，使用T4連接酶(ferminant公司)，22°C連接過夜(約16h)， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，利用Zeocin+抗性板篩選陽性克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒 (Omega公司)提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切驗證(EcoRI與XbaI)以及測序驗證，證明斜帶石 斑魚促性腺激素I單亞基成熟肽基因克隆到表達載體中，酶切圖譜見圖4，序列見序列表實施例4含斜帶石斑魚促性腺激素I雙亞基成熟肽基因串聯(lián)表達載體 pPICZ α A-FSH ^ah 的構(gòu)建根據(jù)GeneBank中上已登錄的斜帶石斑魚促性腺激素a (登錄號AY129308/ AY129309)基因序列與FSHi3 (登錄號AY553982/AY679087)基因序列，設(shè)計特異性引物PI β 3 5, -g gaattcgactgtcatctgaccagcat-3,PI β 6 5 ‘ -gg ggtacc agaacc agaacc agaacc agaacc aaagg acaga cagct ggat-3‘Ρα 5 :5' -gg ggtacc taccccaacattgacttaccaaacat-3‘P α 45, -tcc ccgcggttaatgatgatgatgatgatgtatcttgtggaaat-3,其中，Gaattc為EcoRI酶切位點，g為其保護堿基；ggtacc為Kpn I酶切位點，gg為 其保護堿基；CCgcgg為SacII酶切位點，tcc為其保護堿基；ggtacc agaacc agaacc agaacc agaacc 為 gly-ser-gly-ser-gly-ser-gly-ser-gly-thr, atgatgatgatgatgatg 為6Xhis標簽。分別以克隆載體pPTZ 57R/T-GTHa與pPTZ 57R/T_FSHi3為模板，擴增目的片 段，反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C，4min ；變性94°C，30s ；退火GTH α (P α 5與P α 4)為60°C / FSH β (PI β 3 與 PI β 6)為 60°C，30s ；延伸 72°C，30s ；反應(yīng) 30 個循環(huán)；72°C保溫，lOmin。PCR 擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖5，目的片段GTHa大小為3Mbp，F(xiàn)SHii分別為33!3bp。將PCR擴增產(chǎn)物分離純化，分離純化產(chǎn)物與表達空載體pPICZ a A分別用相應(yīng)的限 制性內(nèi)切酶CToyobo公司)處理(GTHa :KpnI與&icII，F(xiàn)SH3 :EcoRI與Kpn I)，然后經(jīng)過 連接反應(yīng)，使用jM連接酶(ferminant公司)，22°C連接過夜(約16h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大
8腸桿菌DH5ci，利用Zeocin+抗性板篩選陽性克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司)提 取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切(EcoRI與^CbaI)驗證以及測序驗證，證明斜帶石斑魚促性腺激素 I單亞基成熟肽基因克隆到表達載體中，酶切圖譜見圖4，序列見序列表。實施例3、4表達載體構(gòu)建示意圖見圖6-1，圖6-2，圖6_3，圖6_4。實施例5斜帶石斑魚促性腺激素I畢赤酵母重組表達菌株pPICZ α A-GTH α -Χ33、 pPICZ α A-FSH β h_X33、pPICZ α A-FSH (β -α ) h_X33、pPICZ α A-FSH (β + α ) hm_X33 的構(gòu)建提前制備好畢赤酵母Χ33感受態(tài)，將構(gòu)建好的畢赤酵母表達載體 pPICZ α A-GTH α h經(jīng)Pme I (NEB公司)線性化處理，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，Zeocin+高抗性板 YPDS板上篩選，獲得陽性重組菌株pPICZ α A-GTHa-X33 ；將構(gòu)建好的畢赤酵母表達載 體pPICZ α A-FSH^h經(jīng)Pme I (NEB公司)線性化處理，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，Zeocin+高抗性板 YPDS板上篩選，獲得陽性重組菌株pPICZ α A-FSHβ h-X33 ；將構(gòu)建好的畢赤酵母表達載 體pPICZ α A-FSH^ α h經(jīng)Pme I (NEB公司)線性化處理，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，Zeocin+高抗性板 YPDS板上篩選，獲得陽性重組菌株pPICZ α A_FSH(i3 - α )h_X33，將構(gòu)建好的畢赤酵母表 達載體pPICZ α A-GTH α h與pPICZ α A-FSH β hm按照摩爾比1 1混合后經(jīng)Rne I (NEB 公司)線性化處理，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，Zeocin+高抗性板YPDS板上篩選，獲得陽性重組菌株 pPICZaA-FSH(0 + a)hm-X33。轉(zhuǎn)化線性化質(zhì)粒的質(zhì)量為5_10ug，轉(zhuǎn)化電壓為2000V。實施例6利用畢赤酵母基因工程菌pPICZaA-GTHah_X33、 pPICZ a A-FSH^ h_X33、pPICZ a A_FSH( β - a )h_X33、pPICZ a A-FSH( β + a )hm-X33 生產(chǎn)重 組斜帶石斑魚促性腺激素I單亞基GTH α與FSHi3和兩種形式的雙亞基蛋白FSH( β - a ) 與 FSH(3 + a)分別挑取各種工程菌的單克隆，接種于BMGY中，，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6， 換培養(yǎng)基BMMY稀釋0D600至1. 0，每24h想培養(yǎng)基中補加0. 5%甲醇，培養(yǎng)48h-7ai (此階 段蛋白表達量較高)后2000rpm離心5min，4°C收集上清。取上清加入2X電泳上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標準方法跑SDS-PAGE凝膠電 泳，由于促性腺激素為糖基化蛋白，在表達過程中出現(xiàn)了不同程度的糖基化，導致表達蛋白 不能在SDS-PAGE膠上看到明顯條帶，所以通過免疫印跡(western-blot)方法特異的驗證 目的蛋白的表達，一抗為鼠源his單克隆抗體(Novagen)，二抗為羊抗鼠IgG-HRP (博士德公 司)，結(jié)果見圖7。實施例7畢赤酵母生產(chǎn)斜帶石斑魚cga即GTH a、FSH β及FSH分離純化的方法通過實驗室小試實驗獲得大量的培養(yǎng)上清，首先利用硫酸銨沉淀的方法沉淀總蛋 白；然后利用鎳柱親和層析分離純化目的蛋白，親和層析使用Tris-HCl ρΗ7.9緩沖系統(tǒng)， 使用的鎳柱為Novagen公司的預(yù)裝柱，操作步驟按照說明書進行，具體操作步驟為先將培 養(yǎng)上清使用NaOH和HCl調(diào)pH值至7. 9，向鎳柱中加入10倍柱床體積的binding buffer 平衡柱子，然后加入培養(yǎng)上清液，然后加入6倍柱體積的washing buffer以洗脫非特異 結(jié)合的雜質(zhì)，最后加入6倍柱體積的elution buffer洗脫目的蛋白并收集，其中binding buffer咪唑濃度為5mM，washingbuffer咪唑濃度為20mM，elution buffer咪唑濃度 為IOOmM;最后利用脫鹽柱脫鹽以除去蛋白中殘留的咪唑與其它鹽類，使用的脫鹽柱為 Amersham Biosciences公司的PD-10脫鹽柱，操作步驟按照說明書進行，具體操作步驟為 先用6倍柱體積的去離子水平衡柱子，然后上樣，上樣量為2. 5ml，最后加入3. 5ml的去離子水洗脫柱子并收集。經(jīng)分離純化后得到純度較高的重組蛋白產(chǎn)品，純化前后蛋白電泳圖見 圖8。利用Novagen公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化蛋白的量，操作步驟按照 說明書進行，GTHa的表達量約為25mg/L，F(xiàn)SHii的表達量約為15mg/L，F(xiàn)SH( β - a )的表 達量約為2.5mg/L，F(xiàn)SH(i3 + a)的表達量約為28mg/L，蛋白測定標準曲線見圖9。實施例8重組斜帶石斑魚促性腺激素I生理功能驗證通過在體實驗和離體實驗驗證重組蛋白的生理活性，離體實驗采用性腺碎片靜態(tài) 孵育實驗，具體分兩部分進行，首先以特定濃度重組蛋白(濃度見附圖10-1，10-2)處理斜 帶石斑魚性腺碎片，不同時間點(Muiai與18h)收集培養(yǎng)上清液檢測睪酮和雌二醇的含 量，以確定作用的最佳時間點，然后以不同濃度重組蛋白處理斜帶石斑魚性腺碎片，在特定 時間收集培養(yǎng)上清液檢測睪酮和雌二醇的含量，以確定作用濃度。在體實驗通過腹腔注射實驗(注射劑量見附圖10-5，10-6，10-7,10_8)，證明重組 蛋白的生理活性。通過單次注射實驗和連續(xù)注射實驗進行驗證，單次注射實驗中設(shè)計時間 梯度(iau24h與36h)進行取樣，檢測血清中睪酮和雌二醇的含量；連續(xù)注射實驗中每隔 48h注射一次，連續(xù)注射5次，第5次注射后4 取樣，檢測血清中睪酮和雌二醇的含量。在體和離體實驗證明，重組蛋白FSH(i3-a)，F(xiàn)SH(^ + a)是有活性的，能夠促進 睪酮和雌二醇的釋放，離體實驗中，F(xiàn)SH(i3-a)與FSH(i3 + a)對性類固醇激素睪酮和雌 二醇的刺激作用存在著時間和劑量依存效應(yīng)，F(xiàn)SH(^-a)對睪酮的刺激在1 最強，而對 雌二醇的刺激在1 最強，F(xiàn)SH(i3 + a)對兩種性類固醇激素的刺激作用均在1 最強，中 間劑量的FSH(i3_a)與FSH(i3 + a)對性類固醇激素的作用最強，低劑量和高劑量作用則 較弱，在體實驗中，可以發(fā)現(xiàn)單次注射重組蛋白FSH(i3-a)與FSH(i3 + a)，在12h可以顯 著的刺激睪酮的分泌，在12h、Mh、3^!均能夠顯著刺激雌二醇的分泌，說明FSH(i3-a)與 FSH(^ + a)對雌二醇的刺激作用可以持續(xù)比較長的時間，且作用效果較陽性對照魚用hCG 處理組強，連續(xù)注射實驗中，F(xiàn)SH(i3-a)與FSH(i3 + a)均可以顯著的刺激睪酮和雌二醇的 2-3倍釋放，作用效果比單次注射要強，同時比魚用hCG效果要好；另外，連續(xù)注射實驗證 明重組蛋白FSHii可以顯著促進睪酮和雌二醇的釋放，重組蛋白GTHa可以促進雌二醇的 釋放，說明重組的單亞基蛋白也有一定的生理功能。生理實驗證明重組的魚類促性腺激素 I可以促進性類固醇激素的釋放，這為其在魚類性腺發(fā)育和魚類催產(chǎn)中的應(yīng)用提供了一定 的依據(jù)。具體實驗數(shù)據(jù)見圖10-1，圖10-2，圖10-3，圖10-4，圖10-5，圖10-6，圖10-7，圖 10-8。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種克隆載體，其特征是含有斜帶石斑魚促性腺激素GTH α或FSHi3成熟肽基因。
2.一種克隆載體，其特征是由含有斜帶石斑魚促性腺激素GTH α或FSHi3的成熟肽 基因和大腸桿菌構(gòu)建制得pPTZ 57R/T-GTH α或pPTZ 57R/T_FSH3。
3.一種重組菌株，其特征是由克隆載體pPTZ 57R/T-GTHα或pPTZ 57R/T_FSH@轉(zhuǎn) 化大腸桿菌 DH5a 構(gòu)建制得 pPTZ 57R/T-GTH a-DH5 α 或 pPTZ 57R/T-FSH β-DH5 a。
4.一種真核表達載體，其特征是含有斜帶石斑魚促性腺激素GTH α和/或FSH β成 熟肽基因。
5.一種真核表達載體，其特征是由含有斜帶石斑魚促性腺激素GTH α和/或FSH β 的成熟肽基因與畢赤酵母PPICZ a A構(gòu)建而得的pPICZ a A-GTH a h、pPICZ a A-FSH β h、 pPICZ a A-F SH β hm、pPICZ a A_F SH^ ah。
6.一種重組菌株，其特征是由真核表達載體pPICZ a A-GTH ah、pPICZ a A-FSH β h、 pPICZ a A-FSH β a h、pPICZ a A-GTH a h 與 pPICZ a A-FSH β hm 轉(zhuǎn)化畢赤酵母 X33 構(gòu)建制 成的 pPICZ a A-GTHa h-X33, pPICZ a A-F SHβ h_X33、pPICZ a A_F SH(3_a)h_X33 與 pPICZ a A-F SH( β + a )hm_X33。
7.—種重組促性腺激素成熟肽基因的制備方法，其特征是將真核表達載體 pPICZ a A—GTHa h、pPICZ a A—F SH β h、pPICZ a A—F SH β a h、pPICZ a A—GTH a h 與 pPICZ a A-F SHβ hm分別轉(zhuǎn)化的寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得相應(yīng)的重組 rGTHa , rFSHβ、rFSH(3_a)與 rFSH(3 + a)成熟肽基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組促性腺激素成熟肽基因的制備方法，其特征是所述的 重組成熟肽基因需經(jīng)純化處理，所述的純化處理過程是利用硫酸銨沉淀的方法沉淀總蛋 白，然后利用鎳柱親和層析分離純化目的蛋白，鎳柱親和層析采用Tris-HCl pH7. 9緩沖系 統(tǒng)，緩沖系統(tǒng)中洗脫緩沖液咪唑濃度為IOOmM,最后利用脫鹽柱脫鹽以除去蛋白中殘留的咪 唑與其它鹽類，經(jīng)分離純化后得到純化的重組蛋白產(chǎn)品。
9.一種重組促性腺激素成熟肽基因，其特征是由真核表達載體pPICZ a A-GTH a h、 pPICZ a A-FSH β h、pPICZ a A-FSH β a h、pPICZ a A-GTH a h 與 pPICZ a A-FSH β hm 分另lj 轉(zhuǎn) 化的寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得相應(yīng)的重組rGTHa、rFSH β、rFSH(i3-a)、 rFSH(^ + a)成熟肽基因的制備方法制備獲得。
10.權(quán)利要求9所述的重組促性腺激素成熟肽基因在制備魚類催產(chǎn)劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有斜帶石斑魚促性腺激素成熟肽基因GTHα或FSHβ的克隆載體、真核表達載體、重組菌株和重組蛋白及其在制備魚類催產(chǎn)劑中的應(yīng)用。斜帶石斑魚為名貴海產(chǎn)魚類，具有重大的經(jīng)濟價值，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，生產(chǎn)重組斜帶石斑魚促性腺激素I的重組蛋白，可用作制備成本低廉，效果顯著的魚類催產(chǎn)劑。
文檔編號C12N15/16GK102080095SQ20101057206
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者李文笙, 陳軍 申請人:中山大學