專利名稱：對藻類進(jìn)行定性與定量分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，具體地涉及藻類的定性與定量分析方法。更具體涉及一種采用針對rRNA的S1酶保護(hù)分析探針和夾心雜交技術(shù)，從而快速鑒定藻的種類和數(shù)量的方法。
背景技術(shù)：
赤潮是海洋中某些微小的浮游藻類、原生動物或細(xì)菌，在一定的條件下暴發(fā)性繁殖(增殖)或聚集而引起水體變色的一種有害的生態(tài)異?，F(xiàn)象。從全球來講，海洋浮游微藻是引發(fā)赤潮的主要生物，在四千多種海洋浮游微藻中有260多種能形成赤潮，其中有70多種能產(chǎn)生毒素。赤潮發(fā)生時魚類和貝類大量死亡，導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的海洋生態(tài)災(zāi)難；毒素還會富集在貝類和魚類體內(nèi)，人類食用后會引發(fā)疾病。
如果能夠?qū)崟r監(jiān)控海水中浮游微藻的種類和數(shù)量，獲得大量的監(jiān)測數(shù)據(jù)，就可能為預(yù)報赤潮提供必要的條件，及時對養(yǎng)殖區(qū)的魚、貝類采取措施，避免重大經(jīng)濟(jì)損失，保證沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)和社會穩(wěn)定發(fā)展。
目前鑒定藻的方法主要通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡。訓(xùn)練有素的專家通過光學(xué)顯微鏡輕易就能鑒定大多數(shù)微藻，但有些屬內(nèi)的藻很難在種水平上用普通光學(xué)顯微鏡分開。雖然有一些特殊的熒光染料配以熒光顯微鏡用以區(qū)分它們，或者用電子顯微鏡也可以觀察分類學(xué)上的細(xì)微差別，但這些方法不僅對技術(shù)要求高，而且既費時又費力且易發(fā)生檢測錯誤。因此本領(lǐng)域長期迫切需要發(fā)展出針對赤潮藻等藻類的簡單、可靠的鑒定方法。
一般認(rèn)為微藻的核糖體RNA(rRNA)與藻的進(jìn)化和分類有密切的關(guān)系，GenBank上有關(guān)微藻的數(shù)據(jù)主要集中在這個區(qū)域。通過比較相近微藻的rRNA，找出每個種特有的核酸作為寡核苷酸引物和探針，利用分子雜交技術(shù)進(jìn)行定性定量鑒定。目前在用的主要有定量PCR、全細(xì)胞雜交和夾心雜交技術(shù)。
定量PCR技術(shù)是一種高靈敏度高特異性的核酸檢測技術(shù)，它在微藻鑒定中的應(yīng)用才剛剛起步。但由于現(xiàn)有的定量PCR技術(shù)要求高純度的DNA或者RNA作為檢測樣本，而且目前該項技術(shù)對儀器和操作人員要求比較高，因此限制了定量PCR在微藻檢測中的普及應(yīng)用。
全細(xì)胞雜交的原理是用濾膜和過濾裝置收集藻細(xì)胞，然后用含有熒光素標(biāo)記的特異性探針與藻細(xì)胞內(nèi)的rRNA雜交，在熒光顯微鏡下直接觀察，對相應(yīng)的藻種作出鑒定和定量計數(shù)；或者從膜上洗下藻細(xì)胞，以寡核苷酸探針結(jié)合后，以特定波長在流式細(xì)胞計數(shù)儀上計數(shù)。前者的好處在于計數(shù)的同時可以待檢藻細(xì)胞的形態(tài)特征，提高了鑒定的準(zhǔn)確性；但該方法仍未克服操作繁瑣、費時費力的缺點。研究人員趨向于用流式細(xì)胞計數(shù)儀，因為該方法可以快速計數(shù)，易于自動化，但某些藻自發(fā)的熒光可能會影響檢測的準(zhǔn)確性。此外，該項技術(shù)對儀器和操作人員要求也比較高。
PCR-ELISA技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項核酸快速診斷技術(shù)。它首先并通過PCR擴(kuò)增待檢測的目的DNA片段，并在擴(kuò)增時摻入地高辛或熒光素等標(biāo)記物；然后與固定在96孔板上特異性寡核苷酸探針雜交，將未雜交的片段洗去后，加入標(biāo)記了辣根過氧化物酶(HRP)或者堿性磷酸酶(AP)的地高辛或熒光素抗體，最后加入適當(dāng)?shù)娘@色底物后，就可以通過96孔板讀板機(jī)讀出數(shù)據(jù)，從而定性定量分析目的DNA片段。在此基礎(chǔ)上的夾心雜交技術(shù)是指將擴(kuò)增好的未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與96孔板上的DNA雜交，從而被后者抓捕在微孔上，然后再與地高辛或熒光素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交。由于普通PCR擴(kuò)增對檢測定量的準(zhǔn)確性有很大的影響且費時，因此該項技術(shù)不太適合應(yīng)用到海洋樣品中的微藻實時監(jiān)控。
由于rRNA被認(rèn)為是與藻類的系統(tǒng)進(jìn)化密切相關(guān)的序列，而且真核生物細(xì)胞中rRNA含量非常高，可以達(dá)到106～107個拷貝，rRNA是夾心雜交的很好的靶點。1996年，Christopher A.Scholin等將提取的RNA或者藻細(xì)胞裂解液在一定條件下與結(jié)合在96孔板上的寡核苷酸探針雜交后，再用一標(biāo)記的信號探針與之雜交，最后進(jìn)行酶標(biāo)抗體顯色反應(yīng)(見圖1)。該技術(shù)現(xiàn)在海洋藻類的監(jiān)測中已經(jīng)有所應(yīng)用，但到目前為止，應(yīng)用該技術(shù)能夠檢測的微藻只限于有限的幾種。其主要缺點是(a)因捕獲探針的長度僅10-30bp，因此能夠有效區(qū)別親緣關(guān)系較近的微藻的捕獲探針數(shù)量極少；(b)在整個檢測過程中都需要防止RNA降解，然而洗滌、抗體反應(yīng)等各步驟極易造成RNA降解，因此操作難度大、檢測結(jié)果波動性大。
綜上所述，目前缺乏對微藻進(jìn)行快速、簡便、可靠的鑒定方法，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的能夠?qū)ξ⒃宓姆N類和/或數(shù)量進(jìn)行快速、簡便、可靠的鑒定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種對微藻種類和/或數(shù)量進(jìn)行快速、簡便、可靠的鑒定方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測樣品中藻類的方法，該方法包括以下步驟(a)將待檢測樣品和S1酶保護(hù)分析探針的混合并雜交，形成混合溶液；(b)在適合條件下，用S1酶(濃度通常為0.05-10U/μl，較佳地為0.1-5U/μl，更佳地為0.5-2.5U/μl)處理步驟(a)的混合溶液，從而切割單鏈核酸以及降解雙鏈核酸中的單鏈部分；(c)對步驟(b)的溶液進(jìn)行變性處理，從而釋放出S1酶保護(hù)分析探針；(d)用固定于固相載體上的抓捕探針，將被保護(hù)的S1酶保護(hù)分析探針特異地抓捕在固相載體上；(e)用帶有可檢測信號的專一信號探針與S1酶保護(hù)分析探針雜交；或者用連接探針與S1酶保護(hù)分析探針雜交，然后用帶有可檢測信號的通用信號探針再與連接探針雜交；(f)檢測可檢測信號，從而確定樣品中藻類的種類和/或數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，所述的S1酶保護(hù)分析探針的長度為40-100個核苷酸，并且特異性結(jié)合于一種或多種藻類的rRNA特定區(qū)域(例如種特異性或?qū)偬禺愋許1酶保護(hù)分析探針)。
在另一優(yōu)選例中，所述的抓捕探針的長度為12～50個核苷酸，并特異性結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端。
在另一優(yōu)選例中，所述的連接探針的長度為40～100個核苷酸，并且在一端約有15～35個核苷酸的S1酶保護(hù)分析探針結(jié)合區(qū)，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合抓捕探針的一端互補，并且在另一端具有15-50個核苷酸的信號探針結(jié)合區(qū)，與信號探針互補。
在另一優(yōu)選例中，所述的專一信號探針的長度為15～50個核苷酸，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合于抓捕探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的通用信號探針的長度為15～50個核苷酸，與連接探針的不結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法用于定性或定量檢測角毛藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法用于定性或定量檢測塔瑪亞歷山大藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品中藻類的試劑盒，它包括以下組件(a)S1酶保護(hù)分析探針，所述的S1酶保護(hù)分析探針的長度為40-100個核苷酸，并且特異性結(jié)合于藻類的rRNA特定區(qū)域；(b)抓捕探針，所述的抓捕探針的長度為12～50個核苷酸，并特異性結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端；(c)連接探針，所述的連接探針的長度為40～100個核苷酸，并且在一端約有15～35個核苷酸的S1酶保護(hù)分析探針結(jié)合區(qū)，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合抓捕探針的一端互補，并且在另一端具有15-50個核苷酸的信號探針結(jié)合區(qū)，與信號探針互補，附加條件是當(dāng)信號探針為(d1)所述的專一信號探針則無連接探針；(d)信號探針，所述的連接探針選自下組(d1)所述的專一信號探針的長度為15～50個核苷酸，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合于抓捕探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合；(d2)所述的通用信號探針的長度為15～50個核苷酸，與連接探針的不結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于定性或定量檢測角毛藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于定性或定量檢測塔瑪亞歷山大藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。


圖1是現(xiàn)有技術(shù)中Christopher A.Scholin等發(fā)展的夾心雜交技術(shù)的示意圖。
圖2是本發(fā)明方法的示意圖。
圖3顯示了用針對角毛藻的探針探測各種不同的藻的檢測結(jié)果，證明了本發(fā)明方法的可行性和探針的特異性。
圖4顯示了對不同細(xì)胞數(shù)的角毛藻的檢測曲線。
圖5顯示了用針對塔瑪亞歷山大藻的探針探測各種不同的藻的檢測結(jié)果，證明了本發(fā)明方法的可行性和探針的特異性。
圖6顯示了對不同細(xì)胞數(shù)的塔瑪亞歷山大藻的檢測曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過多年廣泛而深入的研究，開發(fā)了一種全新的針對rRNA的定性定量分析方法，從而實現(xiàn)對生物種類(如藻類)的快速定性和定量。
如本文所用，術(shù)語“S1酶保護(hù)分析探針”指與目標(biāo)RNA互補而且用于的S1酶保護(hù)分析方法的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用本領(lǐng)域的常規(guī)方法，通過測定生物的rRNA序列，進(jìn)行多序列比較，尋找出待檢測生物的特征序列，作為該種生物或該類生物的rRNA特異區(qū)域，然后根據(jù)該rRNA特異區(qū)域序列(特征序列)設(shè)計S1酶保護(hù)分析探針。通常該探針長約40-100個核苷酸，較佳地為45-75個核苷酸，更佳地為50～70個核苷酸。應(yīng)理解，尋找生物特異性區(qū)域的方法以及根據(jù)特異區(qū)域設(shè)計探針的技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的，有市售的設(shè)備和軟件可供技術(shù)人員使用。已有的實驗表明，不同藻rRNA之間若存在2-3個以上核苷酸的連續(xù)錯配或者缺失也可以作為特異探針設(shè)計的靶序列。
如本文所用，術(shù)語“抓捕探針”指與S1酶保護(hù)分析探針的一端(通常為3′端)結(jié)合，從而將經(jīng)過S1酶酶切處理和變性處理后保留在溶液中的S1酶保護(hù)分析探針捕獲下來的探針。抓捕探針的長度為12-50個核苷酸或更長，較佳地為15～35個核苷酸。通常，在檢測之前，將抓捕探針固定于固相載體，從而形成預(yù)制的用于夾心雜交的檢測載體。用于固定的方式?jīng)]有特別限制，可以用本領(lǐng)域常用的固定方法，例如通過高鹽吸附、化學(xué)合成或者親和素與生物素作用結(jié)合固定在酶標(biāo)板或者玻璃片、尼龍膜以及纖維素膜上。
如本文所用，術(shù)語“連接探針”指這樣的探針，它與S1酶保護(hù)分析探針的另一端(通常為5′端)互補，從而能夠在抓捕探針捕獲S1酶保護(hù)分析探針后，結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的另一端。通常，連接探針長約40-100個核苷酸，較佳地為45～70個核苷酸，并且在5′端或3′端約有15～35個核苷酸的S1酶保護(hù)分析探針結(jié)合區(qū)，與S1酶保護(hù)分析探針的一端(不同于與抓捕探針互補結(jié)合的一端)互補；并且在另一端具有15-50個核苷酸的信號探針結(jié)合區(qū)，與信號探針互補。在一優(yōu)選例中，用于檢測不同微藻的連接探針具有相同的信號探針結(jié)合區(qū)，從而可以使用通用的信號探針，以便進(jìn)一步降低成本。
如本文所用，術(shù)語“信號探針”指結(jié)合于連接探針，從而產(chǎn)生可檢測信號的探針。信號探針與連接探針的一端(不同于與S1酶保護(hù)分析探針互補結(jié)合的一端)互補。通常，信號探針長約15-50個核苷酸，更佳地20～40個核苷酸，并且在5′端或3′端帶有標(biāo)記物。常用的標(biāo)記物包括(但并不限于)地高辛、熒光素、生物素或者辣根過氧化物酶等。在一優(yōu)選例中，用于檢測不同微藻的信號探針是相同的。
一種特別形式的信號探針是將連接探針的功能和信號探針的功能合二為一所形成的探針。即在連接探針不與S1酶保護(hù)分析探針的另一端標(biāo)記熒光素、生物素等標(biāo)記物所形成的專一信號探針。這樣特別探針既作為一般連接探針起作用，又起到信號探針的作用。然而，缺點是在針對每一組檢測探針都需要合成一個帶有標(biāo)記的專一信號探針，合成的成本較高，而通用信號探針可以廣泛通用，不必為每一個新設(shè)計的微藻S1酶保護(hù)分析探針合成一個專一的高成本的信號探針。
如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可用常規(guī)方法和設(shè)備，根據(jù)S1酶保護(hù)分析探針而設(shè)計和合成相應(yīng)的抓捕探針、連接探針和信號探針。
簡而言之，本發(fā)明方法是針對待檢生物的rRNA特定區(qū)域合成以S1酶保護(hù)分析探針為核心的一套探針，聯(lián)合S1酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)實現(xiàn)對rRNA的定性定量分析。
本發(fā)明方法的原理如圖2所示。它包括下列步驟
(a)待檢測樣品和S1酶保護(hù)分析探針的混合在該步驟中，可以將經(jīng)裂解處理已釋放出rRNA的待檢測的微藻樣品與S1酶保護(hù)分析探針混合。也可以將待檢測的微藻樣品與S1酶保護(hù)分析探針直接混合，然后再進(jìn)行裂解處理，從而釋放rRNA。一旦釋放出的rRNA包含對應(yīng)于S1酶保護(hù)分析探針的靶序列，經(jīng)過雜交，則會與S1酶保護(hù)分析探針形成雙鏈。
(b)S1酶處理S1酶是一種已知的、分子量約為32,000道爾頓的含Zn2+的糖蛋白，是一種單鏈特異性的核酸內(nèi)切酶，能將DNA或RNA降解成為酸可溶性5’-P核苷酸，最終90％以上被降解為5’-P單核苷酸。也可以降解雙鏈核酸中的單鏈部分，中等量的S1酶可在切口或小缺口處切割雙鏈DNA。如果S1酶的用量過大，則雙鏈核酸可以被完全消化；S1酶的最適pH在4.5附近，作用時必需有輔因子Zn2+，該酶的抑制劑是一定濃度的EDTA和磷酸化合物。其屬于依賴Zn2+的糖蛋白質(zhì)，對熱極其穩(wěn)定，在底物存在下65～70攝氏度仍能表現(xiàn)活性。
在本發(fā)明方法中，當(dāng)S1酶保護(hù)分析探針與待檢測生物的rRNA雜交后，用適當(dāng)濃度(通常為0.05-10U/μl，較佳地為0.1-5U/μl，更佳地為0.5-2.5U/μl，最佳地為1U/μl)的S1酶消化過量游離的探針；當(dāng)該探針與其他非目標(biāo)rRNA反應(yīng)時，由于雜交體存在切口或小缺口，S1酶亦能將該探針切斷；最終保留下與完全匹配的S1酶保護(hù)分析探針和目標(biāo)生物的rRNA形成的DNA/RNA雙鏈，而且該雙鏈的量代表了樣本中相應(yīng)的rRNA的量。
(c)DNA-RNA雜合體的變性在該步驟將DNA/RNA雙鏈雜合體變性為DNA單鏈(即S1酶保護(hù)分析探針)和RNA單鏈。合適的變性方法沒有特別限制，可以用本領(lǐng)域常用的各種變性方法，例如熱變性等。例如，加入中和溶液后加熱，使S1酶保護(hù)分析探針和目標(biāo)生物的rRNA形成的雜合體變性，從而釋放出保留下來的S1酶保護(hù)分析探針。由于RNA不穩(wěn)定，解鏈形成的RNA單鏈易被內(nèi)源或源的RNA酶降解。
(d)捕獲S1酶保護(hù)分析探針將保留有S1酶保護(hù)分析探針的溶液與預(yù)先固定于固相載體上的抓捕探針雜交，將S1酶保護(hù)分析探針特異地抓捕在固相載體上，并洗滌除去非特異的結(jié)合。
(e)結(jié)合帶可檢測信號的探針一種方法包括步驟(e1)用連接探針與被捕獲的S1酶保護(hù)分析探針雜交，并洗滌除去非特異的結(jié)合；和(e2)用帶有標(biāo)記物的信號探針再與連接探針雜交，并洗滌除去非特異的結(jié)合。
另一種方法是使用專一信號探針與被捕獲的S1酶保護(hù)分析探針雜交，并洗滌除去非特異的結(jié)合，此時可省略步驟(e1)。
(f)信號檢測可用本領(lǐng)域常規(guī)方法對可檢測信號進(jìn)行信號檢測。例如信號探針上可以標(biāo)記上熒光信號，這樣通過激發(fā)熒光來讀取數(shù)據(jù)；也可以在信號探針上標(biāo)記上地高辛、熒光素或者生物素等，然后通過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體或者親和素與之反應(yīng)；最后加入發(fā)光底物或者顯色底物(TMB或者NPP等)，通過探測發(fā)光強(qiáng)弱或者吸光度來判讀信號。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1)探針適用性好夾心雜交特異識別的關(guān)鍵是抓捕探針的特異性，一般情況抓捕探針約長20～30核苷酸，該探針要具有特異性，必須與其他非目標(biāo)生物的rRNA分子要有較大的差異，盡管不同生物的rRNA在進(jìn)化上會有差異，但在找到并成功驗證親緣關(guān)系較近的生物之間的特異性探針并不是一件容易的事，這可能也是夾心雜交技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在只有找到很少量抓捕探針的原因之一。本發(fā)明中涉及的S1酶保護(hù)分析探針，盡管長度在60個核苷酸左右，但并不要求探針全長都要有特異性，而只要求探針的中間區(qū)域有幾個核苷酸的差異即可，這大大方便了特異探針的尋找和實現(xiàn)，從而使本發(fā)明可以廣泛適用于幾乎所有的微藻。
2)穩(wěn)定性高夾心雜交技術(shù)成功執(zhí)行的關(guān)鍵之一在于保證RNA分子在整個過程不被降解，特別要保證抓捕探針與信號探針之間的那段目標(biāo)RNA分子(可能在幾十到幾百個核苷酸之間)在整個實驗過程的完好無損。但由于實驗過程涉及抗原抗體反應(yīng)和多次洗滌步驟，這為RNA酶對RNA分子降解提供了較多機(jī)會，因此要保證目標(biāo)RNA分子不被降解有非常大的難度。即使最終能夠?qū)崿F(xiàn)定性分析，定量分析的可信度也大大打了折扣。而本發(fā)明中直接與rRNA分子相關(guān)的過程只有S1酶保護(hù)分析探針與rRNA分子雜交這一步，只要雜交裂解液加入適當(dāng)?shù)腞NA酶抑制劑就能保證雜交時rRNA分子不被降解或很少被降解，實驗操作的其他步驟都是針對穩(wěn)定的DNA分子進(jìn)行的，相對比較容易執(zhí)行。因此本發(fā)明的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于夾心雜交技術(shù)。
(3)可以實現(xiàn)快速自動化的分析大量樣品由于不需要抽提RNA或DNA，也不需要進(jìn)行PCR反應(yīng)，因此操作相對簡單，可以實現(xiàn)自動化；本發(fā)明可在5小時左右獲得結(jié)果，實現(xiàn)了快速檢測大量樣品，能夠滿足大規(guī)模即時監(jiān)測的要求。
(4)結(jié)果準(zhǔn)確性高。由于S1酶的特性，能將非特異結(jié)合的S1酶保護(hù)分析探針降解，因此本發(fā)明方法用于定性檢測微藻時候特異性非常高，而且用于定量檢測微藻時線性非常好，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性高。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1對應(yīng)用針對rRNA的S1酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)實現(xiàn)對角毛藻的定性定量分析在本實施例中，將S1酶保護(hù)分析技術(shù)和夾心雜交技術(shù)聯(lián)合用來實現(xiàn)對海洋赤潮生物角毛藻(Chaetoceros sp.)的定性和定量分析，步驟如下1.1角毛藻rRNA特異區(qū)域的尋找和S1酶保護(hù)分析探針的設(shè)計與合成通過測定角毛藻核糖體小亞基18S rRNA序列并與其它藻類的rRNA序列進(jìn)行多序列比較，找到其在小亞基rRNA的550～700區(qū)域與其它藻類不同，確定該區(qū)域序列為特征序列；根據(jù)特征序列設(shè)計和合成S1酶保護(hù)分析探針CHV_S1，序列為5’-TTA ATGCCAGGACGAACCACTCAAGGATGGCGCGACAACATCGAGTACCCACCAAAGGTC(SEQ IDN01)。
根據(jù)S1酶保護(hù)分析探針設(shè)計和合成夾心雜交所需的其他探針抓捕探針CHV_CAPT5’-Biotin-GACCTTTGGTGGGTACTCGATGTTG(SEQ ID NO2)，長25個核苷酸，與S1酶保護(hù)分析探針的3’端互補，在5’端有生物素(Biotin)標(biāo)記；連接探針CHV_LINK5’-CTTGAGTGGTTCGTCCTGGCATTAATAACAACTCACCTG CCGAATGAACTAGCCCTG(SEQ IDO3)，在5’端的25個核苷酸與S1酶保護(hù)分析探針的5’端互補。
通用信號探針Universal_SIGNAL_PROBE5’-Fluorescein-CAGGGCTAGTTCATTCGGCAGGTGAGTT GTTA(SEQ ID NO4)，長32個核苷酸，在5’端標(biāo)記有熒光素(Fluorescein)，與連接探針的3’端互補。
1.2抓捕探針固定于酶標(biāo)板抓捕探針的固定方法在預(yù)先包被有親和素的酶標(biāo)板(Pierce公司)的每一孔中加入100μl溶解于PBS(pH7.2)的40nM抓捕探針，37攝氏度靜置2小時。用PBS洗三次備用。
1.3Sl酶保護(hù)分析將用f2培養(yǎng)基培養(yǎng)的海藻樣品計數(shù)后，離心收集于1.5ml塑料管中，棄去上清，加入濃度為50nM S1酶保護(hù)分析探針(SEQ ID NO1)的1000μl裂解液(0.8％SDS，1.2M脲(Urea)，20％甲酰胺(Formamide)，0.3M NaCl，50mM Tris，pH7.0)。
進(jìn)行特異性驗證時，將裸甲藻、三角褐脂藻、中肋骨條藻、Parlova gyransButcher、膜胞藻、旋鏈角毛藻、卡氏球鈣板藻、球等鞭金藻、等鞭金藻、塔瑪亞歷山大藻、膜質(zhì)舟形藻、新月菱形藻、諾氏海鏈藻各約1000000個細(xì)胞分別進(jìn)行上述處理。
進(jìn)行角毛藻的檢測曲線分析時，將離心得到的5×107角毛藻樣品用含有S1酶保護(hù)分析探針的裂解液10倍逐級稀釋五次共獲得6個樣品。
對于海藻樣品和S1酶保護(hù)分析探針的混合物，超聲波處理兩分鐘，將混合溶液在95攝氏度放置10分鐘，然后70攝氏度雜交2小時。自然冷卻后加入500μl含有800U S1酶(Promega公司)的S1酶解緩沖液(50mM ZnSO4，500mM NaAc，50mM NaCl pH4.5)，在50攝氏度酶切處理30分鐘。
1.4DNA-RNA雜合體的變性加入250μl變性緩沖液(1.5M NaOH，300mM EDTA)，95攝氏度處理10分鐘，自然冷卻后用于夾心雜交。此時DNA-RNA雜合體變性形成單鏈DNA(即曾結(jié)合于靶序列的S1酶保護(hù)分析探針)和單鏈RNA。與此同時，單鏈RNA被降解，因此溶液中僅含曾結(jié)合于靶序列的S1酶保護(hù)分析探針。
1.5夾心雜交抓捕將100μl上述變性后的反應(yīng)混合液分別移入到預(yù)固定有抓捕探針(SEQ IDNO2)的酶標(biāo)板微孔中，50攝氏度雜交1小時，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
夾心雜交每孔加入含有100μl 5nM連接探針(SEQ ID NO3)的雜交緩沖液(2×SSC，0.1％SDS)，于50攝氏度雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次；每孔加入含有100ul 5nM通用信號探針(SEQ ID NO4)的雜交緩沖液(2×SSC，0.5％SDS)于50攝氏度雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
1.6信號檢測酶標(biāo)板用磷酸緩沖液(PBS)洗6次；每孔加入含有標(biāo)記了辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體(購自Roche公司)，37攝氏度反應(yīng)30分鐘，然后用PBS洗6次；每孔加入TMB(購自Pierce公司)顯色液100μl，37攝氏度處理15分鐘后，每孔加入50μl 2M硫酸。將酶標(biāo)板置于讀板機(jī)上于450nm測定光吸收值。
1.6結(jié)果檢測結(jié)果如圖3和圖4所示。
圖3顯示了用針對角毛藻的探針探測各種不同的藻的檢測結(jié)果，證明了本發(fā)明方法具有極高的可行性和特異性。
圖4顯示了對不同細(xì)胞數(shù)的角毛藻的檢測曲線。對數(shù)據(jù)用常規(guī)統(tǒng)計方法進(jìn)行擬合，獲得如下關(guān)系y＝2.6571x+13.617；R2＝0.9965；x為實際測定的0D.450的自然對數(shù)，y為樣品中的細(xì)胞數(shù)的自然對數(shù)；R為相關(guān)系數(shù)。
下表列出了用本實施例方法測定的角毛藻樣品數(shù)量與顯微計數(shù)結(jié)果的比較

實施例2對應(yīng)用針對rRNA的S1酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)實現(xiàn)對塔瑪亞歷山大藻的定性定量分析在本實施例中，將S1酶保護(hù)分析技術(shù)和多重夾心雜交技術(shù)聯(lián)合用來實現(xiàn)對塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的定性和定量分析，步驟如下2.1塔瑪亞歷山大藻rRNA特異區(qū)域的尋找和S1酶保護(hù)分析探針的設(shè)計與合成通過測定塔瑪亞歷山大藻核糖體小亞基18S rRNA序列并與其它藻類的rRNA序列進(jìn)行多序列比較，找到其在小亞基rRNA的600～800區(qū)域與其它藻類不同，確定該區(qū)域序列為特征序列；根據(jù)特征序列設(shè)計和合成S1酶保護(hù)分析探針ALT S15’-CACACCACACAGTCAAGTGCAGTTGTGCTTTCAAGATAAATGCTCAGGCTGTGCCAAAT(SEQ IDNO5)。
根據(jù)S1酶保護(hù)分析探針設(shè)計和合成夾心雜交所需的其他探針抓捕探針ALT CAPT5’-Biotin-GACCTTTGGTGGGTACTCGATGTTG(SEQ ID NO6)，長24個核苷酸，與S1酶保護(hù)分析探針的5’端互補，在5’端有生物素標(biāo)記；連接探針AlT LINK5’-ACAACTGCACTTGACTGTGTGGTGT GTAACAACTCACCTGCCGAATGAACTAGCCCTG(SEQID NO7)，在5’端的25個核苷酸與S1酶保護(hù)分析探針的3’端互補。
信號探針SIGNAL PROBE5’-Fluorescein-CAGGGCTAGTTCATTCGGCAGGTGAGTTGTTA(SEQ ID NO4)，長32個核苷酸，在5’端標(biāo)記有熒光素，與連接探針的3’端互補(同實施例1)。
2.2抓捕探針固定于酶標(biāo)板方法同實施例1.1，不同點僅在于用塔瑪亞歷山大藻的抓捕探針替換角毛藻的抓捕探針。
2.3S1酶保護(hù)分析方法同實施例1.3，不同點在于用塔瑪亞歷山大藻待分析樣品替換角毛藻待分析樣品。
2.4DNA-RNA雜合體的變性方法同實施例1.4。
2.5夾心雜交方法同實施例1.5，不同點僅在于用塔瑪亞歷山大藻的連接探針替換角毛藻的連接探針。
2.6信號檢測方法同實施例1.6。
2.7結(jié)果檢測結(jié)果如圖5和圖6所示。
圖5顯示了用針對塔瑪亞歷山大藻的探針探測各種不同的藻的檢測結(jié)果，證明了本發(fā)明方法具有極高的可行性和特異性。
圖6顯示了對不同細(xì)胞數(shù)的塔瑪亞歷山大藻的檢測曲線。對數(shù)據(jù)用常規(guī)統(tǒng)計方法進(jìn)行擬合，獲得如下關(guān)系y＝2.1496x+9.6158R2＝0.9993x為實際測定的OD.450的自然對數(shù)，y為樣品中的細(xì)胞數(shù)的自然對數(shù)；R2為相關(guān)系數(shù)。
下表列出了用本實施例方法測定的塔瑪亞歷山大藻樣品數(shù)量與顯微計數(shù)結(jié)果的比較


實施例3對應(yīng)用針對rRNA的S1酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)實現(xiàn)對角毛藻的定性定量分析在本實施例中，重復(fù)實施例1的各步驟，不同點僅在于不使用通用的信號探針，而是在專一信號探針的5′端直接標(biāo)記熒光素(即將連接探針和信號探針的功能合二為一)。
結(jié)果獲得了與實施例1完全相同的角毛藻的定性結(jié)果，和幾乎完全相同定量檢測結(jié)果。然而，該實施例的缺點是在針對每一組檢測探針都需要合成一個帶有標(biāo)記的專一信號探針，合成的成本較高，而實施例1和2使用的通用信號探針可以廣泛通用，不必為每一個新設(shè)計的微藻S1酶保護(hù)分析探針合成一個專一的高成本的信號探針。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國海洋大學(xué)上海交通大學(xué)<120>對藻類進(jìn)行定性與定量分析的方法<130>045545<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>60<212>DNA<213>角毛藻(Chaetoceros sp)<400>1ttaatgccag gacgaaccac tcaaggatgg cgcgacaaca tcgagtaccc accaaaggtc 60<210>2<211>25<212>DNA<213>角毛藻(Chaetoceros sp)<400>2gacctttggt gggtactcga tgttg 25<210>3<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>連接探針<400>3cttgagtggt tcgtcctggc attaataaca actcacctgc cgaatgaact agccctg57<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220〉<221>misc_feature<223>信號探針<400>4cagggctagt tcattcggca ggtgagttgt ta 32<210>5<211>59<212>DNA<213>塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)<400>5cacaccacac agtcaagtgc agttgtgctt tcaagataaa tgctcaggct gtgccaaat 59<210>6<211>25<212>DNA<213>塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)<400>6gacctttggt gggtactcga tgttg 25<210>7<211>58<212>DNA<213>人工序列<400>7acaactgcac ttgactgtgt ggtgtgtaac aactcacctg ccgaatgaac tagccctg 58
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中藻類的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將待檢測樣品和S1酶保護(hù)分析探針的混合并雜交，形成混合溶液；(b)在適合條件下，用S1酶處理步驟(a)的混合溶液，從而切割單鏈核酸以及降解雙鏈核酸中的單鏈部分；(c)對步驟(b)的溶液進(jìn)行變性處理，從而釋放出S1酶保護(hù)分析探針；(d)用固定于固相載體上的抓捕探針，將被保護(hù)的S1酶保護(hù)分析探針特異地抓捕在固相載體上；(e)用帶有可檢測信號的專一信號探針與S1酶保護(hù)分析探針雜交；或者用連接探針與S1酶保護(hù)分析探針雜交，然后用帶有可檢測信號的通用信號探針再與連接探針雜交；(f)檢測可檢測信號，從而確定樣品中藻類的種類和/或數(shù)量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的S1酶保護(hù)分析探針的長度為40-100個核苷酸，并且特異性結(jié)合于一種或多種藻類的rRNA特定區(qū)域。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抓捕探針的長度為12～50個核苷酸，并特異性結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的連接探針的長度為40～100個核苷酸，并且在一端約有15～35個核苷酸的S1酶保護(hù)分析探針結(jié)合區(qū)，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合抓捕探針的一端互補，并且在另一端具有15-50個核苷酸的信號探針結(jié)合區(qū)，與信號探針互補。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的專一信號探針的長度為15～50個核苷酸，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合于抓捕探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合；或者，所述的通用信號探針的長度為15～50個核苷酸，與連接探針的不結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法用于定性或定量檢測角毛藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法用于定性或定量檢測塔瑪亞歷山大藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。
8.一種檢測樣品中藻類的試劑盒，其特征在于，它包括以下組件(a)S1酶保護(hù)分析探針，所述的S1酶保護(hù)分析探針的長度為40-100個核苷酸，并且特異性結(jié)合于藻類的rRNA特定區(qū)域；(b)抓捕探針，所述的抓捕探針的長度為12～50個核苷酸，并特異性結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端；(c)連接探針，所述的連接探針的長度為40～100個核苷酸，并且在一端約有15～35個核苷酸的S1酶保護(hù)分析探針結(jié)合區(qū)，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合抓捕探針的一端互補，并且在另一端具有15-50個核苷酸的信號探針結(jié)合區(qū)，與信號探針互補，附加條件是當(dāng)信號探針為(d1)所述的專一信號探針則無連接探針(d)信號探針，所述的連接探針選自下組(d1)所述的專一信號探針的長度為15～50個核苷酸，與S1酶保護(hù)分析探針的不結(jié)合于抓捕探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合；(d2)所述的通用信號探針的長度為15～50個核苷酸，與連接探針的不結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的一端互補，并且所述的在5’端或3’端帶有選自下組的標(biāo)記物地高辛、熒光素、生物素、辣根過氧化物酶、或其它組合。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒用于定性或定量檢測角毛藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO1、2、3、4所示的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒用于定性或定量檢測塔瑪亞歷山大藻，并且S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針序列、連接探針序列和信號探針序列分別具有SEQ ID NO5、6、7、4所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用針對rRNA的S1酶保護(hù)分析探針和夾心雜交技術(shù)，從而快速鑒定藻的種類和數(shù)量的方法，該方法包括以下步驟(a)將待檢測樣品和S1酶保護(hù)分析探針混合并雜交；(b)用S1酶酶切處理步驟(a)的混合溶液；(c)變性處理，從而釋放出S1酶保護(hù)分析探針；(d)用固定于固相載體上的抓捕探針，捕獲保留下來的S1酶保護(hù)分析探針；(e)用連接探針與S1酶保護(hù)分析探針雜交，然后與帶可檢測信號的信號探針雜交；(f)檢測可檢測信號，從而確定樣品中藻類的種類和/或數(shù)量。本發(fā)明方法還快速、簡便、可靠的鑒定微藻種類和數(shù)量。
文檔編號C12Q1/68GK1730662SQ20041005353
公開日2006年2月8日 申請日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者于志剛, 李榮秀, 蔡青松, 米鐵柱, 甄毓 申請人:中國海洋大學(xué), 上海交通大學(xué)