專利名稱：一種具有防治Ⅰ型糖尿病作用的重組門冬酰胺酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，本發(fā)明是一種重組蛋白，能用于預(yù)防和治療I型糖尿病的發(fā)生。
背景技術(shù)：
大腸桿菌L-門冬酰胺酶是一種臨床上廣泛使用的抗白血病藥物，本實(shí)驗(yàn)室已從大腸桿菌野生株中克隆了該酶基因，工程菌表達(dá)的酶蛋白占菌體總蛋白的48％以上，建立了相應(yīng)的滲透振擾提取新工藝，能以高收率提取獲得高純度重組蛋白。在研究中我們注意到，當(dāng)門冬酰胺酶基因的C末端區(qū)連接上破傷風(fēng)毒素830-854肽段基因后，再在下游接加適當(dāng)長(zhǎng)度的多肽編碼序列時(shí)，所表達(dá)的融合蛋白可以分泌到細(xì)菌周質(zhì)腔，并能形成有門冬酰氨酶活性的重組分子，這表明融合的多肽并沒有改變或輕微改變了酶分子的天然構(gòu)象，換而言之，連接的多肽可能僅游離于酶分子的表面，具有相對(duì)的獨(dú)立性。
門冬酰胺酶作為有效表位載體有許多優(yōu)點(diǎn)(1)門冬酰胺酶活力測(cè)定的靈敏度高，如果呈現(xiàn)構(gòu)象化表位的酶依然具有活力，這相當(dāng)于構(gòu)象化多肽已被酶標(biāo)記，并且不影響多肽與抗體的結(jié)合活性；(2)門冬酰胺酶由四個(gè)相同亞基構(gòu)成，因此一個(gè)酶分子上呈現(xiàn)有四個(gè)環(huán)狀多肽，能方便地設(shè)計(jì)“夾心法”等酶免疫測(cè)定方法。(3)我們?cè)陂T冬酰胺酶PAGE電泳時(shí)還發(fā)現(xiàn)該酶有形成多聚分子的傾向，能形成二聚體、三聚體和四聚體蛋白，這種顆粒化傾向有利于增強(qiáng)免疫原性。該酶在臨床應(yīng)用中已經(jīng)顯示有很強(qiáng)的免疫原性，能用于發(fā)展疫苗；(4)門冬酰胺酶是血中半衰期較長(zhǎng)的藥物。若肌肉注射也能緩慢吸收。有足夠時(shí)間供抗原充分發(fā)揮免疫刺激作用；(5)門冬酰胺酶也有一個(gè)二硫鍵，能分泌到細(xì)胞周質(zhì)腔(periplasm)折疊，在周質(zhì)腔氧化環(huán)境中二硫鍵容易自發(fā)形成。(6)將抗原多肽通過T細(xì)胞表位肽段與門冬酰胺酶C端融合，在細(xì)菌中高效表達(dá)并分泌到細(xì)胞周質(zhì)腔中，這種基因工程菌在周質(zhì)腔中含大量表面呈現(xiàn)有抗原多肽的重組門冬酰氨酶，能夠直接用于發(fā)展活菌苗或滅活菌苗。(7)門冬酰氨酶已經(jīng)在臨床上用于治療白血病和淋巴瘤，其安全性已經(jīng)得到驗(yàn)證，用該酶作為呈現(xiàn)載體，開發(fā)用于人體的藥物，將是較為安全的。
抗熱休克蛋白60((heat shock protein 60，HSP60)是人I型糖尿病，或稱胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)中極其重要的一個(gè)抗原，P277多肽是存在于人HSP60蛋白上437-460的一段特異性多肽，是在IDDM中發(fā)揮作用的特異片段，序列為VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。有文獻(xiàn)報(bào)道了一次隨機(jī)的、雙盲的二期臨床實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P277能挽救機(jī)體內(nèi)未受損的胰島β細(xì)胞的功能(即使機(jī)體已表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀)，使其能繼續(xù)釋放內(nèi)源性的胰島素。在鼠和人中，與胰島β細(xì)胞決定簇作用的主要為CD4+T細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞按其分泌的細(xì)胞因子不同又分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2和IFN-γ，前者能有效刺激T細(xì)胞增值，后者為炎癥因子，能引起阻止發(fā)炎并誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2α抗體。而且由于77％的Th1細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，它可以溶解呈遞自身移植抗原的β細(xì)胞，從而使抗體生成降低，降低體液免疫。Th2細(xì)胞分泌IL-2和IL-10，能降低Th1效應(yīng)。IL-4促進(jìn)β細(xì)胞產(chǎn)生IgG1抗體，抑制Th1產(chǎn)生前炎癥因子。IL-10通過影響抗原呈遞細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放前炎癥因子而抑制Th1活性。P277可以作用于T細(xì)胞，誘使Th1向Th2細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)化，至于P277為什么能誘導(dǎo)這種變化，現(xiàn)在認(rèn)為關(guān)鍵在于P277本身的抗原特性，結(jié)構(gòu)等，因?yàn)門細(xì)胞表型的分化受不同抗原刺激產(chǎn)生不同的結(jié)果。因此可考慮用此作為免疫疫苗來預(yù)防和治療I型糖尿病。疫苗的方法可以克服傳統(tǒng)的口服或注射胰島素及器官移植等方法的諸多缺點(diǎn)，更重要的是它能挽救未損傷的β細(xì)胞，使其繼續(xù)釋放內(nèi)源性的胰島素。
由于線性多肽構(gòu)象不穩(wěn)定、免疫原性較弱，常不能激發(fā)有效的保護(hù)性免疫，這是多肽疫苗研究中常遇到的老問題。雖然人們也常用戊二醛等雙功能試劑將多肽聚合，或用化學(xué)方法將肽與載體偶聯(lián)來彌補(bǔ)多肽免疫原性較弱的不足、有時(shí)也通過在肽兩端引入半胱氨酸使多肽通過二硫橋環(huán)化的方法來保持肽的特定構(gòu)象，然而常常不能同時(shí)兼顧兩方面的問題。通過基因工程法將四個(gè)拷貝的多肽呈現(xiàn)到一個(gè)酶分子表面，有望使多肽能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗多肽特異性免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種呈現(xiàn)P277肽段的重組門冬酰氨酶基因和蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一目的是提供生產(chǎn)該該重組蛋白的方法。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是該重組門冬酰氨酶的用途。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種呈現(xiàn)多肽P277的重組門冬酰氨酶基因和蛋白。該基因序列編碼具有圖1所示氨基酸序列的重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的DNA序列包括圖1中第1-1218位核苷酸序列。應(yīng)用基因操作技術(shù)將具有強(qiáng)T輔助表位功能的破傷風(fēng)毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，簡(jiǎn)稱TTP)、作為連接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和作為呈現(xiàn)肽段的P277連接到門冬酰氨酶的C末端，在大腸桿菌中表達(dá)出有活性的融合蛋白，具體步驟是(1)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從大腸桿菌染色體DNA中擴(kuò)增獲得門冬酰氨酶II基因，在大腸桿菌中高效表達(dá)；(2)用基因工程方法將具有強(qiáng)T輔助表位功能的破傷風(fēng)毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，以下簡(jiǎn)稱TTP)、作為連接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和P277肽段(VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED)連接到門冬酰氨酶的C末端，在大腸桿菌中表達(dá)出有活性的融合蛋白；這樣，P277肽段就被呈現(xiàn)到了酶的表面，由于門冬酰氨酶是同性四聚體蛋白，因此，每個(gè)酶分子表面呈現(xiàn)有四個(gè)同形的多肽。通過測(cè)定酶活力，能夠觀察到這種新的呈現(xiàn)有P277多肽的重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)并分泌到細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)腔中，用滲透振擾法也很容易從周質(zhì)腔中分離出具有門冬酰氨酶活性的重組酶。本發(fā)明所述的重組酶基因適宜在大腸桿菌中表達(dá)，將基因引入其他生物體，如腸道習(xí)居的各種微生物、各種減毒的病原菌，同樣能表達(dá)出相同功能的重組酶。
在本發(fā)明的第二方面，是提供生產(chǎn)該抗人I型糖尿病重組蛋白的方法，其技術(shù)路線詳述如下1.P277基因的設(shè)計(jì)與獲得P277是人HSP60上的一段437VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED460，該序列是在HSP60中對(duì)IDDM發(fā)揮作用的特異片段。我們將442和447位的C(半胱氨酸)用V(纈氨酸)來置換，以增強(qiáng)肽段的穩(wěn)定性，兩者具有相同的免疫特性。根據(jù)多肽P277氨基酸序列，選擇原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸鏈，分別作為上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的酶切位點(diǎn)，下游引物5’端加上終止密碼子和限制性核酸內(nèi)切酶HindIII的酶切位點(diǎn)，兩條引物互補(bǔ)序列為20個(gè)堿基，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法獲得P277多肽基因的核苷酸序列。
2.門冬酰胺酶-TTP基因的設(shè)計(jì)與獲得在門冬酰胺酶-TTP堿基序列的前提下，借助于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸鏈，以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pET28-AnsB-TTP質(zhì)粒為模板，5’端添加了NcoI的識(shí)別位點(diǎn)，3’端添加了BclI的識(shí)別位點(diǎn)，通過PCR方法獲得AnsB-TTP的核苷酸序列。
3.pET28-P277重組基因工程菌的構(gòu)建P277基因經(jīng)BamHI、HindIII切割插入經(jīng)BamHI、HindIII切割的pET-28(a)質(zhì)粒載體中，組成融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pET28-P277，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
4.pET28-AnsB-TTP-P277重組基因工程菌的構(gòu)建AnsB-TTP基因經(jīng)NcoI、BclI切割插入經(jīng)NcoI、BamHI切割的pET28-P277中，組成融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pET28-AnsB-TTP-P277，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
5.工程菌發(fā)酵及重組門冬酰胺酶-TTP-P277的獲得以液體LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，玉米漿培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵參數(shù)如下溫度37℃，pH6.8-7.2。發(fā)酵后離心收集工程菌，經(jīng)滲透振擾法獲取重組酶。用SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，可以判斷純化的重組酶的純度。
在本發(fā)明的第三方面是該重組酶的用途，如上所述，此種重組蛋白能用于防治人I型糖尿病的發(fā)生。P277肽段呈現(xiàn)在重組酶的表面，容易被機(jī)體的免疫細(xì)胞表面的受體識(shí)別，重組酶還能憑借強(qiáng)的T輔助表位(如破傷風(fēng)毒素的830-854多肽)，誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞的應(yīng)答，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)P277多肽的特異性抗體，促使機(jī)體Th1型免疫反應(yīng)向Th2型免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)化，從而起到預(yù)防和治療I型糖尿病的作用。我們選用國(guó)際上通用的I型糖尿病的動(dòng)物模型NOD(non-obese diabetic mouse，NOD)小鼠，隨機(jī)分成四組，每組十只，分別是空白對(duì)照組，AnsB-TTP-P277腹腔注射組，P277腹腔注射組，門冬酰胺酶對(duì)照組。分別于4周齡，7周齡，10周齡3次免疫，每月測(cè)小鼠體內(nèi)血糖水平及相應(yīng)的抗體滴度。結(jié)果顯示，P277和AnsB-TTP-P277都可以不同程度的抑制NOD小鼠糖尿病的發(fā)生，AnsB-TTP-P277明顯優(yōu)于單獨(dú)使用P277，更有利于防治I型糖尿病的發(fā)生。我們通過初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明了此重組蛋白AnsB-TTP-P277對(duì)I型糖尿病的發(fā)生有明顯的降低作用。


圖1重組蛋白AnsB-TTP-P277的全基因序列(1218bp)及氨基酸序列(406aa)圖2重組質(zhì)粒pET28-P277和pET28-AnsB-TTP-P277結(jié)構(gòu)圖。
圖3pET28-AnsB-TTP-P277 N端部分基因測(cè)序結(jié)果。
圖4pET28-AnsB-TTP-P277 C端部分基因測(cè)序結(jié)果圖5SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示AnsB-TTP-P277的融合表達(dá)。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.載荷pET28-AnsB-TTP-P277質(zhì)粒的大腸桿BL21細(xì)胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；3.載荷pET28-AnsB-TTP-P277質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)前)。
圖6SDS-PAGE電泳顯示AnsB-TTP-P277融合蛋白的純化.1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；純化的AnsB-TTP-P277融合蛋白；3.載荷pET28-AnsB-TTP-P277質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；4.大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；5.純化的大腸桿菌門冬酰氨酶。
圖7ELISA測(cè)定結(jié)果顯示融合蛋白重組門冬酰胺酶-TTP-P277和P277都能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗P277的抗體，其中重組酶激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的抗體滴度顯著高于多肽P277。圖例■AnsB-TTP-P277組；□P277組圖8Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示重組門冬酰胺酶-TTP-P277能誘發(fā)NOD小鼠產(chǎn)生抗P277抗體。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.氧化態(tài)rhVEGF-P277；3.還原態(tài)rhVEGF-P277；4.rhVEGF。箭頭A顯示rhVEGF-二聚體，箭頭B顯示rhVEGF-P277單體。
圖9各組小鼠免疫后不同月齡血清中血糖的含量。結(jié)果顯示AnsB-TTP-P277可以顯著降低NOD小鼠血糖含量，單純注射多肽P277也可降低NOD小鼠的血糖，另單純的門冬酰胺酶也對(duì)小鼠血糖有不同程度的降低。圖例■對(duì)照組； P277組；□AnsB-TTP-P277組； AnsB組圖10各組小鼠不同時(shí)期糖尿病發(fā)生率，結(jié)果顯示重組酶AnsB-TTP-P27免疫可以顯著降低NOD鼠糖尿病的發(fā)生。圖例 對(duì)照組； AnsB；-×-P277組； AnsB-TTP-P277組具體實(shí)施方式
材料(1)菌株與質(zhì)粒宿主菌E.coli BL21(Escherichia coli BL21)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室一般都有保存。
質(zhì)粒pET28a-AnsB-TTP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，門冬酰胺酶也由本實(shí)驗(yàn)室分離純化。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細(xì)菌基因組、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品；PCR回收試盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為華舜生物工程公司產(chǎn)品。
(3)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術(shù)的經(jīng)典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(5)Cellouse-DEAE DE-52為Whatman公司產(chǎn)品。
(6)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗為武漢博士德公司產(chǎn)品。
(7)3、3`、5、5`-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國(guó)西格馬(Sigma)公司產(chǎn)品。
(8)96孔酶標(biāo)板為美國(guó)康寧(Corning)公司產(chǎn)品。
(9)硝酸纖維素膜為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。
(10)測(cè)定小鼠血糖的儀器為Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。
方法分子生物學(xué)操作方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、限制性核酸內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌在基因工程研究領(lǐng)域，這些都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，ManiatisT.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達(dá)量的測(cè)定參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進(jìn)行。
實(shí)施例1 P277多肽基因的設(shè)計(jì)、合成和克隆根據(jù)P277多肽基因的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，在計(jì)算機(jī)的輔助下設(shè)計(jì)出2條寡核苷酸片段。首先通過PCR法合成P277多肽基因，將該基因克隆到pET28-(a)的L-ansB-C基因的C端，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組質(zhì)粒命名為pET28-P277。具體方法如下2條寡核苷酸P15’-GCTGGATCCAGTTCTGGGTGGTGGCGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTGG-3’P25’-GTCAAGCTTAATCTTCGTTAGCCGGGGTCAGGGAGTCCAGAGCCGGGATAACGCGC-3’通過PCR獲得P277 27多肽基因?qū)⒐押塑账崞蜳1和P2按一定比例混合，二者互為引物和模板，94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，30sec，共30個(gè)循環(huán)；72℃，10min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后用限制性核酸內(nèi)切酶BamH1和HindIII消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消化的pET28-(a)質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，所獲得的轉(zhuǎn)化子中含連有P277多肽基因的重組質(zhì)粒pET28-P277。
實(shí)施例2門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白基因的構(gòu)建、克隆和表達(dá)用普洛麥格試劑盒，抽提質(zhì)粒pET28-AnsB-TTP。據(jù)AnsB-TTP基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，在引物的兩頭加入酶切位點(diǎn)。上游引物5’-TTCGCCATGGCCAAGAACAATTGCGTACG-3’；下游引物5’-AAAATGATCAGTAGTACCAGAGATTAC-3’。以提取的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用NcoI和BclI酶切，和用NcoI和BamHI酶切的pED-P277載體連接。載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21，轉(zhuǎn)化子涂布于含有卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)16小時(shí)，通過測(cè)定菌體門冬酰氨酶活性進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。從陽(yáng)性克隆中抽提的質(zhì)粒用核苷酸自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證了基因克隆的正確性，該重組質(zhì)粒命名為pET28-AnsB-TTP-P277，其結(jié)構(gòu)見圖2。
實(shí)施例3門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)將含重組質(zhì)粒pET28-AnsB-TTP-P277的基因工程菌單菌落分別種入液體培養(yǎng)基中37℃過夜，按1％比例轉(zhuǎn)種入新鮮的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)T7RNA聚合酶，菌體經(jīng)離心回收后，用SDS電泳再經(jīng)薄層掃描顯示重組門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的30％左右，結(jié)果見圖5。菌體的門冬酰氨酶活力測(cè)定顯示重組門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白的工程菌保持了酶活力，說明TTP的引入不僅能強(qiáng)化免疫原性，也有利于多肽的呈現(xiàn)，維持門冬酰氨酶原有的構(gòu)像。
實(shí)施例4門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白的制備含pET28-AnsB-TTP-P277質(zhì)粒的工程菌培養(yǎng)在500ml搖瓶中進(jìn)行。從新鮮轉(zhuǎn)接的平皿中挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期作為一級(jí)種子，以1％接種量接入到含200ml玉米漿培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，37℃，260rpm培養(yǎng)4h后，加入1％乳糖誘導(dǎo)4h，以5000rpm離心25min收集菌體，用滲透休克法，即每1g濕菌體加入10ml滲透休克液(20％蔗糖，1mmol EDTA，10mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液)中，在37℃攪拌1小時(shí)。8000rpm離心15min，收集上清，用陰離子交換樹脂DEAE纖維素DE52進(jìn)行柱(2×60cm)層析，用含50mmol/LNaCl的PBS到含300mmol/L NaCl的PBS梯度洗脫，分步收集進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，門冬酰氨酶-TTP-P277在80-120mmol/L NaCl處的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳檢查制備樣品的純度(見圖6)。與天然的門冬酰氨酶相比，重組門冬酰氨酶-TTP-P277融合蛋白的比活力也很高，說明TTP-P277呈現(xiàn)在酶表面對(duì)酶活力影響較小，門冬酰氨酶能維持原有的構(gòu)像。
實(shí)施例5重組酶AnsB-TTP-P277能誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗P277的特異抗體選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機(jī)分成4組分別為PBS腹腔注射對(duì)照組、AnsB-TTP-P277腹腔注射實(shí)驗(yàn)組、P277腹腔注射實(shí)驗(yàn)組、和門冬酰氨酶腹腔注射對(duì)照組，每組各10只。分別腹腔注射對(duì)應(yīng)的蛋白50ug/只(PBS對(duì)照組50ulPBS/只)，AnsB-TTP-P277、P277和門冬酰氨酶都用PBS溶解，加入弗氏不完全佐劑。以后每隔3周加強(qiáng)免疫一次，共進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。每次免疫后3周內(nèi)眥取血一次，血量為0.5-0.8ml，離心，取血清。
用純化的重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子121和P277的融合蛋白(rhVEGF-P277)4℃過夜包被96孔ELISA酶標(biāo)板，每孔100ul含50ug融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時(shí)。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀釋50倍，然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時(shí)。用PBST(含0.1％Tween-20)和自來水間隔洗滌6次后加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)，每孔100μl，37℃作用1小時(shí)。PBST和自來水間隔洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3、3`、5、5`-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液于37℃顯色30分鐘后，加入50μl 2MH2SO4終止反應(yīng)，并于450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔吸光度值。結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，AnsB-TTP-P277和P277腹腔注射都能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生特異的抗P277抗體，AnsB-TTP-P277誘發(fā)產(chǎn)生的抗體明顯高于P277。
實(shí)施例6抗P277特異抗體的Western檢測(cè)將純化后的rhVEGF、還原態(tài)和氧化態(tài)rhVEGF-P277用15％SDS-PAGE電泳后，于25V電壓電泳過夜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后以5％BSA溶液室溫封閉2小時(shí)。實(shí)施例5中所得抗血清稀釋50倍后，與硝酸纖維素膜上的抗原于37℃作用1小時(shí)后，以pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀釋400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根過氧化物酶標(biāo)記)二抗，于37℃作用1小時(shí)，再以以pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色。具體操作方法參考Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。NOD小鼠血清Western blot法檢測(cè)結(jié)果見圖8。氧化態(tài)rhVEGF-P277(泳道2)由于其鏈間二硫鍵的作用，部分蛋白質(zhì)形成二聚體，在PAGE膠上表現(xiàn)為分子量分別為17kD和34kD的雙條帶，還原態(tài)rhVEGF-P277(泳道1)為單體，在膠上表現(xiàn)為分子量為16kD的單條帶。由于NOD小鼠血清中有抗P277抗體的存在，因此可以分別和膜上16kD和32kD的rhVEGF-P277蛋白帶雜交，但不和rhVEGF雜交(泳道4)，證實(shí)了AnsB-TTP-P277實(shí)驗(yàn)組能誘發(fā)NOD小鼠產(chǎn)生特異的抗P277的抗體。
實(shí)施例8 HSP65-P277重組蛋白的藥效學(xué)研究選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機(jī)分成4組，分別為PBS腹腔注射對(duì)照組、AnsB-TTP-P277腹腔注射實(shí)驗(yàn)組、P277腹腔注射實(shí)驗(yàn)組、和門冬酰氨酶腹腔注射對(duì)照組，每組各10只。分別腹腔注射對(duì)應(yīng)的蛋白50ug/只(PBS對(duì)照組50ulPBS/只)，AnsB-TTP-P27、P277和門冬酰氨酶都用PBS溶解，加入弗氏不完全佐劑。以后每隔3周加強(qiáng)免疫一次，共進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。每次免疫后3周內(nèi)眥取血一次，以后每月取血一次。血量為0.5-0.8ml，離心，取血清5小時(shí)內(nèi)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖含量。結(jié)果見圖9，在降低NOD血糖方面，AnsB-TTP-P277明顯優(yōu)于P277。以血糖濃度≥11.1umol/L判為糖尿病。各組小鼠糖尿病的發(fā)病率見圖10。結(jié)果表明重組蛋白AnsB-TTP-P277可以顯著降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生，P277和門冬酰胺酶對(duì)NOD小鼠也有不同程度降低作用。
權(quán)利要求
1.一種人工構(gòu)建的呈現(xiàn)有P277肽段具有預(yù)防人I型糖尿病作用的門冬酰氨酶，其特征在于通過基因操作將P277肽段通過一段間隔肽和源于破傷風(fēng)毒素的T輔助表位肽段，連接在L-門冬酰氨酶的C端；形成的融合基因可以表達(dá)產(chǎn)生具有門冬酰氨酶活性的融合蛋白，P277多肽被呈現(xiàn)到酶表面，不影響酶自身的折疊。
2.如權(quán)利要求1所述呈現(xiàn)有P277肽段的重組門冬酰氨酶，它包括序列表1所示的第1-406位氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于，該DNA序列包括序列表1中第1-1218位所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述呈現(xiàn)有P277肽段的重組門冬酰氨酶，其特征在于免疫動(dòng)物能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗P277的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白能預(yù)防和治療I型糖尿病。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述為呈現(xiàn)有P277肽段的重組門冬酰氨酶的基因，其特征在于可直接將該基因引入微生物體內(nèi)表達(dá)，并將表達(dá)有該重組酶的微生物體直接作為疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述呈現(xiàn)有P277肽段的重組門冬酰氨酶，其特征在于可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能用于預(yù)防和治療I型糖尿病的重組門冬酰胺酶，通過基因操作，將I型糖尿病特異的一段抗原表位P277和源于破傷風(fēng)毒素的T輔助表位肽段融合到門冬酰氨酶的C端，形成一種新的重組蛋白和相應(yīng)編碼基因。該基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，生成的重組酶能分泌到周質(zhì)中并保持大部分酶活性，并能通過滲透振擾法快速制備。重組酶將P277多肽呈現(xiàn)到了酶表面，能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗P277多肽的的特異抗體，增強(qiáng)P277的免疫原性，極大地提高了P277預(yù)防I型糖尿病的作用。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1654639SQ200410065969
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者劉景晶, 朱愛華, 劉文濤, 李文佳, 吳潔, 曹榮月 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)