專利名稱：一種用于防治糖尿病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用或功能性保健品用組合物，具體地說，是一種含有天然植物提取物或單體的組合物及其在藥物、功能性保健品方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代科學(xué)的高速發(fā)展，人們?cè)絹碓街匾暋疤烊弧彼幬?。近年來，醫(yī)藥界在治療心腦血管疾病、降血糖等藥用植物研究方面做了諸多工作，加強(qiáng)了對(duì)生物活性物質(zhì)的分析和研究，以期進(jìn)一步明確其功效。然而，取得的成效是有限的。這主要是由于心腦血管疾病、糖尿病的致病機(jī)理復(fù)雜，常伴有不同類別的一種或多種并發(fā)癥，已有的單一天然活性成分難以全方位奏效。
自由基損傷是II型糖尿病的重要發(fā)病因素之一，而高血糖又會(huì)導(dǎo)致自由基生成。據(jù)報(bào)道，咖啡酸、綠原酸可以抗氧化，而梔子能降低血糖，但是各自作用機(jī)制并不十分清楚(中國紀(jì)檢監(jiān)察報(bào)2000/6/21；郭婷等，國外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)1999，19(4)；桅子降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究中藥新藥與臨床藥理2006年1月，第17卷第1期)，這對(duì)于科學(xué)地利用二者的優(yōu)缺點(diǎn)來進(jìn)一步改善糖尿病的治療是不利的。另外，糖尿病及其并發(fā)癥均需要長期服藥，所以在改善療效的基礎(chǔ)上，減少給藥劑量/次數(shù)、降低治療成本是醫(yī)藥工作者必須解決的一項(xiàng)迫切任務(wù)。
不同藥物的聯(lián)用，似乎總是一種不錯(cuò)的解決方案。然而，迄今為止，針對(duì)單/二咖啡?？鼘幩崮芊衽c梔子聯(lián)合應(yīng)用，二者的作用機(jī)制是加合、協(xié)同還是拮抗等基礎(chǔ)問題，現(xiàn)有技術(shù)沒有提供科學(xué)依據(jù)。至于二者是否能聯(lián)合用于其它疾病(例如心腦血管疾病)，現(xiàn)有技術(shù)甚至沒有類似的暗示或嘗試。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在這方面進(jìn)行了大量的有益探索，并取得了諸多喜人的結(jié)果。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供單和/或二咖啡?？鼘幩崤c梔子的組合在治療和/或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管疾病、老年癡呆癥、高脂血癥等疾病中的應(yīng)用。
以下對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
糖尿病在前期對(duì)于含有單/二咖啡?？鼘幩岬乃幱媒M合物研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人對(duì)于本發(fā)明組合在糖尿病治療方面的藥效及其作用機(jī)制做了詳細(xì)的研究，得出了相當(dāng)滿意的結(jié)果。
我們根據(jù)以下機(jī)制設(shè)計(jì)了本發(fā)明藥物聯(lián)用①梔子的降血糖機(jī)制與提高胰島素分泌有關(guān)。②單/二咖啡?？鼘幩?、咖啡酸具有抗炎性反應(yīng)、抗氧化、降低血粘度、抑制血小板聚集等作用，改善微循環(huán)；③單/二咖啡?？鼘幩帷⒖Х人嵩鰪?qiáng)了梔子的降血糖作用④梔子苷增強(qiáng)了單/二咖啡?？鼘幩帷⒖Х人峥寡仔苑磻?yīng)及抗氧化作用，降低胰腺自由基損傷。
所有這些作用，對(duì)于糖尿病(尤其是II型糖尿病)的發(fā)生、發(fā)展過程中的病理生理改變都是有益的。
期望不受任何理論或組方所限，在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人推測(cè)這是由于梔子苷和單/二咖啡?？鼘幩嶙饔糜诓煌悬c(diǎn)，尤其是在不同病理階段發(fā)揮治療作用，發(fā)揮了藥物聯(lián)用的整體治療優(yōu)勢(shì)。
心腦血管疾病、老年癡呆癥二者聯(lián)用的有益效果并不僅局限于糖尿病及其并發(fā)癥中。在心腦血管疾病的防治中同樣是適用且有益的。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，如果冠心病、腦卒中已經(jīng)發(fā)生，無論是急性期還是恢復(fù)期治療也同樣有共同的干預(yù)靶點(diǎn)，比如抗氧化及抗炎。對(duì)于急性期治療，抗氧化及抗炎藥物可以減少細(xì)胞的死亡，最大限度的保留功能。對(duì)于恢復(fù)期治療，抗氧化及抗炎及降低血脂可以延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，降低再次發(fā)生血栓(或出血)的可能性。
基于上述糖尿病研究所得出的結(jié)論，我們可以認(rèn)為本發(fā)明組合對(duì)于冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的防治是適用的。進(jìn)一步的研究證實(shí)了本發(fā)明藥物組合在心腦血管疾病(尤其是缺血性疾病)、老年癡呆癥的治療和/或預(yù)防中表現(xiàn)出極好的治療效果。
所述心腦血管疾病例如包括冠心病、腦卒中(也稱腦中風(fēng))、心肌梗塞，和所述老年癡呆癥包括阿爾茨海默病(簡稱AD)或腦血管性癡呆(簡稱VD)。
高脂血癥在針對(duì)上述疾病的研究中，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合具有調(diào)節(jié)血脂的作用。
功能性保健品本發(fā)明的另一個(gè)目的在于本發(fā)明組合在制備功能性保健品中的應(yīng)用。
由于本發(fā)明組合物具備上述功效，也符合功能性保健品安全性的要求。因此，本發(fā)明上述組合也可作為制備功能性保健食品的主要功能成分、或作為增益劑摻加到食品、飲料中，供適應(yīng)人群長期使用。而且，在本發(fā)明試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，含有本發(fā)明上述組合的功能性保健品至少具有下述保健功能輔助降血脂功能、輔助降血糖功能、輔助調(diào)節(jié)血壓、抗氧化功能、輔助改善記憶功能、功能。
同樣，功能性保健品制備技術(shù)也屬于已知技術(shù)。相對(duì)于可藥物而言，本發(fā)明組合物用于功能性保健品的來源、條件可以更為廣泛和寬松。例如，可以使用含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬奶崛∥锖蜅d子提取物組合，也可以直接選擇單和/或二咖啡?？鼘幩岷蜅d子苷組合，也可以選擇含有咖啡酸酯的其它植物提取物或使用其化學(xué)全合成、半合成物。在功能性保健品的功效成分構(gòu)成中，可以僅含有本發(fā)明組合，也可以是本發(fā)明組合加其它輔助或加強(qiáng)功效的成分，如添加維生素E用以增強(qiáng)抗氧化功效，在此不再贅述。
本發(fā)明組合及相應(yīng)制劑本發(fā)明組合是指以單獨(dú)含有單和/或二咖啡?？鼘幩?、梔子的獨(dú)立制劑形式供聯(lián)合施用，或者以同時(shí)含有二者的組合物/產(chǎn)品形式提供。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于含有梔子和單和/或二咖啡?？鼘幩岬乃幱媒M合物，其中以單/二咖啡?？鼘幩岷蜅d子中的梔子苷計(jì)，二者的重量比例為0.1-10∶1，優(yōu)選0.1-8∶1，更優(yōu)選0.2-5∶1，和更優(yōu)選0.5-2∶1。
本發(fā)明組合物中，梔子可以選擇藥味直接粉碎成粉末入藥，也可以相當(dāng)于上述中藥材生藥量的提取物或其它形式入藥。因此，本發(fā)明藥物組合物的梔子活性組成包括藥材原粉、脂或水溶性提取物、有效部位、或有效成分，或者采用現(xiàn)有技術(shù)中已有的制品形式。例如，所述活性組成包括a).以梔子苷(即京尼平苷，Geniposide)為主要活性成分的物質(zhì)含有梔子總苷的梔子提取物，例如梔子的水提取物、醇提取物，或梔子總苷，或梔子苷單體或其衍生物。梔子總苷是指環(huán)烯醚萜總苷，其中的主要活性成分梔子苷，還可含有羥異梔子苷(gardenoside)、、山梔子苷(shazhiside)、梔子酮苷(gardoside)及京尼平酸苷的混合物，其中也可含有藏紅花素(crocin)、藏紅花酸(crocetin)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，梔子總苷、梔子苷的提取和制備方法為已知技術(shù)(例如中國專利申請(qǐng)CN200510026143.0、CN02124158.9、ZL03109126、ZL 03122071、ZL 03137512、ZL03137512、ZL 200310111038)，在此不作贅述。
b).以單和/或二咖啡?？鼘幩釣橹饕钚猿煞值奈镔|(zhì)咖啡?？鼘幩崾且活愑煽鼘幩?quinic acid)與數(shù)目不等的咖啡酸(caffeic acid)通過酯化縮合而成的酚酸類天然成分，也稱為咖啡酸酯。根據(jù)奎寧酸分子上連接的咖啡?；鶖?shù)目不同可以將該類成分分為單(一)咖啡酰奎寧酸、二咖啡?？鼘幩?、三咖啡酰奎寧酸和四咖啡?？鼘幩岬阮悇e。
可以自多種植物提取出來的單/二咖啡?？鼘幩?，如含有單和/或二咖啡酰奎寧酸的植物提取物，例如燈盞細(xì)辛水提取物；含有咖啡酸、單寧酸(丹寧酸)、單咖啡?？鼘幩?如綠原酸)的咖啡提取物，優(yōu)選其中不含咖啡因；含有綠原酸和/或異綠原酸的金銀花、杜仲提取物；或直接取綠原酸、異綠原酸、或者其它單咖啡?？鼘幩?、或者二咖啡?？鼘幩?。
單/二咖啡?？鼘幩?、咖啡酸則來源很為廣泛。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明所用單/二咖啡?？鼘幩岬膩碓床⒉痪窒抻谏鲜鲋参?。試驗(yàn)表明，只要含有單和/或二咖啡酰奎寧酸，其它植物或植物部位(提取物)也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，例如茜草科咖啡屬咖啡豆或菊科植物，蒼耳子、向日葵、艾葉、茼蒿、燈盞細(xì)辛、茵陳、旋覆花、紫菀、菜薊、山萵苣、林蔭千里光，及蜂膠、杜仲、金銀花及其它忍冬科植物、繼木、咖啡、可可樹、北劉寄奴、狹葉紫錐花、苦丁茶及其它冬青屬植物、甘薯葉、甘薯、梔子、土豆、常春藤屬植物、或魚眼草屬植物。同時(shí)，需要指出的是，采用這些植物提取單和/或二咖啡酰奎寧酸或相應(yīng)單體的提取和制備方法為已知技術(shù)，例如藥物分析雜志2005年，25(7)751-755、瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)1999年，22(6)469-470、醫(yī)學(xué)綜述2004年，10(4)249-250、EP0299107、US5401858、ZL01115358X、ZL031287298、ZL99105113、ZL200310113536、ZL94102414、ZL97109109、ZL01144170、ZL02133448、ZL02811814、ZL02824704、ZL03110999、ZL03134575、ZL200310111180、ZL200510000484、ZL03117754，在此不作贅述。
由于單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩幔渌幚砉πЬ哂袠O大的相同性，并且，自植物中提取的咖啡?？鼘幩嵬菃巍⒍Х弱？鼘幩岬幕旌衔?，甚至還含有少量三咖啡?？鼘幩幔覇?、二咖啡?？鼘幩嵋渤Ｊ歉鞣N同分異構(gòu)體的混合物質(zhì)(也即總咖啡酸酯)。因此，本發(fā)明既可以采用含有單咖啡?？鼘幩?、或含有二咖啡酰奎寧酸的植物提取物或單體，也可采用單咖啡酰奎寧酸單體、二咖啡酰奎寧酸單體的混合物，也可以采用含有單、二、三咖啡?？鼘幩岬奶崛∥铩?br> 單咖啡?？鼘幩峥梢匀∽?-咖啡?？鼘幩?綠原酸)、5-咖啡?？鼘幩?異綠原酸)，或者它們的混合物。
根據(jù)咖啡?；〈恢貌煌?，二咖啡?？鼘幩岱譃?，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、1，3-二-O-咖啡?？鼘幩?、1，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、3，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩?。
可單獨(dú)或者采用上述單、二咖啡?？鼘幩岬幕旌衔铮缇G原酸、異綠原酸、3，4-位、3，5-位、1，5-位二咖啡?？鼘幩岬幕旌衔铮蛘呃绾?，5-位二咖啡酰奎寧酸的提取物，或者例如綠原酸單體(即3-咖啡酰奎寧酸)、異綠原酸單體(即5-咖啡?？鼘幩?、或者綠原酸和異綠原酸的混合物，或者3，5-二-O-咖啡?？鼘幩釂误w、和/或1，5-位二咖啡?？鼘幩釂误w。上述單、二咖啡酰奎寧酸衍生物或藥用鹽也適于本發(fā)明。
有利的是，上述活性成分當(dāng)以提取物形式入藥時(shí)，梔子苷在所述提取物中的純度為2-98wt％、優(yōu)選25％、50％、75％或92wt％，和單/二咖啡酰奎寧酸在所述提取物中的純度為5-98wt％、優(yōu)選40％、75％或96wt％。
在上下文中，“本發(fā)明藥用組合”所涉及術(shù)語“單/二咖啡?？鼘幩帷薄ⅰ皸d子”、“梔子(總)苷”具有上述定義。
下面的試驗(yàn)將證實(shí)按照本發(fā)明描述的具有上述定義之“單/二咖啡?？鼘幩帷迸c“梔子”的組合，具有本發(fā)明所述的有益效果。鑒于現(xiàn)有技術(shù)中業(yè)已存在著相當(dāng)成熟有效的制備上述定義組分的技術(shù)，在此不作重點(diǎn)描述。例如，可以采用現(xiàn)代提取和分離技術(shù)以提高活性物質(zhì)的純度、盡量除去不需要的雜質(zhì)，類似的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中已相當(dāng)成熟有效。
可針對(duì)梔子苷類、單/二咖啡?？鼘幩岬娜芙馓匦院腕w內(nèi)吸收特點(diǎn)(中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)2003，34(01)65-9；沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)1999，16(4)250-3；中國藥理學(xué)通報(bào)1992，8(4)278-80)，采用標(biāo)準(zhǔn)制劑技術(shù)，與藥用輔料一起制成適宜的口服或非腸道給藥劑型，類似的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中也已相當(dāng)成熟有效，例如片劑(ZL01115358、ZL03112999)；分散片(ZL03112974、ZL02153445)；口腔速崩片(ZL03102405、ZL200410016510、ZL200410041256)；混懸劑(ZL200410080266)、乳劑(ZL200410080265)、緩控釋制劑(ZL01117620、ZL02109758、ZL02116795、ZL02129313、ZL02134118、ZL03100021、ZL03133897)、滴丸(ZL01133515、ZL03135325、ZL200310119222)；軟膠囊(ZL01117620)；注射或輸液劑(ZL03129007、ZL200410008734、ZL200410022438、ZL200410080023、ZL93106319、ZL95104038、ZL97101107、ZL02155001、ZL021332983、ZL031279953、ZL03141614、ZL03113037、ZL2003101210259、ZL200410013845)；或含磷脂制劑(ZL03111469、ZL01138902、ZL03153496)。
本發(fā)明組合物臨床使用中，示例性的每日口服推薦劑量為單/二咖啡?？鼘幩?0-1000mg(優(yōu)選80-200mg)、梔子苷10-200mg(優(yōu)選50-150mg)。
本發(fā)明的上述藥物組合克服了已有藥物存在的作用單一、服藥量大等缺點(diǎn)，代表了天然藥物治療和預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管疾病的新趨勢(shì)。
藥理藥效學(xué)試驗(yàn)研究一.糖尿病方面的藥理作用1.對(duì)鏈佐菌素所致糖尿病大鼠血糖和血清胰島素的影響方法取雄性SD大鼠按標(biāo)準(zhǔn)方法制備小劑量鏈佐菌素致糖尿病大鼠模型，3d后根據(jù)大鼠血糖值隨機(jī)分組，每組8只。
各組連續(xù)灌胃給藥8d，每日1次，空白組給予等量蒸餾水。最后一次給藥后2小時(shí)(二甲雙胍組1小時(shí))摘眼球取血，測(cè)定血糖和血清胰島素。
實(shí)驗(yàn)藥物陽性藥二甲雙胍組300mg/kg；咖啡酸酯組(mg/kg)二咖啡?？鼘幩?20、50；梔子組(mg/kg)梔子提取物(梔子總苷含量50％)200、100；組合A組(mg/kg)二咖啡?？鼘幩帷脳d子提取物(梔子苷含量60％)＝1∶5200、100、50；組合B組(mg/kg)單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔铩脳d子苷＝5∶1100、50、30；組合C組(mg/kg)二咖啡酰奎寧酸∶梔子苷＝1∶1100、50、30；結(jié)果表1對(duì)鏈佐菌素所致大鼠糖尿病血糖及血清胰島素影響(X±s)


*與空白組對(duì)比，前后差值P＜0.5；**與空白組對(duì)比，前后差值P＜0.01實(shí)驗(yàn)表明二甲雙胍組可以有效降低本模型大鼠血糖，差異有顯著性，但不提高大鼠血清胰島素水平。梔子大劑量組對(duì)血清胰島素升高有顯著性影響，但無明顯降糖作用。二咖啡?？鼘幩峤M對(duì)血糖及血清胰島素均無顯著性影響。
本發(fā)明組合物各劑量組均可降低大鼠血糖，其作用優(yōu)于二甲雙胍或與之相當(dāng)，各大劑量組可以提高血清胰島素。
二.心腦血管方面的藥理作用1.對(duì)大鼠試驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用對(duì)腦水含量的影響將體重160-180g大鼠隨機(jī)分組，試驗(yàn)前9天及術(shù)前1hr每天口服給藥一次。結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈造成急性實(shí)驗(yàn)性不完全缺血模型。
組合物A綠原酸+梔子提取物(梔子總苷含量80％)1∶2組合物B單咖啡酰奎寧酸(含綠原酸及異綠原酸)+梔子總苷1∶1表2對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠腦水含量的影響(X±S)(n＝10)

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01由上表可知，本發(fā)明各組及依達(dá)拉奉組對(duì)不完全性腦缺血引起的腦水腫均顯示出保護(hù)作用，但是與腦缺血模型組比較，組合物組中劑量以上組使腦含水量減少更加顯著(P＜0.01)，表明其對(duì)不完全性腦缺血引起的腦水腫有顯著的保護(hù)作用。而單獨(dú)施用的綠原酸及梔子提取物沒有保護(hù)作用。
2.對(duì)缺血性腦損傷的影響對(duì)大鼠腦梗塞組織重量的影響取SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組假手術(shù)組、生理鹽水組(NS)、本發(fā)明組合物A(單/二咖啡酰奎寧酸混合物(2∶1)+梔子苷1∶5)3個(gè)劑量組、本發(fā)明組合物B(燈盞細(xì)辛提取物+梔子提取物(梔子苷含量65％)3∶1)3個(gè)劑量組、陽性藥組(單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔锝M(2∶1)、梔子總苷組)，每組10只。按照已知藥理學(xué)方法做成大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎(MCAO)模型。結(jié)果見下表。
表3對(duì)MCAO所致大鼠腦梗塞組織重量的影響(n＝10)

與NS比較，*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果表明，大鼠MCAO后明顯有腦梗塞發(fā)生，本發(fā)明組合各組各劑量(iv)組可明顯降低腦梗塞組織重量百分比(P＜0.01，P＜0.05)，而單/二咖啡酰奎寧酸混合物、梔子苷組也有較明顯的降低效果(P＜0.05)，但是與組合物大、中劑量相比，陽性對(duì)照組效果明顯不如本發(fā)明組合。
同樣，在采用與上表相同的藥物及其劑量，對(duì)MCAO所致大鼠缺血損傷行為學(xué)指標(biāo)的影響的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示了并可以得出與上述相類似的結(jié)論，即組合物、單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔锖蜅d子苷組均顯示了相關(guān)的作用，但以本發(fā)明組合大、中劑量組的效果最好，明顯優(yōu)于單純的單/二咖啡酰奎寧酸混合物和梔子總苷組。
3對(duì)腫瘤壞死因子損傷大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的影響材料本發(fā)明組合物A梔子苷+總咖啡酸酯(含有綠原酸、異綠原酸、二咖啡酰奎寧酸及咖啡酸共85％)1∶12，(25、50、100μg/ml)；本發(fā)明組合物B梔子總苷(含量85％)+總咖啡酸酯(含有綠原酸、異綠原酸、二咖啡?？鼘幩峒翱Х人峁?5％)10∶1，(25、50、100μg/ml)；對(duì)照藥梔子總苷(含量85％)(50μg/ml、100μg/ml)；總咖啡酸酯(含有綠原酸、異綠原酸、二咖啡酰奎寧酸及咖啡酸共85％)(50μg/ml、100μg/ml)；方法通過CMEC體外培養(yǎng)技術(shù)，建立TNF-α損傷的細(xì)胞模型，以細(xì)胞活力(MTT)、乳酸脫氫酶(LDH)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察藥物對(duì)損傷的CMEC的保護(hù)作用。以雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)損傷CMEC上清液中白介素6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、白介素8(IL-8)的含量；以實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)損傷CMEC IL-6、MCP-1、IL-8mRNA的表達(dá)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察藥物在不同濃度對(duì)損傷的CMEC合成釋放炎癥介質(zhì)的影響。
結(jié)果及結(jié)論顯示本發(fā)明組合物各組25～100μg/ml均可提高TNF-α損傷CMEC的細(xì)胞活力，降低LDH的釋放，以50μg/ml效果最佳。梔子總苷組無此作用，總咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，與本發(fā)明組合物A、B組中的25μg/ml相當(dāng)。
本發(fā)明組合物各組在25～100μg/ml范圍內(nèi)能夠濃度依賴性的抑制TNF-α損傷CMEC IL-6的釋放及mRNA的表達(dá)。梔子總苷無此作用，總咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，但稍弱于本發(fā)明組合物A、B組中的25μg/ml。
本發(fā)明組合物各組對(duì)TNF-α損傷CMEC作用3～12h內(nèi)均可減少IL-6的釋放，其中在9h時(shí)作用最為明顯。在25～100μg/ml范圍內(nèi)能夠濃度依賴性的抑制TNF-α損傷CMEC的MCP-1釋放，且作用隨時(shí)間的增長抑制作用逐漸減弱。25～50μg/ml的本發(fā)明組合物有降低損傷CMEC的MCP-1mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，100μg/ml的本發(fā)明組合物降低MCP-1的表達(dá)。本發(fā)明組合物對(duì)TNF-α損傷CMEC釋放IL-8有降低的趨勢(shì)。梔子苷無此作用，總咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，但稍弱于本發(fā)明組合物25μg/ml。本試驗(yàn)表明，本發(fā)明組合物能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)CMEC分泌IL-6、MCP-1的作用，降低其mRNA表達(dá)，阻抑炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕炎性因子對(duì)CMEC的損傷。單獨(dú)給予的梔子總苷無此作用，總咖啡酸酯高濃度(大劑量)有微弱作用?？梢缘贸鰲d子苷和總咖啡酸酯合用具有協(xié)同抗炎作用的結(jié)論。
4腦細(xì)胞保護(hù)作用材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康Wistar大鼠72只，體重260±15g；藥物本發(fā)明組合物A梔子提取物(梔子苷含量75％)+總咖啡酸酯(含有單、二、三咖啡酰奎寧酸及咖啡酸)7∶1，20mg/kg；本發(fā)明組合物B梔子提取物(梔子苷含量75％)+總咖啡酸酯(含有單、二、三咖啡酰奎寧酸及咖啡酸)1∶7，20mg/kg；陽性對(duì)照藥(注射)梔子苷，20mg/kg；總咖啡酸酯(含有單、二、三咖啡酰奎寧酸及咖啡酸)，20mg/kg；依達(dá)拉奉注射液，10mg/kg；實(shí)驗(yàn)方法大鼠隨機(jī)分為6組，每組12只。正常對(duì)照組給0.9％氯化鈉液3ml/kg；模型組參照Kaizumis栓線法建立腦缺血再灌注動(dòng)物模型。
腦水腫及腦鈣含量的測(cè)定取右前腦50～100mg，烘干至恒重，即為干重。
腦含水量測(cè)定用公式(濕重-干重)/濕重，計(jì)算腦含水量。
結(jié)果(1)大鼠腦組織梗塞區(qū)觀察光鏡下模型組神經(jīng)元輪廓模糊，胞體著色變深，胞質(zhì)分界不清。細(xì)胞周圍亮區(qū)變寬與正常對(duì)照組有顯著差異(P＜0.01)。本發(fā)明組合物各組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)尚清晰，胞核與胞質(zhì)界限尚能分清，細(xì)胞周圍亮區(qū)較寬，與模型組相比雖有縮小，但無顯著性差異。梔子苷組和總咖啡酸酯組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)欠清晰，胞核與胞質(zhì)界限能分清，細(xì)胞周圍亮區(qū)較寬，與模型組相比未見明顯縮小。
電鏡下模型組神經(jīng)元變形，明暗神經(jīng)元不易區(qū)分，胞核變形，核內(nèi)異染色質(zhì)增多、核膜及核周隙模糊不清、核質(zhì)分界不清、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失、細(xì)胞器減少或變形、結(jié)構(gòu)不清。線粒體呈氣球樣腫脹、質(zhì)膜結(jié)構(gòu)不清或消失斷裂、細(xì)胞周圍有大量水腫液呈低電子密度亮區(qū)。本發(fā)明組合物各組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)元核周核膜清晰、核內(nèi)異染色質(zhì)稍增多、核周間隙較狹窄、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較明顯、但線粒體均有水腫樣改變、細(xì)胞周圍有少量水腫液。梔子苷組和總咖啡酸酯組神經(jīng)元核周核膜欠清晰、核內(nèi)異染色質(zhì)稍明顯增多、核周間隙較狹窄、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器不明顯、線粒體有水腫樣改變。模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、胞質(zhì)電子密度降低、細(xì)胞器減少、局部細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不清。本發(fā)明組合物組及依達(dá)拉奉組星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫表現(xiàn)較模型組輕，細(xì)胞器與模型組相比明顯較多。梔子苷組和總咖啡酸酯組星形膠質(zhì)細(xì)胞則與模型組基本相似。
(2)腦組織鈣、丙二醛、超氧化物歧化酶、腦水分含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型組腦組織丙二醛含量、鈣含量、腦水分均較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，而SOD活性則明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01)；本發(fā)明組合物各組能抑制灌注后腦組織丙二醛含量的升高和升高SOD活性(P＜0.01)，改善腦水含量(P＜0.01)，效果與依達(dá)拉奉相當(dāng)，明顯優(yōu)于總咖啡酸酯和梔子苷組。
結(jié)論本發(fā)明組合物能顯著抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織MDA含量的升高和提高SOD活性，改善腦水含量，并從超微結(jié)構(gòu)上證實(shí)對(duì)膜性結(jié)構(gòu)尚有一定保護(hù)作用。本發(fā)明組合物主要通過提高SOD活性，清除氧自由基，從而對(duì)腦細(xì)胞起保護(hù)作用，其作用與依達(dá)拉奉相當(dāng)，明顯優(yōu)于單獨(dú)施用的梔子苷和總咖啡酸酯。
三.老年癡呆方面的藥理作用對(duì)缺血再灌注制備的VD模型的作用大鼠分為假手術(shù)組、模型組、單咖啡酰奎寧酸組(含有綠原酸、異綠原酸)、梔子苷組和本發(fā)明組合物A組單咖啡?？鼘幩?含有綠原酸、異綠原酸)+梔子苷8∶1，注射用藥和本發(fā)明組合物B組單咖啡?？鼘幩?含有綠原酸、異綠原酸)+梔子苷1∶8，口服給藥，在制備模型前連續(xù)給藥，然后用反復(fù)缺血再灌注制備VD大鼠模型，測(cè)定海馬組織中MDA的含量。
表4.對(duì)再灌注制備的VD大鼠海馬組織中MDA含量的影響比較(n＝10)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.1，**P＜0.05，***P＜0.01上表顯示，本發(fā)明組合物各組均可降低大鼠海馬MDA含量，有抗氧化作用，但以本發(fā)明組合物(中、高劑量的A組和B組)的作用最顯著，梔子苷組也降低了MDA含量，而單組分的單咖啡酰奎寧酸組則較弱。
四.抗氧化及降血脂方面的藥理作用對(duì)高血脂癥大鼠的抗氧化作用材料本發(fā)明藥物組合物A梔子苷+杜仲提取物1∶10，80mg/kg、40mg/kg灌胃；本發(fā)明藥物組合物A梔子苷+金銀花提取物8∶1，80mg/kg、40mg/kg灌胃正常對(duì)照組生理鹽水；高血脂組生理鹽水；陽性對(duì)照藥杜仲提取物(50mg/kg)；金銀花提取物(50mg/kg)；梔子提取物(50mg/kg)；羅格列酮組3mg/kg；灌胃。
實(shí)驗(yàn)方法模型的建立SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分組，每組8只。正常組喂基礎(chǔ)飼料，飲用清潔的自來水。其余大鼠喂高脂、高糖飼料(基礎(chǔ)飼料42％、豬油23％、蔗糖24％、食鹽5％)，并飲用1％的食鹽水。每日一次，藥物灌胃，連續(xù)4周后取血測(cè)定觀察指標(biāo)。
結(jié)果抗氧化作用實(shí)驗(yàn)表明，單獨(dú)施用的杜仲提取物及金銀花提取物存在一定的抗氧化活性(對(duì)血清和肝臟LPO和SOD的影響，P＜0.05)，梔子組則沒有抗氧化活性。本發(fā)明組合物各組的低、高劑量組均有抗氧化活性，尤其是高劑量組的活性更顯著(p＜0.01)，明顯優(yōu)于單獨(dú)施用的杜仲提取物及金銀花提取物和羅格列酮對(duì)照藥。
調(diào)血脂作用表5對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響

與高血脂組比較*p＜0.05**p＜0.01；與正常組比較△△p＜0.01
結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)表明，單獨(dú)施用的杜仲提取物及金銀花提取物可以降低TC，但對(duì)血脂其他指標(biāo)沒有影響，而梔子則對(duì)所有血脂指標(biāo)都沒有作用。本發(fā)明組合物各組均具有顯著的降低血脂TC、TG和LDL-C的作用，效果優(yōu)于所有對(duì)照藥。
本實(shí)驗(yàn)表明，梔子的加入，顯著增強(qiáng)了杜仲提取物及金銀花提取物的抗氧化及調(diào)節(jié)血脂作用，這種協(xié)同作用很大可能性上來源于梔子和咖啡酸酯的協(xié)同，具有良好的藥用前景。
五.抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化(AS)血管重構(gòu)的影響材料本發(fā)明藥物組合物A梔子苷+單/二咖啡?？鼘幩?∶8，50mg/kg灌胃；本發(fā)明藥物組合物B梔子總苷+單/二咖啡?？鼘幩?∶1，50mg/kg灌胃；正常對(duì)照組生理鹽水；模型組生理鹽水；陽性對(duì)照藥單/二咖啡酰奎寧酸(50mg/kg)、梔子總苷(50mg/kg)、普羅布考(25mg/kg)。
實(shí)驗(yàn)方法將純種雄性新西蘭兔，隨機(jī)分組，飼養(yǎng)1周后，采用球囊損傷內(nèi)皮繼喂食高脂飼料的方法復(fù)制家兔實(shí)驗(yàn)性AS模型。觀察12周。
測(cè)定項(xiàng)目及結(jié)果組織病理學(xué)光學(xué)顯微鏡下，正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞完整未見異常改變；模型組動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞缺損，內(nèi)膜增生，6周時(shí)內(nèi)膜增生嚴(yán)重，管腔明顯狹窄而且大小不規(guī)則，細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸性不明顯，出現(xiàn)大量大小不規(guī)則的泡沫細(xì)胞，有的可見脂肪壞死中心，內(nèi)膜下層可見大量梭形增生細(xì)胞；各給藥組內(nèi)皮缺損面減少，增厚明顯減輕，泡沫細(xì)胞減少，尤其以本發(fā)明組合物各組及普羅布考為最優(yōu)。
組織形態(tài)學(xué)最大內(nèi)膜厚度(MIT)、最小管腔直徑(MLD)、管腔面積(LA)、內(nèi)彈力膜圍繞面積(IELa)、外彈力膜圍繞面積(EELa)，并得出內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)、管腔狹窄百分比(LS)，其中，IA＝IELa-LA；MA＝EELa-IELa；LS＝IA/IELa。
內(nèi)膜厚度已經(jīng)被證實(shí)可以作為早期動(dòng)脈硬化的有用指征，在減小MIT、IA和LS、增加LA方面，各給藥組表現(xiàn)出不同程度作用。在抑制內(nèi)膜增殖方面，以本發(fā)明組合物和普羅布考組作用尤為明顯(P＜0.01)，顯著優(yōu)于梔子和單/二咖啡?？鼘幩峤M(P＜0.05)。
討論已知梔子和咖啡酰奎寧酸對(duì)AS都有一定治療作用，但其抗AS的機(jī)理并不清楚。由于植物藥多組分的特性使得其藥理作用往往也是呈現(xiàn)出“多靶點(diǎn)”的特性，當(dāng)然，也正是由于這種特性，使得詳細(xì)研究其藥理機(jī)制顯得較為困難。同樣的原因，本發(fā)明人目前尚無法準(zhǔn)確認(rèn)定本發(fā)明組合協(xié)同作用的機(jī)理，只能以藥效學(xué)資料作為結(jié)論，而暫時(shí)忽略其具體機(jī)制。
梔子苷與咖啡?？鼘幩崴苄远己芎?，二者的合用，配伍相對(duì)穩(wěn)定，也不會(huì)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)而減損藥效，相反，可能由于治療機(jī)理的側(cè)重方向不同，可產(chǎn)生更顯著的協(xié)同作用，這也是臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中對(duì)藥物特性極為需要的——單藥多靶點(diǎn)藥理特性。
實(shí)施例實(shí)施例1膠囊劑取梔子5g，粉碎成粗粉，加75％乙醇回流提取三次，第一、二次各2小時(shí)，第三次1小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至約400ml，用正丁醇提取三次，每次300ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至無正丁醇味，加水200ml，加熱溶解，濾過，濾液噴霧干燥，得提取物I備用；取提取物I一份、取金銀花提取物(綠原酸含量不低于50％)1g，加入淀粉、硬脂酸鎂，混勻，裝入硬膠囊中。經(jīng)檢測(cè)，每膠囊中含有綠原酸500mg、和梔子苷100mg。
實(shí)施例2片劑取咖啡豆5kg，用95％的乙醇提取，提取物溶于水后分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分。乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析和MCI柱層析分別得二咖啡酰氧基奎寧酸8g和奎寧酸4g。然后把二咖啡酰氧基-奎寧酸100mg，溶于1000ml水中制成0.1％濃度的水溶液加熱溶解，混合均勻后，裝入藥瓶中密封，消毒制成產(chǎn)品，得提取物II備用。
取實(shí)施例1的提取物I兩份、提取物II一份，加入低取代羥丙基纖維素、硬脂酸鎂、淀粉、微晶纖維素，按照標(biāo)準(zhǔn)制粒和壓片工藝制粒。經(jīng)檢測(cè)，含有二咖啡?？鼘幩?00mg/片、梔子苷200mg/片。
實(shí)施例3軟膠囊劑取實(shí)施例1的提取物I半份、提取物II五份，加入淀粉、硬脂酸鎂，混勻，按照標(biāo)準(zhǔn)工藝制成軟膠囊。經(jīng)檢測(cè)，每膠囊中含有含有二咖啡?？鼘幩?00mg、梔子苷50mg。
實(shí)施例4水針劑取燈盞細(xì)辛全植物30kg，用95％的乙醇提取，提取物溶于水后分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分。乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析和MCI柱層析得提取物III。
另取梔子總苷5g，加注射用水及氯化鈉適量，溶解后再加入上述提取物III，加注射用水至2000ml，濾過，灌封(10ml/支)，滅菌，即得。經(jīng)檢測(cè)，含有總咖啡酸脂150mg/支、和梔子總苷25mg/支。
實(shí)施例5凍干針劑無菌條件下取單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔?5g、適量藥用堿，加注射用水約至900ml，攪拌使溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.5-7.5，加入梔子苷75g至溶解，混合均勻、微孔濾膜過濾，加注射用水至1000ml。然后，加配制量的0.02％活性炭攪拌5-10min，用無菌抽濾漏斗過濾，再用滅菌垂熔漏斗精濾或超濾，濾液檢驗(yàn)合格后分裝于1000支5ml安瓿中，低溫冷凍干燥，無菌熔封即得。經(jīng)檢測(cè)，含有單咖啡酰奎寧酸8mg/支、二咖啡酰奎寧酸15mg/支、和梔子苷75mg/支。
實(shí)施例6功能性保健食品取蜂膠提取物100g(含咖啡酸、單咖啡?？鼘幩岵坏陀?0％)、梔子提取物(梔子苷含量不低于65％)100g、維生素E 50g、甜味添加劑適量，加入淀粉等輔料至總質(zhì)量300g，混勻，按標(biāo)準(zhǔn)工藝壓片成1000片，即得功能性保健食品片劑。
實(shí)施例7功能性保健食品取咖啡豆提取物(總咖啡酸酯含量不低于50％，不含咖啡因)400g、梔子苷5g、甜味添加劑、淀粉適量，按標(biāo)準(zhǔn)工藝制備成顆粒劑。
權(quán)利要求
1.一種藥用或功能性保健品用組合物，包括以下活性組分a.含有單和/或二咖啡酰奎寧酸的植物或者植物部位提取物，或單和/或二咖啡?？鼘幩釂误w；和b.含有梔子總苷的梔子提取物，或梔子總苷，或梔子苷單體；其中組分a中單或二咖啡酰奎寧酸與組分b中梔子苷的重量比例為0.1-10∶1。
2.如權(quán)利要求1的組合物，所述二咖啡?？鼘幩徇x自1，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、1，3-二-O-咖啡?？鼘幩?、1，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、3，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩幔蛘咚鼈兊幕旌衔?。
3.如權(quán)利要求1的組合物，所述單咖啡?？鼘幩徇x自3-咖啡?？鼘幩?、5-咖啡?？鼘幩?，或者它們的混合物。
4.如權(quán)利要求1的組合物，所述植物或者植物部位選自蒼耳子、向日葵、艾葉、茼蒿、燈盞細(xì)辛、茵陳、旋覆花、紫菀、菜薊、山萵苣、林蔭千里光，蜂膠、杜仲、金銀花、繼木、咖啡、可可樹、北劉寄奴、狹葉紫錐花、苦丁茶、甘薯葉、甘薯、梔子、土豆、常春藤屬植物、或魚眼草屬植物。
5.如權(quán)利要求1的組合物，所述組分a為含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬目Х忍崛∥?。
6.如權(quán)利要求5的組合物，所述咖啡提取物中還含有咖啡酸。
7.如權(quán)利要求5或6的組合物，所述咖啡提取物不含咖啡因。
8.如權(quán)利要求1的組合物，所述活性組分a為含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬慕疸y花提取物。
9.如權(quán)利要求1的組合物，所述活性組分a為含有單和/或二咖啡酰奎寧酸的燈盞細(xì)辛提取物。
10.如權(quán)利要求1的組合物，所述活性組分a為含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬亩胖偬崛∥?。
11.如權(quán)利要求1-10之一的組合物，是經(jīng)口服或非腸道施用的產(chǎn)品。
12.權(quán)利要求1-11之一的藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管疾病、老年癡呆癥、高脂血癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥用或保健品用組合物、制備方法及其應(yīng)用，所述組合物含有天然植物提取物或單體為活性成分。本發(fā)明藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防糖尿病及心腦血管疾病。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101057674SQ20071011088
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者林谷風(fēng), 潘錫平 申請(qǐng)人:深圳市生物谷科技有限公司