專利名稱：生物催化生產(chǎn)羥基乙酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物催化生產(chǎn)羥基乙酸的方法。
背景技術(shù)：
羥基乙酸又名乙醇酸或甘醇酸，是一種大噸位生產(chǎn)的精細(xì)有機(jī)化工原料，具有廣泛的用途?？蓱?yīng)用于粘結(jié)劑、生產(chǎn)降解聚合物、金屬清潔劑、電鍍助劑、奶制品容器清潔劑、染色助劑、水井清潔劑、建筑、紡織、洗滌劑、制藥、農(nóng)藥、鞣革等，其衍生物，如醇酐(醚)、鹽、酯是許多精細(xì)有機(jī)化工產(chǎn)品的原料，像羥基乙酸鋅，羥基乙酸丁酯已被用于汽車底漆的生產(chǎn)。羥基乙酸在鍋爐清洗劑的生產(chǎn)中被大量使用，其中最有代表性的是羥基乙酸與甲酸的混合物用于超臨界鍋爐水垢的清除，效果很好，已成為國(guó)際上通行的標(biāo)準(zhǔn)方法。聚羥基乙酸或稱為聚乙交酯是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的線性脂肪族聚酯，是體內(nèi)可降解的最早商品化的一個(gè)聚合物產(chǎn)品，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)工程材料和高分子降解材料等許多領(lǐng)域。
目前工業(yè)上生產(chǎn)羥基乙酸主要為化學(xué)合成，方法有氯乙酸水解法，氯乙酸在強(qiáng)堿性條件下水解生成羥基乙酸，該法存在著原料消耗高、產(chǎn)品收率低、產(chǎn)品精制復(fù)雜等缺點(diǎn)，而且腐蝕和污染嚴(yán)重；甲醛羰化法，美國(guó)杜邦公司首創(chuàng)的工業(yè)化生產(chǎn)乙醇酸方法，此方法需要高壓、液體酸催化，對(duì)設(shè)備要求很高、腐蝕嚴(yán)重，最終產(chǎn)品的分離、精制復(fù)雜，催化劑不能重復(fù)利用，污染也嚴(yán)重；草酸的電解還原法，20世紀(jì)90年代實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，該法能耗高、產(chǎn)物復(fù)雜、生產(chǎn)羥基乙酸的成本高；羥基乙腈酸水解法，羥基乙腈水溶液在硫酸、磷酸、硝酸或混合酸酸存在時(shí)水解，經(jīng)萃取、脫鹽、反萃、脫水等過(guò)程得到產(chǎn)品。
有文獻(xiàn)提議應(yīng)用生物催化方法合成羥基乙酸，因?yàn)樯锎呋ň哂羞x擇性好、產(chǎn)品純度高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。專利U.S.3,940,316公開了具有腈水解活性的微生物Bacillus，Bacteridium，Micrococcus及Brevibacterium催化腈化合物水解合成酸的方法，把羥基乙腈作為其中的一個(gè)底物；專利JP 09028390報(bào)道利用Rhodococcus或Gordona腈水解酶催化羥乙腈水解合成羥基乙酸；專利U.S.6,037,155利用微生物Variovorax spp.和Arthrobacter NSSC104催化羥基腈水解合成相應(yīng)的羥基酸，把羥基乙腈列為其中的一個(gè)底物；專利U.S.6,416,980利用Acidovorax facilis 72W及其變異株的水解酶合成羥基乙酸，產(chǎn)物濃度可以累積達(dá)1M。這些酶轉(zhuǎn)化方法所顯示出的優(yōu)越性，為替代化學(xué)方法展示了良好前景，但這些反應(yīng)累積的產(chǎn)物濃度還不高，無(wú)工業(yè)化生產(chǎn)方面的報(bào)道，技術(shù)水平滿足不了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，從而提供一種生物催化生產(chǎn)羥基乙酸的方法，具體為通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887而得到的腈水解酶來(lái)催化羥基乙腈的水解反應(yīng)而得到產(chǎn)物羥基乙酸，反應(yīng)式如下
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的具體實(shí)施過(guò)程如下一、制備生物催化劑腈水解酶(1)我們從上海金山地區(qū)的含腈廢水中選育得到一個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)鑒定命名為乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)，保藏號(hào)為CGMCC No.0887。我們對(duì)該菌種進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)或上發(fā)酵罐培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；搖瓶培養(yǎng)在三角瓶中裝入適量的培養(yǎng)基(10-70％)，滅菌后接入一定量的菌種(1-10％)，在20-40℃下，旋轉(zhuǎn)式搖床(100-300rpm)中培養(yǎng)30-120小時(shí)，得到發(fā)酵液，除去瓊脂備用。
其中，搖瓶培養(yǎng)基組成(％)葡萄糖1-2.0；酵母膏0.2-1；NaCl0.05-0.15；K2HPO40.05-0.3MgSO4·7H2O0.01-0.3；瓊脂2.0，pH為7.0-7.5。
上罐發(fā)酵培養(yǎng)在種子罐中裝入適量的種子培養(yǎng)基(10-70％)，滅菌后接入一定量的菌種(1-10％)，在溫度20-40℃，攪拌轉(zhuǎn)速100-300rpm的條件下培養(yǎng)30-120小時(shí)，得到種子液，在50L-20m3的發(fā)酵罐中裝入適量的發(fā)酵培養(yǎng)基(40-70％)，實(shí)罐消毒后接入2-30％的種子液，在通氣量1∶0.2-1∶1，攪拌轉(zhuǎn)速50-400rpm，罐壓0.03-0.06MPa，溫度20-40℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)30-200小時(shí)，獲得含酶的發(fā)酵液。
其中，上罐發(fā)酵培養(yǎng)組成種子培養(yǎng)基組成(％)葡萄糖0.5-2.0；酵母膏0.2-1；KH2PO40.05-0.3；K2HPO40.05-0.3；MgSO4·7H2O0.01-0.3；pH6.5-7.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖1.0-2.5；酵母膏0.2-1；K2HPO40.03-0.1；KH2PO40.03-0.1；MgSO4·7H2O0.03-0.1；誘導(dǎo)劑I0.01-0.5；誘導(dǎo)劑II0.01-0.5；生長(zhǎng)素0.1-2；pH6.5-7.5。誘導(dǎo)劑I可以是己內(nèi)酰胺、苯甲腈、苯乙腈、β-內(nèi)酰胺、丙烯腈、正丁腈、戊二腈、煙腈、丁內(nèi)酰胺、α-氨基戊二酸內(nèi)酰胺、十二內(nèi)酰胺、己二腈、乙腈或異丁腈等，誘導(dǎo)劑II可以是尿素、蛋白胨、牛肉膏、麥芽抽提物或玉米漿等，生長(zhǎng)素可以是CoCl2、FeCl3、FeCl2、半胱氨酸、MnSO4、CuCl2、天冬酰胺、甘氨酸、ZnSO4、苯硫酚、乙硫醇、硫代乙醇酸、α，β-二硫代甘油、噻枯唑或甲硫氨酸等。
(2)發(fā)酵液再通過(guò)離心或膜過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行酶細(xì)胞收集，然后制備生物催化劑；酶細(xì)胞收集發(fā)酵液在分離因素≥5000的條件下離心，棄去上清液，細(xì)胞用去離子水洗滌后再離心，收集濃縮的濕細(xì)胞液；或者發(fā)酵液用膜過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行膜分離過(guò)濾，并加入2-3倍發(fā)酵液體積的去離子水洗滌，收集濃縮的濕細(xì)胞液，其中的膜過(guò)濾系統(tǒng)可以是中空纖維膜或卷式膜或陶瓷膜或超濾膜或Ultra-flo。
制備生物催化劑收集的含酶細(xì)胞可以直接用作催化劑；或通過(guò)常規(guī)方法如海藻酸鈉包埋法等固定化后用作催化劑；或?qū)⒓?xì)胞用常規(guī)方法如超聲波等破碎后得到的細(xì)胞破碎液用作催化劑；或離心除去細(xì)胞碎片后酶清液直接用作催化劑；或?qū)⒔?jīng)過(guò)提純得到的粗酶或純度更高的酶蛋白用作催化劑。
二、生物催化水解反應(yīng)羥基乙腈生物催化水解反應(yīng)，包括底物前處理和水解反應(yīng)兩個(gè)步驟。
(1)底物羥基乙腈的前處理用強(qiáng)堿或堿性碳酸鹽如NaOH、KOH、Ba(OH)、Ca(OH)2、Ca(HCO3)2或CaCO3)中和，或用強(qiáng)堿或弱堿陰離子樹脂如D201型、D202型或D301型，至pH6-8。
(2)羥基乙腈水溶液的生物催化水解反應(yīng)在水或磷酸緩沖液或水-有機(jī)介質(zhì)或微水有機(jī)反應(yīng)介質(zhì)中加入生物催化劑，加入底物后進(jìn)行反應(yīng)，pH控制在2.0-10.0之間，反應(yīng)溫度控制在0-70℃之間，攪拌速度控制在50-500rpm之間。反應(yīng)方式可以是批式反應(yīng)或者連續(xù)反應(yīng)，在批式反應(yīng)中底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或者流加，底物濃度控制在0-50％(wt％)。反應(yīng)時(shí)間根據(jù)反應(yīng)的具體情況而定，反應(yīng)結(jié)束時(shí)應(yīng)保證底物濃度盡可能低，這可以通過(guò)停止加料后延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，或通過(guò)補(bǔ)加少量生物催化劑反應(yīng)一段時(shí)間來(lái)達(dá)到這一要求。在連續(xù)反應(yīng)中，底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或者流加，在任何時(shí)刻都必須保證底物的加入量不會(huì)使反應(yīng)液中的底物濃度≥50％(wt％)，當(dāng)產(chǎn)物濃度累積達(dá)到一定值≥10％(wt％，以羥基乙酸計(jì))時(shí)，可以通過(guò)膜過(guò)濾系統(tǒng)一次性，或者分多次間歇地，或者連續(xù)地分流出反應(yīng)清液，優(yōu)選為連續(xù)分流方法，同時(shí)可一次性，或者間歇分多次地，或者連續(xù)地補(bǔ)加反應(yīng)介質(zhì)和底物，優(yōu)選為連續(xù)補(bǔ)加方法，并根據(jù)反應(yīng)的情況，可一次性，或者間歇分多次地，或者連續(xù)地定量補(bǔ)加新的生物催化劑，以保證反應(yīng)可連續(xù)進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式
為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，下面通過(guò)實(shí)施例予以進(jìn)一步說(shuō)明。
以下實(shí)施例中所列的百分比濃度均為重量百分比。
酶活定義1小時(shí)內(nèi)將一微克的羥基乙腈轉(zhuǎn)化為羥基乙酸所需要的酶量，單位微克/小時(shí)。
實(shí)施例1分別配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基A、B、C，其中培養(yǎng)基組成如下A葡萄糖1.0％，酵母膏0.2％，NaCl0.05％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.3％，瓊脂2.0％，pH7.0；B葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.10％，K2HPO40.15％，MgSO4·7H2O0.15％，瓊脂2.0％，pH7.2；C葡萄糖2.0％，酵母膏1.0％，NaCl0.15％，K2HPO40.30％，MgSO4·7H2O0.01％，瓊脂2.0％，pH7.5；分別將以上配制好的培養(yǎng)基以30mL一份倒入250mL的三角瓶?jī)?nèi)，于高壓滅菌器中120℃滅菌20分鐘。冷卻后分別接種乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)保藏菌種到各培養(yǎng)基中，于28℃，250rpm轉(zhuǎn)速下震蕩培養(yǎng)96小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集發(fā)酵液，取10ml，加入1ml羥基乙腈，反應(yīng)10分鐘，加入5M鹽酸溶液，終止反應(yīng)，HPLC(島津公司LC-10A)測(cè)定羥基乙酸的量，計(jì)算酶活(下同)，結(jié)果列于表1。
表1

實(shí)施例2配制種子培養(yǎng)基，其組成為葡萄糖0.6％，酵母膏0.2％，K2HPO40.05％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，pH7.2；再分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基A、B、C、D，培養(yǎng)基組成為A葡萄糖1.0％，酵母膏0.2％，K2HPO40.03％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，β-內(nèi)酰胺0.05％，尿素0.5％，CoCl20.1％，pH7.0；B葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，K2HPO40.05％，KH2PO40.10％，MgSO4·7H2O0.03％，己二腈0.2％，蛋白胨0.35％，半胱氨酸0.5％，pH7.5；C葡萄糖2.0％，酵母膏0.8％，K2HPO40.08％，KH2PO40.03％，MgSO4·7H2O0.10％，α-氨基戊二酸內(nèi)酰胺0.4％，牛肉膏0.15％，天冬酰胺1.0％，pH6.5；D葡萄糖2.5％，酵母膏1.0％，K2HPO40.10％，KH2PO40.08％，MgSO4·7H2O0.08％，煙腈0.5％，玉米漿0.05％，硫代乙醇酸2.0％，pH7.2；在5L種子罐中裝入種子培養(yǎng)基70％，滅菌后接入一茄子瓶的菌種，在溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得到種子液，在50L3的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基A、B、C、D各70％，實(shí)罐消毒后接入10％的種子液，在通氣量1∶0.5，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，罐壓0.05Mpa，溫度28℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集發(fā)酵液，測(cè)定酶活，結(jié)果列于表2。
表2

實(shí)施例3按實(shí)施例2方法得到的發(fā)酵液3.5L，分別用低溫高速離心，在6℃和15000rpm轉(zhuǎn)速下冷凍離心15分鐘或中空纖維膜過(guò)濾，流量180mLmin-1，壓力0.8Kg/cm2；或卷式膜過(guò)濾，流量180mLmin-1，壓力16Kg/cm2；或陶瓷膜過(guò)濾，流量180mLmin-1，壓力4Kg/cm2；或Ultra-flo過(guò)濾，流量180mLmin-1，壓力3Kg/cm2。并分別用4L去離子水洗滌細(xì)胞，收集濃縮細(xì)胞液，取一定量，用去離子水稀釋恢復(fù)至原發(fā)酵液體積，測(cè)定酶活，結(jié)果列于表4表2


實(shí)施例4按實(shí)施例2方法得到的發(fā)酵液，按實(shí)施例3的中空纖維膜過(guò)濾方法，洗滌濃縮4倍，得到的濃縮細(xì)胞進(jìn)一步處理，得到不同形式的具有腈水解酶活性的生物催化劑。①、取濃縮細(xì)胞與3.2％的海藻酸鈉混合均勻后，注入到0.2M的CaCL2溶液中進(jìn)行凝膠化包埋，制得固定化細(xì)胞。②、取濃縮細(xì)胞用超聲波細(xì)胞破碎器將細(xì)胞破碎，條件800W、溫度8℃、每次破碎體積100mL，累計(jì)超聲時(shí)間1小時(shí)，得到細(xì)胞破碎液。③、?、诘募?xì)胞破碎液于15000g、6℃下離心，收集上清液，得到無(wú)細(xì)胞酶液。④、?、鄣纳锨逡航?jīng)過(guò)不同濃度硫酸銨鹽析，收集20-50％飽和度下的沉淀組份，置于pH7.0的10mM磷酸鉀緩沖液中透析24小時(shí)，然后再在純水透析24小時(shí)，得到粗酶液，經(jīng)過(guò)冷凍真空干燥后即得到粗酶粉。⑤、?、艿拇置阜塾媒?jīng)過(guò)pH7.0的10mM磷酸鉀緩沖液預(yù)平衡過(guò)的DEAE-Sephadex柱處理，用含0-0.6M氯化鉀的pH7.0的10mM磷酸鉀緩沖液梯度洗脫，收集具有腈水解酶活性的組份，于純水中充分透析脫鹽，即得純度相對(duì)較高的酶溶液，經(jīng)過(guò)冷凍真空干燥后即得到酶粉。用去離子水將各種不同形式的生物催化劑恢復(fù)至初始發(fā)酵液體積，測(cè)定酶活，結(jié)果列于表3。
表3

實(shí)施例5取羥基乙腈水溶液(pH≤2.5，濃度50％)100mL，滴加濃氫氧化鈉中和，使pH≈7.0，置于低溫下備用；取相同的羥基乙腈水溶液100mL，滴加濃碳酸鈉中和，使pH≈7.0，置于低溫下備用；取相同的羥基乙腈水溶液100mL，上樹脂柱脫酸處理，φ3×50的玻璃柱裝有250mL的D202強(qiáng)堿陰離子樹脂，棄去初試階段流出液，收集底物流出液，濃度45％，pH＞6.0，置于低溫下備用；按同樣的方法用D301弱堿陰離子樹脂處理底物，收集底物流出液，濃度46％，pH＞6.0，置于低溫下備用。按實(shí)施例3的中空纖維膜過(guò)濾方法處理得到的濃縮細(xì)胞液用做催化劑，濃縮細(xì)胞用去離子水恢復(fù)至原體積，分別取100mL，各加入1％(wt％，按體積100mL計(jì)算)的前述不同方式處理過(guò)的羥基乙腈，于30℃和200rpm條件下振蕩反應(yīng)30分鐘，HPLC色譜分析(島津公司LC-10A，下同)，結(jié)果如表4。
表4

實(shí)施例6按實(shí)施例4的方法得到的細(xì)胞破碎液，用去離子水將細(xì)胞破碎液恢復(fù)至初試發(fā)酵液體積，分別取50mL，加入2％經(jīng)過(guò)氫氧化鈉中和處理的底物(wt％，按體積50mL計(jì)算)，于不同溫度，200rpm的轉(zhuǎn)速下振蕩反應(yīng)，反應(yīng)30分鐘后，HPLC色譜分析結(jié)果如表5。
表5

實(shí)施例7按實(shí)施例4的方法得到的細(xì)胞液，用去離子水將細(xì)胞液恢復(fù)至初始發(fā)酵液體積，取1.5L于2L的三口反應(yīng)瓶中，加入0.5％經(jīng)過(guò)氫氧化鈉中和處理的羥基乙腈溶液(wt％，按體積1.5L計(jì)算)，于28℃水浴溫度和150rpm攪拌轉(zhuǎn)速條件下反應(yīng)，間歇加入底物，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?.1％時(shí)，按0.5％加入底物，反應(yīng)68小時(shí)，底物累計(jì)加入次數(shù)55次，共加入412.5g，約825mL，反應(yīng)后底物殘留濃度＜0.05％，轉(zhuǎn)化率＞99.0％，終產(chǎn)物濃度3.13M，羥基乙酸產(chǎn)率＞98.0％。
實(shí)施例8按實(shí)施例4的方法得到的細(xì)胞液，用去離子水將細(xì)胞液恢復(fù)至初始發(fā)酵液體積，取2.0L于3L的三口反應(yīng)瓶中，用蠕動(dòng)泵加入經(jīng)過(guò)氫氧化鈉中和處理的羥基乙腈溶液，流加速率約8-15mLmin-1，于30℃水浴溫度和200rpm攪拌轉(zhuǎn)速條件下反應(yīng)，跟蹤分析，根據(jù)底物濃度的高低調(diào)節(jié)流加速率，保證底物濃度≤0.6％，當(dāng)產(chǎn)物累積濃度達(dá)到3.0M左右時(shí)，停止加料，繼續(xù)反應(yīng)使底物消耗完，當(dāng)?shù)孜餁埩魸舛龋?.05％時(shí)終止反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程時(shí)間56小時(shí)，轉(zhuǎn)化率＞99.0％，終產(chǎn)物濃度3.47M，羥基乙酸產(chǎn)率＞98.0％。
實(shí)施例9配制種子培養(yǎng)基，其組成為葡萄糖0.6％，酵母膏0.4％，K2HPO40.05％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，pH7.2。再配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為葡萄糖2％，酵母膏0.4％，K2HPO40.05％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，誘導(dǎo)劑I 0.1％，誘導(dǎo)劑II 0.5％，生長(zhǎng)素0.5％，罐壓0.05Mpa，pH7.2。在5L種子罐中裝入種子培養(yǎng)基70％，滅菌后接入一茄子瓶的菌種，在溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，得到種子液。在50L的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基70％，實(shí)罐消毒后接入10％的種子液，在通氣量1∶0.5，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，罐壓0.05Mpa，溫度28℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集發(fā)酵液，用平板超濾膜過(guò)濾，兩倍去離子水洗滌，收集濃縮細(xì)胞，去離子水稀釋至原體積，向帶有膜分離器的10L的反應(yīng)器中加入細(xì)胞液6L，夾套水浴溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，用蠕動(dòng)泵泵入經(jīng)過(guò)氫氧化鈉中和處理的羥基乙腈溶液，流加速率約8-15mLmin-1，HPLC色譜跟蹤分析，根據(jù)底物濃度的高低調(diào)節(jié)流加速率，保證底物濃度在0.5％左右，當(dāng)產(chǎn)物累積濃度達(dá)到15％(2.0M)左右時(shí)，停止加料，繼續(xù)反應(yīng)一段時(shí)間使底物消耗完，當(dāng)?shù)孜餄舛龋?.05％時(shí)，通過(guò)膜過(guò)濾系統(tǒng)濾出反應(yīng)清液，然后向反應(yīng)器補(bǔ)加去離子水，重新流加底物，繼續(xù)反應(yīng)，并根據(jù)反應(yīng)情況隨時(shí)補(bǔ)加濃縮細(xì)胞，如此連續(xù)反應(yīng)不斷得到含產(chǎn)物的反應(yīng)清液，得到的含有產(chǎn)物羥基乙酸的反應(yīng)清液。
本發(fā)明采用生物催化的方法生產(chǎn)羥基乙酸，利用腈水解酶將羥基乙腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸，其操作過(guò)程簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、可工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。
本發(fā)明與現(xiàn)有的方法相比，具有明顯的特點(diǎn)和進(jìn)步產(chǎn)酶菌株為從自然源篩選得到的新菌株，現(xiàn)鑒定為乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)，其保藏號(hào)為CGMCC No.0887，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的育種工作，酶活力已達(dá)10萬(wàn)單位/毫升發(fā)酵液；在催化劑生產(chǎn)中引入膜分離技術(shù)，使生產(chǎn)可以連續(xù)化進(jìn)行；反應(yīng)選擇性好、原料利用率高、對(duì)環(huán)境污染小、生產(chǎn)成本低；產(chǎn)物累積濃度高，可工業(yè)化實(shí)施生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種生物催化生產(chǎn)羥基乙酸的方法，包括通過(guò)腈水解酶來(lái)催化羥基乙腈的水解反應(yīng)而得到羥基乙酸，其特征在于所述的腈水解酶是通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887而得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該乳酪短桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件如下培養(yǎng)基組成(wt％)葡萄糖1.0-2.5；酵母膏0.2-1；K2HPO40.03-0.1；KH2PO40.03-0.1；MgSO4·7H2O0.03-0.1；誘導(dǎo)劑I0.01-0.5；誘導(dǎo)劑II0.01-0.5；生長(zhǎng)素0.1-2；pH6.5-7.5；發(fā)酵條件通氣量1∶0.2-1∶1，攪拌轉(zhuǎn)速50-400rpm，罐壓0.03-0.06MPa，溫度20-40℃，時(shí)間30-200小時(shí)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑I包括但不限于己內(nèi)酰胺、苯甲腈、苯乙腈、β-內(nèi)酰胺、丙烯腈、正丁腈、戊二腈、煙腈、丁內(nèi)酰胺、α-氨基戊二酸內(nèi)酰胺、十二內(nèi)酰胺、己二腈、乙腈或異丁腈；誘導(dǎo)劑II包括但不限于尿素、蛋白胨、牛肉膏、麥芽抽提物或玉米漿；生長(zhǎng)素包括但不限于CoCl2、FeCl3、FeCl2、半胱氨酸、MnSO4、CuCl2、天冬酰胺、甘氨酸、ZnSO4、苯硫酚、乙硫醇、硫代乙醇酸、α，β-二硫代甘油、噻枯唑或甲硫氨酸。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的腈水解酶是將發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液通過(guò)離心或膜過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行酶細(xì)胞收集而得到的。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的膜過(guò)濾系統(tǒng)是中空纖維膜或卷式膜或陶瓷膜或超濾膜或Ultra-flo。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的羥基乙腈水解反應(yīng)前先進(jìn)行前處理。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的前處理包括用強(qiáng)堿或堿性碳酸鹽中和，或用強(qiáng)堿或弱堿陰離子樹脂處理，至pH6-8。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的強(qiáng)堿包括但不限于NaOH、Ca(OH)2、Ba(OH)2、KOH；所述的堿性碳酸鹽包括但不限于CaCO3、Na2CO3、NaHCO3、Ca(HCO3)2；所述的強(qiáng)堿或弱堿陰離子樹脂包括但不限于D201型、D202型或D301型。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的水解反應(yīng)的條件如下溫度為0-70℃，pH為2-10，底物濃度控制在0-50％(wt％)。
10.一種用于生物催化生產(chǎn)羥基乙酸的乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)，其特征在于保藏號(hào)為CGMCC No.0887。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物催化生產(chǎn)羥基乙酸的方法。本方法以羥基乙腈為起始原料，以通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887而得到的具有腈水解活性的微生物酶為催化劑，在一定條件下水解反應(yīng)，得到產(chǎn)物羥基乙酸。本方法具有反應(yīng)條件溫和、工藝路線簡(jiǎn)單、無(wú)污染、可連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的顯著特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/42GK1772912SQ200410068140
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者薛建萍, 羅積杏, 李還寶, 于軍華, 朱健, 許弘, 沈寅初 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)藥研究所, 薛建萍