專利名稱：一種依據(jù)熒光素酶基因的表現(xiàn)來檢測二惡英類化合物的重組細胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要是有關(guān)于帶有一外源性熒光素酶基因(exogenousluciferase gene)的重組細胞株(recombinant cell line)，特別是經(jīng)轉(zhuǎn)染的小鼠肝癌細胞(transfected mouse hepatoma cell)Hepa1c1c7-M4P2與Hepa1c1c7-MP，其中該熒光素酶基因的上游處坐落有一當中含有可能為二惡英反應片段所特有的核苷酸序列“cacgc”與“gcgtg”的DNA片段。
背景技術(shù)：
由于文明過度的開發(fā)，許多有形或無形的污染因子一再地侵襲生活在文明世界的人類社會，而在種種污染因子中，二惡英(dioxins)被認為是現(xiàn)今對于人類和動物為最毒的化學品(chemicals)，而因此被稱之為「世紀之毒」。在近二十多年來的研究中發(fā)現(xiàn)，二惡英不但會影響人體生育、造成發(fā)育障礙、破壞免疫系統(tǒng)以及干擾正常內(nèi)分泌外，甚至還具有致癌性。然而，二惡英是一種不易分解的物質(zhì)，它會持續(xù)地累積并存在于自然界與生物體內(nèi)，而對于整個環(huán)境形成一嚴重的潛在危害。
特別地，由于二惡英在一般狀態(tài)下，甚至在熱、酸或堿的環(huán)境中都非常穩(wěn)定，當其被微量釋出到環(huán)境中并進入食物鏈后，會隨著食物鏈的攀升而使?jié)舛仍絹碓礁摺６河⒌幕瘜W結(jié)構(gòu)與人體荷爾蒙的結(jié)構(gòu)相似(E.L.Gregoraszczuk，Cad Saude Publica.，Mar-Apr，2002，18(2)453-62)，因此，當經(jīng)由食物鏈而進入人體后，一方面會形成「假性荷爾蒙」而產(chǎn)生類似荷爾蒙的作用，另一方面會影響身體內(nèi)的荷爾蒙含量，這二者皆會干擾人體原有的內(nèi)分泌機制，并嚴重影響人體的新陳代謝與干擾荷爾蒙的平衡，導致身體機能受損。
此外，二惡英也被證實是強力的促癌劑(tumor promoter)，會引起動物致癌性，包括增加大白鼠肝癌、肺部腫瘤以及皮膚腫瘤的發(fā)生率。美國環(huán)保署(US-EPA)以及世界衛(wèi)生組織(WHO)將二惡英歸類為可能人類致癌物，而國際癌癥中心(InternationalAgency for Research on Cancer，IARC)在1997年已將毒性最強的2，3，7，8-TCDD歸類為“一級人類確定治癌物”(D.B.McGregoret al.(1998)，Environ Health Perspect.，Apr；106 Suppl2755-60)。因此，如何在最短的時間內(nèi)使用一有效方法來檢測出此環(huán)境污染因子，即成為相關(guān)研究人員的一重要研究方向。
二惡英(dioxins)是一群由一或兩個氧原子與兩個苯環(huán)連結(jié)而被形成的化合物的統(tǒng)稱，且此類化合物是屬于鹵化芳族碳氫化合物(halogenated aromatic hydrocarbons，HAHs)當中的一類。二惡英可分成兩個系列的共平面三環(huán)化合物，分別為(1)多氯二聯(lián)苯二惡英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins，PCDDs)，此類化合物具有一化學通式為C12H8-nO2Cln，其中n＝1～8；以及(2)多氯二聯(lián)苯呋喃(polychlorinated dibenzofurans，PCDFs)，此類化合物具有一化學通式為C12H8-nOCln，其中n＝1～8。當苯環(huán)的八個取代位置上接上不同數(shù)目的氯原子后，PCDDs具有75種同分異構(gòu)物(isomers)，而PCDFs具有135種同分異構(gòu)物。在這210種的二惡英同分異構(gòu)物中，以2，3，7，8-四氯二苯并-ρ-二惡英(2，3，7，8-tetrachloro-dibenzo-ρ-dioxin，2，3，7，8-TCDD)的毒性是最強的，因此又被稱為“世紀之毒”。
PCDDs與PCDFs是幾乎成平面結(jié)構(gòu)的芳香族化合物，這兩類化合物的物性與化性相似，同樣具有非常穩(wěn)定的有機分子結(jié)構(gòu)，并且具有高熔點、高沸點以及不易分解的特性，因此在各種環(huán)境媒介(諸如空氣、土壤、水以及食物)中都會有此等化合物的存在(W.Parzefall(2002)，F(xiàn)ood Chem Toxicol.，40(8)1185-9)。以2，3，7，8-TCDD為例，其分子量為322，高溫燃燒需要在850℃以上才會被破壞。就其揮發(fā)性而言，它在25℃下的蒸氣壓為7.4×10-10mmHg。另外，二惡英對水的溶解度為19.3ng/L，屬親脂性，且在平常狀態(tài)下是非常穩(wěn)定的。除了被暴露于異辛烷及紫外光時其化學性質(zhì)會被改變之外，二惡英對于熱、酸、堿的穩(wěn)定性很高。
基于以上所提的特性，二惡英不論是在水中或是土壤中的揮發(fā)速度均很慢。以環(huán)境分解性來看，在模擬水生態(tài)試驗中，在100種微生物中僅有5種可分解TCDD。因此，二惡英一旦在自然界產(chǎn)生后就很難被分解，并且會持續(xù)地在自然界中累積。
二惡英的計量單位通常以介質(zhì)中含有多少毒性當量來表示。由于二惡英有75個同分異構(gòu)物，每個異構(gòu)物的毒性不一，而試驗動物對它們的反應也有一廣范圍的變化，并且被暴露于環(huán)境中的二惡英類化合物通常是由許多種化合物所構(gòu)成的混合物而非單一化合物。因此，關(guān)于二惡英的測定方式，許多學者提出所謂毒性等值數(shù)的觀點，而根據(jù)芳香族碳氫化合物接受器(arylhydrocarbon receptor，簡稱AHR)對于各個單一化合物的感受程度，并依據(jù)該等化合物對于物質(zhì)的相對毒性影響(relative toxicityinfluence)來訂定出國際毒性當量因子(International ToxicityEquivalency Factor，I-TEF)，并將毒性最強的2，3，7，8-TCDD定為1，并成為世界衛(wèi)生組織的歐洲環(huán)境健康中心(WHO EuropeanCenter for Environment & Health)暨國際化學安全計劃(Interntional Programme on Chemical Safety，IPCS)共同提出的標準化毒性當量因子(S.H.Safe(1990)，Crit.Rev.Toxicol.，21(1)51-88)。
TEF值的使用是基于以下假設(shè)(1)假設(shè)所有二惡英類化合物都只經(jīng)由AHR而造成毒性作用；(2)二惡英類化合物的毒性總和為各別化合物毒性相加成的結(jié)果；以及(3)只使用TEF來推測大部份的毒性作用。于是，2，3，7，8-TCDD的毒性當量的計算方式如下TEQ＝TEF×真實濃度(true concentration)在國際上，二惡英類化合物的毒性當量是以I-TEQ(International Toxic Equivalency)來表示，其中空氣中的二惡英濃度可以ng-TEQ/Nm3來表示，而土壤中的二惡英濃度則以pg-TEQ/g來表示。若單純只計算介質(zhì)中所含有的二惡英數(shù)量，可以采用重量表示法，常用的有pg/g、ppt、ppb等。例如，pg/kg-bw是指每公斤體重含有多少pg的二惡英。世界衛(wèi)生組織建議每人每日的二惡英容許攝取量為1～4pg/kg-bw，若以體重60公斤的成年人來說，每天最高的容許攝取量為240pg的二惡英。
在過去20年來，二惡英的化學檢驗方法已被發(fā)展得相當完善，這當中主要是利用氣相層析(gas chromatography)加上電子捕獲檢測(electron capture detection)或是質(zhì)譜儀(massspectrometry)，而分析步驟主要包含有樣品的采集、萃取、凈化、分離以及定量測定(C.Rappe(1991)，IARC Sci Publ.，1081-426；De Jong APJM and AKD.Liem(1993)，TrandsAnal Chem.，12115-124)?；瘜W檢測方法能精準地將二惡英的所有成分濃度予以分析出來，但是在整個檢測過程中需要耗費許多時間和金錢成本，而不利于用在日常的例行性檢驗上。
而后，于本領(lǐng)域中發(fā)展出另一類以免疫化學方法為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(Zajicek JL，Application of enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA) for measurement ofpolychlorinated biphenyls from hydrophobic solutionsextracts of fish and dialysates of semipermeable membranedevices.InVan Emon JM et al.，editors.Environmentalinnunochemical methods，chapter 26.American ChemicalSociety，1996，pp.307-325)。此種技術(shù)是根據(jù)抗體與其對應的抗原之間會存在有一極佳的專一性與親和性，因此可利用針對二惡英化學結(jié)構(gòu)的半抗原(hapten)來產(chǎn)生二惡英-專一性抗體(Y.Sugawara et al.(1998)，Anal Chem.，70(6)1092-1099)，或是能夠?qū)Ｒ恍缘乇孀R會與二惡英接合的AHR的抗體，并通過測定轉(zhuǎn)化的AHR的程度來辨識外來二惡英的濃度(A.Poland et al.(1991)，Mol Pharmacol.，39(4)435)。然而，此類檢測方法在實驗操作上是相當復雜的。
近年有人以這種免疫分析法為基礎(chǔ)而建立生物感應器(biosensor)技術(shù)(S.Bender et al.(1998)，Environ Sci Technol.，32788-797)，其中以抗體配合適當檢測系統(tǒng)來構(gòu)成免疫反應型生物感應器，并通過檢測反應過程中的質(zhì)量變化來定量樣品中的抗原濃度。例如，經(jīng)由化學鍵將抗體有效固定于一金電極表面上，存在于樣品內(nèi)的抗原和被固定的抗體產(chǎn)生親合性結(jié)合，再經(jīng)由光學(光纖及表面電漿共振)或振蕩晶體(石英振蕩晶體以及表面彈性波裝置)等訊號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)來進行檢測，由此，可有效定量樣品中的抗原濃度。此外，也可通過在抗體上作處理，使其在和二惡英結(jié)合后能放出電化學訊號(electrochemical signal)，再由訊號來判讀二惡英數(shù)量。但是，這方面的技術(shù)還不是非常成熟，目前也未被廣泛利用。
為了研發(fā)出更快速且方便的檢測方式，也隨著人們?nèi)諠u了解二惡英在生物體內(nèi)的致毒機制，以生物反應為基礎(chǔ)的生物檢測方法(bioassays)逐漸受到重視。
當一生物體被暴露于含有二惡英的環(huán)境內(nèi)時，它會產(chǎn)生許多生化、生理上的變化，而通過觀察這些變化可以判斷二惡英的存在。在二惡英的致毒機制中被最為廣泛研究的是AHR傳遞路徑(AHR pathway)(O.Hankinson(1995)，Annu Rev PharmacolToxicol.，35307-40)。
當二惡英進入細胞后，它會經(jīng)由AHR傳遞路徑中的一系列的訊息傳遞而進入至細胞核，最后會通過和AHR核轉(zhuǎn)運蛋白(AHRnuclear translocator，ARNT)的結(jié)合而被帶到DNA上的二惡英反應片段(dioxin response elements，DREs)處，進而調(diào)控基因作用。在這方面，細胞色素P4501A(cytochrome P450 1A，CYP1A)基因是一個著名的“活體內(nèi)生物標記(in vivo biomarker)”，不管是在人類或老鼠的細胞中，CYP1A基因會經(jīng)由AHR傳遞路徑而被引發(fā)大量表現(xiàn)(M.Merchant et al.(1992)，Arch Biochem Biophys.，298(2)389-94；J.P.Vanden-Heuvel et al.(1993)，Carcinogenesis.，142003-2006；Denison MS，Withlock JP Jr.(1995)，Journal of Biological Chemistry，1995；270(31)18175-8)。
據(jù)報導，存在于許多不同細胞的基因中的DREs已被找出(Z.-W.Lai et al.(1996)，Chemico-Biological Interaction，10097-112)，而且在該等DREs中存在有一些特定的核苷酸序列(諸如cacgc或gcgtg)，它們在二惡英的辨識上扮演一重要角色(J.Corchero et al.(2001)，Pharmacogenetics.，111-6)。
在生物檢測方法中，CALUX[化學品-活化的熒光素酶表現(xiàn)(chemical-activated luciferase expression)]分析法是近年來很受重視的一種方法，它的主要技術(shù)概念是在DREs的后面接上報告基因(reporter gene)。
1993年Hans Postlind建構(gòu)了2個人類CYP1-熒光素酶質(zhì)粒，他從人類的CYP1基因前面截取出啟動子(promoter)與5′-側(cè)翼序列(flanking sequence)片段，并予以分別放入至一帶有熒光素酶(luciferase)的質(zhì)粒中，再將建構(gòu)好的重組型質(zhì)粒送入至人類101L細胞中，之后加入不同濃度的TCDD來刺激被轉(zhuǎn)染的細胞并測量熒光素酶的活性，藉此，二惡英的濃度可通過所檢測到的熒光表現(xiàn)而被測定出(H.Postlind et al.(1993)，Toxicol Appl Pharmacol.，118(2)255-262)。
總括來說，在目前的二惡英檢測方法中，以化學分析方法最為精準，但是缺點為操作過程復雜、檢驗時間長且所需的成本極高。至于以免疫化學方法為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸收分析，它具有生物檢測法的專一性以及靈敏度優(yōu)點，但是在操作上還是相當繁瑣。而以免疫分析法為基礎(chǔ)所建立出的生物感應器，它在整個技術(shù)層面上還不夠成熟而未被廣泛利用。再就生物檢測法而論，除了具有毒理上專一性之外，它比化學方法更為省時且成本低廉，并可靈敏地、專一性地檢測出二惡英類化合物的TEQ，且適用于大量的環(huán)境樣品的檢測。因此，發(fā)展出一適用于生物檢測法的重組細胞株來供二惡英類化合物的有效檢測，已成為本領(lǐng)域中的相關(guān)研究人員所致力的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
于是，在第一個方面，本發(fā)明提供一種用于克隆對于二惡英具反應性的DNA片段的引物對，其包括一正向引物(forwardprimer)與一反向引物(reverse primer)，該正向引物具有一如序列辨識編號1或序列辨識編號3所示的核苷酸序列，而該反向引物具有一如序列辨識編號2或序列辨識編號4所示的核苷酸序列正向引物15’-cagagagcacctgcaaaaca-3’(序列辨識編號1)反向引物1
5’-ggctacaaagggtgatgctt-3’(序列辨識編號2)正向引物25’-ctcgagagggcaggtgaaggtgttag-3’(序列辨識編號3)反向引物25’-aagcttaagtgaagagtgttctctagg-3’(序列辨識編號4)。
于是，當使用CYP1A1基因序列作為模板(template)并使用依據(jù)本發(fā)明的引物對來進行PCR反應時，可以得到一帶有可能為二惡英反應片段(DREs)所特有的核苷酸序列(cacgc與gcgtg)的DNA片段。
上述DNA片段，其具有的核苷酸序列是下列之一(1)實質(zhì)上對應于一通過使用CYP1A1基因序列作為模板以及使用根據(jù)上述引物對來進行PCR反應而被擴增出的DNA片段所具有的核苷酸序列；(2)實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號5所示的核苷酸序列；(3)實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號6所示的核苷酸序列；(4)實質(zhì)上對應于一與(1)項中所述的DNA片段的核苷酸序列或(2)或(3)項中所述的核苷酸序列相互補的核苷酸序列。
該DNA片段接而可被并入至一個具有一報告基因(例如熒光素酶基因)的載體內(nèi)。因此，在第二個方面，本發(fā)明提供一種重組載體，其具有一報告基因，以及一如上所述的DNA片段位于該報告基因的上游處；該報告基因是熒光素酶基因。
上述對應于一如序列辨識編號5所示的核苷酸序列的重組載體是重組載體M4P2。
上述對應于一如序列辨識編號6所示的核苷酸序列的重組載體是重組載體MP。
該重組載體進而可被用來轉(zhuǎn)染一選定的宿主細胞。因此，在第三個方面，本發(fā)明提供一種重組細胞株，它是通過以一如上所述的重組載體來轉(zhuǎn)染一宿主細胞而被形成者。
該被用來轉(zhuǎn)染的宿主細胞是小鼠肝癌細胞Hepa-1C1C7。
該重組細胞株是以寄存編號PTA-6089被寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP或其次培養(yǎng)后代。
以寄存編號PTA-6090寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2或其次培養(yǎng)后代。
依據(jù)本發(fā)明的重組細胞株及其次培養(yǎng)后代可被應用于一種用于檢測一環(huán)境樣品中的二惡英類化合物的生物分析，其中一含有二惡英類化合物的樣品被接觸以培養(yǎng)中的該重組細胞株歷時一段時間，而致使位在該重組細胞株內(nèi)的該重組載體所具有的報告基因被表現(xiàn)，由此被生成的基因產(chǎn)物(例如熒光素酶)會產(chǎn)生一可檢測的現(xiàn)象(例如發(fā)光強度)，該可檢測的現(xiàn)象即可作為定性與定量二惡英類化合物的存在的指標。


下面結(jié)合附圖及實施例來對本發(fā)明進行詳細說明，所以本發(fā)明在上述以及其它目的與特征，可借由參照下文的描述、隨文檢附的權(quán)利要求書和伴隨的圖式而變得更為明顯，附圖中圖1顯示質(zhì)粒yT&A克隆載體(2728bp)的架構(gòu)，其中具有氨芐青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene，AP)、T7啟動子(T7promoter)、β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase gene，lacZ)以及多克隆位點(multiple cloning site，MCS)；圖2顯示pGL2-啟動子載體(pGL2-promoter vector)(5790bp)的架構(gòu)，其中具有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、SV40啟動子、熒光素酶基因(luc)以及多克隆位點等；圖3顯示pGL3-基本載體(pGL3-basic vector)(4818bp)的架構(gòu)，其中具有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、熒光素酶基因(luc+)以及多克隆位點等；圖4顯示一通過使用自小鼠巨噬細胞J774A.1分離與純化出的染色體DNA(chromosomal DNA)來作為模板，并使用依據(jù)本發(fā)明的正向引物1與反向引物1來進行PCR反應所擴增出的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，其中該PCR產(chǎn)物全長為479bp，并且當中含有7個可能為二惡英反應片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga與gcgtg(被框起來的部分)；圖5顯示一通過使用自小鼠巨噬細胞J774A.1分離與純化出的染色體D NA來作為模板，并使用依據(jù)本發(fā)明的正向引物2與反向引物2來進行PCR反應所擴增出的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，其中該PCR產(chǎn)物全長為1503bp，并且當中含有12個可能為二惡英反應片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga與gcgtg(被框起來的部分)；圖6顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2在以100pM的二惡英(2，3，7，8-TCDD)予以處理歷時一段不同的時間(5、10、15與20小時)后所測得的光強度結(jié)果；圖7顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP在以100pM的二惡英(2，3，7，8-TCDD)予以處理歷時一段不同的時間(5、10、15與20小時)后所測得的光強度結(jié)果；圖8顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2在以不同濃度的二惡英(2，3，7，8-TCDD)予以處理歷時15小時后所測得的光強度結(jié)果；圖9顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP在以不同濃度的二惡英(2，3，7，8-TCDD)予以處理歷時15小時后所測得的光強度結(jié)果；圖10顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2在以不同濃度的二惡英(2，3，7，8-TCDD)、兩種濃度的標準樣品S1與S2以及飛灰樣品29予以處理歷時15小時后所測得的光強度結(jié)果；以及圖11顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP在以不同濃度的二惡英(2，3，7，8-TCDD)、兩種濃度的標準樣品S1與S2以及飛灰樣品29予以處理15小時后所測得的光強度結(jié)果。
小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP與Hepa1c1c7-M4P2已于公元2004年6月18日被寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，P.O.Box1549，Manassas，VA 20108，USA)，寄存編號分別為PTA-6089與PTA-6090。
具體實施例方式
先前的研究顯示，當二惡英進入細胞后會和帶有兩個熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)的芳族烴受體(aromatichydrocarbon receptor，AHR)結(jié)合而形成復合物，而該復合物在進入細胞核之后會分離，并通過一連串的下游分子的作用后輾轉(zhuǎn)傳遞至DNA上，并與DNA上所存在的二惡英反應片段(DRE)結(jié)合，而使得受該二惡英反應片段調(diào)控的基因被大量地表現(xiàn)，進而影響到整個生物體的生理系統(tǒng)。針對此傳遞路徑的特色，申請人嘗試構(gòu)建含有二惡英反應片段(DRE)和報告基因的重組載體(recombinant vector)，并將所形成的重組載體送入一感受態(tài)的宿主細胞(competent cell)內(nèi)，以建立出帶有該重組載體的重組細胞株。
由此所得到的重組細胞株可被應用于一種用于檢測一取自于自然環(huán)境的樣品中的二惡英類化合物的生物分析。首先，使用不同濃度的二惡英標準品來處理該重組細胞株，以建立出一有關(guān)二惡英濃度相對于該重組細胞株所帶有的重組載體上所具有的報告基因的表現(xiàn)能力之間的關(guān)聯(lián)性。
而后，從一自然環(huán)境(例如土壤，水源，供食用的肉類、魚類、蔬果等等，工廠或焚化爐的煙道、底灰、底泥等等)取得一可能含有二惡英類化合物(dioxin-like compounds)的原始樣品(original sample)，并依照后文所描述的各種預處理(preliminarytreatment)來作適當處理，而得到一要被試驗的待測樣品(analyteunder test)。
之后，令該待測樣品接觸該重組細胞株歷時一段時間，并測定該重組細胞株所帶有的重組載體上所具有的報告基因的表現(xiàn)結(jié)果。將由此所得到的測定結(jié)果拿來與上面所建立出的二惡英濃度相對于該報告基因的表現(xiàn)能力之間的關(guān)聯(lián)性作一比對，就可推算出該原始樣品內(nèi)所含有的二惡英數(shù)量。
依據(jù)本發(fā)明，CYP1A1基因是一適于作為尋找有用的二惡英反應片段(DRE)的來源，因此，申請人依據(jù)NCBI網(wǎng)址中所登錄的寄存編號(accession number)AF210905[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因，啟動子區(qū)域與部分序列]當中所示的核苷酸序列以及寄存編號X01681[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因]當中所示的核苷酸序列，而設(shè)計出針對小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列中的二惡英反應片段(DREs)的下面兩組引物對(primer pairs)正向引物15’-cagagagcacctgcaaaaca-3’(序列辨識編號1)反向引物15’-ggctacaaagggtgatgctt-3’(序列辨識編號2)
正向引物25’-ctcgaggagggcaggtgaaggtgttag-3’(序列辨識編號3)反向引物25’-aagcttaagtgaagagtgttctctagg-3’(序列辨識編號4)于是，當以小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列作為模板(template)時，使用由正向引物1與反向引物1所構(gòu)成的第一引物對(first primer pair)來進行聚合酶鏈式反應(PCR)，可以得到一為479bp的PCR產(chǎn)物(序列辨識編號5)(參見圖4)，而使用由正向引物2與反向引物2所構(gòu)成的第二引物對(second primer pair)來進行PCR，可以得到一為1503bp的PCR產(chǎn)物(序列辨識編號6)(參見圖5)。這兩個PCR產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)分別帶有7與12個可能為二惡英反應片段所特有的核苷酸序列(cacgc與gcgtg)。于是，本發(fā)明使用這兩個PCR產(chǎn)物來進一步構(gòu)建所欲的重組載體。
依據(jù)本發(fā)明，可以于重組載體的克隆過程中使用中介細胞(intermediate cells)(例如，大腸桿菌細胞)來大量擴增上述兩個PCR產(chǎn)物，而這當中所涉及到的實驗方法與材料是熟悉此項技術(shù)人士參考本領(lǐng)域中所詳知的教科書就可據(jù)以實施者。例如，參見，Sambrook J，Russell DW(2001) Molecular CloningaLaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York。
適用于插入上述任一PCR產(chǎn)物的載體包含一個供在適當?shù)臈l件下篩選該載體的標記基因(marker gene)或報告基因(reportergene)。
可用于本發(fā)明的標記基因包括，例如，用于真核細胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶基因以及G418或新霉素(neomycin)抗性基因，以及用于大腸桿菌與其它細菌培養(yǎng)物的氨芐青霉素(ampicilin)、鏈霉素(streptomycine)、四環(huán)素(tetracycline)或康那霉素(kanamycine)抗性基因。
適用于本發(fā)明的載體可以含有其它表現(xiàn)控制要素，例如一轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription starting site)、一轉(zhuǎn)錄終止位點(transcription termination site)、一核糖體結(jié)合位點(ribosomebinding site)、一RNA剪接位點(RNA splicing site)、一個聚腺苷酸化位點(polyadenylation site)以及一個轉(zhuǎn)譯終止位點(translation termination site)、多克隆位點(multiple cloningsite，MCS)。適用于本發(fā)明的載體還可包含另外的調(diào)控要素，例如轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯的增強子序列(enhancer sequences)等。適用于本發(fā)明的載體也可包含一編碼分泌信號(secretion signal)的核酸序列。這些序列是熟悉此項技術(shù)者已知的。
在本發(fā)明的一個較佳具體例中，一帶有熒光素酶基因(luclluc+)以作為報告基因的載體被使用，這包括，但不限于，pGL2-啟動子載體與pGL3-基本載體。
在本發(fā)明的一個較佳具體例中，該479bp的PCR產(chǎn)物在經(jīng)過使用中介細胞的增殖處理后被并入至pGL2-啟動子載體內(nèi)，而得到一重組載體M4P2。
在本發(fā)明的另一較佳具體例中，該載體1503bp的PCR產(chǎn)物在經(jīng)過使用中介細胞的增殖處理后被并入至pGL3-基本載體內(nèi)，而得到一重組載體MP。
上述兩個重組載體進而可被轉(zhuǎn)移至一感受態(tài)的宿主細胞內(nèi)，以生成所欲的重組細胞株。在本發(fā)明的一個較佳具體例中，該感受態(tài)的宿主細胞是小鼠肝癌細胞Hepa-1C1C7。在以該重組載體M4P2與該重組載體MP來分別轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細胞Hepa-1C1C7后，得到小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2以及小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP。
小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP與Hepa1c1c7-M4P2已先后于公元2004年5月7日與2004年5月14日被寄存于臺灣的食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(臺灣300新竹市食品路331號)，寄存編號分別為BCRC 960207與BCRC 960208。此二細胞株也有依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，于公元2004年6月18日被寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，寄存編號分別為PTA-6089與PTA-6090。
申請人進一步確認上述細胞株對于二惡英的反應能力，其中使用2，3，7，8-TCDD作為測試化合物并變化測試濃度與反應時間后，而成功地建立出此二細胞株內(nèi)所帶有的重組載體上所具有的熒光素酶基因的表現(xiàn)能力相對于二惡英濃度的關(guān)聯(lián)性。于是，依據(jù)本發(fā)明該重組細胞株可供應用于通過生物分析法(bioassay)來定性地或定量地檢測存在于一從自然環(huán)境(例如土壤，水源，供食用的肉類、魚類、蔬果等等，工廠或焚化爐的煙道、底灰、底泥等等)所收集到的樣品內(nèi)的二惡英類化合物。
本發(fā)明將就下面實施例來作進一步說明，但應了解的是，該實施例僅為例示說明用，而不應被解釋為本發(fā)明實施上的限制。
實施例一般實驗方法與材料本發(fā)明中所采用的實驗方法以及用于DNA克隆(DNAcloning)的相關(guān)技術(shù)，是參考本領(lǐng)域中所詳知的教科書SambrookJ，Russell DW(2001)Molecular Cloninga LaboratoryManual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，例如使用限制酶的DNA剪切反應(DNA cleavage reactionby restriction enzymes)、使用T4 DNA黏接酶(ligase)的DNA黏接反應(DNA ligation with T4 DNA ligase)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)、瓊脂糖凝膠電泳法(agarose gelelectrophoresis)、硫酸十二酯鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法(plasmid transformation)等，而這些技術(shù)都是熟悉此項技術(shù)人士可根據(jù)本身的專業(yè)素養(yǎng)來實施者。例如，于下面實施例中所使用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法是以經(jīng)氯化鈣(CaCl2)處理的感受態(tài)細胞(calcium chloride-treated competent cell)來進行。
少量質(zhì)粒(plasmid)的制備、大量質(zhì)粒的制備以及DNA片段的純化回收是分別使用Plasmid Miniprep Purification Kit(Bertec Enterprise Co.，Ltd.)、Plasmid Midiprep kit(VIOGENE)和Gel Elution Kit(VIOGENE)等商業(yè)化純化試劑盒來進行。
I、實驗材料1.二惡英[2，3，7，8-四氯二苯并-ρ-二惡英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-ρ-dioxin，2，3，7，8-TCDD)(購自WellingtonLaboratories，Inc.)溶液，原始濃度為10μg/ml，在實驗之前使用二甲亞(DMSO)予以稀釋成不同濃度備用；2.二惡英標準品[含17種二惡英/呋喃化合物(dioxin/furancompounds)2，3，7，8-TCDD、2，3，7，8-TCD F、1，2，3，7，8-PeCDD、1，2，3，7，8-PeCDF、2，3，4，7，8-PeCDF、1，2，3，4，7，8-HxCDD、1，2，3，6，7，8-HxCDD、1，2，3，7，8，9-HxCDD、1，2，3，4，7，8-HxCDF、1，2，3，6，7，8-HxCDF、1，2，3，7，8，9-HxCDF，2，3，4，6，7，8-HxCDF、1，2，3，4，6，7，8-HpCDD、1，2，3，4，6，7，8-HpCDF、1，2，3，4，7，8，9-HpCDF、OCDD、OCDF]是由正修科技大學超微量中心所提供；3.下列實驗材料是購自波仕特生物科技股份有限公司(Protech Technology Enterprise Co.Ltd.)TBE緩沖液[TBEbuffer，Tris/硼酸鹽(borate)/EDTA]、PBS緩沖液(PBS buffer，NaCl/KCl/Na2HPO4/KH2PO4，pH7.4)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、酚/氯仿/異戊醇(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)、5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside，X-Gal)；4.下列實驗材料是購益生生技開發(fā)股份有限公司(YeasternBiotech Co.，Ltd.)YEA DNA聚合酶(YEA DNA polymerase)，10倍緩沖液(10X buffer)；5.培養(yǎng)基最低必需培養(yǎng)基(Minimum essential medium，MEM)是購自BioWest；杜貝可氏改良的依格氏培養(yǎng)基(Dulbecco’sModified Eagles Medium，DMEM)是購自GibcoBRL；α-最低必需培養(yǎng)基(Alpha-minimum essential medium，α-MEM)是購自BioWest，LB肉湯培養(yǎng)基(LBBroth)是購自Athena EnzymeSystem Inc.；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrition Agar)是購自BectonDickson Inc.；胎牛血清Fetal Bovine serum(FBS)是購自Hyclone Inc.；以及馬血清(horse serum，HS)是購自BioWest；6.細菌培養(yǎng)用抗生素氨芐青霉素(ampicillin)(A1593)是購自Sigma；青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin)是購自Invitrogen Inc.；以及GENETICIN(G-418硫酸鹽)是購自GibcoBRL；7.限制酶(restriction enzymes)KpnI與BglII是購自NewEngland Biolabs，Ltd.(NEB)，HindII是購自Promega，而XhoI是購自GibcoBRL；8.Luciferase Assay System(Cat#1500)是購自PromegaCooperation；pcDNA是購自Invitrogen Cooperation；GenePORTERTM2 Transfection Reagent是購自GST Inc.；SeaKem LE瓊脂糖(agarose)是購自FMC Bioproducts Inc.；胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)是購自GibcoBRL；二甲亞砜
(DMSO)與溴化乙錠(EtBr，E8751)是購自Sigma；1Kb DNA梯(DNA Ladder)與裝填染料緩沖液(loading dye buffer)是購自Biolabs Inc.；9.下列實驗材料是購自益生生技開發(fā)股份有限公司(Yeastern Biotech Co.，Ltd.)大腸桿菌菌株JM109(E.colistrain JM 109)，它的培養(yǎng)與儲存方式是根據(jù)供貨商的產(chǎn)品說明書；yT&A Cloning Vector Kit，包含有yT&A克隆載體、接合緩沖液A(ligation buffer A)、接合緩沖液B、T4DNA連接酶(ligase)，其中yT&A克隆載體(2728bp)的架構(gòu)如圖1所示，并具有氨芐青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene，AP)、T7啟動子(T7promoter)、β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase gene，lacZ)以及多克隆位點(multiple cloning site，MCS)；10.下列載體是購自Promega CooperationpGL2-啟動子載體(pGL2-promoter vector)(5790bp)的架構(gòu)如圖2所示，并具有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、SV40啟動子、熒光素酶基因(luc)以及多克隆位點等；以及pGL3-基本載體(pGL3-basicvector)(4818bp)的架構(gòu)如圖3所示，并具有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、熒光素酶基因(luc+)以及多克隆位點等；II、細胞株與培養(yǎng)條件被用來進行轉(zhuǎn)染作用的宿主細胞是小鼠肝癌細胞(mousehepatoma cell)Hepa-1C1C7以及小鼠巨噬細胞(mousemacrophage cell)J774A.1，它們皆是購自臺灣的食品工業(yè)發(fā)展研究所(Food Industry Research and Development Institute，F(xiàn)IRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection andResearch Center，BCRC)(臺灣300新竹市食品路331號)，寄存編號為BCRC 60104與BCRC60140，并各自依據(jù)下面所述方式來作繼代培養(yǎng)(subculture)
1.Hepa-1C1C7細胞將細胞混合以添加有10％胎牛血清(FCS)的不含核苷酸的α-MEM(nucleotide-free Alpha minimum essential mediumsupplemented with 10％FCS)，并將所形成的細胞懸浮液加入至培養(yǎng)皿內(nèi)，并在培養(yǎng)條件被設(shè)定為37℃與5％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當培養(yǎng)皿底部的面積有80至90％被培養(yǎng)的細胞所覆蓋時，移除培養(yǎng)液并以3至5ml的PBS緩沖液(pH 7.4)清洗細胞，繼而加入1ml的胰蛋白酶-EDTA以使細胞自培養(yǎng)皿的底部脫離。之后，加入新鮮的培養(yǎng)液來中和胰蛋白酶活性并以移液管(pipette)反復沖吸培養(yǎng)液以打散細胞，然后將所形成的細胞懸浮液分配至培養(yǎng)皿(直徑10cm)中，并在培養(yǎng)條件被設(shè)定為37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
2.J774A.1細胞將細胞加入至含有4mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)并被調(diào)整至含有1.5g/L的碳酸鈉以及4.5g/L的葡萄糖且添加有10％胎牛血清的杜貝可氏改良的依格氏培養(yǎng)基(DMEM)中，并將所形成的細胞懸浮液加入至培養(yǎng)皿內(nèi)，并在培養(yǎng)條件被設(shè)定為37℃與5％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當培養(yǎng)皿底部的面積有80至90％被培養(yǎng)的細胞所覆蓋時，移除培養(yǎng)液并以3至5ml的PBS緩沖液(pH7.4)清洗細胞，然后以刮刀輕輕劃過培養(yǎng)皿的底部以使細胞自培養(yǎng)皿的底部脫離。之后，加入新鮮的培養(yǎng)液并以移液管(pipette)反復沖吸培養(yǎng)液以打散細胞，然后將所形成的細胞懸浮液分配至培養(yǎng)皿(直徑10cm)中，并在培養(yǎng)條件被設(shè)定為37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
III、源自不同自然來源的含有二惡英的樣品的前處理(Preliminary treatments of dioxin-containing samples fromdifferent natural sources)
1.環(huán)境樣品的前處理環(huán)境樣品主要是取自于下列來源的樣品土壤(soil)，水源，工廠或焚化爐的煙道、飛灰、底灰以及底泥等。
(1)萃取步驟(extraction step)稱取一適量的樣品并予以放入至一已清洗過的圓筒濾紙(Thimble Filter)(Toyo Roshi Kaisha，Ltd.)內(nèi)，然后將圓筒濾紙放入索氏萃取器回流管(soxhlet)中，接著予以加入2g的無水硫酸鈉，并另外取150ml的甲苯置于一個250ml的平底燒瓶中，并對樣品進行回流式萃取處理(extraction treatment with refluxing)歷時24小時。之后，利用減壓濃縮將甲苯萃取液濃縮至大約1ml以供后續(xù)處理。
(2)酸洗步驟(acid-wash step)將步驟(1)所得到的甲苯萃取物加入至一個具有一鐵氟龍內(nèi)櫬瓶蓋的24ml樣品瓶中，繼而加入7ml的正己烷(n-hexane)并振蕩該樣品瓶歷時大約5秒，然后加入4ml的濃硫酸(98％)予以酸洗并劇烈振蕩該樣品瓶歷時大約20秒。之后，進行離心(2000rpm，2分鐘)以產(chǎn)生分層并收集硫酸酸層，而正己烷層則再以硫酸予以酸洗直到硫酸酸層變?yōu)榘咨?不超過3次酸洗)。將正己烷層收集于一個50ml樣品瓶中。各硫酸酸層再以7ml的正己烷逐一萃取兩次。將所有的正己烷層收集于該50ml樣品瓶中，并予以減壓濃縮至大約1ml以供后續(xù)處理。
(3)使用多層硅膠管柱的凈化步驟(purification step using amulti-layered silica gel column)于一個多層硅膠管柱(直徑0.5cm，長20cm)的尖形底部裝填以玻璃棉(glass wool)，繼而依序地填入0.5g硅膠(silica gel)、0.5g硝酸銀硅膠(AgNO3-silica gel)、0.5g硅膠、0.5g氫氧化鈉硅膠(NaOH-silica gel)、0.5g硅膠、5g硫酸硅膠(sulfuric acid-silicagel)、0.5g硅膠及0.5g無水硫酸鈉(anhydrcus sodium sulfate)，并于充填(packing)時以玻璃棒予以壓實。以30ml正己烷預洗(pre-wash)充填好的管柱并丟棄洗液。
將步驟(2)中所得的1ml酸洗產(chǎn)物移入至預洗過的多層硅膠管柱中，待酸洗產(chǎn)物全部進入至管柱內(nèi)后，以1ml的正己烷來清洗含有酸洗產(chǎn)物的樣品瓶共計3次，并將正己烷洗液再移入至該管柱中。接著，以5ml的正己烷來洗脫(eluting)管柱共計兩次，繼而以120ml的正己烷洗脫管柱，并將洗脫物(eluate)收集至一個300ml的錐形瓶中。以氮氣吹掃(nitrogen purge)將所收集的洗脫物(eluate)吹至近干。至此所得到的凈化產(chǎn)物里面含有二惡英化合物(dioxin compounds)、非平面型多氯聯(lián)苯化合物(non-planarpolychlorinated biphenyl compounds)以及平面型多氯聯(lián)苯化合物(planar polychlorinated biphenyl compounds)。
若欲分析該凈化產(chǎn)物里面所含上述三類化合物的總濃度，可將該凈化產(chǎn)物溶于DMSO內(nèi)，并使用將于后文中所描述的生物分析方法來進行此等化合物的總濃度檢測。
而若欲分析該凈化產(chǎn)物里面所含二惡英化合物、非平面型多氯聯(lián)苯化合物以及平面型多氯聯(lián)苯化合物的各別濃度，該凈化產(chǎn)物須再進行下面使用酸性氧化鋁管柱與活性碳管柱凈化步驟，俾以將二惡英化合物、非平面型多氯聯(lián)苯化合物以及平面型多氯聯(lián)苯化合物予以分開，而后再以將于后文中所描述的生物分析方法來進行濃度分析。
(4)使用酸性氧化鋁管柱的凈化步驟于一酸性氧化鋁管柱(acid aluminum oxide column)(直徑0.5cm，長20cm)的尖形底部填入玻璃棉，之后依序地填入1g硅膠、6g酸性氧化鋁、1g硅膠以及1g無水硫酸鈉。以20ml正己烷來預洗已充填好的管柱并丟棄洗液。
從步驟(3)中的多層硅膠管柱被洗脫出的洗脫物在被氮氣吹掃至成為1ml后，予以移入預洗過的酸性氧化鋁管柱中，然后以5ml的正己烷進行洗脫共計兩次，繼而以90ml的正己烷洗脫管柱，并將洗脫物(eluate)收集至一個150ml的錐形瓶中。至此所得到的洗脫物里面含有非平面型多氯聯(lián)苯化合物。
若分析該洗脫物所含有的非平面型多氯聯(lián)苯化合物的濃度，可將該洗脫物以氮氣吹掃至近干，然后予以溶于DMSO內(nèi)，并使用將于后文中所描述的生物分析方法來進行化合物的濃度分析。
在完成正己烷洗脫后，酸性氧化鋁管柱再以20ml的二氯甲烷/正己烷(methylene chloride/n-hexane)(20/80，v/v)進行洗脫，并將洗脫物收集于一個50ml的樣品瓶中，緩慢地以氮氣吹掃至近干，至此所得到的洗脫物里面含有二惡英化合物與平面型多氯聯(lián)苯化合物的混合物。將該洗脫物溶于1ml正己烷并裝于一樣品瓶內(nèi)，以便進行下面的活性碳管柱凈化步驟。
(5)使用活性碳管柱的凈化步驟于一活性碳/硅藻土(activated carbon/celite)管柱(直徑0.5cm，長20cm)的尖形底部填入玻璃棉，之后依序地填入0.5g硅膠、0.5g活性碳/硅藻土(18/82，v/v)以及0.5g硅膠，于充填時以玻璃棒予以壓實。之后，充填好的管柱依序地以各為5ml的甲醇(methanol)、甲苯(toluene)、二氯甲烷/甲醇/甲苯(75/20/5，v/v/v)、環(huán)己烷/二氯甲烷(cyclohexane/methylenechloride)(50/50，v/v)以及正己烷予以預洗并將洗液丟棄。
將上述步驟(4)中從經(jīng)過二氯甲烷/正己烷洗脫后所得到的1ml正己烷溶液移入至該活性碳/硅藻土管柱中，待該正己烷溶液全部進入至管柱內(nèi)后，以1ml的正己烷來清洗樣品瓶共計3次，并將正己烷洗液再移入至該管柱中。
接著，以2ml的環(huán)己烷/二氯甲烷(50/50，v/v)洗脫該活性碳/硅藻土管柱共計4次，再以1ml的二氯甲烷/甲醇/甲苯(75/20/5，v/v/v)洗脫管柱共計兩次，所有的洗脫物被合并于一個50ml的樣品瓶中，至此所得到的洗脫物含有平面型多氯聯(lián)苯化合物。
若欲分析該平面型多氯聯(lián)苯化合物的濃度，以氮氣吹掃將所收集的洗脫物液吹到近干，然后溶于DMSO內(nèi)，并使用將于后文中所描述的生物分析方法來進行化合物的濃度分析。
在完成上述洗脫后，該活性碳/硅藻土管柱再以35ml的甲苯予以洗脫，而洗脫物被收集于一個150ml的錐形瓶內(nèi)，至此步驟所得到的洗脫物含有二惡英類化合物。
若欲單獨分析二惡英化合物，以氮氣吹掃將所收集的將該甲苯洗脫物吹到近干，然后溶于DMSO內(nèi)，并使用將于后文中所描述的生物分析方法來進行二惡英類化合物的濃度分析。
2.植物樣品的前處理(1)植物樣品的萃取稱取一適量的樣品并予以放入至一個250ml的棕色血清瓶中，接著加入50ml正己烷、50ml二氯甲烷、25ml的37.5％HCl以及25ml的超純水，并搖晃振蕩該棕色血清瓶歷時24小時。之后，將所形成的混合物倒入至一分液漏斗中，并以50ml的正己烷清洗該棕色血清瓶共計兩次，而洗液也予以倒入至該分液漏斗中。該分液漏斗被靜置，由此而形成一有機上層(organic upper layer)與一水性下層(aqueous lower layer)。收集該有機上層，并以50ml的正己烷清洗該水性下層共計兩次，然后將兩次的正己烷洗液與該有機上層合并，并將所形成的有機混合物減壓濃縮成為大約1ml的濃縮物。
之后，該1ml的濃縮物可依照上述“環(huán)境樣品的前處理”中的(2)酸洗步驟、(3)使用多層硅膠管柱的凈化步驟、(4)使用酸性氧化鋁管柱的凈化步驟以及(5)使用活性碳管柱的凈化步驟來作進一步的處理。
3.含脂樣品的前處理(1)含脂樣品的萃取含脂樣品主要是指取自于下列來源的樣品肉類、飼料、血液以及乳品等。
稱取一適量的樣品并放入至一個250ml棕色瓶中，加入150ml二氯甲烷并搖晃振蕩該棕色瓶歷時24小時。之后。將二氯甲烷萃取液倒入一燒瓶中，并以50ml的二氯甲烷清洗該棕色瓶共計兩次，并將洗液全部倒入至該燒瓶中，然后將所形成的混合物減壓濃縮成大約1ml的濃縮物。
(2)油含量百分比的測定(detection of oil content％)將上述萃取步驟(1)中所得到的1ml濃縮物通入至一個含有0.5g硅膠的管柱(直徑0.5cm，長20cm)內(nèi)，以50ml的二氯甲烷來洗脫該管柱，并將所收集的洗脫物濃縮至干，即得到一油脂。將該油脂所秤得的重量除以該含脂樣品的重量即可算出該含脂樣品的油含量百分比。
(3)酸洗步驟將上述步驟(2)中所得到的油脂加入至一個具有一鐵氟龍內(nèi)櫬瓶蓋的50ml的樣品瓶中，繼而加入10ml的正己烷并振蕩該樣品瓶歷時大約5秒，然后加入7ml的濃硫酸(98％)予以酸洗并劇烈振蕩該樣品瓶歷時大約20秒。之后進行離心(2000rpm，2分鐘)，藉此而得到一正己烷層與一硫酸層。收集硫酸酸層，而正己烷層則再以硫酸予以酸洗直到硫酸酸層變?yōu)榘咨?不超過3次酸洗)。將正己烷層收集于一個50ml樣品瓶中。各硫酸酸層分別再以7ml的正己烷予以萃取兩次。將所有的正己烷層收集于該50ml樣品瓶中，并予以減壓濃縮成為大約1ml的濃縮物以供后續(xù)處理。
(4)使用酸性硅膠管柱的凈化步驟(purification step usingan acid silica gel column)于一個酸性硅膠管柱(直徑0.5cm，長20cm)的尖底部裝填以玻璃棉，繼而依序地填入20g硅膠、100g硫酸硅膠、20g硅膠以及10g無水硫酸鈉，并于充填時以玻璃棒予以壓實。以50ml正己烷來預洗充填好的管柱并丟棄洗液。
將上述酸洗步驟(3)中所得到的1ml濃縮物移入至經(jīng)預洗過的該酸性硅膠管柱中，待該濃縮物全部進入至管柱內(nèi)后，以1ml的正己烷來清洗該50ml的樣品瓶共計3次，并將正己烷洗液全部加入至該酸性硅膠管柱中。接著，以5ml的正己烷來洗脫管柱共計兩次，繼而以500ml的正己烷洗脫管柱，并將洗脫物收集于一個1000ml的錐形瓶內(nèi)。以氮氣吹掃將所收集的洗脫物吹至近干。
之后，由此所得到的殘余物可依照上述“環(huán)境樣品的前處理”中的(3)使用多層硅膠管柱的凈化步驟、(4)使用酸性氧化鋁管柱的凈化步驟以及(5)使用活性碳管柱的凈化步驟來作進一步的處理。
實施例1.構(gòu)建含有二惡英反應片段的重組載體M4P2與MP(Construction of recombinant plasmids M4P2 and MPcontaining dioxin-response elements)根據(jù)NCBI網(wǎng)址中所登錄的寄存編號(accession number)AF210905[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因，啟動子區(qū)域與部分序列]當中所示的核苷酸序列以及寄存編號X01681[小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因]當中所示的核苷酸序列，并利用軟件Primer3 Version而設(shè)計出針對小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列中的二惡英反應片段(DREs)的下面兩組引物對(primer pairs)，其中該等引物的核苷酸序列是委托波仕特生物科技股份有限公司來合成正向引物(forward primer)15’-cagagagcacctgcaaaaca-3’(序列辨識編號1)
反向引物(reverse primer)15’-ggctacaaagggtgatgctt-3’(序列辨識編號2)正向引物25’-ctcgaggagggcaggtgaaggtgttag-3’(序列辨識編號3)反向引物25’-aagcttaagtgaagagtgttctctagg-3’(序列辨識編號4)其中正向引物2與反向引物2分別被設(shè)計成具有限制酶XhoI和HindII的切割位點(如底線所標示者)。
因此，當以小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因序列作為模板(template)，使用由正向引物1與反向引物1所構(gòu)成的第一引物對(first primer pair)來進行聚合酶鏈式反應(PCR)，可以得到一為479bp的PCR產(chǎn)物(序列辨識編號5)(參見圖4)，而使用由正向引物2與反向引物2所構(gòu)成的第二引物對(second primer pair)來進行PCR，可以得到一為1503bp的PCR產(chǎn)物(序列辨識編號6)(參見圖5)。這兩個PCR產(chǎn)物帶有可能為二惡英反應片段所特有的核苷酸序列(cacgc與gcgtg)，而于下面的實驗中被用來構(gòu)建重組載體M4P2與MP。
(A)重組載體M4P2的構(gòu)建依據(jù)上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述的方法，自小鼠巨噬細胞J774A.1分離與純化出染色體DNA(chromosomal DNA)來作為模板，并使用由正向引物1與反向引物1所構(gòu)成的第一引物對來進行PCR反應，而擴增出一為479bp的PCR產(chǎn)物，其中該PCR產(chǎn)物的核苷酸序列對應于NCBI網(wǎng)址中所登錄的寄存編號AF210905的核苷酸殘基210-688，并且當中含有7個可能為二惡英反應片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga與gcgtg(參見圖4中被框起來的部分)。
使用yT&A克隆載體試劑盒(yT&A Cloning Vector Kit，Yeastern Biotech Co.，Ltd.)而將該被擴增出的479bp PCR產(chǎn)物克隆至yT&A克隆載體(2728bp，其架構(gòu)如圖1所示)內(nèi)，繼而依照上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法將所形成的重組載體轉(zhuǎn)染至大腸桿菌JM109細胞(Yeastern Biotech Co.，Ltd)中，并利用含有氨芐青霉素的固態(tài)培養(yǎng)皿來篩選由被轉(zhuǎn)染的大腸桿菌細胞(transformed E.coli cells)所長出的抗-氨芐青霉素菌落(ampicillin-resistant colonies)。
之后，使用Plasmid Miniprep Purification Kit(BertecEnterprise Co.，Ltd.)而從篩選出的重組型氨芐青霉素抗性大腸桿菌菌落來純化出質(zhì)粒以作為模板，并使用該第一引物對來進行PCR反應，并以瓊脂糖凝膠電泳法(agarose gel electrophoresis)來作分析，由此，一含有一所具核苷酸序列大體上是對應于該479bpPCR產(chǎn)物所具者的DNA片段的重組型yT&A克隆載體被篩選出。
依照上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述，使用限制酶KpnI/BglII來切割該被篩選出的重組型yT&A克隆載體，而得到一個KpnI-BglII DNA片段(0.5Kb)。
之后，將該KpnI-BglII DNA片段并入至以KpnI/BglII切開的pGL2-啟動子載體[5790bp，其架構(gòu)如圖2所示，其中具有熒光素酶基因(luc)](Promega Cooperation)內(nèi)，而得到一含有一所具核苷酸序列大體上是對應于該479bp PCR產(chǎn)物所具者的DNA片段的重組載體M4P2，其中被并入的KpnI-BglII DNA片段坐落在pGL2-啟動子載體的熒光素酶基因(luc)的上游處。
依照上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法，該重組載體M4P2通過被轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株JM109中而被大量地復制。之后，依照前面所述的操作方式來抽取重組載體M4P2并進行PCR反應，俾以確認該重組載體M4P2中是否含有一對應于該479bpPCR產(chǎn)物的DNA片段，而該重組載體M4P2也被定序以作進一步的確認。
經(jīng)確認的重組載體M4P2通過被轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株JM109內(nèi)而被大量地復制，繼而用Plasmid Midiprep Purification Kit予以純化，然后將被純化的重組載體M4P2儲存于-20℃下備用。
(B)重組載體MP的構(gòu)建依據(jù)上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述的方法，自小鼠巨噬細胞J774A.1分離與純化出染色體DNA(chromosomal DNA)來作為模板，并使用由正向引物2與反向引物2所構(gòu)成的第二引物對來進行PCR反應，而擴增出一為1503bp的PCR產(chǎn)物，其中該PCR產(chǎn)物的核苷酸序列是大體上對應于NCBI網(wǎng)址中所登錄的寄存編號AF210905的核苷酸殘基108-1557加上寄存編號X01681的核苷酸殘基22-63，并且當中含有12個可能為二惡英反應片段(DREs)所特有的核苷酸序列cacga與gcgtg(參見圖5中被框起的部分)。
使用yT&A克隆載體試劑盒(yT&A Cloning Vector Kit，Yeastern Biotech Co.，Ltd.)而將該被擴增出的1503bp PCR產(chǎn)物克隆至yT&A克隆載體內(nèi)，繼而依照上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法將所形成的重組載體轉(zhuǎn)染至大腸桿菌JM109細胞中，并利用含有氨芐青霉素的固態(tài)培養(yǎng)皿來篩選由被轉(zhuǎn)染的大腸桿菌細胞所長出的抗-氨芐青霉素菌落。
使用Plasmid Miniprep Purification Kit(BertecEnterprise Co.，Ltd.)而從篩選出的重組型氨芐青霉素抗性大腸桿菌菌落來純化出質(zhì)粒以作為模板，并使用該第二引物對來進行PCR反應，并以瓊脂糖凝膠電泳法(agarose gel electrophoresis)來作分析，由此，一含有一所具核苷酸序列是大體上對應于該1503bp PCR產(chǎn)物所具者的DNA片段的重組型yT&A克隆載體被篩選出。
依照上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述，使用限制酶HindIII/XhoI來切割該被篩選出的重組型yT&A克隆載體，而得到一個HindIII-XhoI DNA片段(大約1.5Kb)。之后，將該HindIII-XhoI DNA片段次克隆至以限制酶HindIII/XhoI切開的pGL3-基本載體[4818bp，其架構(gòu)如圖3所示，其中具有熒光素酶基因(luc+)](Promega Cooperation)內(nèi)，而得到一含有一所具核苷酸序列是大體上對應于該1503bp PCR產(chǎn)物所具者的DNA片段的重組載體MP，其中該HindIII-XhoI DNA片段坐落在pGL3-基本載體的熒光素酶基因(luc+)的上游處。
依照上面“一般實驗方法”一節(jié)中所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法，該重組載體MP通過被轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株JM109中而被大量地復制。之后，依照前面所述的操作方式來抽取重組載體MP并進行PCR反應，以確認該重組載體MP中是否含有一對應于該1503bp PCR產(chǎn)物的DNA片段，而該重組載體MP也被定序以作進一步的確認。
經(jīng)確認的重組載體MP通過被轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株JM109內(nèi)而被大量地復制，繼而用Plasmid Midiprep Purification Kit予以純化，然后將被純化的重組載體MP儲存于-20℃下備用。
實施例2.使用重組載體M4P2與MP來轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細胞Hepa-1C1C7(Transfection of mouse hepatoma cellsHepa-1C1C7 with recombinant vectors M4P2 and MP)Hepa-1C1C7細胞株可依照下列制備程序A或制備程序B而被重組載體MP或M4P2所轉(zhuǎn)染，其中Hepa-1C1C7細胞株的培養(yǎng)方式是依照上面“細胞株與培養(yǎng)條件”一節(jié)中所述的操作程序來進行。
制備程序A1.將172μl的基本DMEM與28μl的GenePORTERTM2Transfection Reagent(GST Inc.)混合均勻以形成一第一溶液，另將200μl的New DNA diluent B(GST Inc.)與8μg的DNA[其中所選用的重組載體的DNA以及pcDNA(InvitrogenCooperation)各為4μg]混合均勻以形成一第二溶液，并讓該第一與第二溶液分別靜置歷時5分鐘；之后，將此二溶液均勻混合，然后讓由此所形成的混合物靜置歷時20分鐘；2.將2×107細胞/ml的Hepa-1C1C7細胞加入至一個10cm2的培養(yǎng)皿內(nèi)，并于一設(shè)定為37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)歷時大約18-20小時，而使得培養(yǎng)皿底部的面積有70％～80％被細胞所覆蓋；之后，移除培養(yǎng)基并以1X PBS清洗細胞共計2次，然后加入5ml的新鮮基本DMEM培養(yǎng)基；3.將步驟1中所準備好的混合物加入至培養(yǎng)皿內(nèi)，并于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培育歷時大約4小時；之后，將適量培養(yǎng)基(DMEM+20％FBS)加入至培養(yǎng)皿內(nèi)，并繼續(xù)培養(yǎng)歷時20小時；4.移除培養(yǎng)基，以1X PBS清洗細胞共計2次并移除洗液，然后加入1ml的胰蛋白酶-EDTA來處理細胞歷時不超過5分鐘，接著加入9ml的培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)，然后將所形成的細胞懸浮物(the resultant cell suspension)分配到6-孔培養(yǎng)盤內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；5.以培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)將步驟4所培養(yǎng)出的細胞稀釋成具一細胞濃度為1個細胞/100μl，然后接種至96-孔培養(yǎng)盤(100μl/孔)內(nèi)培養(yǎng)過夜；6.于顯微鏡下篩選96-孔培養(yǎng)盤內(nèi)的每個孔內(nèi)是否只有一個細胞，并將該細胞移到6-孔培養(yǎng)盤中繼續(xù)培養(yǎng)，以建立被轉(zhuǎn)染的細胞的個別純株(individual clones of transfected cells)；以及7.就步驟4至6中所培養(yǎng)的細胞，可通過下面實施例3中所描述的二惡英誘導法(dioxin induction)來檢測細胞是否會有表現(xiàn)熒光素酶基因的能力，俾以確認由此所建立的細胞株確實帶有所選用的重組載體M4P2或MP。
制備程序B1.依照制備程序A中所述的步驟1來制備一第一混合物，但是使用8μg的pcDNA(Invitrogen Cooperation)來制備該第二溶液；接下來的步驟2至3同于上述制備程序A中所述的步驟2至3，然后繼續(xù)進行下列步驟4.移除培養(yǎng)基并加入含有GENETICIN的培養(yǎng)基[90％基本DMEM+10％FBS，添加有G-418]來進行培育歷時1周；5.依照制備程序A中所述的步驟1來制備一第二混合物，但是使用8μg的所選用的重組載體DNA來制備該第二溶液；6.對于通過步驟4的GENETICIN篩選的細胞，使用步驟5所制備的第二混合物來重復制備程序A中所述的步驟2至3，俾使細胞被所選用的重組載體M4P2或MP所轉(zhuǎn)染；以及7.重復制備程序A中所述的步驟4至7。
申請人使用實施例1中所建立的兩個重組載體M4P2以及MP來轉(zhuǎn)染Hepa-1C1C7細胞，而得到兩個經(jīng)轉(zhuǎn)染的小鼠肝癌細胞株，也即Hepa1c1c7-MP與Hepa1c1c7-M4P2。此二細胞株已分別于公元2004年5月7日與2004年5月14日被寄存于臺灣的食品工業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，寄存編號分別為BCRC 960207與BCRC 960208。此二細胞株也有依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，于公元2004年6月18日被寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，寄存編號分別為PTA-6089與PTA-6090。
實施例3.建立二惡英濃度相對于熒光素酶所引發(fā)的光強度的關(guān)聯(lián)性(Establishment of the correlation of dioxinconcentration vs.the light intensity caused by luciferase)
A.經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)的熒光素酶基因在二惡英刺激后的表現(xiàn)(Expression of luciferase gene in transfected cells after thestimulation of dioxin)將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞(4×105細胞/孔)置放于24孔-培養(yǎng)盤內(nèi)，并于每孔加入1ml的培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS)，然后將培養(yǎng)盤放在37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中并靜置2個小時以使細胞貼附。
以DMSO將濃度為10μg/ml的二惡英(2，3，7，8-TCDD)儲備溶液(stock solution)作10倍連續(xù)稀釋(10-fold serial dilution)，對各個稀釋液分別取3.22μl并加入至培養(yǎng)盤的各孔內(nèi)，俾使各實驗組的二惡英最終濃度分別為10nM、1nM、100pM、50pM、10pM、1pM與0.1pM，且每一實驗組作4個重復。正常對照組(normal control)是不作任何處理的細胞，而溶劑對照組(solve ntcontrol)是使用3.22μl DMSO予以處理的細胞。
在以二惡英來處理經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞歷時一預定的時間(5hrs、10hrs、15hrs與20hrs)后，移除培養(yǎng)基并于每孔內(nèi)加入150μl的1X細胞溶解溶液(cell lysis solution)(內(nèi)含于Luciferase AssaySystem(Cat#1500)，Promega Cooperation)，然后輕輕搖晃培養(yǎng)盤歷時15-20分鐘以使細胞被完全溶解。之后，將位于每孔內(nèi)的溶液移至一微量離心管(microtube)中，并于4℃下以12000rpm來離心歷時2分鐘，由此所得到的上清液(supernatant)就是以二惡英處理過的轉(zhuǎn)染細胞溶胞產(chǎn)物(lysate of dioxin-treatedtransfected cell)。
將各組所得到的溶胞產(chǎn)物各取100μl并加入至不透明的96孔-培養(yǎng)盤(non-transparent 96-well plate)的各孔內(nèi)，繼而加入50μl的熒光素(luciferin)(內(nèi)含于Luciferase Assay System，(Cat#1500)，Promega Cooperation)，最后使用Beckman coulterDU640B spectrophotometer[設(shè)定值為PMT1100，讀取長度(read length)0.5，以及Gain1～100]來自動檢測20秒內(nèi)的光強度(lightintensity)。所得到的實驗結(jié)果通過統(tǒng)計分析法予以分析繪圖，并檢視當中是否存在有統(tǒng)計顯著性(statistic significance)。
B.結(jié)果圖6與圖7分別顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2與Hepa1c1c7-MP在以100pM的二惡英(2，3，7，8-TCDD)予以處理5、10、15與20小時之后所測得的光強度結(jié)果，其中在檢測Hepa1c1c7-M4P2的光強度時的檢測敏感度被設(shè)定為100，而在檢測Hepa1c1c7-MP時則予以設(shè)定為10。
由結(jié)果顯示，小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2在以100pM的二惡英(2，3，7，8-TCDD)予以處理15小時后會有最穩(wěn)定以及最佳的光強度結(jié)果(圖6)，而且正常組與DMSO組的背景值也非常低。但是經(jīng)二惡英處理20小時之后，小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2的反應顯著地下跌。
至于小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP，它在以二惡英處理20小時之后會有最穩(wěn)定以及最佳的光強度結(jié)果(圖7)，而在以二惡英予以處理15小時之后也會產(chǎn)生足夠明顯的反應，且光強度讀取值非常高而需要將熒光分析儀的敏感度降到10才能全部讀取。
根據(jù)這些實驗結(jié)果，在接下來的實驗中即將二惡英處理時間皆設(shè)定為15小時。
圖8與圖9分別顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2與Hepa1c1c7-MP在以不同濃度(0.1pM、1pM、5pM、10pM、50pM、100pM以及1000pM)的二惡英(2，3，7，8-TCDD)予以處理15小時之后所測得的光強度結(jié)果，其中在檢測Hepa1c1c7-M4P2的光強度時的檢測敏感度被設(shè)定為10，而在檢測Hepa1c1c7-MP時則予以設(shè)定為1。
參見圖8，當使用依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2來檢測二惡英(2，3，7，8-TCDD)時，相對于對照組的光強度結(jié)果，僅使用5pM的2，3，7，8-TCDD來處理該細胞就可以觀察到明顯的光強度的變化。
而如圖9所示，當使用依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP來檢測二惡英(2，3，7，8-TCDD)時，也可在5pM的2，3，7，8-TCDD處理下觀察到明顯的光強度的變化，并且要比Hepa1c1c7-M4P2更為明顯。此外，相對于對照組的光強度結(jié)果，二惡英濃度和所測得的光強度之間呈現(xiàn)一非常清楚的正向關(guān)系。
總結(jié)，依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2與Hepa1c1c7-MP的二惡英檢測極限都是5pM。而當考慮到對照組的光強度(作為背景值)時，小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP所產(chǎn)生的光強度差異較大，因此，就小鼠肝癌細胞Hepa-1C1C7而言，重組載體MP可能會是一較佳的轉(zhuǎn)化載體。
實施例4.飛灰樣品的二惡英含量的檢測A.二惡英標準品的制備(Preparation of dioxinstandards)于一適當容器內(nèi)，使用DMSO將下面表1中所列的17種二惡英/呋喃化合物(dioxin/furanc ompounds)依照各個化合物的毒性系數(shù)的比例而配制成總濃度為0.5ng-TEQ以及0.1ng-TEQ。之后，以氮氣吹至近干，然后以128.8μl DMSO以回溶(redissolve)。
表1.二惡英標準品的配制


B.二惡英檢測將2g的飛灰樣品(由正修科技大學超微量中心提供)置于一燒杯中，并依照前面“環(huán)境樣品的前處理”中所述的步驟來進行前處理，而得到一被回溶于DMSO內(nèi)的飛灰樣品29溶液。
依據(jù)實施例3中所述，取各為3.22μl的經(jīng)10倍連續(xù)稀釋的二惡英(2，3，7，8-TCDD)來處理細胞，并使二惡英于細胞培養(yǎng)液中的最終濃度分別為10nM、1nM、100pM、50pM、10pM、1pM、0.1pM。每一實驗組作3個重復。正常對照組是不作任何處理的細胞，而溶劑對照組是使用3.22μl DMSO予以處理的細胞。
上述所得到的飛灰樣品溶液29以及于步驟(A)中所配置的兩種不同濃度的標準樣品S1與S2也各取3.22μl來處理細胞，藉此，該飛灰樣品溶液與該二標準樣品S1與S2的濃度被稀釋40倍。
在細胞經(jīng)二惡英處理歷時15小時之后，依照實施例3中所述方式來檢測光強度，其中光強度檢測敏感度皆設(shè)定為1。
C.結(jié)果
表2顯示要作為分析樣品用的對照標準品的二惡英(2，3，7，8-TCDD)濃度與數(shù)量的關(guān)系表。因此，在估算該飛灰樣品溶液與該二標準樣品S1與S2所含有的二惡英類化合物的含量時，即依照各樣品所測得的光強度來與標準品的光強度比對，并依照表2中所示的二惡英濃度與數(shù)量的關(guān)系表來換算出飛灰樣品溶液與該二標準樣品S1與S2所含有的二惡英數(shù)量。
表2.二惡英濃度與數(shù)量的關(guān)系表

圖10與圖11分別顯示依據(jù)本發(fā)明的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2與Hepa1c1c7-MP在以不同濃度(0.1pM、1pM、10pM、50pM、100pM、1nM以及10nM)的二惡英(2，3，7，8-TCDD)以及該飛灰樣品溶液與該二標準樣品S1與S2予以處理15小時之后所測得的光強度結(jié)果。
如圖10所示，當以小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2來作二惡英含量檢測時，二惡英濃度和光強度呈現(xiàn)一明顯的正向關(guān)系。依據(jù)圖10所示，被稀釋40倍的標準樣品S1的光強度為6980，而依據(jù)表2中所示的二惡英濃度標準來推算，可知標準樣品S1的二惡英質(zhì)量應落在3.22～16.1pg-2，3，7，8-TCDD之間。至于被稀釋40倍的標準樣品S2，其光強度為13184，因此推算其所含二惡英質(zhì)量應落在32.2～322pg-2，3，7，8-TCDD之間。稀釋40倍的飛灰樣品29的熒光讀值為4718，其所含二惡英數(shù)量應落在0.322～3.22pg-2，3，7，8-TCDD之間。
由于圖10顯示二惡英濃度和光強度呈現(xiàn)一明顯的正向關(guān)系，當以二惡英質(zhì)量作為橫軸以及所測得的光強度作為縱軸時，可以得到一線性關(guān)系圖，而標準樣品S1與S2與飛灰樣品29所含二惡英數(shù)量可根據(jù)該線性關(guān)系圖而被更精確地估算出，于是得到下面結(jié)果標準樣品S17.44pg-2，3，7，8-TCDD；標準樣品S2104.83pg-2，3，7，8-TCDD；以及飛灰樣品292.15pg-2，3，7，8-TCDD。
之后，將上述所得數(shù)值分別乘以40，則標準樣品S1所含二惡英數(shù)量297.65pg-2，3，7，8-TCDD，標準樣品S2所含二惡英數(shù)量為4193.35pg-2，3，7，8-TCDD，而該飛灰樣品29所含二惡英數(shù)量為85.89pg-2，3，7，8-TCDD。
同樣地，圖11顯示以小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP來作二惡英含量檢測時，二惡英濃度和光強度也呈現(xiàn)一明顯的正向關(guān)系。被稀釋40倍的該二標準樣品S1與S2以及該飛灰樣品29所所測得的光強度分別為18650、33998與20523，依據(jù)表2的二惡英濃度與數(shù)量的關(guān)系表來推算，該二標準樣品S1與S2以及該飛灰樣品29所含二惡英質(zhì)量應分別落在3.22～16.1pg-2，3，7，8-TCDD、16.1～32.2pg-2，3，7，8-TCDD以及3.22～16.1pg-2，3，7，8-TCDD的范圍內(nèi)。
由于圖11顯示二惡英濃度和光強度呈現(xiàn)一明顯的正向關(guān)系，當以二惡英質(zhì)量作為橫軸以及所測得的光強度作為縱軸時，可以得到一線性關(guān)系圖，而標準樣品S1與S2與飛灰樣品29所含二惡英數(shù)量可根據(jù)該線性關(guān)系圖而被更精確地估算出，于是得到下面結(jié)果標準樣品S14.81pg-2，3，7，8-TCDD；標準樣品S217.65pg-2，3，7，8-TCDD；以及飛灰樣品296.24pg-2，3，7，8-TCDD。
之后，將上述所得數(shù)值分別乘以40，則標準樣品S1所含二惡英數(shù)量192.36pg-2，3，7，8-TCDD，標準樣品S2所含二惡英數(shù)量為705.97pg-2，3，7，8-TCDD，而該飛灰樣品29所含二惡英數(shù)量為249.536pg-2，3，7，8-TCDD。
總結(jié)，當以小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2來作檢測時，對照作為標準品的二惡英(2，3，7，8-TCDD)的檢測結(jié)果，化學分析濃度被定義為0.1ng-TEQ的標準樣品S1的生物檢測結(jié)果相當于297.65pg-2，3，7，8-TCDD，而化學分析濃度被定義為0.5ng-TEQ的標準樣品S2的生物檢測結(jié)果則相當于4193.35pg-2，3，7，8-TCDD。而當以小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP來作檢測時，化學分析濃度被定義為0.1ng-TEQ的標準樣品S1的生物檢驗結(jié)果相當于192.363pg-2，3，7，8-TCDD，而化學分析濃度被定義為0.5ng-TEQ的標準樣品S2的生物檢驗結(jié)果則是705.97pg-2，3，7，8-TCDD。
由上面的數(shù)值來看，生物檢測結(jié)果都會比化學分析結(jié)果為高，就小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2而言，0.1ng-TEQ的標準樣品S1的生物檢測濃度與化學分析濃度的比值是3.0，而0.5ng-TEQ的標準樣品S2的比值則為8.4。我們推測，這可能是化學分析時二惡英含量在接下的純化步驟中會有所損耗，而導致TEQ值偏低。另外，也有可能是由于生物檢測方法對于各種二惡英化合物的TEF值與傳統(tǒng)的TEF值不同。因此，接下來可以使用小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2來分別針對17種不同的二惡英化合物進行熒光素酶活性分析，以建立出一套完整的用于檢測二惡英類化合物的生物分析檢測系統(tǒng)(bioassay detection system)。
而就小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP而言，0.1ng-TEQ的標準樣品S1的生物檢測濃度與化學分析濃度的比值是1.9，而0.5ng-TEQ的標準樣品S2的比值是1.4。因此，小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP看來要比小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2具有更佳的檢測精準度。
另一方面，當飛灰樣品29分別以小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2與Hepa1c1c7-MP來作檢驗時，所得到的生物檢測結(jié)果分別相當于85.89pg-2，3，7，8-TCDD與249.536pg-2，3，7，8-TCDD。而該飛灰樣品當以傳統(tǒng)化學質(zhì)譜儀來作分析時所得到的結(jié)果為76pg-TEQ。若將飛灰樣品29所得到的生物檢測結(jié)果與化學分析結(jié)果作一比較，使用小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2與Hepa1c1c7-MP所產(chǎn)生的比值分別是1.1與3.3。由此看來，生物檢測數(shù)值會大于化學分析值，而這極有可能是因為生物檢測方法的TEF值與傳統(tǒng)的TEF值不同，而有需要另外定義出一套適用于生物分析檢測的TEF值系統(tǒng)。此外，化學分析步驟中所損耗的二惡英量也會導致測量結(jié)果TEQ值偏低。
基于小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP的檢測精準度似乎較小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2為優(yōu)，下面的實施例使用小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP來分析取自于自然環(huán)境中的生物樣品。
實施例5.檢測魚肉樣品的二惡英含量取3g魚肉，依照上述“含脂樣品的前處理”中所述所述的步驟來進行前處理，其中在油含量百分比的測定步驟中得到1.97g的油脂，因此推算出3g魚肉的油含量百分比為65.7％。該1.97g的油脂接而被進行“含脂樣品的前處理”中所述的酸洗步驟、使用酸性硅膠管柱的凈化步驟以及“環(huán)境樣品的前處理”中所述的使用多層硅膠管柱的凈化步驟而得到一洗脫物，并以氮氣吹掃將所收集的洗脫物吹至近干，最后予以回溶于644μl的DMSO內(nèi)，而得到一魚肉樣品溶液。
依照實施例3中所述的方式，取出3.22μl的該魚肉樣品溶液來處理細胞，并檢測被處理的細胞所產(chǎn)生的光強度變化。依照實施例4中所述的實驗方式以及表2中所顯示的二惡英(2，3，7，8-TCDD)濃度與數(shù)量的關(guān)系表，該魚肉樣品溶液被估算出具有一二惡英濃度為7.5pM。而再經(jīng)換算后，該魚肉樣品溶液被估算為具有0.96pg-2，3，7，8-TCDD。
由上述結(jié)果可得到魚肉樣品內(nèi)的二惡英含量為0.32pg/g-魚肉(或者為0.49pg/g-油脂)。
此外，由于檢測是利用2，3，7，8-TCDD作為標準品，而2，3，7，8-TCDD的毒性當量值(TEQ)被設(shè)定為1.00，該魚肉樣品的二惡英含量也可被表示為0.32pg-TEQ/g-魚肉(或為0.49pg-TEQ/g-油脂)。
實施例6.檢測魚飼料樣品的二惡英含量參照實施例5所述相同方式，取100g魚飼料來進行二惡英含量的檢測，其中100g魚飼料被測得含有7.84g油脂，因此，該魚飼料樣品的油含量百分比為7.84％。之后，取1g的油脂來進行“含脂樣品的前處理”中所述的酸洗步驟、使用酸性硅膠管柱的凈化步驟以及“環(huán)境樣品的前處理”中所述的使用多層硅膠管柱的凈化步驟而得到一洗脫物，并以氮氣吹掃將所收集的洗脫物吹至近干，最后予以回溶于644μl的DMSO內(nèi)，而得到一魚飼料樣品溶液。
依照實施例3中所述的方式，取出3.22μl的該魚飼料樣品溶液來處理細胞，并檢測被處理的細胞所產(chǎn)生的光強度變化。依照實施例4中所述的實驗方式以及表2中所顯示的二惡英(2，3，7，8-TCDD)濃度與數(shù)量的關(guān)系表，該魚飼料樣品溶液被估算出具有一二惡英濃度為25 pM。而再經(jīng)換算后，該魚飼料樣品溶液被估算為具有一二惡英含量為3.22pg-2，3，7，8-TCDD。
由上述結(jié)果可得到100g魚飼料內(nèi)的二惡英含量為0.25pg/g-魚飼料(或者為3.22pg/g-油脂)。
此外，由于檢測是利用2，3，7，8-TCDD作為標準品，而2，3，7，8-TCDD的毒性當量值(TEQ)被設(shè)定為1.00，該魚飼料樣品的二惡英含量也可被表示為0.25pg-TEQ/g-魚飼料(或為3.22pg-TEQ/g-油脂)。
于本說明書中被引述的所有文獻數(shù)據(jù)與專利案以其整體被并入本案作為參考數(shù)據(jù)。若有所沖突時，本案的詳細說明(包含界定在內(nèi))將占上風。
雖然本發(fā)明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發(fā)明的范圍和精神的下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發(fā)明僅受如隨文檢附的權(quán)利要求書中所示者的限制。
序列表<110>正修科技大學<120>一種依據(jù)熒光素酶基因的表現(xiàn)來檢測二惡英類化合物的重組細胞株<130>PE-26749<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的正向引物1<400>1cagagagcac ctgcaaaaca20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的反向引物1<400>2ggctacaaag ggtgatgctt20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的正向引物2<400>3ctcgaggagg gcaggtgaag gtgttag 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>用于小家鼠(Mus musculus)CYP1A1基因合成的反向引物2<400>4aagcttaagt gaagagtgtt ctctagg 27<210>5<211>479<212>DNA<213>人工<220>
<223>正向引物1與反向引物1擴增的PCR產(chǎn)物<400>5cagagagcac ctgcaaaaca gccagctagg cgtgccgggt ggtgctgcgt gtcctgccac 60taaaaatgtg gacacacgct gttcaggcct ttgctctcag gcagaagccg agcatcgcac 120gcaaacccgg ccctttgcac cgctggcgct gtcttgtcgc gcccttgcaa agcatagact 180atttctatct cttaaacccc accccaacgc cccaggagag ctggcccttt aagagcctca 240cccacggttc ccctccccca gctagcgtga cagcactggg acccgcgccc ggttgtgagt 300tgggtagctg ggtggctgcg cgggcctcca ggctcttctc acgcaactcc ggggcacctt 360gtccccagcc aggtggggcg gagacaggca gcccgacctc tgcccccaga ggatggagca 420ggcttacgca cgctagcctc aggaacctgt gtgcgtgcca agcatcaccc tttgtagcc 479<210>6
<211>1503<212>DNA<213>人工<220>
<223>正向引物2與反向引物2擴增的PCR產(chǎn)物<400>6ctcgaggagg gcaggtgaag gtgttagtta ggaacaggtt gagttagaca cgccaagttc60agatgttctt cttacactaa tctcactctg ggagcaccct tcagggccag agagcacctg120caaaacagcc agctaggcgt gccgggtggt gctgcgtgtc ctgccactaa aaatgtggac180acacgctgtt caggcctttg ctctcaggca gaagccgagc atcgcacgca aacccggccc240tttgcaccgc tggcgctgtc ttgtcgcgcc cttgcaaagc atagactatt tctatctctt300aaaccccacc ccaacgcccc aggagagctg gccctttaag agcctcaccc acggttcccc360tcccccagct agcgtgacag cactgggacc cgcgcccggt tgtgagttgg gtagctgggt420ggctgcgcgg gcctccaggc tcttctcacg caactccggg gcaccttgtc cccagccagg480tggggcggag acaggcagcc cgacctctgc ccccagagga tggagcaggc ttacgcacgc540tagcctcagg aacctgtgtg cgtgccaagc atcacccttt gtagccccag accccctcct600gctgtctcgc gtggatcctt cctccaccct ttcctccacc atacttagat agctctgcac660ccgccgcccg acttctctgt gttgcctgct tcagtatgta tgcacaacac tagcaagccc720cgggagccta cagggagctg caagcgggga ctcccgggct tgcagcttgc ctaaggtgac780ccttagaggt gagatctgca agcctgccat ccatccccac cctctagatg aagcagcgcg840aacttcggcc gatacccaat ttgtggggca cagagtcagt ccaatggcgc cactggcctt900cctgtcctgt gacctctggg ctggggtcgt tgcgcttctc acgcgagctt ggactcagta960atccagggaa gcaaagtcac cacccagctg ttctccctct accagccttt cccgggcacc1020cattggcttg tagtaggcaa gaggatctta cacactgaat gtttcagggg tgcaaaaata1080gtgaaaagga atccctatga cccggaatgg aggccccagt acttactttt taggttaccc1140cagaattttt cctcaaaccc ctccctcagt gggattatgc actgtccatg gagcaccttg1200aaagtgtggg gggtggtgac cccaaccttt attctttttc ttttcttatg tttttttgtg1260
cctgtaccta catcaggtat ccggtatggc ttcttgccta tctcccccct cccccctgcc1320tagagcactc cctaaggctg tccctccctc ggtcccacca ctgggctcag ataaggaggc1380gtggccaaca gacacagagt cctataaagg tggtggtgcc ttcaccctaa ccctgaaggt1440ggtagttctt ggagcttccc cgatcctccc tagggtccta gagaacactc ttcacttaag1500ctt 150權(quán)利要求
1.一種用于克隆對于二惡英具反應性的DNA片段的引物對，其特征在于該引物包括一正向引物與一反向引物，該正向引物具有一如序列辨識編號1或序列辨識編號3所示的核苷酸序列，而該反向引物具有一如序列辨識編號2或序列辨識編號4所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的引物對，其特征在于該正向引物具有一如序列辨識編號1所示的核苷酸序列，而該反向引物具有一如序列辨識編號2所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的引物對，其特征在于該正向引物具有一如序列辨識編號3所示的核苷酸序列，而該反向引物具有一如序列辨識編號4所示的核苷酸序列。
4.一DNA片段，其具有一核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列是下列之一(1)實質(zhì)上對應于一通過使用CYP1A1基因序列作為模板以及使用根據(jù)權(quán)利要求1的引物對來進行PCR反應而被擴增出的DNA片段所具有的核苷酸序列；(2)實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號5所示的核苷酸序列；(3)實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號6所示的核苷酸序列；(4)實質(zhì)上對應于一與(1)項中所述的DNA片段的核苷酸序列或(2)或(3)項中所述的核苷酸序列相互補的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA片段，其特征在于該DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號5所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA片段，其特征在于該DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號6所示的核苷酸序列。
7.一種重組載體，其特征在于該重組載體具有一報告基因，以及一如權(quán)利要求4的DNA片段位于該報告基因的上游處。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的重組載體，其特征在于該報告基因是熒光素酶基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的重組載體，其特征在于該DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號5所示的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組載體，其特征在于該重組載體是重組載體M4P2。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的重組載體，其特征在于該DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)上對應于一如序列辨識編號6所示的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的重組載體，其特征在于該重組載體是重組載體MP。
13.一種重組細胞株，其特征在于該重組細胞株是通過以一如權(quán)利要求7至12項中任一項的重組載體來轉(zhuǎn)染一宿主細胞而被形成的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的重組細胞株，其特征在于該被用來轉(zhuǎn)染的宿主細胞是小鼠肝癌細胞Hepa-1C1C7。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的重組細胞株，其特征在于該重組細胞株是以寄存編號PTA-6089被寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1C1C7-MP或其次培養(yǎng)后代。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的重組細胞株，其特征在于該重組細胞株是以寄存編號PTA-6090寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2或其次培養(yǎng)后代。
17.一種用于檢測一環(huán)境樣品中的二惡英類化合物的生物分析，其特征在于該生物分析是利用一如權(quán)利要求13至16項中任一項的重組細胞株來接觸一含有二惡英類化合物的樣品，而致使位在該重組細胞株內(nèi)的該重組載體所具有的報告基因被表現(xiàn)，由此被生成的基因產(chǎn)物會產(chǎn)生一可檢測的現(xiàn)象，而該可檢測的現(xiàn)象被作為定性與定量二惡英類化合物的存在的指標。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的生物分析，其特征在于該重組載體上所具有的報告基因是熒光素酶基因，而該可檢測的現(xiàn)象是由熒光素酶與熒光素反應后所產(chǎn)生的光強度。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的生物分析，其特征在于該重組細胞株是以PTA-6089被寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-MP或其次培養(yǎng)后代。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的生物分析，其特征在于該重組細胞株是以寄存編號PTA-6090寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的小鼠肝癌轉(zhuǎn)化細胞株Hepa1c1c7-M4P2或其次培養(yǎng)后代。
全文摘要
本發(fā)明涉及帶有一外源性熒光酶基因的重組細胞株，特別是經(jīng)轉(zhuǎn)染的小鼠肝癌細胞株Hepalclc7－M4P2與Hepalclc7－MP，其中該發(fā)光酶基因的上游處坐落有一當中含有可能為二惡英反應片段所特有的核苷酸序列“cacgc”與“gcgtg”的DNA片段，該DNA片段是依據(jù)小家鼠(Mus musculus)CYP1 A1基因的啟動子區(qū)域以及結(jié)構(gòu)基因的部分前端序列而被設(shè)計出。于是，該重組細胞株及其次培養(yǎng)后代可供應用于通過生物分析法來檢測存在于一從自然環(huán)境(例如土壤，水源，供食用的肉類、魚類、蔬果等等，工廠或焚化爐的煙道、底灰、底泥等等)所收集到的樣品內(nèi)的二惡英類化合物。
文檔編號C12Q1/00GK1749403SQ20041007441
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者李偉山, 李心予, 張簡國平, 黃怡瑋, 盧冠妤 申請人:正修科技大學