專利名稱：集成化的蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的有機結(jié)合，使得原來無法大量獲得的天然蛋白質(zhì)特別是基因工程藥物能夠大量生產(chǎn)，應(yīng)用于臨床的基因工程藥物的市場正以每年約12％的速度增長，迄今為止已有200多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成了一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟效益。
大腸桿菌屬于兼性厭氧性的革蘭氏陰性菌，因為具有下列特性(1)培養(yǎng)容易，只要簡單的必需養(yǎng)分即可養(yǎng)活細胞；(2)生長快速，有利于大規(guī)模的生產(chǎn)；(3)大腸桿菌的遺傳和生理的作用機制已被了解得相當透徹，而且許多載體系統(tǒng)均是針對大腸桿菌而開發(fā)的，所以常被用來作為生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的宿主細胞。但由于大腸桿菌缺乏天然的分泌機制，目前在大腸桿菌中表達的絕大多數(shù)外源蛋白無法分泌到胞外，只能在細胞內(nèi)積累。
外源蛋白的胞內(nèi)積累對重組蛋白的生產(chǎn)具有許多不利之處(1)外源蛋白在胞內(nèi)過度積累會影響宿主細胞的生理狀況，進而影響到目標蛋白的合成；(2)發(fā)酵結(jié)束后，必須破碎細胞才能回收目標蛋白。同時，因為細胞破碎過程中會釋放胞內(nèi)其它蛋白及細胞組分，使得后續(xù)的分離純化更加困難；(3)作為一種外源物質(zhì)，重組蛋白以可溶形式存在于胞內(nèi)時，會招致宿主自身蛋白酶的攻擊而被降解，導致最終蛋白產(chǎn)量或活性降低。重組蛋白過度積累也許會形成不可溶的包涵體，從而避免宿主自身蛋白酶的攻擊，但從包涵體中回收蛋白需要復雜的變性、復性過程，收率極低。
由于外源蛋白在胞內(nèi)積累對重組蛋白的生產(chǎn)具有種種不利之處，使得胞外表達目標蛋白常常成為首選目標。近年來國外已有專利和文獻報道利用分子生物學技術(shù)促使大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中直接將合成的外源蛋白分泌至胞外，但該方法缺乏普適性，且成功的案例不多。
利用某些化學藥品如有機溶劑、抗生素、表面活性劑等能改變細胞壁或膜的通透性，從而使細胞內(nèi)含物有選擇性地滲透出來，這是化學滲透法的基本原理。這種方法已經(jīng)被用來破碎發(fā)酵后經(jīng)離心收獲的菌體，以回收胞內(nèi)合成的重組蛋白。如能將化學滲透法應(yīng)用于發(fā)酵過程中，即在發(fā)酵過程中直接添加化學試劑促使外源蛋白在發(fā)酵過程中就釋放出來，從而避免外源蛋白胞內(nèi)積累帶來的種種不利就成為本發(fā)明的目的。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)酵是一個活細胞不斷生長繁殖的過程，而化學試劑可影響細胞膜通透性，使得化學試劑可進入菌體內(nèi)部而影響其正常的代謝作用，使得菌體停止生長甚至引起菌體自溶死亡。因此如何實現(xiàn)菌體生長與重組蛋白選擇性地滲漏協(xié)調(diào)進行成為本發(fā)明需要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。
本發(fā)明所說的集成化蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法，其主要包括重組大腸桿菌的培養(yǎng)和外源基因誘導表達階段，其特征在于，在外源基因誘導表達啟動0～12小時后添加表面活性劑或脂溶劑，使其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度達到0.01～10v/v％；發(fā)酵液離心分離之前對其進行熱處理，所說熱處理是指將發(fā)酵液加熱至40～140℃維持0.01～60分鐘；其中所說的表面活性劑或脂溶劑是指具有選擇性破除大腸桿菌外壁功能的試劑，其包括(但并不限于)十二烷基硫酸鈉、吐溫80、曲同X-100(TritonX-100)、甲苯和乙醇中的一種或一種以上，優(yōu)選Triton X-100。


圖1為質(zhì)粒(pET32aBI1)構(gòu)建過程示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明所說的集成化蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法包括如下步驟1)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取重組大腸桿菌單菌落接入10～1000ml(優(yōu)選25～100ml)種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在種子培養(yǎng)基中濃度達到10～1000mg/l(優(yōu)選50～200mg/l)，20～45℃(優(yōu)選30～35℃)，50～500rpm(優(yōu)選180～250rpm)搖床培養(yǎng)2～24h(優(yōu)選20～24)，按0.01～20％(優(yōu)選0.5～5％)接種量將前面的培養(yǎng)液再次接入種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在種子培養(yǎng)基中濃度達到10～1000mg/l(優(yōu)選50～200mg/l)，20～45℃(優(yōu)選30～35℃)，50～500rpm(優(yōu)選180～250rpm)搖床培養(yǎng)2～24h(優(yōu)選6～10h)，再按0.01～20％(優(yōu)選0.5～5％)的接種量將活化的種子液加入到0.1～500L(優(yōu)選1.5～3L)發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素使得濃度達到10～1000mg/ml(優(yōu)選50～200mg/ml)，20～45℃(優(yōu)選30～35℃)，50～2000rpm(優(yōu)選500～1000rpm)培養(yǎng)2～24h(優(yōu)選6～10h)，然后加入安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導，使其在培養(yǎng)基中濃度達到0.05～0.5mM(優(yōu)選0.1～0.5mM)，在添加了安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導后0～12h(優(yōu)選0～4h)，加入表面活性劑或脂溶劑[推薦使用Triton X-100]，使其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度達到0.01～10v/v％(優(yōu)選0.01～1v/v％)，繼續(xù)培養(yǎng)2～20h；2)熱處理將由步驟1)得到發(fā)酵液加熱至40～140℃(優(yōu)選80～100℃)維持0.01～60min(優(yōu)選5～30min)，然后冷卻，于0～40℃(優(yōu)選2～10℃)條件下離心分離，收集上清液即得重組蛋白粗提物，重組蛋白的純度達60％～70％。
其中所說的種子培養(yǎng)基為甘油5～30g/l，K2HPO43H2O 10～35g/l，(NH4)2HPO40.5～15，g/l檸檬酸0.5～5g/l，MgSO47H2O 0.5～5g/l，發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油5～50g/l，K2HPO43H2O 10～35g/l，(NH4)2HPO40.5～15g/l，檸檬酸0.5～5g/l，MgSO47H2O 0.5～5g/l，固體培養(yǎng)基為甘油5～30g/l，K2HPO43H2O 10～35g/l，(NH4)2HPO40.5～15，g/l檸檬酸0.5～5g/l，MgSO47H2O 0.5～5g/l，瓊脂2g/l。
本發(fā)明所述方法采用重組大腸桿菌(宿主細胞)作為生產(chǎn)菌株，熱穩(wěn)定蛋白(如目標蛋白和硫氧還蛋白的融合蛋白)為發(fā)酵目標產(chǎn)物。所用原料均為市售品。
本發(fā)明成功地將化學滲漏法直接應(yīng)用于發(fā)酵過程中，實現(xiàn)了菌體生長和目標蛋白選擇性滲漏協(xié)調(diào)地進行。在發(fā)酵過程中，重組目標蛋白可以從胞內(nèi)滲漏且不顯著影響菌體的持續(xù)生長，保證了目標蛋白的大量合成積累并最終滲漏至培養(yǎng)基中。滲漏不僅簡化了純化重組蛋白的工藝，也提高了目標產(chǎn)物的表達水平。同時，選用優(yōu)化的培養(yǎng)基組成，針對熱穩(wěn)定性重組蛋白(如目標蛋白和硫氧還蛋白的融合蛋白)產(chǎn)物，在發(fā)酵過程結(jié)束時加熱后再離心。熱處理不僅進一步促使蛋白的滲漏，而且使相當多的雜蛋白、核酸等變性后沉淀下去。經(jīng)檢測，超過90％的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，且離心后上清液中重組蛋白的純度可達60％～70％。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，其目的是更好理解本發(fā)明內(nèi)容。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護范圍。此外，在所列實施例中如無特別說明勻采用如下材料
1)菌種宿主為Escherichia coli BL21(DE3)，質(zhì)粒為pET32a(+)，工程菌為Escherichiacoli BL21(DE3)[pET32aBI1]，質(zhì)粒pET32aBI1由商品化質(zhì)粒pET32a(+)改造而來，具體構(gòu)建方法參見Molecular Cloning ，構(gòu)建過程如圖1所示。
2)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/l)甘油10，K2HPO43H2O 10，(NH4)2HPO40.5，檸檬酸0.5，MgSO47H2O 1.2發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)甘油30，K2HPO43H2O 17.5，(NH4)2HPO45，檸檬酸5，MgSO47H2O 1.2固體培養(yǎng)基(g/l)甘油10，K2HPO43H2O 10，(NH4)2HPO40.5，檸檬酸0.5，MgSO47H2O 1.2，瓊脂2所用試劑均為市售品。
實施例1重組大腸桿菌發(fā)酵過程中蛋白滲漏與熱分離相結(jié)合的集成化蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法的步驟如下1)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取一個重組大腸桿菌單菌落接入40ml的種子培養(yǎng)基中(500ml的三角瓶)，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到120mg/l，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)24h，按10％接種量將前面的培養(yǎng)液再次接入40ml的種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到120mg/l，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)14h，再按2％的接種量將活化的種子液加入到1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素使得濃度達到120mg/ml，30℃，600rpm，培養(yǎng)10h。然后加入安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導，使其在培養(yǎng)基中濃度達到0.2mM，在添加了安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導后4h，加入曲同X-100(Triton X-100)，使其在培養(yǎng)基中的濃度達到1％，繼續(xù)培養(yǎng)5h。
2)熱處理將由步驟1)所得發(fā)酵液加熱至80℃維持15min，然后冷卻至發(fā)酵溫度，再用冷凍離心機將發(fā)酵液于4℃條件下以6000rpm的速度離心10min，收集上清液即得重組蛋白粗提物，重組蛋白的純度為60％。
實施例2重組大腸桿菌發(fā)酵過程中蛋白滲漏與熱分離相結(jié)合的集成化蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法的步驟如下1)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取一個重組大腸桿菌單菌落接入50ml的種子培養(yǎng)基中(500ml的三角瓶)，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到100mg/l，31℃，220rpm搖床培養(yǎng)22h，按5％接種量將前面的培養(yǎng)液再次接入50ml的種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到100mg/l，31℃，220rpm搖床培養(yǎng)12h，再按3％的接種量將活化的種子液加入到2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素使得濃度達到100mg/ml，31℃，800rpm，控制適宜的溶氧水平，培養(yǎng)9h。然后加入安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導，使其在培養(yǎng)基中濃度達到0.5mM，在添加了安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導后4h，加入Triton X-100，使其在培養(yǎng)基中的濃度達到0.5％，繼續(xù)培養(yǎng)6h。
2)熱處理將由步驟1)所得發(fā)酵液加熱至100℃維持10min，然后冷卻至發(fā)酵溫度，再用冷凍離心機將發(fā)酵液于4℃條件下以7000rpm的速度離心10min，收集上清液即得重組蛋白粗提物，重組蛋白的純度為65％。
實施例3重組大腸桿菌發(fā)酵過程中蛋白滲漏與熱分離相結(jié)合的集成化蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法的步驟如下1)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取一個重組大腸桿菌單菌落接入60ml的種子培養(yǎng)基中(500ml的三角瓶)，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到60mg/l，32℃，260rpm搖床培養(yǎng)20h，按2％接種量將前面的培養(yǎng)液再次接入100ml的種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到60mg/l，32℃，260rpm搖床培養(yǎng)10h，再按2％的接種量將活化的種子液加入到2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素使得濃度達到60mg/ml，32℃，1200rpm，通過酸、堿的加入調(diào)控pH，培養(yǎng)8h。然后加入安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導，使其在培養(yǎng)基中濃度達到0.25mM，在添加了安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導后3.5h，加入Triton X-100，使其在培養(yǎng)基中的濃度達到0.2％繼續(xù)培養(yǎng)6個小時。
2)熱處理將由步驟1)所得發(fā)酵液加熱至80℃維持10min，然后冷卻至發(fā)酵溫度，再用冷凍離心機將發(fā)酵液于4℃條件下以8000rpm的速度離心10min，收集上清液即得重組蛋白粗提物，重組蛋白的純度為70％。
實施例4重組大腸桿菌發(fā)酵過程中蛋白滲漏與熱分離相結(jié)合的集成化蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法的步驟如下1)發(fā)酵從固體培養(yǎng)基上挑取一個重組大腸桿菌單菌落接入100ml的種子培養(yǎng)基中(500ml的三角瓶)，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到70mg/l，35℃，240rpm搖床培養(yǎng)20h，按2％接種量將前面的培養(yǎng)液再次接入100ml的種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中濃度達到70mg/l，35℃，240rpm搖床培養(yǎng)10h，再按2％的接種量將活化的種子液加入到2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素使得濃度達到70mg/ml，35℃，1400rpm培養(yǎng)8h。然后加入安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導，使其在培養(yǎng)基中濃度達到0.25mM，在添加了安慰性誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導后4.5h，加入Triton X-100，使其在培養(yǎng)基中的濃度達到0.2％繼續(xù)培養(yǎng)6h。
2)熱處理將由步驟1)所得發(fā)酵液加熱至80℃維持30min，然后冷卻至發(fā)酵溫度，再用冷凍離心機將發(fā)酵液于4℃條件下以8000rpm的速度離心10min，收集上清液即得重組蛋白粗提物，重組蛋白的純度為70％。
實施例5除表面活性劑或脂溶劑外，其它實驗條件同實施例2，實驗結(jié)果如表1所示表1

權(quán)利要求
1.一種集成化的蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法，其主要包括重組大腸桿菌的培養(yǎng)和外源基因誘導表達階段，其特征在于，在外源基因誘導表達啟動0～12小時后添加表面活性劑或脂溶劑，使其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度達到0.01～10v/v％；發(fā)酵液離心分離之前對其進行熱處理，所說熱處理是指將發(fā)酵液加熱至40～140℃維持0.01～60分鐘。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，其中在外源基因誘導表達啟動0～4小時后添加表面活性劑或脂溶劑。
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，其中所說熱處理是指將發(fā)酵液加熱至80～100℃維持5～30分鐘。
4.如權(quán)利要求1～3所述的任意一種生產(chǎn)方法，其特征在于，其中所說的表面活性劑為曲同X-100，其在培養(yǎng)基中的濃度為0.01～1v/v％。
5.如權(quán)利要求1～3所述的任意一種生產(chǎn)方法，其特征在于，其中選用的發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油或碳水化合物5～50g/l，K2HPO43H2O 10～35g/l，(NH4)2HPO4或其它氮源0.5～15g/l，檸檬酸0.5～5g/l，MgSO47H2O 0.5～5g/l。
6.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，其中選用的發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油或碳水化合物5～50g/l，K2HPO43H2O 10～35g/l，(NH4)2HPO4或其它氮源0.5～15g/l，檸檬酸0.5～5g/l，MgSO47H2O 0.5～5g/l。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白發(fā)酵生產(chǎn)方法，其為一種重組大腸桿菌發(fā)酵過程中蛋白滲漏與熱分離相結(jié)合的集成化生產(chǎn)方法。本發(fā)明成功地將化學滲漏法直接應(yīng)用于發(fā)酵過程中，實現(xiàn)了菌體生長和重組蛋白選擇性滲漏協(xié)調(diào)地進行。重組蛋白滲漏不僅簡化了純化重組蛋白的工藝，也提高了目標產(chǎn)物的表達水平。同時，選用優(yōu)化的培養(yǎng)基組成，針對熱穩(wěn)定性重組蛋白(如目標蛋白和硫氧還蛋白的融合蛋白)產(chǎn)物，在發(fā)酵過程結(jié)束時加熱后再離心。熱處理不僅進一步促使蛋白的滲漏，而且使相當多的雜蛋白、核酸等變性后沉淀下去。經(jīng)檢測，超過90％的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，且離心后上清液中重組蛋白的純度可達60％～70％。
文檔編號C12P21/00GK1661033SQ200410089499
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者魏東芝, 傅向陽, 童望宇 申請人:華東理工大學