專利名稱：：一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌、篩選方法及其在固體發(fā)酵中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌、篩選方法及其固體發(fā)酵中的應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：我國是世界上最大的養(yǎng)殖生產(chǎn)國之一，同時(shí)也是世界上飼料原料特別是蛋白質(zhì)原料的需求大國。我國飼料工業(yè)生產(chǎn)中蛋白質(zhì)飼料資源的嚴(yán)重不足已成為事實(shí)，對國際原料市場強(qiáng)大的依賴性，導(dǎo)致我國配合飼料的生產(chǎn)成本居高不下，價(jià)格波動(dòng)使生產(chǎn)企業(yè)處于虧損的邊緣，抑制了飼料工業(yè)的發(fā)展。飼料蛋白作為第一大和第一重要的原料是制約我國畜牧業(yè)發(fā)展的第一大權(quán)重因子，主控權(quán)受制于國外，因此飼料蛋白成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的第一大原料供給瓶頸和食物供給安全瓶頸，詞料蛋白資源的開發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，更具有重要的國家安全意義。我國詞料工業(yè)的發(fā)展，對植物性蛋白原料需求不斷增加，而我國長江、黃河中下游和新疆地區(qū)為棉花主產(chǎn)區(qū)，每年可提供約600萬噸棉籽，是我國飼料蛋白質(zhì)重要的來源之一。棉籽(餅)粕是棉籽去油后的一種加工副產(chǎn)品，它是一種常用的高蛋白質(zhì)飼料，其蛋白質(zhì)含量可達(dá)38%~46%，年產(chǎn)量可達(dá)400萬噸以上，占我國年產(chǎn)各種餅粕總量的12%左右。棉籽粕中含有棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中棉酚對動(dòng)物危害性最大，因而最受大家關(guān)注。世界上每年的每年棉籽產(chǎn)量在4400萬噸左右，而我國的棉籽總量為9501100萬噸，因而對棉籽進(jìn)行深加工綜合開發(fā)，不僅可以有效地緩解植物蛋白的供需矛盾，也可使棉籽油、棉酚和棉籽殼在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域被廣泛使用，隨著開發(fā)的深入，其應(yīng)用前景十分廣闊。我國是全球頭號(hào)產(chǎn)棉大國，棉籽資源非常豐富。產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的1/4。我國的主要產(chǎn)棉地有山東、新疆、江蘇、湖北、河北、安徽、湖南和河南等省。棉籽是與棉花纖維分開后未加工的、純的含油種子，棉籽蛋白是從棉籽中提取的一種植物蛋白，主要有棉粕、棉籽餅、棉籽蛋白粉等形式，經(jīng)壓榨處理的棉籽稱為棉籽餅，溶劑浸提的稱為棉籽粕。棉籽(餅)粕的營養(yǎng)價(jià)值隨棉花的品種、種植環(huán)境、是否去殼及榨油的工藝不同而不同。其蛋白質(zhì)含量在35%以上，另外棉籽蛋白中含有毒性物質(zhì)-游離棉酚和環(huán)丙烯類脂肪酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，是限制棉籽(餅)粕利用的主要因素，因此棉籽脫酚是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前常用的脫酚方法為采用有機(jī)溶劑對棉籽蛋白進(jìn)行萃取，如申請?zhí)枮?00610115230的中國專利，采用6號(hào)溶劑油和乙醇分別浸出，得到脫酚的棉籽蛋白。但是額外加入的有機(jī)溶劑增加了成本。此外，也可采用微生物發(fā)酵的方法將棉粕中的棉酚轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，達(dá)到脫毒的目的。鐘英長(1989)等從自然界霉變棉籽餅中，分離篩選出對棉酚有耐受能力的霉菌，接種在棉籽中發(fā)酵，脫毒率達(dá)60%75%，總脫毒率在80%以上，并使棉仁餅和棉籽餅的蛋白質(zhì)分別提高5.18%和5.75%，氨基酸含量分別提高7.14%和21.9%。在此基礎(chǔ)上研制的微生物固態(tài)菌種發(fā)酵脫毒法，具有脫毒率高，發(fā)酵時(shí)間短，投資小，成本低，工藝簡單，發(fā)酵過程能增加生物活性物質(zhì)，改善營養(yǎng)及適口性等特點(diǎn)。但是上述方法所采用的微生物如霉菌等脫酚的棉籽蛋白可能對動(dòng)物有不利的影響。可見采用微生物發(fā)酵的方法對棉籽蛋白進(jìn)行脫毒的關(guān)鍵在于菌種的選擇和發(fā)酵工藝的控制。本發(fā)明是以有益乳酸桿菌為發(fā)酵菌種，對棉籽蛋白進(jìn)行發(fā)酵，采用符合我國國情的固態(tài)發(fā)酵法進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)；不僅提高經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也保護(hù)生態(tài)環(huán)境，推動(dòng)我國畜牧業(yè)持續(xù)、健康、穩(wěn)定地發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌，該菌株既可以使用于脫除植物蛋白中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，又可以作為益生菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并長期存活，對動(dòng)物生長發(fā)育起有益作用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌的篩選方法。本發(fā)明的又一目的在于提供上述乳酸桿菌在固體發(fā)酵中的應(yīng)用。簡單的說，本發(fā)明提供了一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌，該乳酸桿菌為2008年4月1日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》的乳酸桿菌Lactobacillussp.，保藏號(hào)為CGMCCNo.2426。其中，所述的乳酸桿菌的生物學(xué)特性為(1)菌株桿狀；(2)菌落乳白色，邊緣整齊；(3)發(fā)酵后有乳酸產(chǎn)生；(4)該乳酸桿菌與大腸桿菌K88、K99或987P混合培養(yǎng)時(shí)，其抑制大腸桿菌生長的抑菌直徑達(dá)到1.2cm;(5)在pH2.0處理10小時(shí)后存活率為73%，當(dāng)溫度為6(TC培養(yǎng)15分鐘，存活率為56%。本發(fā)明還提供了一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌的篩選方法，包括(1)出發(fā)菌種的初篩利用RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基對動(dòng)物消化道不同位置的微生物進(jìn)行選擇行篩選，以獲得乳酸桿菌；(2)菌種耐酸特性的復(fù)篩利用MRS培養(yǎng)基對初篩出的乳酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以在pH為2.0時(shí)進(jìn)行耐受性篩選，從而獲得耐酸性較高的乳酸桿菌；(3)菌種的益生特性篩選利用MRS培養(yǎng)基對耐酸性較高的乳酸桿菌進(jìn)行乳酸產(chǎn)量的篩選以及對致病性大腸桿菌抑制性能的篩選，以獲得益生性能較好的乳酸桿菌；(4)菌種的脫酚能力篩選首先利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行益生性能較好的乳酸桿菌發(fā)酵18小時(shí)后，將發(fā)酵液按1%的重量比加入棉籽蛋白中，將固體發(fā)酵基質(zhì)水分含量調(diào)至50%，發(fā)酵24小時(shí)，干燥，即得發(fā)酵脫毒的棉籽蛋白產(chǎn)品，測定發(fā)酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，當(dāng)脫酚率至少在50%以上時(shí)，該乳酸桿菌即為所需的乳酸桿菌。其中，步驟(1)中所述的動(dòng)物為豬，優(yōu)選仔豬，步驟(3)中進(jìn)行乳酸產(chǎn)量的篩選的標(biāo)準(zhǔn)為接種量為1.0%的條件下，經(jīng)過20小時(shí)培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中乳酸的含量達(dá)到5—6%以上。對致病性大腸桿菌抑制性能的篩選的標(biāo)準(zhǔn)為所述乳酸桿菌的抑菌直徑為1.2cm。本發(fā)明還提供了權(quán)利要求1所述的乳酸桿菌在固體發(fā)酵中的應(yīng)用。其中，所述的固體發(fā)酵采用植物蛋白進(jìn)行發(fā)酵，優(yōu)選大豆蛋白和棉籽蛋白。固體發(fā)酵中固液比為l:0.6—1.5，優(yōu)選l:0.8。發(fā)酵溫度為29—37。C，pH為4.5—5.5，接種量為6—10%,發(fā)酵時(shí)間為2—4天。優(yōu)選發(fā)酵溫度為37'C，pH為5，接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為3天。以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述?，F(xiàn)有技術(shù)采用微生物對棉籽蛋白進(jìn)行發(fā)酵脫酚，為從自然界霉變棉籽餅中，分離篩選出對棉酚有耐受能力的霉菌，接種在棉籽中發(fā)酵，以達(dá)到脫除棉酚的目的。但是由于霉菌中有害菌種類較多，因此該方法所采用的霉菌脫酚的棉籽蛋白有可能對動(dòng)物有不利的影響，即使所用的霉菌為有益菌種，但其在動(dòng)物消化道中也無法長期存活。乳酸桿菌為一種益生菌，可有效促進(jìn)動(dòng)物生長和提高動(dòng)物對疾病的抵抗力。何明清等(1986)對病、健仔豬腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬腸道中的乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)數(shù)量顯著下降，大腸桿菌數(shù)顯著上升。使用乳酸桿菌益生素可以調(diào)整胃腸道微生態(tài)平衡(Fuller等，1978)，所以乳酸桿菌是一種很有前途的益生素生產(chǎn)菌種。美國FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品種共43種，其中乳酸桿菌占12種，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部1999年公布允許使用的12種飼用微生物中有3種是乳酸桿菌。在美國，益生素工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)品57%含有乳酸桿菌屬(李玲，1995)。大連醫(yī)學(xué)院康白等開發(fā)研制的乳酶生，是一種乳酸桿菌的干燥制劑，保存期間穩(wěn)定性好，每克產(chǎn)品含活乳酸桿菌約107個(gè)，仔豬每日口服3-4克可以有效治療腹瀉。因此本發(fā)明的目標(biāo)在于分離一種用來進(jìn)行棉籽蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌，使得該菌株既可以使棉籽蛋白脫酚，又可以作為益生菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并長期存活，對動(dòng)物生長發(fā)育起有益作用。為了達(dá)到這個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下方法進(jìn)行篩選1、出發(fā)菌種的初篩利用RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基對動(dòng)物消化道不同位置的微生物進(jìn)行選擇行篩選，以獲得乳酸桿菌。其中RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基配方為現(xiàn)有技術(shù)，具體為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸椽酸銨2g，磷酸二氫鉀6g,七水硫酸鎂0.58g，四水硫酸錳0.25g，硫酸亞鐵0.03g，吐溫-80:lg，瓊脂13g，蒸餾水1000mL，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0。由于采用的出發(fā)菌種為動(dòng)物消化道不同位置的微生物，如胃中、十二指腸中、空腸中或結(jié)腸中，這樣所篩選出的有益菌種由于為動(dòng)物消化道中天然存在的微生物，因而必定可以長期存活，優(yōu)選采用豬消化道不同位置的微生物，更優(yōu)選采用仔豬消化道不同位置的微生物。采用RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基的目的在于排除雜菌，獲得乳酸桿菌,，這是由于RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基含有5M的醋酸鈉(W/V),培養(yǎng)基的pH為5.0,在此條件下消化道內(nèi)的微生物只有乳酸桿菌能夠生長，而其它微生物不會(huì)生長。2、菌種耐酸特性的復(fù)篩利用MRS培養(yǎng)基對初篩出的乳酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以在pH為2.0時(shí)進(jìn)行耐受性篩選，從而獲得耐酸性較高的乳酸桿菌；其中MRS培養(yǎng)基配方為現(xiàn)有技術(shù)，具體為蛋白胨，10g;牛肉浸膏，10g;酵母浸粉，5g;磷酸氫二鉀，2g;枸椽酸二銨，2g;葡萄糖，20g;七水硫酸鎂，0.58g;四水硫酸錳，0.25g;醋酸鈉，5g;吐溫-80，lg;蒸餾水，1000mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至2.0。經(jīng)過耐酸篩選出的乳酸桿菌，可抵抗胃酸的殺菌作用，降低其在胃中的死亡率。3、菌種的益生特性篩選利用MRS培養(yǎng)基對耐酸性較高的乳酸桿菌進(jìn)行乳酸產(chǎn)量的篩選以及對致病性大腸桿菌抑制性能的篩選，以獲得益生性能較好的乳酸桿菌。其中，乳酸產(chǎn)量篩選的標(biāo)準(zhǔn)是，在接種量為1.0%的條件下，經(jīng)過20小時(shí)培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中乳酸的含量要達(dá)到5—6%以上。對治病性大腸桿菌抑制性能的篩選的標(biāo)準(zhǔn)為乳酸桿菌的抑菌直徑要達(dá)到1.2cm或以上，在抑菌直徑的范圍內(nèi)，乳酸桿菌可抑制大腸桿菌的生長，特別是致病性大腸桿菌K88、K99或987P的生長。4、菌種的脫酚能力篩選首先利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸桿菌發(fā)酵18小時(shí)后，將固體發(fā)酵基質(zhì)水分含量調(diào)至50%，發(fā)酵24小時(shí)，干燥，即得發(fā)酵脫毒的棉籽蛋白產(chǎn)品，測定發(fā)酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，當(dāng)脫酚率至少在50%以上時(shí)，該乳酸桿菌即為所需的乳酸桿菌。經(jīng)過上述步驟的篩選，即可得到既能對棉籽蛋白進(jìn)行發(fā)酵以降低棉酚含量，又能產(chǎn)生較多乳酸同時(shí)具有大腸桿菌抑菌性能的乳酸桿菌。發(fā)明人經(jīng)過上述篩選，即得到了一株性能優(yōu)異的用來進(jìn)行棉籽蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌，該乳酸桿菌為2008年4月1日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》的乳酸桿菌Lactobacillussp.，保藏號(hào)為CGMCCNo.2426。該乳酸桿菌的生物學(xué)特性為(1)菌株桿狀；(2)菌落乳白色，邊緣整齊；(3)發(fā)酵后有乳酸產(chǎn)生；(4)該乳酸桿菌與大腸桿菌K88、K99或987P混合培養(yǎng)時(shí)，其抑制大腸桿菌生長的抑菌直徑達(dá)到1.2cm;(5)在pH2.0處理10小時(shí)后存活率為73%，當(dāng)溫度為60'C培養(yǎng)15min,存活率為56%。為了更好的利用該菌株，發(fā)明人就該菌株在固體發(fā)酵中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。固體發(fā)酵與液體發(fā)酵相比，基質(zhì)不溶于水，培養(yǎng)基單純，發(fā)酵原料成本低。發(fā)明人以棉籽蛋白為基質(zhì)，對該菌株在固體發(fā)酵中的應(yīng)用條件進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵中固液比以l:0.6—1.5為宜，優(yōu)選l:0.8，其中固體是指棉籽蛋白，液體包括水和菌種液，菌種液取處于對數(shù)期和穩(wěn)定期的乳酸桿菌，其中乳酸菌濃度通常大于101G/ml。發(fā)酵溫度為29—37'C，pH為4.5—5.5，接種量為6—10%，發(fā)酵時(shí)間為2—4天，優(yōu)選的發(fā)酵溫度為37r，pH為5，接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為3天。此處接種量為菌種液體積與棉籽蛋白重量的比，其中體積以ml計(jì)，重量以g計(jì)。在上述發(fā)酵條件下，乳酸桿菌脫除棉酚的能力最高，同時(shí)棉籽蛋白發(fā)酵后粗蛋白含量有所增加，粗纖維含量有所降低，增加了棉籽蛋白作為飼料的營養(yǎng)價(jià)值。此外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該乳酸桿菌不僅可用來脫除棉酚，還可用來脫除其它植物蛋白中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如以應(yīng)用廣泛的大豆蛋白為例，其存在形式以豆粕最為普遍。而豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如抑制生長的胰蛋白酶抑制因子，抑制胰凝乳蛋白酶和膽堿酶活性的皂苷，降低蛋白質(zhì)溶解性和酶活性的植酸等，這些都會(huì)對詞料的營養(yǎng)價(jià)值造成影響。而乳酸桿菌CGMCCNo.2426可脫除這些抗?fàn)I養(yǎng)因子，使之降解為無害的其它物質(zhì)。以豆粕等其它植物蛋白為基質(zhì)對對該菌株在固體發(fā)酵中的條件進(jìn)行探索，其適宜條件與棉籽蛋白大體相同。綜上所述，本發(fā)明提供了一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌的篩選方法，用這種方法分離的保藏號(hào)為CGMCCNo.2426的乳酸桿菌菌株，該菌株既可以脫除植物蛋白中的棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子，又可以作為益生菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并長期存活，對動(dòng)物生長發(fā)育起有益作用。保藏說明菌株乳酸桿菌丄0f加&"c/腸印.保藏日期2008年4月1日保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏編號(hào)CGMCCNo.2426。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本實(shí)施例所用的胰蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、醋酸鈉、枸椽酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、四水硫酸錳、硫酸亞鐵、吐溫-80、瓊脂、蛋白胨、牛肉浸膏、枸椽酸二銨、醋酸鈉均購于Sigma公司。本實(shí)施例為保藏號(hào)為CGMCCNo，2426的乳酸桿菌菌株的篩選過程，具體步驟為(1)、出發(fā)菌種的初篩利用RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基對仔豬消化道不同位置的微生物進(jìn)行選擇行篩選，以獲得乳酸桿菌。其中RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基配方為現(xiàn)有技術(shù)，具體為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸鈉15g，枸椽酸銨2g，磷酸二氫鉀6g，七水硫酸鎂0.58g，四水硫酸錳0.25g，硫酸亞鐵0.03g，吐溫-80:lg，瓊脂13g，蒸餾水1000mL，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0。(2)、菌種耐酸特性的復(fù)篩利用MRS培養(yǎng)基對初篩出的乳酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以在pH為2.0時(shí)進(jìn)行耐受性篩選，從而獲得耐酸性較高的乳酸桿菌；其中MRS培養(yǎng)基配方為現(xiàn)有技術(shù)，具體為蛋白胨，10g;牛肉浸膏，10g;酵母浸粉，5g;磷酸氫二鉀，2g;枸椽酸二銨，2g;葡萄糖，20g;七水硫酸鎂，0.58g;四水硫酸錳，0.25g;醋酸鈉，5g;吐溫-80，lg;蒸餾水，1000mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至2.0。(3)、菌種的益生特性篩選利用MRS培養(yǎng)基對耐酸性較高的乳酸桿菌進(jìn)行乳酸產(chǎn)量的篩選以及對致病性大腸桿菌抑制性能的篩選，以獲得益生性能較好的乳酸桿菌。其中，乳酸產(chǎn)量篩選的標(biāo)準(zhǔn)是，在接種量為1.0%的條件下，經(jīng)過20小時(shí)培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中乳酸的含量要達(dá)到5—6%以上。對治病性大腸桿菌抑制性能的篩選的標(biāo)準(zhǔn)為乳酸桿菌對致病性大腸桿菌K88、K99或987P的抑菌直徑要達(dá)到1.2cm或以上。(4)、菌種的脫酚能力篩選首先利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸桿菌發(fā)酵18小時(shí)后，將發(fā)酵液按體積重量比10%加入棉籽蛋白中，將固體發(fā)酵基質(zhì)水分含量調(diào)至50%，發(fā)酵24小時(shí)，干燥，即得發(fā)酵脫毒的棉籽蛋白產(chǎn)品，測定發(fā)酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，當(dāng)脫酚率至少在50%以上時(shí)，該乳酸桿菌即為所需的乳酸桿菌。經(jīng)過篩選，得到一株乳酸桿菌Lactobacillussp，2008年4月1日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，保藏號(hào)為CGMCCNo.2426。該菌株桿狀；菌落乳白色，邊緣整齊；發(fā)酵后有乳酸產(chǎn)生；該乳酸桿菌與大腸桿菌K88、K99或987P混合培養(yǎng)時(shí)，其抑制大腸桿菌生長的抑菌直徑達(dá)到1.2cm;在pH2.0處理IO小時(shí)后存活率為73%，當(dāng)溫度為6(TC培養(yǎng)15分鐘，存活率為56%。實(shí)施例2本實(shí)施例是實(shí)施例1保藏號(hào)為CGMCCNo.2426的乳酸桿菌對棉籽蛋白脫毒效果和發(fā)酵條件的研究。1材料和方法1.1菌種和原料發(fā)酵菌種為乳酸桿菌(LA,CGMCCNo.2426)，棉籽蛋白購于市場。1.2分析方法游離棉酚苯胺法，按國標(biāo)GB13086—91"飼料中游離棉酚的測定方法"進(jìn)行；粗蛋白凱氏定氮法；粗纖維按國標(biāo)GBT6434—94;其它營養(yǎng)成分測定均參考國標(biāo)進(jìn)行處理分析。1.3主要設(shè)備UV—2000紫外可見分光光度計(jì)(龍尼柯儀器有限公司)、DHP—9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、DHG~9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司)、高速萬能粉碎機(jī)FW100型(天津市泰斯特儀器有限公司)、DSHL—300多用途水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、LX—C35Z型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)，操鏡臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造)。1.4主要工藝流程乳酸桿菌厭氧培養(yǎng)連續(xù)傳3代作為試驗(yàn)的菌種保藏備用。乳酸桿菌活化后以2%接種在37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h，然后轉(zhuǎn)入37'C種子培養(yǎng)罐培養(yǎng)13h。棉籽蛋白不經(jīng)過滅菌，加入水和生產(chǎn)好的液體菌種，充分?jǐn)嚢韬筮M(jìn)行恒溫發(fā)酵。1.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.5.1確定菌種發(fā)酵棉籽蛋白的固液比例。根據(jù)在一定的培養(yǎng)條件下，觀察記錄發(fā)酵棉籽蛋白的表觀性狀，以及檢測發(fā)酵后棉籽蛋白游離棉酚含量，計(jì)算脫毒率，干物質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量和產(chǎn)率等指標(biāo)，篩選出最佳適宜固態(tài)發(fā)酵的固液比例。1.5.2單因素試驗(yàn)。根據(jù)微生物的特點(diǎn)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，主要影響因素為溫度、時(shí)間、pH和接種量。1.5.3正交試驗(yàn)。根據(jù)篩選出的最佳固液比，按照正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素及水平見表l。根據(jù)試驗(yàn)的研究目的，單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)主要測定指標(biāo)為游離棉酚的含量，并計(jì)算脫毒率。表l正交試驗(yàn)因素和水平(乳酸發(fā)酵)水平12溫度rc)A293337時(shí)間(d)B2接種量(％)C6810PHD4.55脫毒率=降解棉酚含量發(fā)酵前棉酚含]Xl00%:發(fā)酵前棉酚含量_發(fā)酵后棉酚含]發(fā)酵前棉酚含量xl00%發(fā)酵后干物質(zhì)腿x婦M發(fā)酵前干物質(zhì)質(zhì)量1.5.4綜合試驗(yàn)。按照最佳的脫毒條件，對棉籽蛋白進(jìn)行擴(kuò)大試驗(yàn)，取樣并測定游離棉酚、粗蛋白、粗纖維、鈣、總磷、灰分、鹽分等營養(yǎng)指標(biāo)的含量。1.6統(tǒng)計(jì)分析采用Excel對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。2結(jié)果與討論2.1乳酸桿菌發(fā)酵結(jié)果2丄1固液比對乳酸桿菌固體發(fā)酵效果的影響棉籽蛋白為淡黃色固體粉末，液體包括水和液體菌種，在37'C，自然pH，接種量為8%的條件下固態(tài)厭氧發(fā)酵4天。從表2可知，在6種不同固液比例水平的乳酸厭氧發(fā)酵后，棉籽蛋白中游離棉酚的含量均減少，且以固液比為1:1.2的游離棉酚含量最低，為216ppm，脫毒率為55.83%。而發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率正好相反，干物質(zhì)中粗蛋白的含量以固液比為1:0.8的最高，為59.02%。且從各方面的性狀來看，氣味為酸香味，烘干后味道變淡，顏色稍微加深，呈金黃色。當(dāng)固液比在1:11:2之間，液體的含量過多，發(fā)酵結(jié)束后不容易把產(chǎn)物全部收回，且烘干較慢。另外，固液比在1:11:1.2時(shí)棉籽蛋白不容易攪拌均勻。而固液比在1:0.8時(shí)發(fā)酵結(jié)果較接近各方面12的最優(yōu)值，游離棉酚的含量為217ppm，且干物質(zhì)中粗蛋白含量最高，外觀呈黃色濕粉狀，能保持基質(zhì)足夠的水分并易于發(fā)酵操作。所以，乳酸桿菌發(fā)酵棉籽蛋白最佳的固液比例選擇為1:0.8。表2固液比對乳酸桿菌固體發(fā)酵結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2丄2乳酸桿菌的發(fā)酵條件根據(jù)上面試驗(yàn)的結(jié)果，以固液比為1:0.8的比例對乳酸桿菌厭氧發(fā)酵棉籽蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化。從表3可以看出，對棉籽蛋白脫毒率影響最大的是溫度，隨之依次是接種量、時(shí)間和pH值，即各因素的影響力由主到次為A〉C〉B>D，B(時(shí)間)和D因素(pH)是對脫毒率的影響次要兩個(gè)因素，當(dāng)固態(tài)厭氧發(fā)酵到第三天以后，脫毒率變化不大，所以為了縮短生產(chǎn)周期，發(fā)酵三天即可，不同條件下得到兩組的脫毒率最高，為55.92%。由于棉籽蛋白不經(jīng)過滅菌處理，所以接種量選擇10%為好。此處接種量為菌種液體積與棉籽蛋白重量的比，其中體積以ml計(jì)，重量以g計(jì)。綜合它們的主要因素得到的最佳脫毒條件為A3B2C3D2，即在溫度為37'C，pH值為5，接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為3d時(shí)，脫毒率為最高。_表3正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析(乳酸桿菌發(fā)酵)_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.3乳酸發(fā)酵方法對棉籽蛋白營養(yǎng)成分的影響在最佳脫毒工藝條件下，用乳酸桿菌對棉籽蛋白進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，然后測定發(fā)酵后棉籽蛋白中的游離棉酚、粗蛋白、粗纖維、灰分、鹽分、鈣和總磷的含量。由表4可知，經(jīng)過乳酸桿菌發(fā)酵后脫毒率分別為56.24%;粗蛋白分別增加了2.51%;粗纖維則分別降低了2.55%,其它營養(yǎng)成分變化不大。表4發(fā)酵前后棉籽蛋白營養(yǎng)成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過以上試驗(yàn)表明，乳酸桿菌能分解棉籽蛋白中有毒成份一游離棉酚，降低粗纖維并提高粗蛋白的含量。3小結(jié)3.1利用乳酸桿菌在厭氧條件下對棉籽蛋白進(jìn)行固體發(fā)酵的最佳條件為溫度37°C，pH值為5，接種量為10%，固液比為1:0.8時(shí)發(fā)酵3d的脫毒效果最好。3.2利用本試驗(yàn)方法棉籽蛋白經(jīng)過脫毒后，棉酚的含量可以降低56%，達(dá)到國家飼料用棉籽餅粕的安全標(biāo)準(zhǔn)為棉酚含量在400ppm以下，同時(shí)提高了粗蛋白的含實(shí)施例3本實(shí)施例是經(jīng)過實(shí)施例1保藏號(hào)為CGMCCNo.2426的乳酸桿菌發(fā)酵后的棉籽蛋白對仔豬性能的影響。1、材料與方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)選取5055日齡左右的大白和長白仔豬108頭，按體重、性別、遺傳基礎(chǔ)相似的原則隨機(jī)分為3個(gè)處理，每個(gè)處理4欄，每欄9頭，公母各半。4個(gè)處理分別為對照組(不添加棉籽蛋白)、棉籽蛋白組、乳酸桿菌發(fā)酵棉籽蛋白組。試驗(yàn)期28d。棉籽蛋白粉購于市場。動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表5。表5試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理添加量處理重復(fù)數(shù)重復(fù)豬數(shù)(頭)對照組一49棉籽蛋白組5%49乳酸桿菌發(fā)酵棉籽蛋白組5%491.2試驗(yàn)日糧以總氨基酸為基礎(chǔ)，參照NRC(1998)豬營養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)日糧，仔豬日糧的原料組成及營養(yǎng)水平見表6。試驗(yàn)預(yù)混料來自北京九洲大地科技有限公司。1.3飼養(yǎng)管理仔豬采用高床飼養(yǎng)，欄內(nèi)面積247cm2、117cm2，舍內(nèi)溫度保持2022°C。自由采食和飲水，免疫及消毒程序按豬場常規(guī)進(jìn)行。1.4檢測指標(biāo)為檢驗(yàn)發(fā)酵棉籽蛋白粉在仔豬上的應(yīng)用效果，試驗(yàn)從仔豬健康水平與生產(chǎn)性能兩方面進(jìn)行考察，分別在試驗(yàn)的第l、14和28d對全部仔豬進(jìn)行個(gè)體稱重，統(tǒng)計(jì)階段耗料量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和飼料增重比。并記錄全期腹瀉仔豬頭次數(shù)。1.5統(tǒng)計(jì)分析將全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，用Excel和Spssl2.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。表6仔豬日糧組成及營養(yǎng)成分含量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注4%預(yù)混料含鐵3735mg,銅12504980mg鋅3362mg,錳492mg，硒8rag，碘9mg，鈣10.4%22.4%,磷》2.2%,食鹽6.2%13.4%,VA237000IU，VD:,47300IU,VE587mg，尼克酸20.Omg，泛酸鈣253mg，葉酸12mg，VK343.5mg,VB2144mg，VB,36mg,VB12574wg,氯化膽堿9850mg，生物素184mg'VB62.5mg。2結(jié)果與討論2.1發(fā)酵棉籽蛋白粉對仔豬生產(chǎn)性能的影響發(fā)酵棉籽蛋白粉對仔豬生產(chǎn)性能的影響結(jié)果見表7。在試驗(yàn)前期，乳酸桿菌組仔豬的結(jié)束體重、平均日增重、飼料增重比表現(xiàn)最佳。各組的日采食量差異均不顯著。其中，未發(fā)酵處理棉籽組的飼料增重比最高，為2.14，乳酸組最低，為1.38，在日增重方面，乳酸組最高為497.86g/d，未發(fā)酵處理棉籽組最低為321.43g/d。與對照組相比，乳酸組的日增重分別提高37.2%。而飼料增重比則分別降低28.12%。在試驗(yàn)的后期，棉籽組的日增重、詞料增重比差異不顯著(P>0.05)，但是與對照組相比，日增重均高于對照組(459.29g)，飼料增重比均顯著低于對照組(2.46)，乳酸組的末重最高為28.96Kg，對照組最低為26.01Kg。從試驗(yàn)全期來看，試驗(yàn)各組的日采食量均差異不顯著(P>0.05)，但是各組的曰增重差異均顯著(p〈0.05),與對照組相比，未發(fā)酵處理的棉籽蛋白的飼料增重比差異不顯著(P>0.05)，，乳酸組的詞料增重比極顯著低于對照組(p〈0.01)。全期的腹瀉率未發(fā)酵處理的棉籽蛋白粉和對照組最高為11.43%，乳酸的最低為3.74%。表7棉籽蛋白粉對仔豬生產(chǎn)性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注同行肩注不同表示差異顯著(p〈0.05)，只要有相同字母即差異不顯著(pX).05)，相間字母表示差異極顯著(p〈0.01)，SEM表示平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。權(quán)利要求1、一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌，其特征在于，該乳酸桿菌為2008年4月1日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》的乳酸桿菌Lactobacillussp.，保藏號(hào)為CGMCCNo.2426。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸桿菌，其特征在于，所述的乳酸桿菌的生物學(xué)特性為(1)菌株桿狀；(2)菌落乳白色，邊緣整齊；(3)發(fā)酵后有乳酸產(chǎn)生；(4)該乳酸桿菌與大腸桿菌K88、K99或987P混合培養(yǎng)時(shí)，其抑制大腸桿菌生長的抑菌直徑達(dá)到1.2cm;(5)在pH2.0處理10小時(shí)后存活率為73%，當(dāng)溫度為60'C培養(yǎng)15min,存活率為56%。3、一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌的篩選方法，其特征在于，包括(1)出發(fā)菌種的初篩利用RogosaSL完全選擇性培養(yǎng)基對動(dòng)物消化道不同位置的微生物進(jìn)行選擇行篩選，以獲得乳酸桿菌；(2)菌種耐酸特性的復(fù)篩利用MRS培養(yǎng)基對初篩出的乳酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以在pH為2.0時(shí)進(jìn)行耐受性篩選，從而獲得耐酸性較高的乳酸桿菌；(3)菌種的益生特性篩選利用MRS培養(yǎng)基對耐酸性較高的乳酸桿菌進(jìn)行乳酸產(chǎn)量的篩選以及對致病性大腸桿菌抑制性能的篩選，以獲得益生性能較好的乳酸桿菌；(4)菌種的脫酚能力篩選首先利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行益生性能較好的乳酸桿菌發(fā)酵18小時(shí)后，將發(fā)酵液按體積重量比10%加入棉籽蛋白中，其中體積以ral計(jì)，重量以g計(jì)，將固體發(fā)酵基質(zhì)水分含量調(diào)至50%，發(fā)酵24小時(shí)，干燥，即得發(fā)酵脫毒的棉籽蛋白產(chǎn)品，測定發(fā)酵前后棉籽蛋白中棉酚含量，當(dāng)脫酚率至少在50%以上時(shí)，該乳酸桿菌即為所需的乳酸桿菌。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中所述的動(dòng)物為豬，優(yōu)選仔豬，步驟(3)中進(jìn)行乳酸產(chǎn)量的篩選的標(biāo)準(zhǔn)為接種量為1.0%的條件下，經(jīng)過20小時(shí)培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中乳酸的含量達(dá)到5—6%以上。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述的步驟(3)中對致病性大腸桿菌抑制性能的篩選的標(biāo)準(zhǔn)為所述乳酸桿菌的抑菌直徑為1.2cm。6、權(quán)利要求l所述的乳酸桿菌在固體發(fā)酵中的應(yīng)用。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固體發(fā)酵采用植物蛋白進(jìn)行發(fā)酵，優(yōu)選大豆蛋白和棉籽蛋白。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固體發(fā)酵中固液比為1:0.6—1.5，優(yōu)選1:0.8。9、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固體發(fā)酵中發(fā)酵溫度為29—37。C，pH為4.5—5.5，接種量為6—10%，發(fā)酵時(shí)間為2—4天。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固體發(fā)酵中發(fā)酵溫度為37。C，pH為5，接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為3天。全文摘要本發(fā)明提供了一種用來進(jìn)行植物蛋白發(fā)酵的乳酸桿菌、篩選方法及其在固體發(fā)酵中應(yīng)用，用這種方法分離的保藏號(hào)為CGMCCNo.2426的乳酸桿菌菌株，該菌株既用于脫除植物蛋白中的大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子、棉酚等的抗?fàn)I養(yǎng)因子，又可以作為益生菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并長期存活，對動(dòng)物生長發(fā)育起有益作用。文檔編號(hào)A23J3/00GK101307300SQ20081009735公開日2008年11月19日申請日期2008年5月13日優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日發(fā)明者潘寶海申請人:北京巨潤農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司