專利名稱：經(jīng)改變的自生微生物、疫苗組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及疫苗組合物和免疫療法。特別地，本發(fā)明涉及的是疫苗組合物，這些組合物包含一群經(jīng)過(guò)改變的(modified)自生的微生物，這些微生物可以用于向個(gè)體傳輸特定抗原。在這種組合物中，疫苗針對(duì)的是微生物自身或者是整合到微生物中的異源抗原。本發(fā)明還涉及的是使用該經(jīng)改變的微生物荷載和誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞的活化和成熟。
背景技術(shù)：
已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多疫苗用于臨床，這些疫苗大多數(shù)的用途是預(yù)防由病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)導(dǎo)致的傳染性疾病?？梢允褂没畹臏p毒的微生物、滅活的(殺死的)微生物或者微生物自身的組分制備疫苗?；畹臏p毒微生物包含遺傳改變，例如毒力因子的刪除，導(dǎo)致微生物毒力的減弱。對(duì)于滅活的疫苗，可以用化學(xué)或者物理方法對(duì)微生物進(jìn)行滅活。理想情況下，這種疫苗不會(huì)導(dǎo)致感染但是仍然能夠刺激產(chǎn)生所需要的免疫應(yīng)答。滅活疫苗的實(shí)例包括脊髓灰質(zhì)炎病毒和流感病毒，以及抗霍亂和百日咳的細(xì)菌疫苗，當(dāng)然對(duì)于脊髓灰質(zhì)炎、流感和霍亂也有活的減毒疫苗。為了引發(fā)所需的免疫應(yīng)答，重要的是滅活的微生物在滅活之前要包含正確的抗原。在一些情況中觀察到微生物的滅活導(dǎo)致免疫應(yīng)答的顯著降低，原因是需要感染性微生物的基因表達(dá)重新開(kāi)始，以刺激產(chǎn)生最佳的免疫應(yīng)答。這對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌是非常重要的。已經(jīng)用于滅活細(xì)菌的方法包括使用丙酮、乙醇、福爾馬林、戊二醛、低聚甲醛或者苯酚、加熱或者紫外線輻射[Pace等人，Vaccine 16(16)1563(1998)]。
除了使用微生物疫苗預(yù)防由微生物自身導(dǎo)致的傳染性疾病，可以對(duì)微生物進(jìn)行改變使其包含編碼某種蛋白或者抗原的異源核酸序列。這種重組微生物用作傳輸載體且可以用作疫苗，以刺激產(chǎn)生對(duì)異體抗原的免疫應(yīng)答。已經(jīng)顯示這些重組疫苗在動(dòng)物模型上是有效的。經(jīng)過(guò)改變后表達(dá)伯氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium berghei)環(huán)子孢子蛋白抗原的活的減毒沙門(mén)氏菌制備的口服疫苗，可以保護(hù)小鼠不感染瘧疾[Aggarwal等人，J Exp Med 172(4)1083(1990)]。類(lèi)似地，美國(guó)專利6,051,237號(hào)描述了單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的重組形式，該細(xì)菌生長(zhǎng)、傳播并表達(dá)一種腫瘤特異的抗原，用作癌癥疫苗。盡管這種重組疫苗可能是有效的，但是每一個(gè)微生物菌株必需進(jìn)行遺傳改變才能制備該疫苗。因此就需要開(kāi)發(fā)出制備安全有效微生物疫苗的方法，它可以用于任何微生物，不論該微生物是否包含重組抗原。對(duì)基于樹(shù)突細(xì)胞(DC)的免疫療法已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，顯示其對(duì)于多種類(lèi)型腫瘤的治療是有臨床益處的。目前正在開(kāi)發(fā)多種不同的策略以分離和產(chǎn)生自體樹(shù)突細(xì)胞(DC)，接下來(lái)在免疫接種病人之前使這些樹(shù)突細(xì)胞體外荷載抗原或者多肽。除了有效的抗原荷載以外，最近對(duì)于理解免疫機(jī)制的研究進(jìn)展強(qiáng)調(diào)了用于免疫接種的DC的活化和成熟狀態(tài)對(duì)癌癥免疫療法有效性的重要性。未成熟的DC對(duì)于抗原的攝取和加工更為有效，雖然活化的/成熟的DC喪失了這個(gè)能力，但是它們?cè)贛HC分子存在時(shí)將抗原呈遞給原初T淋巴細(xì)胞的能力更強(qiáng)。實(shí)際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)成熟的DC是有效的誘導(dǎo)初級(jí)T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，克服了外周T淋巴細(xì)胞耐受并且提高抗腫瘤的免疫性。盡管開(kāi)發(fā)出了多種不同的方法荷載并刺激DC的活化和成熟，并已經(jīng)獲得了令人鼓舞的臨床數(shù)據(jù)，但是仍然沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)有效且經(jīng)濟(jì)的方法將抗原荷載與DC的活化和成熟組合在一起的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及的是自生的微生物，其中微生物的增殖受到衰減，而同時(shí)保留了足夠的微生物基因表達(dá)，其中的衰減可以以劑量依賴的方式進(jìn)行控制。本發(fā)明包括了使自生微生物進(jìn)行這種衰減的方法。本發(fā)明包括了包含這些減毒后微生物的疫苗組合物。本發(fā)明還提供了改變后微生物，特別是減毒的利斯特氏菌屬(Listeria)，的新型用途，即在體外或者離體荷載并且誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞例如樹(shù)突細(xì)胞的活化和成熟。產(chǎn)生的抗原呈遞細(xì)胞在疫苗和免疫治療中是有用的。在特別的實(shí)施方案中，所提供的疫苗和免疫療法針對(duì)的是癌癥。
一方面，本發(fā)明提供了包含自生微生物的疫苗，其中該微生物的核酸(例如基因組核酸)經(jīng)過(guò)改變使微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物增殖的衰減是可以以劑量依賴的方式控制的。在一些實(shí)施方案中，微生物中的微生物基因表達(dá)基本上不受微生物增殖衰減的影響。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物表達(dá)的抗原水平足以使向個(gè)體給予該疫苗之后誘導(dǎo)出針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，使用與核酸直接發(fā)生反應(yīng)的靶向核酸化合物(或者稱為核酸靶向化合物)對(duì)核酸進(jìn)行改變。在一個(gè)實(shí)施方案中核酸靶向化合物是一種烷化劑，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是一種被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素化合物(例如4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素，這里還被稱為S-59)。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物包含基因突變，該突變減弱了微生物對(duì)其經(jīng)過(guò)改變的核酸進(jìn)行修復(fù)的能力。在一些實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌，例如炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)或者單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗還包含藥物上可以接受的載體和/或佐劑。本發(fā)明還提供預(yù)防或者治療宿主中疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的疫苗。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中微生物表達(dá)抗原。
另一方面，本發(fā)明提供包含自生微生物(例如細(xì)菌)的疫苗，該微生物中至少一種DNA修復(fù)酶有缺陷。在一些實(shí)施方案中，自生的微生物在一個(gè)或者多個(gè)基因中包含基因突變，這些基因選自由以下基因組成的組phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是上述基因的功能等價(jià)物。在一些實(shí)施方案中，微生物在uvrA和uvrB(或者uvrA和uvrB的功能等價(jià)物，這取決與微生物的種屬)中都包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，微生物的RecA(或者RecA蛋白的功能等價(jià)物，這取決與微生物的種屬)有缺陷。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原(例如癌癥抗原或者對(duì)于該微生物為外源的傳染性疾病抗原)的異源核酸序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗還包含藥物上可以接受的載體或者佐劑。本發(fā)明還提供宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包含向宿主給予有效量的疫苗。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中微生物表達(dá)抗原。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的突變利斯特菌株，例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株，該突變株包含了基因突變，減弱了該菌株修復(fù)其核酸的能力。在一些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株在至少一種DNA修復(fù)酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株在uvrA基因和/或uvrB基因中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變菌株是保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，登錄編號(hào)PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-/uvrAB-。在其他實(shí)施方案中，菌株是保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，登錄編號(hào)PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-/uvrAB-菌株的突變株，其中被保藏菌株的突變株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。本發(fā)明還提供了包含突變利斯特菌株的疫苗和專職性抗原呈遞細(xì)胞。還提供了使用改變的利斯特菌株誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及預(yù)防或者治療疾病的方法。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的炭疽芽孢桿菌突變株，該突變株包含了基因突變，減弱了該菌株修復(fù)其核酸的能力。在一些實(shí)施方案中，突變株在至少一種DNA修復(fù)酶上(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變株在uvrA基因和/或uvrB基因中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變株的RecA有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變株的recA基因中包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，突變株在lef基因和cya基因中的一個(gè)或者全部上包含一個(gè)或者多個(gè)突變，這些突變降低了菌株的毒性。本發(fā)明還提供了包含突變突變株的疫苗和專職性抗原呈遞細(xì)胞。還提供了使用改變的炭疽芽孢桿菌菌株誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及預(yù)防或者治療疾病的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括疫苗，其包含已經(jīng)與補(bǔ)骨脂素化合物和UVA紫外線發(fā)生反應(yīng)的細(xì)菌，其中細(xì)菌的增殖受到衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，在補(bǔ)骨脂素的改變以后細(xì)菌的表達(dá)足夠活躍，以致補(bǔ)骨脂素減毒的細(xì)菌可以繼續(xù)表達(dá)蛋白質(zhì)抗原，其中當(dāng)細(xì)菌向個(gè)體施用時(shí)，誘發(fā)出針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，所需的免疫應(yīng)答針對(duì)的是細(xì)菌自身。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌是表達(dá)異源蛋白質(zhì)抗原的重組菌株，其中當(dāng)細(xì)菌向個(gè)體施用時(shí)，誘發(fā)出針對(duì)異源抗原的免疫應(yīng)答。可以設(shè)計(jì)出這種包含異源抗原的疫苗，用于治療或預(yù)防多種不同的疾病，包括傳染性疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏、癌癥以及其他過(guò)度增生性疾病。
為了治療或者預(yù)防傳染性疾病，可以根據(jù)本發(fā)明的方法制備用作疫苗的致病病原。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗可以用本發(fā)明中包含異源抗原的微生物進(jìn)行制備，異源抗原來(lái)自致病因子，例如病毒、細(xì)菌或者寄生蟲(chóng)。當(dāng)接受這種細(xì)菌載體的健康風(fēng)險(xiǎn)與傳染性因子導(dǎo)致可能感染的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)相比要小得多時(shí)，這種疫苗可能提供一定水平的益處。用于預(yù)防或治療傳染性疾病的、通過(guò)本發(fā)明的方法減毒的異源疫苗，可能還有其他的益處。首先，可能不能從傳染性因子自身直接制備減毒活疫苗或者死疫苗。第二，如果需要活疫苗，可能不能既使傳染性病原減毒又使其保持正確的免疫應(yīng)答。
另一個(gè)可能性是如果沒(méi)有細(xì)菌載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)在免疫應(yīng)答，則插入到細(xì)菌載體內(nèi)的抗原在個(gè)體內(nèi)不能刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答。例如，自體細(xì)胞不適當(dāng)增殖產(chǎn)生的疾病可能含有通常不能刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原。通過(guò)找到一種方式刺激產(chǎn)生這種針對(duì)自體抗原的免疫應(yīng)答，則有助于抗御這種疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中增殖細(xì)胞表達(dá)或者過(guò)量表達(dá)一種抗原，其表達(dá)水平高于正常細(xì)胞中的表達(dá)水平，這樣免疫應(yīng)答基本上是對(duì)于增殖細(xì)胞特異的?？梢允褂眠@種疫苗進(jìn)行治療的疾病包括，但是不限于，自身免疫疾病、過(guò)敏、癌癥和其他細(xì)胞增生性細(xì)胞疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗可能針對(duì)疾病的產(chǎn)物或者與疾病相關(guān)的目標(biāo)，而不是患病的細(xì)胞本身。例如可以使用針對(duì)血管上皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的疫苗治療腫瘤，VEGF對(duì)于為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)所需的新血管的產(chǎn)生是必需的。VEGF自身在腫瘤細(xì)胞的外圍，但是遍布在腫瘤生長(zhǎng)的區(qū)域，是可行的疫苗攻擊目標(biāo)，疫苗的攻擊可以限制腫瘤的生長(zhǎng)。另一個(gè)實(shí)例是一種包含抗原的疫苗，該抗原可以誘發(fā)針對(duì)與疾病相關(guān)的蛋白的應(yīng)答，所述的蛋白如導(dǎo)致阿爾茨海默氏疾病或克雅氏疾病所特有的淀粉樣斑塊的蛋白。類(lèi)似地，疫苗可以靶向參與自身免疫或者過(guò)敏應(yīng)答的蛋白。疫苗可以包含能夠誘發(fā)針對(duì)特異的抗體或者細(xì)胞(例如導(dǎo)致自身免疫或者過(guò)敏應(yīng)答的B細(xì)胞或者T細(xì)胞)的應(yīng)答的獨(dú)特型抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括疫苗組合物，該組合物包含自生微生物群，其中的微生物核酸經(jīng)過(guò)改變使微生物群的增殖受到衰減，而其中的微生物基因表達(dá)基本未受影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物基因表達(dá)基本上未受影響，這樣抗原的表達(dá)水平足以在向個(gè)體施用該微生物群后刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群的增殖衰減了至少大約0.3log，或者至少大約1log，大約2log，大約3log，大約4log，大約6log，或者至少大約8log。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群的增殖衰減大約從0.3log到＞10log、從大約2log到＞10log、從大約4log到＞10log、從大約6log到＞10log、大約0.3log-8log、大約0.3log-6log、大約0.3log-5log、大約1log-5log或者大約2log-5log。在一個(gè)實(shí)施方案中，由微生物群表達(dá)的抗原為微生物核酸未被改變的微生物群表達(dá)的抗原的至少大約10％、大約25％、大約50％、大約75％或者至少大約90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的抗原是來(lái)自微生物自身的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含了編碼抗原的異源核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是與疾病有關(guān)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原與疾病有關(guān)，該疾病選自由以下疾病組成的組傳染性疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏、癌癥以及其他過(guò)度增生性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是與腫瘤有關(guān)的抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自分化抗原、組織特異抗原、發(fā)育抗原、腫瘤相關(guān)病毒抗原、癌-睪丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、過(guò)量表達(dá)蛋白抗原以及突變蛋白抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自間皮素(mesothelin)、Sp17，gp100，EphA2，PR3，PAGE-4，TARP以及SP AS-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變微生物核酸的方法選自暴露微生物于輻射中以及使微生物與引起微生物核酸改變的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物的核酸通過(guò)和與核酸能夠直接反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物通過(guò)選自下列的方式靶向核酸插入、小溝結(jié)合、大溝結(jié)合、靜電結(jié)合以及序列特異結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物包含核酸烷基化劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，與核酸直接發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物在輻射，優(yōu)選為UVA紫外輻射，活化的情況下與核酸發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由UVA輻射活化的核酸靶向化合物是補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物間接地導(dǎo)致核酸的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物在輻射，優(yōu)選為UVA輻射，活化的情況下間接地導(dǎo)致核酸的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含基因突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致微生物修復(fù)其經(jīng)改變的微生物核酸能力的衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)的基因選自以下基因組成的組phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因(取決于微生物的種屬)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)一個(gè)以上選自以下組的基因中phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因(取決于微生物的種屬)。在一個(gè)突變出現(xiàn)在recA基因中的實(shí)施方案中，不論其自身還是與其他的一個(gè)或者多個(gè)突變一起，recA突變是一個(gè)條件突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致至少一種DNA修復(fù)酶活性的衰減，該DNA修復(fù)酶選自以下酶組成的組PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一個(gè)實(shí)施方案中，RecA活性的衰減是條件的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有這些突變的微生物通過(guò)與被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物選自細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是分支桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，分支桿菌是結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌是炭疽芽孢桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌是鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌是利斯特氏菌，優(yōu)選為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變導(dǎo)致利斯特氏菌侵入非吞噬細(xì)胞能力的減弱，而對(duì)吞噬細(xì)胞攝取利斯特氏菌沒(méi)有顯著影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于內(nèi)化素(internalin)基因內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變出現(xiàn)的基因選自inlA，inlB，以及任何編碼內(nèi)化素的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB兩個(gè)基因上都包含突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變使其逃脫受感染細(xì)胞的吞噬溶酶體的能力減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于hly基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變導(dǎo)致其肌動(dòng)蛋白多聚化作用減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌突變位于actA基因中。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含一個(gè)以上的突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB兩個(gè)基因中都有突變，優(yōu)選是兩個(gè)基因上的缺失突變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了一種疫苗，該疫苗包含微生物群，其中的微生物核酸通過(guò)與核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而發(fā)生改變，該核酸靶向化合物與核酸直接發(fā)生反應(yīng)，使微生物群的增殖減弱，其中的微生物基因表達(dá)基本上未受影響，其中的微生物群中的微生物包含編碼腫瘤抗原的異源核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物基因表達(dá)基本上未受影響，這樣腫瘤抗原的表達(dá)水平足以在將該微生物施用到個(gè)體后刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群的增殖衰減了至少大約0.3log，或者至少大約1log，大約2log，大約3log，大約4log，大約6log，或者至少大約8log。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群的增殖衰減從大約0.3log到＞10log、從大約2log到＞10log、從大約4log到＞10log、從大約6log到＞10log、大約0.3log-8log、大約0.3log-6log、大約0.3log-5log、大約1-5log或者大約2-5log。在一個(gè)實(shí)施方案中，由微生物群表達(dá)的腫瘤抗原為微生物核酸未被改變的微生物群表達(dá)的抗原的至少大約10％、大約25％、大約50％、大約75％或者至少大約90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自由以下抗原組成的組分化抗原、組織特異抗原、發(fā)育抗原、腫瘤相關(guān)病毒抗原、癌-睪丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、過(guò)量表達(dá)蛋白抗原以及突變蛋白抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自由以下組成的組間皮素、Sp17，gp100，EphA2，PR3，PAGE-4，TARP，以及SPAS-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物包含一種烷化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，烷化劑選自由芥子、芥子中間體和芥子等價(jià)物組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物包含的核酸靶向基團(tuán)選自以下基團(tuán)組成的組嵌入劑、小溝結(jié)合物、大溝結(jié)合物、靜電結(jié)合物以及核酸特異結(jié)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物在化合物的活化下與核酸直接發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物通過(guò)輻射被活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，輻射是UVA輻射。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是由UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群中的微生物包含基因突變，在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致微生物修復(fù)其經(jīng)過(guò)改變的微生物核酸能力的衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)的基因選自以下基因組成的組phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因，取決于微生物的種屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)一個(gè)以上選自以下組的基因中phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因，取決于微生物的種屬。在一個(gè)突變出現(xiàn)在recA基因的實(shí)施方案中，不論其單獨(dú)還是與其他的一個(gè)或者多個(gè)突變一起，recA突變是一個(gè)條件突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致至少一種DNA修復(fù)酶活性的衰減，該DNA修復(fù)酶選自以下酶組成的組PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一個(gè)實(shí)施方案中，RecA活性的衰減是條件的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有這些突變的微生物通過(guò)與被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物選自細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌是利斯特氏菌，優(yōu)選為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變導(dǎo)致利斯特氏菌侵入非吞噬細(xì)胞能力的減弱，而對(duì)吞噬細(xì)胞攝取利斯特氏菌沒(méi)有顯著影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于內(nèi)化素基因內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于的基因選自由以下基因組成的組inlA，inlB，以及任何編碼內(nèi)化素的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB兩個(gè)基因上都包含突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變使其逃脫受感染細(xì)胞的吞噬溶酶體的能力減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于hly基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變使利斯特氏菌肌動(dòng)蛋白的聚合減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于actA基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含一個(gè)以上的突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB兩個(gè)基因中都有突變，優(yōu)選是兩個(gè)基因上的缺失突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突變株還包含uvrAB基因內(nèi)的缺失突變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了一種疫苗，該疫苗包含單核細(xì)胞增生利斯特氏菌群，其中的利斯特氏菌核酸通過(guò)與經(jīng)過(guò)UVA輻射而被活化的補(bǔ)骨脂素發(fā)生反應(yīng)而被改變，使利斯特氏菌群的增殖衰減，其中的利斯特氏菌基因表達(dá)基本上未受顯著影響，其中的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含編碼腫瘤抗原的異源核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌的基因表達(dá)基本上未受影響，這樣腫瘤抗原的表達(dá)水平足以在將利斯特氏菌施用到個(gè)體后刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌群的增殖衰減了至少大約0.3log，或者至少大約1log，大約2log，大約3log，大約4log，大約6log，或者至少大約8log。在另一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌群的增殖衰減從大約0.3到＞10log、從大約2log到＞10log、從大約4到＞10log、從大約6到＞10log、大約0.3-8log、大約0.3-6log、大約0.3-5log、大約1-5log或者大約2-5log。在一個(gè)實(shí)施方案中，由利斯特氏菌群表達(dá)的腫瘤抗原為利斯特氏菌核酸未被改變的利斯特氏菌群表達(dá)的抗原的至少大約10％、大約25％、大約50％、大約75％或者至少大約90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自由以下抗原組成的組分化抗原、組織特異抗原、發(fā)育抗原、腫瘤相關(guān)病毒抗原、癌癥-睪丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、過(guò)量表達(dá)蛋白抗原以及突變蛋白抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自間皮素、Sp17，gp100，EphA2，PR3，PAGE-4，TARP，以及SPAS-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含基因突變，在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致單核細(xì)胞增生利斯特氏菌修復(fù)其經(jīng)過(guò)改變的核酸能力的衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變位于選自下列的基因phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變位于一個(gè)以上選自以下組的基因中phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。在一個(gè)突變出現(xiàn)在recA的實(shí)施方案中，不論其單獨(dú)還是與其他的一個(gè)或者多個(gè)突變一起，recA突變是一個(gè)條件突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳突變導(dǎo)致至少一種DNA修復(fù)酶活性的衰減，該DNA修復(fù)酶選自以下酶組成的組PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一個(gè)實(shí)施方案中，RecA活性的衰減是條件的。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變導(dǎo)致單核細(xì)胞增生利斯特氏菌侵入非吞噬細(xì)胞能力的減弱，而對(duì)吞噬細(xì)胞攝取單核細(xì)胞增生利斯特氏菌沒(méi)有顯著影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變位于內(nèi)化素基因內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于選自下列的基因inlA，inlB，以及任何編碼內(nèi)化素的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB兩個(gè)基因上都包含突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變使其逃脫受感染細(xì)胞吞噬溶酶體的能力減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于hly基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變使利斯特氏菌肌動(dòng)蛋白的聚合減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于actA基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含一個(gè)以上的突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB兩個(gè)基因中都有突變，優(yōu)選是兩個(gè)基因上的缺失突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突變株還包含uvrAB基因的缺失突變。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含自生微生物的專職性(professional)抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)，其中的微生物核酸被改變使微生物的增殖衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物增殖的衰減是可以以劑量依賴的方式控制的。在一些實(shí)施方案中，微生物中的微生物基因表達(dá)基本上未受到微生物增殖衰減的影響。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物表達(dá)的抗原水平足以使向個(gè)體施用該疫苗之后誘導(dǎo)出針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，使用與核酸直接發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物的反應(yīng)對(duì)核酸進(jìn)行改變。在一個(gè)實(shí)施方案中核酸靶向化合物是一種烷化劑，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素化合物(例如4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素，這里還被稱為S-59)。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物包含基因突變，該突變減弱了微生物對(duì)其經(jīng)過(guò)改變的核酸進(jìn)行修復(fù)的能力。在一些實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。本發(fā)明還提供了包含抗原呈遞細(xì)胞的疫苗。本發(fā)明還提供預(yù)防或者治療宿主中疾病的方法，該方法包含向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞，其中的抗原由微生物表達(dá)。本發(fā)明還提供了在離體和/或體外(不互斥)活化原初T細(xì)胞的方法，該方法包括使原初T細(xì)胞在適宜的條件下與專職性抗原呈遞細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間以活化原初T細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的專職性抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)，該細(xì)胞包含自生的微生物(例如細(xì)菌)，微生物在其至少一種DNA修復(fù)酶中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，微生物包含的基因突變位于選自下列的一種或多種的基因phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者其功能等價(jià)物中。例如微生物可能在uvrA和uvrB兩個(gè)基因中都包含基因突變，或者在uvrA和uvrB的功能等價(jià)物中(取決于微生物的種屬)包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，抗原呈遞細(xì)胞的recA或者其功能等價(jià)物有缺陷。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。還提供預(yù)防或者治療宿主中疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞；以及還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞，其中的抗原由微生物表達(dá)。
另一方面，本發(fā)明提供了用抗原荷載專職性抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括使專職性抗原呈遞細(xì)胞(體外或者體內(nèi))在適宜的條件下與包含有編碼該抗原的核酸序列的微生物接觸足夠的時(shí)間以使專職性抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變(例如與直接同核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而改變)，這樣微生物的增殖被衰減。
另一方面，本發(fā)明提供了使專職性抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟的方法，該方法包括使專職性抗原呈遞細(xì)胞(體外或者體內(nèi))在適宜的條件下與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸足夠的時(shí)間以使專職性抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變(例如與直接同核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而改變)，這樣微生物的增殖被衰減。
另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或者治療宿主體內(nèi)疾病的方法，包括以下步驟。(a)使專職性抗原呈遞細(xì)胞與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸使其荷載，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變，這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)向宿主施用有效量的包含荷載的專職性抗原呈遞細(xì)胞的組合物。在一些實(shí)施方案中，微生物與直接同核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。
另一方面，本發(fā)明提供了使用抗原荷載專職性抗原呈遞細(xì)胞例如樹(shù)突細(xì)胞的方法，該方法包括在適宜的條件下使細(xì)胞在體外或者離體與表達(dá)抗原的被改變的微生物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以荷載抗原呈遞細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，盡管微生物的增殖受到衰減，但是微生物保持了足夠的基因表達(dá)，達(dá)到細(xì)胞的抗原呈遞?？乖蔬f可以是MHC I類(lèi)抗原呈遞或者M(jìn)HC II類(lèi)抗原呈遞。
另一方面，本發(fā)明提供了使抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)活化或者成熟的方法，該方法包括在適宜的條件下使抗原呈遞細(xì)胞在體外或者離體與被改變的微生物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，使樹(shù)突細(xì)胞活化和/或使抗原呈遞細(xì)胞成熟。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的增殖受到衰減。在另一個(gè)實(shí)施方案中，盡管微生物的增殖受到衰減，但是微生物保持了足夠的基因表達(dá)，達(dá)到細(xì)胞的活化和/或成熟。
另一方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的免疫原性組合物，該組合物包含呈遞抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含被改變的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的增殖受到衰減。在另一個(gè)實(shí)施方案中，盡管微生物的增殖受到衰減，但是微生物保持了足夠的基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的抗原呈遞。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。
另一方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟(a)在適宜的條件下使抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞)在體外或者離體與表達(dá)該抗原的利斯特氏菌接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間使抗原呈遞細(xì)胞上荷載抗原，以使抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟；以及(b)向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的增殖受到衰減。在另一個(gè)實(shí)施方案中，盡管微生物的增殖受到衰減，但是與抗原呈遞細(xì)胞接觸的微生物保持了足夠的基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抗原呈遞在抗原呈遞細(xì)胞上，并且使抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。
另一方面，本發(fā)明提供了離體或者體外的專職性抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞包含改變的微生物，其中微生物的增殖被衰減。在另一個(gè)實(shí)施方案中，盡管微生物的增殖受到衰減，但是改變的微生物保持了足夠的基因表達(dá)，使樹(shù)突細(xì)胞呈遞抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原呈遞細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了包含抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)的疫苗，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含改變的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是利斯特氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的增殖被衰減。在另一個(gè)實(shí)施方案中，盡管利斯特氏菌的增殖受到衰減，但是利斯特氏菌保持了足夠的基因表達(dá)，使抗原呈遞在細(xì)胞上。
另一方面，本發(fā)明提供了包含抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)以及藥物上可以接受的載體的藥物組合物，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含改變的利斯特氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的增殖被衰減。在另一個(gè)實(shí)施方案中，盡管利斯特氏菌的增殖受到衰減，但是利斯特氏菌保持了足夠的基因表達(dá)，使抗原呈遞在細(xì)胞上。
在前面提到的各個(gè)方面中的一些實(shí)施方案中，被改變的微生物是被改變的利斯特氏菌。在前面提到的各個(gè)方面中的另外的實(shí)施方案中，利斯特氏菌是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在其他的實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含一個(gè)或者多個(gè)基因的突變，基因選自由以下基因組成的組phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。例如在前面提到的方面中的任何一項(xiàng)中，利斯特氏菌可以任選地包含uvrAB基因的突變。在其他實(shí)施方案中，利斯特氏菌可以任選地包含uvrAB基因和actA基因的突變。
在前面提到的各個(gè)方面中的其他實(shí)施方案中，通過(guò)使利斯特氏菌與交聯(lián)劑接觸使其減毒。在前面提到的各個(gè)方面中的一些實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在前面提到的各個(gè)方面中的其他實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是補(bǔ)骨脂素的衍生物，并且使利斯特氏菌與UVA接觸。在前面提到的各個(gè)方面中的一些實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(這里也被稱為″S-59″)。
附圖


圖1顯示了含有OVA抗原的野生型利斯特氏菌DP-L4056的衰減作為補(bǔ)骨脂素S-59濃度(2J/cm2UVA)的函數(shù)，以及對(duì)OVA抗原向樹(shù)突細(xì)胞系呈遞的測(cè)量。細(xì)菌的對(duì)數(shù)滴度(log titer)和被呈遞的抗原對(duì)未被處理的抗原的百分比(數(shù)據(jù)是對(duì)于每DC 2.4細(xì)胞100個(gè)利斯特氏菌)對(duì)S-59的濃度(nM)作圖。
圖2顯示野生型利斯特氏菌DP-L4056(2A)和含有OVA抗原的LLO-突變株DP-L4027(2B)的衰減作為烷化劑化合物I濃度的函數(shù)，以及對(duì)OVA抗原向樹(shù)突細(xì)胞系呈遞的測(cè)量。細(xì)菌的對(duì)數(shù)滴度和被呈遞的抗原對(duì)未被處理的抗原的百分比(數(shù)據(jù)是對(duì)于每個(gè)DC 2.4細(xì)胞1個(gè)利斯特氏菌)對(duì)化合物I的濃度(μM)作圖。
圖3對(duì)比了野生型大腸桿菌與修復(fù)缺陷菌株CSR 603(uvrA recAphr突變株)的滅活作為S-59濃度(2J/cm2UVA)的函數(shù)。細(xì)菌的對(duì)數(shù)滴度對(duì)S-59的濃度(nM)作圖(對(duì)數(shù)刻度)。
圖4顯示了平均腫瘤體積作為將B16OVA腫瘤移植到C57B1/6小鼠中以后天數(shù)的函數(shù)，小鼠在第三、七和十四天接受了免疫接種。實(shí)驗(yàn)的疫苗使用或者未使用S-59進(jìn)行處理。
圖5顯示存活率百分比作為將B16OVA腫瘤移植到C57B1/6小鼠中以后天數(shù)的函數(shù)，小鼠在第三、七和十四天接受了免疫接種。實(shí)驗(yàn)的疫苗使用或者未使用S-59進(jìn)行處理。
圖6顯示了流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果，顯示了TNF-α和IFN-γ陽(yáng)性的脾細(xì)胞群，該細(xì)胞群來(lái)自接種了表達(dá)和沒(méi)有表達(dá)OVA、使用和未用S-59UVA處理(PCT)的野生型利斯特氏菌的小鼠。圖6A顯示了LLO190-210特異的細(xì)胞群。圖6B顯示了OVA特異的細(xì)胞群。
圖7顯示了ELISPOT的結(jié)果，顯示了在使用SL8，LLO190-201或者LLO296-304刺激以后，使用所示的野生型利斯特氏菌菌株(用或者未用S-59處理(PCT))進(jìn)行接種的小鼠的脾細(xì)胞中，每2×105個(gè)細(xì)胞中，形成IFN-γ斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量。
圖8顯示了缺失和未缺失uvrAB后利斯特氏菌的減毒。對(duì)數(shù)滴度對(duì)使用的補(bǔ)骨脂素S-59的濃度(nM)作圖(6J/cm2)。圖8A，菌株DP-L4017(L461T LLO突變株)和野生型(DP-L4056)。圖8B，菌株DP-L4017和DP-L4029(ΔactA).
圖9顯示了含有OVA抗原的DP-L4029(ΔactA)利斯特氏菌的減毒作為補(bǔ)骨脂素S-59的濃度的函數(shù)，以及對(duì)OVA抗原向樹(shù)突細(xì)胞系呈遞的測(cè)量。親本株(在這里是ΔactA；9A，9C)與具有uvrAB缺失的菌株(ΔuvrAB；9B，9D)進(jìn)行比較。細(xì)菌的對(duì)數(shù)滴度和呈遞抗原對(duì)未處理的抗原的百分比對(duì)S-59的濃度(nM)作圖。圖9A，9B，UVA輻射劑量為0.5J/cm2，漂洗利斯特氏菌一次，然后UVA的劑量為5.5J/cm2，測(cè)量每DC2.4細(xì)胞一個(gè)利斯特氏菌時(shí)的抗原呈遞。圖9C，9D，在S-59存在時(shí)培養(yǎng)利斯特氏菌，然后使用6J/cm2UVA輻射，測(cè)量每DC2.4細(xì)胞10個(gè)利斯特氏菌時(shí)的抗原呈遞。(在圖9C和9D中也提供了擴(kuò)展的圖)。
圖10顯示了35S甲硫氨酸/半胱氨酸摻入到S-59/UVA處理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029(ΔactA)和DP-L4029uvrAB(ΔactAΔuvrAB)合成的蛋白中以后的聚丙烯酰胺凝膠。
圖11顯示了來(lái)自接種了經(jīng)59/UVA處理的(兩種方法)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVA菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA菌株的小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)過(guò)OVA特異的抗原SL8、LLO特異的抗原LLO190和LLO296刺激之后，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。圖11A顯示了在使用OVA特異的抗原刺激的平板上的斑點(diǎn)形成集落。圖11B作圖顯示了對(duì)于所有三種抗原，每2×105個(gè)脾細(xì)胞中的IFN-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞。
圖12顯示了使用S-59/UVA處理的(兩種方法)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVA菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA菌株接種小鼠后，使用OVA來(lái)源的T細(xì)胞表位SL8(12A)、LLO特異的II類(lèi)抗原LLO190-201(12B)或者LLO特異的I類(lèi)抗原LLO296-304(12C)進(jìn)行刺激以后，小鼠的脾細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)檢測(cè)結(jié)果。在圖中，S-59/UVA處理的利斯特氏菌標(biāo)記為“PCT”(表示光化學(xué)處理)。
圖13顯示了小鼠脾臟(13A)或者肝臟(13B)的菌落形成單位的數(shù)目。所述小鼠使用S-59/UVA處理的(兩種方法)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者ΔactAΔuvrAB-菌株接種，30天后，使用野生型單核細(xì)胞增生利斯特氏菌進(jìn)行攻擊。
圖14顯示了小鼠脾臟(14A)或者肝臟(14B)的菌落形成單位的數(shù)目。所述小鼠使用S-59/UVA處理的(生長(zhǎng)中加入補(bǔ)骨脂素、然后UVA處理)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者DP-L4029ΔactAΔuvrAB-菌株接種小鼠(免疫一、三、五次)，30天后，使用野生型單核細(xì)胞增生利斯特氏菌進(jìn)行攻擊。
圖15顯示了免疫小鼠血清中利斯特氏菌特異抗體的抗體滴度。所述小鼠使用S-59/UVA處理的(生長(zhǎng)中加入補(bǔ)骨脂素、然后UVA處理)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者ΔactAΔuvrAB-菌株接種(免疫一、三、五次)。
圖16表示了使用S-59/UVA處理的(生長(zhǎng)中加入補(bǔ)骨脂素、然后UVA處理)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者ΔactAΔuvrAB-菌株接種小鼠(免疫一、三、五次)30天后，使用20xLD50或者100xLD50的野生型單核細(xì)胞增生利斯特氏菌進(jìn)行攻擊的。存活百分率(攻擊后10天)。
圖17顯示了來(lái)自使用S-59/UVA處理的(生長(zhǎng)中加入補(bǔ)骨脂素、然后UVA處理)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVAAH1A5菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA AH1A5菌株接種的小鼠并使用抗原LLO91，AH1，AH1A5，或者P815細(xì)胞或者CT26細(xì)胞刺激。脾臟細(xì)胞的ICS檢測(cè)結(jié)果。
圖18顯示了表明來(lái)自小鼠的脾細(xì)胞的斑點(diǎn)形成集落以平板的ELISPOT測(cè)定的結(jié)果。所述小鼠使用S-59/UVA處理的(生長(zhǎng)中加入補(bǔ)骨脂素、然后UVA處理)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVA AH1A5菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA AH1A5菌株接種，并使用抗原AH1A5(18A)或者AH1(18B)進(jìn)行刺激。
圖19顯示了使用S-59/UVA處理的具有或者沒(méi)有ΔuvrAB突變的DP-L4029進(jìn)行治療性接種的已經(jīng)有CT26肺部腫瘤的小鼠的肺(19A)。對(duì)于每個(gè)疫苗株，繪圖表示了肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目(19B)。剩余小鼠的存活在圖19C中繪出。
圖20顯示了已經(jīng)有CT26肺部腫瘤的小鼠接受以下菌株的治療性免疫接種單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactA，ΔactA AH1-A5，ΔactAΔuvrAB AH1-A5以及ΔactAΔinlB AH1-A5。ΔuvrAB菌株或者沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理、或者被熱殺死(HK)或者經(jīng)過(guò)S-59UVA(PCT)的處理。收集每個(gè)亞組中的小鼠的肺，顯示于圖20A中。每組中肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目在圖20B中繪出。剩余小鼠的存活在圖20C中(親本株)和圖20D中(ΔuvrAB株)繪出。
圖21A顯示了DC2.4細(xì)胞的熒光顯微圖像，所述的細(xì)胞被經(jīng)過(guò)S-59/UVA處理的野生型單核細(xì)胞增生利斯特氏菌uvrAB突變體感染，顯示了組合的圖像(利斯特氏菌和肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性)以及用羅丹明染色后的圖像(只有肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性)。圖21B為與LLO-相比，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的野生型、ΔuvrAB突變株(活的、熱殺死的或者S-59UVA處理的)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的百分比。
圖22顯示了經(jīng)過(guò)S-59/UVA處理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌野生型菌株以及ΔuvrAB菌株革蘭氏染色后的光學(xué)顯微照相負(fù)片。
圖23顯示了使用所示的利斯特氏菌株或者載體對(duì)照免疫接種小鼠后的靶細(xì)胞群。與非特異的靶細(xì)胞相比，抗原特異的靶細(xì)胞水平降低，表明了由于接種產(chǎn)生的體內(nèi)T細(xì)胞細(xì)胞毒性。圖23A顯示了表達(dá)AH1-A5的疫苗在第0天免疫接種的結(jié)果(對(duì)于S-59UVA處理的菌株還在第1、2天進(jìn)行免疫接種)。(圖23A和23B的上面一行中顯示了使用所示的對(duì)于AH1靶細(xì)胞的疫苗接種小鼠的結(jié)果。下面一行中顯示了使用所示的對(duì)于AH1-A5靶細(xì)胞的疫苗接種小鼠的結(jié)果。)圖23B顯示的是在第14天進(jìn)行重復(fù)接種的結(jié)果(對(duì)于S-59UVA處理的菌株在第15和16天進(jìn)行免疫接種)，而圖23C涉及的是OVA特異應(yīng)答。
圖24顯示了具有或者沒(méi)有uvrAB缺失的炭疽芽孢桿菌Sterne菌株的減毒。繪圖表示對(duì)數(shù)滴度與生長(zhǎng)和UVA輻射(6J/cm2)過(guò)程中的補(bǔ)骨脂素S-59濃度(nM)的關(guān)系。
圖25顯示了利斯特氏菌uvrAB-對(duì)于S-59/UVA光滅活更為敏感。利斯特氏菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期，用PBS漂洗，加入不同濃度的S-59孵育5分鐘，使用2.1J/cm2的UVA光線進(jìn)行照射。通過(guò)在BHI瓊脂平板上生長(zhǎng)檢測(cè)利斯特氏菌的存活力。(A)代表性的利斯特氏菌BHI瓊脂平板，用100nM的S-59處理。熱殺死的利斯特氏菌作為對(duì)照；(B)使用不同濃度S-59處理的利斯特氏菌的存活力--在BHI瓊脂平板上形成菌落的能力。
圖26顯示了S-59/UVA處理的不能存活的利斯特氏菌uvrAB菌株保持了它們的代謝活性以及它們基因組全部組分的表達(dá)。(A)使用MTT檢測(cè)測(cè)定S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB菌株的代謝活性。活的和熱殺死的利斯特氏菌作為對(duì)照；(B)使用MTT檢測(cè)定量測(cè)定滅活的利斯特氏菌uvrAB菌株的代謝活性。
圖27顯示了完全滅活的利斯特氏菌uvrAB菌株保持了它們感染DC以及逃脫吞噬溶酶體的能力。生長(zhǎng)在蓋玻片上的小鼠DC細(xì)胞系，DC2.4，在MOI＝1下37℃感染30分鐘。多次漂洗仔細(xì)除去細(xì)胞外的細(xì)菌，加入慶大霉素，令感染的細(xì)胞在37℃下繼續(xù)孵育5小時(shí)，防止細(xì)胞外細(xì)菌的生長(zhǎng)。用3.5％甲醛固定DC2.4細(xì)胞，然后使用家兔抗利斯特氏菌抗體染色，用山羊抗家兔FITC二抗檢測(cè)。使用羅丹明-鬼筆環(huán)肽檢測(cè)肌動(dòng)蛋白，使用DAPI顯示細(xì)胞核。
圖28顯示了完全滅活的利斯特氏菌uvrAB菌株有效地荷載抗原進(jìn)入小鼠骨髓來(lái)源DC(BM-DC)的MHC I類(lèi)途徑中。在MOI＝100下，37℃感染第5天的BM-DC 30分鐘。多次漂洗仔細(xì)除去細(xì)胞外的細(xì)菌。感染的BM-DC細(xì)胞與B3Z共同孵育過(guò)夜，通過(guò)水解生色底物CPRG來(lái)測(cè)定活化(吸光度)。
圖29顯示感染了利斯特氏菌的人未成熟單核細(xì)胞衍生的DC使活化標(biāo)記(29A)和成熟標(biāo)記(29B)以及分泌促炎細(xì)胞因子(29C)上調(diào)。在MOI＝1下用利斯特氏菌感染DC 1小時(shí)。感染的DC在慶大霉素存在下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，防止細(xì)胞外細(xì)菌的生長(zhǎng)。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定表型的改變。使用Cytometric bead array試劑盒(Pharmingen)對(duì)細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子水平進(jìn)行測(cè)定。
圖30顯示了S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB OVA在體內(nèi)誘導(dǎo)OVA特異的免疫性。用1×108CFU的S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrABOVA通過(guò)靜脈內(nèi)向雌性C57BL/6小鼠給藥。S-59/UVA滅活的親本利斯特氏菌株以及熱殺死的利斯特氏菌作為對(duì)照。7天后，收獲脾臟，通過(guò)IFN-γELISPOT對(duì)OVA特異的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行測(cè)定。(A)顯示了代表性的ELISPOT孔；(B)通過(guò)ELISPOT對(duì)OVA特異的免疫性進(jìn)行測(cè)定。免疫接種的小鼠的脾臟細(xì)胞在存在或者不存在OVA257-264肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
圖31顯示了異源抗原LLO-OVA/PR3(SEQ ID NO48)的一級(jí)氨基酸序列。該圖還顯示了OVA H-2Kb表位(SEQ ID NO49)和PR3HLA A-2I型限制性表位(又名PR1)(SEQ ID NO50)。
圖32顯示了化合物4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(S-59)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及了改變的自生微生物和改變的自生微生物在疫苗組合物中的用途，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物基因表達(dá)基本上沒(méi)有受到改變的影響。本發(fā)明還涉及在體外或者離體，在抗原荷載和抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的活化/成熟的誘導(dǎo)中改變的微生物的用途?？乖梢允怯筛淖兊奈⑸锾烊划a(chǎn)生的抗原或者是重組微生物表達(dá)的異源抗原。產(chǎn)生的抗原呈遞細(xì)胞適于在疫苗組合物中使用以及用于免疫療法。通過(guò)給予產(chǎn)生的疫苗組合物刺激產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以是CD4+或者CD8+免疫應(yīng)答。
這種被改變的微生物的一種是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。發(fā)明者對(duì)利斯特氏菌進(jìn)行了改造，使其對(duì)于補(bǔ)骨脂素的滅活異常敏感，補(bǔ)骨脂素是一組在紫外線A(UVA)輻射之后會(huì)在細(xì)菌的基因組形成不可逆的交聯(lián)，這樣這些細(xì)菌就不能存活的化合物(參見(jiàn)下面的實(shí)施例3)。野生型和同時(shí)維持模型抗原的表達(dá)的經(jīng)過(guò)改變后的利斯特氏菌增殖的衰減被顯示(參見(jiàn)下面的實(shí)施例1-2和11)。還表明經(jīng)過(guò)改變的利斯特氏菌提供了抗腫瘤應(yīng)答(參見(jiàn)下面的實(shí)施例4和14-16)以及誘導(dǎo)抗原特異的T細(xì)胞應(yīng)答(實(shí)施例5)和體內(nèi)的細(xì)胞毒應(yīng)答(實(shí)施例20)。利斯特氏菌被DC迅速地吞噬，轉(zhuǎn)運(yùn)到吞噬溶酶體的小室中。這個(gè)相遇導(dǎo)致了DC的表型成熟，以及接下來(lái)多種免疫刺激性細(xì)胞因子包括IFN-γ，IL-12，和TNFα的分泌。發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)證明使用重組的利斯特氏菌感染未成熟的DC導(dǎo)致DC迅速地活化/成熟，以及所編碼異源抗原的MHC I型限制的呈遞。此外，吞噬溶酶體中利斯特氏菌疫苗的降解導(dǎo)致編碼的抗原通過(guò)MHC II型途徑進(jìn)行呈遞。(參見(jiàn)下面的實(shí)施例)
另外一個(gè)這種改變的微生物是炭疽芽孢桿菌。發(fā)明人也對(duì)其進(jìn)行了改造，得到了對(duì)補(bǔ)骨脂素滅活異常敏感的炭疽芽孢桿菌減毒菌株。(參見(jiàn)下面的實(shí)施例21)
因此，本發(fā)明提供了包含自生微生物的疫苗，其中該微生物的核酸被改變，使得微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物增殖的衰減受到劑量依賴方式的控制。在一些實(shí)施方案中，微生物中的微生物基因表達(dá)基本上不受微生物增殖衰減的影響。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物表達(dá)的抗原水平足以使向個(gè)體施用疫苗之后誘導(dǎo)出針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，核酸和直接與核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中核酸靶向化合物是一種烷化劑，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是一種被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素(例如4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素，這里還被稱為S-59)。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物包含基因突變，該突變減弱了微生物對(duì)其經(jīng)過(guò)改變的核酸進(jìn)行修復(fù)的能力。在一些實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌，例如炭疽芽孢桿菌或者單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗還包含藥物上可以接受的載體和/或佐劑。本發(fā)明還提供預(yù)防或者治療宿主中疾病的方法，該方法包含向宿主施用有效量的疫苗。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中微生物表達(dá)抗原。
本發(fā)明還提供了分離的突變體利斯特氏菌株，例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株突變株，該突變株包含基因突變，減弱了該菌株修復(fù)其核酸的能力。在一些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株在至少一個(gè)DNA修復(fù)酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變的利斯特氏菌株在uvrA基因和/或uvrB基因上包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，突變菌株是保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，登錄號(hào)PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactA/ΔuvrAB菌株。在其他實(shí)施方案中，菌株是保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，登錄號(hào)PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactA/ΔuvrAB菌株的突變株，其中被保藏的菌株的突變株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。本發(fā)明還提供了包含突變利斯特氏菌株的疫苗和專職性抗原呈遞細(xì)胞。還提供了使用改變的利斯特氏菌株誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及預(yù)防或者治療疾病的方法。
本發(fā)明提供了分離的突變炭疽芽孢桿菌菌株，該突變株包含了基因突變，減弱了該菌株修復(fù)其核酸的能力。在一些實(shí)施方案中，突變的菌株在至少一種DNA修復(fù)酶上(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變株在uvrA基因和/或uvrB基因上包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，突變株的RecA被減弱。在一些實(shí)施方案中，突變株的recA基因中包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，突變株在lef基因和cya基因中的一個(gè)或者全部中包含一個(gè)或者更多突變，這些突變降低了菌株的毒性。本發(fā)明還提供了包含突變株的疫苗和專職性抗原呈遞細(xì)胞。還提供了使用改變的炭疽芽孢桿菌菌株誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及預(yù)防或者治療疾病的方法。
此外，本發(fā)明提供了包含自生微生物的專職性抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)，其中的微生物核酸被改變使微生物的增殖衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物增殖的衰減是可以以劑量依賴的方式控制的。在一些實(shí)施方案中，微生物中的微生物基因表達(dá)基本上未受到微生物增殖衰減的影響。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物表達(dá)的抗原水平足以在向個(gè)體施用疫苗之后誘導(dǎo)出針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，核酸同直接與核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物反應(yīng)對(duì)核酸進(jìn)行改變。在一個(gè)實(shí)施方案中核酸靶向化合物是一種烷化劑，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素化合物。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物包含基因突變，該突變減弱了微生物對(duì)其經(jīng)過(guò)改變的核酸進(jìn)行修復(fù)的能力。在一些實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。本發(fā)明還提供了包含抗原呈遞細(xì)胞的疫苗。本發(fā)明還提供宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包含向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)一種抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞，其中的抗原由微生物表達(dá)。本發(fā)明還提供了在離體或體外活化原初T細(xì)胞的方法，該方法包括使原初T細(xì)胞在適宜的條件下與專職性抗原呈遞細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間以活化原初T細(xì)胞。
本發(fā)明提供了用一種抗原荷載專職性抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括使專職性抗原呈遞細(xì)胞在適宜的條件下與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸足夠的時(shí)間以使專職性抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變，這樣微生物的增殖被衰減。
本發(fā)明還提供了使專職性抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟的方法，該方法包括使專職性抗原呈遞細(xì)胞在適宜的條件下與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸足夠的時(shí)間以使專職性抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變，這樣微生物的增殖被衰減。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或者治療宿主體內(nèi)疾病的方法，包括以下步驟。(a)使專職性抗原呈遞細(xì)胞與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸使其荷載抗原，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變，這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)向宿主施用有效量的包含已荷載的專職性抗原呈遞細(xì)胞的組合物。
本發(fā)明還提供使抗原呈遞細(xì)胞，例如樹(shù)突細(xì)胞，荷載抗原的方法，該方法包括在體外或者離體時(shí)在適宜的條件下使抗原呈遞細(xì)胞與表達(dá)抗原的被改變的微生物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，使抗原呈遞細(xì)胞荷載。
本發(fā)明提供使抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟的方法，該方法包括在體外或者離體時(shí)在適宜的條件下使抗原呈遞細(xì)胞與改變的微生物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使樹(shù)突細(xì)胞活化和/或成熟和/或使抗原呈遞細(xì)胞成熟。
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的免疫原性組合物，該組合物包含呈遞抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含被改變的微生物。
另外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟(a)在適宜的條件下使抗原呈遞細(xì)胞在體外或者離體與表達(dá)抗原的利斯特氏菌接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間使抗原呈遞細(xì)胞上荷載抗原，以使抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟；以及(b)向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的增殖受到衰減。
本發(fā)明還提供了離體或者體外專職性抗原呈遞細(xì)胞，它包含改變的微生物，其中微生物的增殖被衰減。
此外，本發(fā)明提供了包含抗原呈遞細(xì)胞的疫苗(其中的抗原呈遞細(xì)胞包含改變的微生物)和藥物組合物(藥物組合物包含抗原呈遞細(xì)胞和藥物上可以接受的載體，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含利斯特氏菌)。
基于微生物的疫苗
本發(fā)明涉及了改變的自生微生物和在疫苗組合物中使用改變的自生微生物，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物基因表達(dá)幾乎沒(méi)有受到改變的影響。
已經(jīng)觀察到殺死的微生物疫苗經(jīng)常劣于活的減毒微生物疫苗[Lauvau等人，Science 2941735-1739(2001)]。在完全殺死的微生物中，微生物基因的重新合成被完全終止。因此將微生物核酸改變到適當(dāng)?shù)某潭仁刮⑸锏脑鲋呈艿剿p而同時(shí)保持足夠水平的微生物基因表達(dá)，較之殺死的微生物疫苗，可能更為有效，并且提供了一種可以應(yīng)用于任何微生物載體的疫苗制備方式，不論疫苗的目的是用于微生物載體導(dǎo)致的傳染性疾病的預(yù)防還是使用微生物載體傳輸異源抗原。應(yīng)當(dāng)理解，使用“微生物”這個(gè)術(shù)語(yǔ)，正如該術(shù)語(yǔ)涉及本發(fā)明中的所有實(shí)施方案，目的是指自生的微生物而并不包括病毒。這種基于微生物的疫苗可以用于向個(gè)體傳輸特異的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗傳輸一種以上的抗原。設(shè)計(jì)這種疫苗的目的是刺激產(chǎn)生對(duì)一種或者多種抗原的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致個(gè)體對(duì)這個(gè)(這些)抗原產(chǎn)生免疫。產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以是抗體介導(dǎo)的應(yīng)答或者是細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，或者二者兼有。術(shù)語(yǔ)“疫苗”意圖指預(yù)防性疫苗，即該疫苗的施用刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這樣如果個(gè)體接下來(lái)在自然條件下接觸到該抗原，則事先形成的免疫應(yīng)答會(huì)增加個(gè)體抗御攜帶抗原的物質(zhì)(agent)或細(xì)胞的能力。術(shù)語(yǔ)“疫苗”還意圖包括治療性疫苗，即接受該疫苗的個(gè)體已經(jīng)具有與該疫苗的抗原相關(guān)的疾病，這時(shí)疫苗可以誘發(fā)免疫應(yīng)答或者增強(qiáng)個(gè)體對(duì)該抗原已有的免疫應(yīng)答，以增加個(gè)體抗御攜帶抗原的物質(zhì)或細(xì)胞的能力。這包括對(duì)患病細(xì)胞如癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，以及對(duì)與疾病相關(guān)蛋白如朊病毒的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，自生的微生物選自細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，自生的微生物是細(xì)菌，選自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和分支桿菌。
本發(fā)明包括微生物核酸多種不同水平的改變。應(yīng)當(dāng)理解微生物核酸的代謝以多種方式出現(xiàn)。微生物的復(fù)制涉及整個(gè)微生物基因組的DNA的復(fù)制以增殖微生物以及接下來(lái)DNA分子向分離的細(xì)胞中的分配，即細(xì)胞分裂產(chǎn)生的細(xì)胞都具有整個(gè)微生物基因組的完整拷貝。微生物核酸代謝還涉及DNA向RNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯RNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)的組合。微生物基因組的轉(zhuǎn)錄涉及將微生物基因組的部分DNA復(fù)制為RNA，或者是信使RNA或者是轉(zhuǎn)運(yùn)RNA。信使RNA的翻譯涉及對(duì)該RNA的閱讀以產(chǎn)生特異的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)部分。在本發(fā)明中依據(jù)微生物的性質(zhì)和所要的用途，將一群微生物的核酸改變到所需的程度。在一些實(shí)施方案中，所需的改變程度是使微生物基因組的復(fù)制明顯衰減，而同時(shí)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)保持充分的活性(即微生物是代謝活躍的)。
應(yīng)當(dāng)理解不論改變的性質(zhì)如何，改變的水平可以用微生物基因組每個(gè)堿基對(duì)出現(xiàn)改變的平均數(shù)量表示。例如，如果改變的原因是化合物與核酸的共價(jià)結(jié)合(加合物)，則改變可以用加合物之間的平均堿基對(duì)數(shù)表示。本發(fā)明的微生物可以改變的水平是大約每104-108對(duì)堿基一個(gè)改變，還可以是大約每104-107對(duì)堿基一個(gè)改變，還可以是大約每105-107對(duì)堿基一個(gè)改變，或可以是大約每105-106對(duì)堿基一個(gè)改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變的水平調(diào)整為阻斷DNA在微生物群中復(fù)制所需的最小改變量，這樣該微生物群不表現(xiàn)出可觀察到的增殖而同時(shí)保持足夠的個(gè)體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性(即保持了一些代謝活性)，以獲得安全和有效的疫苗。
一方面，本發(fā)明提供了包含自生微生物的疫苗，其中該微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變使微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物增殖的衰減可以以劑量依賴的方式被控制。在一些實(shí)施方案中，微生物中的微生物基因表達(dá)基本上不受微生物增殖衰減的影響。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物表達(dá)的抗原水平足以在向個(gè)體施用疫苗之后誘導(dǎo)出針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，核酸同與核酸直接發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中核酸靶向化合物是一種烷化劑，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素化合物(例如4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素，這里還被稱為S-59)。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物包含基因突變，該突變減弱了微生物對(duì)其經(jīng)過(guò)改變的核酸進(jìn)行修復(fù)的能力。在一些實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌，例如炭疽芽孢桿菌或者單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗還包含藥物上可以接受的載體和/或佐劑。本發(fā)明還提供宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的疫苗。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中的抗原由微生物表達(dá)。
本發(fā)明還提供了包含單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株突變株或者炭疽芽孢桿菌菌株突變株的疫苗，其中單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株突變株或者炭疽芽孢桿菌菌株突變株包含基因突變使菌株修復(fù)其核酸的能力減弱。
抗原呈遞細(xì)胞疫苗
本發(fā)明涉及改變的自生的微生物以及自生的微生物在制備基于抗原呈遞細(xì)胞的疫苗組合物中的用途，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖衰減。在一些實(shí)施方案中，被改變微生物的微生物基因的表達(dá)基本未受影響。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在疫苗中使用的抗原呈遞細(xì)胞是專職化(professional)抗原呈遞細(xì)胞。專職化抗原呈遞細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和B細(xì)胞。其他專職化抗原呈遞細(xì)胞包括單核細(xì)胞、邊緣區(qū)肝巨噬細(xì)胞(kupffer cells)、小膠質(zhì)細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、交錯(cuò)突樹(shù)突細(xì)胞、小節(jié)樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，專職化抗原呈遞細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，專職化抗原呈遞細(xì)胞是巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞(DCs)。在一個(gè)實(shí)施方案中，專職化抗原呈遞細(xì)胞是人的細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，未成熟的抗原呈遞細(xì)胞例如DCs分離自病人，且感染了表達(dá)抗原的經(jīng)過(guò)改變的微生物。將產(chǎn)生的荷載抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)移回到病人體內(nèi)作為一種自體的APC疫苗，這樣誘導(dǎo)CD4+或者CD8+免疫應(yīng)答。
因此制備和使用本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞疫苗的方法的一個(gè)實(shí)例如下從結(jié)腸癌病人分離未成熟的DCs，使其感染S-59/UVA滅活的、不能繁育的、代謝活躍的重組利斯特氏菌-CEA疫苗。用利斯特氏菌感染DC導(dǎo)致CEA腫瘤抗原有效荷載進(jìn)入MHC類(lèi)型I和類(lèi)型II途徑。利斯特氏菌感染刺激DC迅速活化和成熟，這對(duì)于DC成為能夠誘導(dǎo)體內(nèi)的初級(jí)T細(xì)胞應(yīng)答的有效APC是至關(guān)重要的。成熟的DC上調(diào)CD83、輔助刺激分子例如CD80、CD86以及MHC分子的表達(dá)。洗滌荷載了利斯特氏菌疫苗的DC，將其作為自體DC疫苗回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，刺激產(chǎn)生CEA特異的T細(xì)胞應(yīng)答。
在以下具體實(shí)施例中舉例說(shuō)明了特定的實(shí)施方案。但是應(yīng)當(dāng)理解，這里描述的一般方法和技術(shù)可以更廣泛地應(yīng)用到眾多不同的經(jīng)過(guò)改變的微生物、抗原和疾病中。本領(lǐng)域內(nèi)具有一般技術(shù)的人員應(yīng)該能夠容易地調(diào)整這里描述的教導(dǎo)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在體外用表達(dá)抗原的改變的微生物感染未成熟的抗原呈遞細(xì)胞，例如DC。產(chǎn)生的已荷載的抗原呈遞細(xì)胞用來(lái)致敏(prime)T細(xì)胞群，然后將該細(xì)胞群轉(zhuǎn)運(yùn)到病人體內(nèi)，這樣誘導(dǎo)出對(duì)抗原的CD4+或者CD8+免疫應(yīng)答。
另一方面，本發(fā)明提供了包含自生微生物的專職化抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)，其中的微生物核酸被改變使微生物的增殖衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物增殖的衰減可以以劑量依賴的方式控制。在一些實(shí)施方案中，微生物中的微生物基因表達(dá)基本上未受到微生物增殖衰減的影響。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物表達(dá)的抗原水平足以在向個(gè)體施用疫苗之后誘導(dǎo)出針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，核酸同直接與核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中核酸靶向化合物是烷化劑，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素化合物。在一些實(shí)施方案中，疫苗中的微生物包含基因突變，該突變減弱了微生物對(duì)其經(jīng)過(guò)改變的核酸進(jìn)行修復(fù)的能力。在一些實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。本發(fā)明還提供了包含抗原呈遞細(xì)胞的疫苗。本發(fā)明還提供宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的抗原呈遞細(xì)胞，其中的抗原由微生物表達(dá)。本發(fā)明還提供了在離體和/或體外活化原初T細(xì)胞的方法，該方法包括使原初T細(xì)胞在適宜的條件下與專職化抗原呈遞細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間以活化原初T細(xì)胞。
微生物復(fù)制的衰減
本發(fā)明涉及改變微生物的核酸使微生物的復(fù)制衰減。復(fù)制的衰減可以用于提高微生物向個(gè)體施用以后的安全水平。微生物增殖的能力可以通過(guò)在提供正常生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)一群微生物來(lái)進(jìn)行測(cè)量。一般認(rèn)為一群微生物的正常生長(zhǎng)是微生物的核酸沒(méi)有改變的微生物的生長(zhǎng)。微生物基因組的改變會(huì)導(dǎo)致一些衰減這樣微生物不再進(jìn)行正常生長(zhǎng)。一些微生物會(huì)在固化的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上形成集落。這樣微生物復(fù)制的衰減就可以量度為集落形成單位(CFU)數(shù)目的減少。將微生物集落的儲(chǔ)液連續(xù)稀釋直至集落形成單位的數(shù)目可以容易地測(cè)定(例如50-500CFU)。通常稀釋按照10的倍數(shù)進(jìn)行，一個(gè)或者更多稀釋樣品的集落數(shù)目用于估計(jì)樣品的對(duì)數(shù)滴度。例如，將一等份稀釋的微生物儲(chǔ)液涂布于生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，對(duì)產(chǎn)生的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算該稀釋液每毫升的集落形成單位(CFU/mL)，原來(lái)儲(chǔ)液的每毫升集落形成單位(稱為滴度)可以從該稀釋度進(jìn)行計(jì)算。log數(shù)為對(duì)數(shù)滴度。作為一個(gè)實(shí)例，涂布1×105倍稀釋的一份0.2毫升菌液后有24個(gè)集落形成單位，則儲(chǔ)液的滴度是1.2×107，或者是7.08對(duì)數(shù)滴度。衰減的測(cè)量可以是對(duì)微生物核酸改變之前的微生物滴度與微生物核酸改變之后的滴度進(jìn)行比較。未改變的微生物的滴度與改變后的微生物滴度的比值的對(duì)數(shù)即代表對(duì)數(shù)衰減(簡(jiǎn)單地說(shuō)就是兩個(gè)對(duì)數(shù)滴度的差值)。例如，如果未改變的微生物滴度是1.2×107，而改變的微生物滴度是4.3×102，則產(chǎn)生的衰減水平是4.45log。此方法可以用于評(píng)價(jià)任何微生物的衰減，不論是致病性的還是非致病性的。對(duì)于一些微生物，不直接測(cè)量它們的生長(zhǎng)，而可以進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn)，即測(cè)量微生物殺死被其感染的細(xì)胞的能力。例如，某些細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌可以生長(zhǎng)在它們所能夠感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞層上。在適當(dāng)?shù)姆跤院?，可以觀察細(xì)胞層上的空斑(細(xì)胞層上的透明區(qū)域，代表了被殺死的細(xì)胞)。進(jìn)行與上述計(jì)算相似的計(jì)算，其中用空斑形成單位代替了集落形成單位，以評(píng)價(jià)改變微生物核酸以后空斑形成單位數(shù)目的減少。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施方案，所需的衰減量可以從2倍衰減到更高水平的衰減，包括幾乎觀察不到增殖的水平，這取決于所需的安全水平和微生物的應(yīng)用。對(duì)于一個(gè)給定的稀釋度，在一個(gè)微生物群中核酸被改變之后出現(xiàn)的菌落(或者空斑)是未改變微生物群時(shí)的一半，則復(fù)制衰減了兩倍(大約0.3log衰減)。在一些實(shí)施方案中，衰減至少大約0.3log，大約1log，大約2log，大約3log，大約4log，大約5log，大約6log，或者至少大約8log。在一些實(shí)施方案中，衰減范圍是從大約0.3到＞10log、從大約2到＞10log、從大約4到＞10log、從大約6到＞10log、大約0.3-8log、大約0.3-7log、大約0.3-6log、大約0.3-5log、大約0.3-4log、大約0.3-3log、大約0.3-2log、大約0.3-1log。在一些實(shí)施方案中，衰減范圍是大約1到＞10log、1-8log、1-6log、還有大約2-6log、大約2-5log、大約3-5log。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，衰減導(dǎo)致了基本上完全的滅活(例如在檢測(cè)限度內(nèi)不能夠觀察到菌落或者空斑)，而其中的微生物基因表達(dá)有足夠的活性。這樣的微生物群可以這樣獲得滴定用于改變微生物核酸的藥劑的濃度，找到在檢測(cè)限度內(nèi)觀察不到菌落或者空斑的藥劑的最低濃度。
對(duì)于致病微生物，也可以用微生物的生物學(xué)作用來(lái)評(píng)價(jià)其衰減。例如，微生物的致病性可以通過(guò)測(cè)量在小鼠或者其他脊椎動(dòng)物中的半數(shù)致死量(LD50)來(lái)評(píng)價(jià)。LD50是注射到脊椎動(dòng)物中導(dǎo)致該脊椎動(dòng)物群一半死亡的微生物的量(例如CFU)?？梢员容^改變的和未改變的微生物的LD50值，作為衰減量的量度。例如，如果未改變的微生物群的LD50是103個(gè)微生物，而核酸被改變以后的微生物群的LD50是105個(gè)微生物，微生物由于衰減其LD50提高了100倍，或者2log。在一些實(shí)施方案中，LD50提高了2倍到1000倍。在一些實(shí)施方案中，使用的減毒株已經(jīng)有較高的LD50。在這種情況下，改變的微生物的LD50的增加受到的限制是有多少物質(zhì)能夠注入到體內(nèi)而不會(huì)導(dǎo)致傷害。例如，熱殺死生物體的LD50不能高出大約1-5×109太多，只因?yàn)樯镂镔|(zhì)在小鼠體內(nèi)的荷載和/或?qū)τ诩?xì)菌細(xì)胞壁組分的炎癥反應(yīng)。衰減程度還可以通過(guò)其他生物學(xué)作用定量測(cè)定，例如組織病理的程度或者血清肝臟酶的水平。通常在臨床實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定注射了本發(fā)明中的微生物后小鼠血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白以及膽紅素的水平。對(duì)改變的和未改變的微生物在小鼠中或者其他脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生的作用進(jìn)行比較是一種評(píng)價(jià)微生物衰減的方式。除了測(cè)量微生物對(duì)組織的作用以外，從受到感染的組織如肝臟或者脾臟中回收的可存活微生物的數(shù)量對(duì)于時(shí)間的函數(shù)也可以用于測(cè)量微生物的衰減，即比較未改變的和改變之后的微生物注射小鼠得到的這些數(shù)值。
本發(fā)明中的微生物的蛋白表達(dá)
對(duì)微生物的核酸的改變除了使微生物的增殖衰減以外，是受到控制的，這樣微生物的基因表達(dá)幾乎未受影響。在核酸改變后，為了保持基因表達(dá)幾乎不受影響，微生物的基因表達(dá)不需要完全活躍。只需要核酸被改變的微生物群的復(fù)制衰減，微生物基因表達(dá)就有充分的活性以提供所需微生物蛋白足夠水平的表達(dá)。足夠水平的表達(dá)在一定程度上取決于使用微生物的目的。例如如果微生物含有某種要被用作疫苗的抗原，足夠表達(dá)的定義就是為疫苗提供有效保護(hù)性或者治療性免疫應(yīng)答的最低表達(dá)水平。微生物基因表達(dá)也可以通過(guò)體外或者體內(nèi)的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，目的是評(píng)價(jià)這種疫苗是否能夠提供有效的免疫應(yīng)答。一般地，可以對(duì)核酸被改變的微生物群與未改變的微生物群的特定抗原進(jìn)行比較。
一種可能性是測(cè)量與微生物群混和在一起的抗原呈遞細(xì)胞對(duì)目標(biāo)抗原的呈遞。微生物可以與適宜的抗原呈遞細(xì)胞或者細(xì)胞系混和在一起，例如樹(shù)突細(xì)胞，而可以測(cè)量由樹(shù)突細(xì)胞向識(shí)別該抗原的T細(xì)胞進(jìn)行的抗原呈遞。如果微生物表達(dá)的該抗原有足夠的水平，則該抗原會(huì)被樹(shù)突細(xì)胞處理為肽段，在MHC I類(lèi)或者II類(lèi)分子情形下向CD8+或者CD4+T細(xì)胞分別進(jìn)行呈遞。為了檢測(cè)到被呈遞的抗原，可以使用對(duì)特定抗原有響應(yīng)的T細(xì)胞克隆或者T細(xì)胞系。T細(xì)胞還可以是T細(xì)胞雜交瘤，其中T細(xì)胞與癌細(xì)胞系融合而變?yōu)闊o(wú)限增殖化的。這種T細(xì)胞雜交瘤、T細(xì)胞克隆或者T細(xì)胞系可以包含CD8+或者CD4+T細(xì)胞?？乖蔬f細(xì)胞可以向CD8+或者CD4+T細(xì)胞呈遞抗原，這取決于抗原被加工的途徑。CD8+T細(xì)胞識(shí)別MHC I類(lèi)抗原，而CD4+T細(xì)胞識(shí)別MHC II類(lèi)抗原。通過(guò)T細(xì)胞自身的T細(xì)胞受體的特異識(shí)別，T細(xì)胞被呈遞的抗原刺激，導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，例如IL-2或者干擾素γ(IFN-γ)，這些蛋白可以被定量測(cè)定(例如使用ELISA檢測(cè))?；蛘咴O(shè)計(jì)雜交瘤使其包含報(bào)告基因，例如β半乳糖苷酶，其在T細(xì)胞雜交瘤被呈遞的抗原刺激之后會(huì)被活化。β半乳糖苷酶產(chǎn)量的增加可以很容易地通過(guò)其對(duì)于底物(例如氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷)的活性測(cè)定，反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致顏色的改變。顏色的改變可以作為對(duì)特異抗原呈遞的指示的直接量度(實(shí)施例1、2和11)。其他評(píng)價(jià)本發(fā)明微生物疫苗抗原表達(dá)的體外和體內(nèi)的方法可以在實(shí)施例5中找到。還可以直接測(cè)量本發(fā)明的微生物對(duì)某種蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如放射性標(biāo)記的氨基酸可以加入到細(xì)胞群中，摻入某蛋白的放射性量可以測(cè)定。可以分離該細(xì)胞群合成的蛋白，例如通過(guò)凝膠電泳或者毛細(xì)管電泳，例如通過(guò)與該蛋白特異的抗體結(jié)合檢定出目標(biāo)蛋白，放射性的量可以定量測(cè)定以估計(jì)該蛋白的表達(dá)水平?；蛘咴跊](méi)有放射性時(shí)表達(dá)蛋白，用不同的方法檢測(cè)，例如ELISA檢測(cè)或者通過(guò)凝膠電泳以及Western印跡，使用酶聯(lián)抗體或者熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
與未改變的微生物相比，盡管對(duì)微生物核酸的改變有可能降低蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，但是應(yīng)當(dāng)理解這種方式仍然提供了有效的疫苗。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，重要的是增殖衰減與重組蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)合。疫苗的效力一般與能夠被微生物傳輸?shù)目乖膭┝坑嘘P(guān)，在有些實(shí)例中，需要有微生物一定活躍水平的基因表達(dá)。微生物復(fù)制的衰減可能有幾個(gè)log，而微生物的基因表達(dá)可能仍然充分保持。如果相同劑量的衰減的微生物與未改變的微生物比較，在衰減的微生物群中得到的抗原表達(dá)(通過(guò)以上討論的方法進(jìn)行測(cè)定)至少是未改變的微生物群中抗原表達(dá)的大約1％、大約5％、大約10％、大約25％、大約50％、大約75％、或者至少大約90％。因?yàn)樵趶?fù)制中可能有幾個(gè)log的衰減，改變的微生物的劑量可以安全地提高幾個(gè)log水平，結(jié)果是與未改變的微生物相比較，在免疫接種后，衰減的微生物可以提供等量的或者更大量的抗原。
在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)編碼蛋白的異源核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以與表達(dá)該蛋白的細(xì)菌宿主的密碼子偏好相適合。此外，編碼與所表達(dá)蛋白相融合的信號(hào)肽的序列也可以進(jìn)行密碼于優(yōu)化，以與該細(xì)菌宿主的密碼子偏好相適合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主是利斯特氏菌，異源蛋白編碼序列以及編碼信號(hào)肽的序列二者之一或者全部可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化。關(guān)于在利斯特氏菌中對(duì)抗原和信號(hào)序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化的進(jìn)一步信息，請(qǐng)參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)60/532,598，在此引用作為參考。
微生物核酸改變
可以使用多種不同的方法改變微生物群的核酸。可以通過(guò)物理方法改變微生物的核酸，例如使用紫外線輻射或者電離輻射。電離輻射例如x射線或者γ射線可以用來(lái)在核酸中產(chǎn)生單鏈或者雙鏈的斷裂。紫外線輻射可以用來(lái)在核酸中產(chǎn)生嘧啶二聚體。根據(jù)前面的詳述，估算輻射對(duì)復(fù)制和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，可以確定輻射的適宜劑量。
也可以使用化學(xué)方法改變微生物的核酸，例如與核酸靶向化合物反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用核酸靶向化合物處理微生物，使微生物的核酸被改變，這樣微生物的增殖受到衰減，其中微生物群仍然能夠表達(dá)所需的蛋白質(zhì)抗原，表達(dá)量足以誘發(fā)免疫應(yīng)答。核酸靶向化合物不止限于改變核酸的特定機(jī)制。這種化合物改變核酸的方式或者是與核酸直接反應(yīng)(即化合物的所有或者一些部分與核酸共價(jià)結(jié)合)，或者是間接導(dǎo)致核酸的改變(例如通過(guò)產(chǎn)生單線態(tài)氧或者氧自由基導(dǎo)致氧損傷，通過(guò)產(chǎn)生導(dǎo)致?lián)p傷的化合物的自由基，或者通過(guò)其他使核酸氧化或者還原的機(jī)制)。enediynes是一類(lèi)形成自由基導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂的化合物中的實(shí)例[Nicolaou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905881-5888(1993)]。與核酸直接反應(yīng)的化合物可能在該化合物被活化時(shí)，例如在該化合物被輻射時(shí)反應(yīng)。間接反應(yīng)導(dǎo)致核酸改變的化合物可能需要相似的活化以產(chǎn)生該化合物的活化形式或者產(chǎn)生其他的活性形式。盡管對(duì)于活化核酸靶向化合物的方法沒(méi)有限制，但是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括使用光活化的化合物，與核酸直接發(fā)生反應(yīng)或者產(chǎn)生活性形式例如活性氧(例如單線態(tài)氧)，這些活性形式再與核酸反應(yīng)。
核酸靶向化合物優(yōu)選地改變核酸，而對(duì)于生物樣品中的其他組分沒(méi)有顯著改變。這種化合物為核酸提供了足夠的改變，而沒(méi)有顯著改變或者損壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)或者酯類(lèi)。這種化合物可能對(duì)其他的細(xì)胞組分進(jìn)行一些改變，但是改變的程度不顯著。這些細(xì)胞組分例如細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和酯類(lèi)，如果它們的生物學(xué)功能被充分保留則它們沒(méi)有發(fā)生顯著改變。在使用核酸靶向化合物處理微生物時(shí)，核酸的改變導(dǎo)致微生物的復(fù)制被衰減同時(shí)微生物的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和酯類(lèi)幾乎未受影響，這樣微生物的基因表達(dá)仍是活躍的(例如基因表達(dá)所需的酶沒(méi)有受到顯著影響)，與沒(méi)有使用化合物處理的微生物相比，微生物的表面基本上保持了相同的抗原性。所以這種化合物在制備滅活微生物用于疫苗時(shí)是有用的，因?yàn)槲⑸锏脑鲋潮怀浞炙p，而同時(shí)保持了足夠的抗原性和免疫原性，這對(duì)于疫苗來(lái)講是有用的。由于這些化合物特異地改變核酸，改變可以被控制在所需的水平，這樣復(fù)制被衰減而保持了足夠水平的蛋白質(zhì)表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)改變反應(yīng)參數(shù)控制這種改變，例如化合物的濃度、反應(yīng)介質(zhì)、控制化合物活化的因素例如光劑量或者pH，或通過(guò)控制氧的濃度(或者物理控制，例如脫氣或者化學(xué)控制例如使用氧清除劑)來(lái)控制導(dǎo)致氧損傷的化合物濃度。核酸靶向化合物是任何傾向優(yōu)先結(jié)合核酸的化合物，即具有可測(cè)量的對(duì)于核酸的親和性。這種化合物對(duì)核酸比對(duì)生物樣品中的大多數(shù)其他組分，特別是例如蛋白質(zhì)、酶、酯類(lèi)和膜組分，具有更強(qiáng)的親和性。核酸靶向提供了改變核酸的特異性，而對(duì)于生物樣品中的其他組分，例如基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯體系，則沒(méi)有顯著影響。
化合物可以以多種方式靶向核酸。通過(guò)以下方式中的任何一種或者這些方式的組合與核酸結(jié)合的化合物被認(rèn)為是核酸靶向化合物。嵌入、小溝結(jié)合、大溝結(jié)合、靜電引力結(jié)合(例如磷酸主鏈結(jié)合)以及序列特異結(jié)合(通過(guò)大溝或者小溝中的序列識(shí)別)都是與核酸非共價(jià)結(jié)合的方式。包括這些結(jié)合方式中一種或者多種的化合物對(duì)核酸具有高親和性。盡管本發(fā)明并不限于以下的化合物，具有這些結(jié)合核酸方式的化合物的一些實(shí)例如下嵌入劑的實(shí)例有吖啶、吖啶酮、原黃素、吖啶黃素、放線菌素、anthracyclinones、β-紫紅霉素A、道諾霉素、硫代噻噸酮、米來(lái)西D、氨茴霉素、絲裂霉素、棘霉素、醌霉素、三骨菌素、二吖啶、橢圓玫瑰樹(shù)堿(ellipticene)(包括二聚體、三聚體和類(lèi)似物)、norphilin A、芴和芴酮、芴二胺、喹吖因、苯并吖啶、吩嗪、phenanthradines吩噻嗪、氯丙嗪、吩噁嗪、苯并噻唑、呫噸和噻噸、蒽醌、蒽吡唑、苯并硫代吡喃吲哚(benzothiopyranoindoles)，3，4-苯并芘、苯并芘diolepoxidie、1-pyrenyloxirane、苯并蒽-5，6-氧化物、苯并二吡喃酮、苯并噻唑、喹啉酮、氯喹、奎寧、苯基喹啉氨甲酰胺、咈喃香豆素(例如補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和它們的硫類(lèi)似物)、乙啶鹽、丙啶、coralyne，橢圓玫瑰樹(shù)堿陽(yáng)離子以及衍生物，多環(huán)碳?xì)浠衔锖退鼈兊沫h(huán)氧衍生物，以及echinimycin；小溝結(jié)合物的實(shí)例有偏端霉素、絲裂霉素、紡錘霉素、其他lexitropsins，Hoechst 33258和其他Hoechst染料，DAPI(4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)，伯林尼爾(berenil)，以及三芳甲烷染料；小溝結(jié)合劑的實(shí)例有黃曲霉毒素；靜電結(jié)合劑的實(shí)例有精胺、亞精胺、和其他的多胺；序列特異結(jié)合物的實(shí)例有核酸或者其類(lèi)似物，它們通過(guò)序列特異的相互作用例如形成三螺旋、形成D-環(huán)以及與單鏈目標(biāo)直接堿基配對(duì)等方式與核酸結(jié)合。其他的序列特異化合物包括多聚吡咯化合物、多聚吡咯咪唑化合物、環(huán)丙基吡咯吲哚化合物以及相關(guān)的小溝結(jié)合化合物[Wemmer，Nature Structural Biology，5(3)169-171(1998)，Wurtz等人，Chemistry&Biology 7(3)153-161(2000)，Anthon等人，Am.J.pharmacogenomics1(1)67-81(2001)]。
除了靶向核酸以外，化合物還可以與核酸發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生與核酸的共價(jià)結(jié)合。核酸烷化劑是一類(lèi)可以與核酸共價(jià)反應(yīng)的化合物，包括但是不只限于，芥子(例如單或者二鹵代乙胺基團(tuán)以及單鹵代乙基硫基團(tuán))、芥子等價(jià)物(例如環(huán)氧化物、α鹵代酮)以及芥子中間產(chǎn)物(例如氮丙啶、吖丙啶鎓及它們的類(lèi)似物)、硫酸甲酯以及亞硝基脲。核酸烷化劑通常與核酸上的親核基團(tuán)反應(yīng)。是這些化合物使核酸烷化的活性以及靶向核酸的能力二者的結(jié)合使得它們具有與核酸特異地共價(jià)結(jié)合的能力，提供了對(duì)用于本發(fā)明中微生物的核酸的所需改變。這些化合物的特異性可以通過(guò)使用不會(huì)進(jìn)入到微生物中的淬滅劑而得到進(jìn)一步提高。這種淬滅劑會(huì)使與微生物表面的反應(yīng)淬滅而仍然允許核酸靶向化合物與微生物的核酸反應(yīng)。對(duì)于這種淬滅的討論可以在美國(guó)專利編號(hào)6,270,952中找到，該專利公開(kāi)的內(nèi)容在這里引用作為參考?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)化合物的濃度和反應(yīng)條件來(lái)控制對(duì)微生物核酸的改變。根據(jù)前面的詳述，通過(guò)估計(jì)濃度和反應(yīng)條件對(duì)于復(fù)制核蛋白質(zhì)表達(dá)的影響來(lái)確定適宜的濃度和反應(yīng)條件。本發(fā)明中使用的化合物的濃度在大約10pM到10mM時(shí)是有效的，還有在大約100pM到1mM，還有在大約1nM到10μM，還有在大約1-500nM，還有在大約1-200nM或者大約1-100nM。對(duì)于靶向核酸、具有核酸反應(yīng)性能夠與核酸(特別是微生物核酸)發(fā)生特異反應(yīng)的化合物的討論可以在美國(guó)專利編號(hào)6,143,490和6,093,725中找到，這些專利公開(kāi)的內(nèi)容在這里引用作為參考。
可以通過(guò)使用核酸靶向化合物對(duì)核酸進(jìn)行改變，核酸靶向化合物需要輻射的活化才能對(duì)核酸進(jìn)行改變。這種化合物靶向核酸上，如上面所討論的。這些化合物包括，但是不只限于，吖啶、吖啶酮，anthyrl衍生物，咯嗪(例如核黃素)，苯并三唑衍生物，平面芳香族重氮衍生物，平面芳香腈衍生物，甲苯胺，吖黃素，酚噻嗪(例如亞甲基藍(lán))、咈喃香豆素，白芷素，補(bǔ)骨脂素，補(bǔ)骨脂素的硫類(lèi)似物，喹諾酮，喹啉，喹喔啉，萘啶，氟喹啉酮，蒽醌和蒽。許多這些化合物被用作DNA光斷裂劑[Da Ros等人，Current Pharmaceutical Design71781(2001)]。盡管本發(fā)明沒(méi)有對(duì)活化核酸靶向化合物的方法進(jìn)行限制，但通常這些化合物可以使用特定波長(zhǎng)的光進(jìn)行活化。光的有效波長(zhǎng)取決于化合物的性質(zhì)，其范圍可以從大約200到1200nm。對(duì)于這些化合物中的一些，活化使得核酸被改變而沒(méi)有化合物與核酸的直接結(jié)合，例如通過(guò)在核酸周?chē)a(chǎn)生活性氧。對(duì)于這些化合物中的一些，活化導(dǎo)致化合物與核酸直接結(jié)合(即化合物共價(jià)結(jié)合)。這些化合物中的一些可以與核酸反應(yīng)形成一個(gè)鏈間的交聯(lián)。補(bǔ)骨脂素是使核酸交聯(lián)的化合物中的一例。這些化合物通常被UVA光(320-400nm)活化。在本發(fā)明中使用的補(bǔ)骨脂素化合物在美國(guó)專利編號(hào)6,133,460和5,593,823中舉例說(shuō)明，這些專利公開(kāi)的內(nèi)容在這里引用作為參考。同樣，是核酸靶向和在活化后改變核酸的能力二者的結(jié)合使得它們具有與核酸的特異反應(yīng)性。微生物核酸的改變可以通過(guò)調(diào)節(jié)化合物濃度、反應(yīng)條件和光劑量來(lái)改變。根據(jù)前面的詳述，對(duì)濃度和光劑量對(duì)復(fù)制和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而確定適當(dāng)?shù)臐舛群凸鈩┝?。除了化合物濃度和光照射水平以外，反?yīng)還受到樣品在UVA紫外光下照射條件的影響。例如在緩沖培養(yǎng)基內(nèi)輻射微生物群所需的整體濃度與輻射在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如BHI，Triptase Soy Broth)內(nèi)的微生物群所需的整體濃度就有所不同。光反應(yīng)會(huì)受到培養(yǎng)基內(nèi)物質(zhì)的影響，它們可能與補(bǔ)骨脂素發(fā)生相互作用，這樣就需要更高整體濃度的補(bǔ)骨脂素。此外，使微生物接受有效劑量可能取決于生物體的生長(zhǎng)階段和在該生長(zhǎng)階段有沒(méi)有該化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群在補(bǔ)骨脂素UVA處理時(shí)包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素加到微生物群中，在補(bǔ)骨脂素和生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在的條件下培養(yǎng)該微生物，UVA的處理與微生物的生長(zhǎng)階段處于相同時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，在使用適當(dāng)劑量的UVA照射之前，使微生物群在補(bǔ)骨脂素存在的條件下生長(zhǎng)到OD達(dá)0.5-1(1×107到1×109CFU/mL)。補(bǔ)骨脂素化合物在大約10pM-10mM的濃度內(nèi)是有效的，還有在大約100pM-1mM，還有在大約1nM-10μM，還有在大約1-500nM，還有在大約1-200nM或者大約1-100nM，UVA紫外線的劑量范圍從大約0.1-100J/cm2，還有是大約0.1-20J/cm2，還有是大約0.5-10J/cm2，還有是大約0.5-6J/cm2，或者是大約2-6J/cm2。在一個(gè)實(shí)施方案中，在下列濃度的補(bǔ)骨脂素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在下處理微生物大約10pM-10mM，還大約1-5000nM，還大約1-500nM，還大約5-500nM或大約10-400nM。在一個(gè)實(shí)施方案中，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在時(shí)處理微生物，使其在補(bǔ)骨脂素存在時(shí)生長(zhǎng)到OD達(dá)0.5-1，補(bǔ)骨脂素的濃度為大約10pM-10mM，還有在大約1-5000nM，還有在大約1-500nM，還有在大約5-500nM或者大約10-400nM。在生長(zhǎng)達(dá)到OD0.5-1以后，使用UVA紫外線照射該微生物群，照射劑量為大約0.1-100J/cm2，還有是大約0.1-20J/cm2，或是大約0.5-10J/cm2，0.5-6J/cm2，或者是大約2-6J/cm2。
含有異源核酸序列的微生物
可以改變微生物使其包括異源的核酸序列，該序列可以被此微生物表達(dá)。異源序列可以編碼至少一種特異的蛋白質(zhì)抗原。可以通過(guò)對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的方法[Sambrook and Russell，MolecularCloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，(2000)]改變微生物?？梢詫⑽⑸锔淖?yōu)楹幸粋€(gè)或者多個(gè)序列，其編碼一種或者多種抗原。編碼特異抗原的異源核酸序列不限于嚴(yán)格的核酸序列，它應(yīng)該是一種足以提供抗原表達(dá)的序列，該抗原在向個(gè)體施用以后會(huì)誘發(fā)所需的免疫應(yīng)答。異源序列可以被表達(dá)為與某一疾病相關(guān)的抗原。表達(dá)這種抗原的微生物可以用于疫苗，其中的疫苗可以用于預(yù)防性治療或者治療性治療。可以使用這種疫苗治療的疾病包括傳染性疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏、癌癥以及其他細(xì)胞增生型疾病。
可以改變本發(fā)明的微生物使其包含編碼特異腫瘤抗原的異源核酸序列。已經(jīng)鑒定出大量的被T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤特異抗原[Renkvist等人，Cancer Immunol Innumother 503-15(2001)]。這些腫瘤抗原可以是分化抗原(例如PSMA，酪氨酸酶，gp100)、組織特異抗原(例如PAP、PSA)、發(fā)育抗原、腫瘤相關(guān)的病毒抗原(例如HPV 16E7)，癌/睪丸抗原(例如MAGE、BAGE、NY-ESO-1)，胚胎抗原(例如CEA、α胎蛋白)、癌蛋白抗原(例如Ras、p53)、過(guò)量表達(dá)蛋白抗原(例如ErbB2(Her2/Neu)，MUC1)或者突變的蛋白抗原?？梢杂僧愒春怂嵝蛄芯幋a的腫瘤抗原包括，但是不限于，707-AP，膜聯(lián)蛋白II，AFP，ART-4，BAGE，β-連環(huán)蛋白/m，BCL-2，bcr-ab1，bcr-ab1 p190，bcr-ab1 p210，BRCA-1，BRCA-2，CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK-4/m，CEA，CT9，CT10，Cyp-B，Dek-cain，DAM-6(MAGE-B2)，DAM-10(MAGE-B1)，ELF2M，EphA2，ETV6-AML1，G250，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7B，GAGE-8，GnT-V，gp100，HAGE，HER2/neu，HLA-A*0201-R170I，HPV-E7，HSP70-2M，HST-2，hTERT，hTRT，iCE，細(xì)胞程序死亡抑制劑(例如survivin)，KIAA0205，LAGE，LAGE-1，LDLR/FUT，MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-6，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-D，MART-1，MART-1/Melan-A，MC1R，MDM-2，間皮素(mesothelin)，肌球蛋白/m，MUC1，MUC2，MUM-1，MUM-2，MUM-3，neo-polyA-聚合酶，NA88-A，NY-ESO-1，NY-ESO-1a(CAG-3)，PAGE-4，PAP，蛋白酶3(PR3)，P15，p190，Pml/RARα，PRAME，PSA，PSM，PSMA，RAGE，RAS，RCAS1，RU1，RU2，SAGE，SART-1，SART-2，SART-3，SP 17，SPAS-1，TEL/AML1，TPI/m，酪氨酸酶，TARP，TRP-1(gp75)，TRP-2，TRP-2/INT2，WT-1，以及來(lái)源于NY-ESO-1和LAGE-1基因的可變翻譯的NY-ESO-ORF2和CAMEL蛋白。本發(fā)明的微生物包含任何能夠引發(fā)腫瘤特異免疫應(yīng)答的腫瘤抗原，包括還沒(méi)有被檢定的抗原?？梢詫⑽⑸锔淖?yōu)楹幸环N以上異源序列，其編碼一種以上的腫瘤抗原。優(yōu)選的抗原包括間皮素[Argani等人，Clin Cancer Res.7(12)3862-8(2001)]，Sp17[Lim等人，Blood.97(5)1508-10(2001)]，gp100[Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916458(1994)]，PAGE-4[Brinkmann等人，Cancer Res.59(7)1445-8(1999)]，TARP[Wolfgang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(17)9437-42(2000)]，EphA2[Tatsumi等人，Cancer Res.63(15)4481-9(2003)]，PR3[Muller-Berat等人，Clin.Immunol.Immunopath.70(1)51-9(1994)]以及SPAS-1[U.S.專利申請(qǐng)出版編號(hào)20020150588]。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被改變的微生物表達(dá)的異源抗原是CEA。CEA是180kDA的膜細(xì)胞間附著糖蛋白，它在很大一部分的人腫瘤中有過(guò)量的表達(dá)，包括90％的結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、70％的非小型細(xì)胞肺癌以及50％的乳腺癌(Hammarstrom，Semin.Cancer Biol.，967-81)。研究者對(duì)許多不同的免疫療法進(jìn)行了研究例如模擬CEA的抗獨(dú)特型單克隆抗體(Foon等人，Clin.Cancer Res.，87982-90(1995))或者使用表達(dá)CEA的重組痘病毒進(jìn)行接種(Tsang等人，J.Natl.Cancer Inst.，87982-90(1995))，不幸的是它們只取得了有限的成功。但是研究人員鑒定了一種HLA*0201限制表位，CAP-1(CEA605-613)，它被來(lái)自免疫接種病人的人T細(xì)胞系識(shí)別。使用該表位沖擊后的DC接種病人不能誘導(dǎo)臨床應(yīng)答(Morse等人，Clin.CancerRes.，51331-8(1999))。最近鑒定出一個(gè)CEA605-613肽激動(dòng)劑，其具有一個(gè)畸形的天冬氨酸，代替了610位的天冬酰胺(CAP 1-6D)。盡管該氨基酸替代沒(méi)有改變?cè)撾牡腗HC結(jié)合親和性，但是使用改變的肽配基(APL)導(dǎo)致在體外CEA特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)產(chǎn)量的增加。CAP1-6D-特異的CTL保持了它們識(shí)別和裂解表達(dá)天然CEA蛋白的腫瘤細(xì)胞的能力(Zaremba等人，Cancer Res.，574570-7(1997)；Salazar等人，Int.J.Cancer，85829-38(2000))。Fong等人證明具有結(jié)腸癌病人體內(nèi)誘導(dǎo)出CEA特異的免疫性，這些病人接受了用Flt3-配基擴(kuò)展的DC與該APL共同孵育后進(jìn)行的接種。令人鼓舞的是，12個(gè)病人中有兩人在接種后出現(xiàn)顯著的腫瘤消退，這與肽-MHC四聚體+T細(xì)胞的誘導(dǎo)相互關(guān)聯(lián)(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，988809-14(2001))。一起來(lái)看，該工作為以CEA為目標(biāo)治療結(jié)腸癌的免疫療法提供了重要的確證。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，被改變的微生物表達(dá)的異源抗原是蛋白酶3或者來(lái)源于蛋白酶3。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原包含HLA-A2.1-限制肽PR1(氨基酸169-177；VLQELNVTV(SEQ ID NO50))。關(guān)于蛋白酶3和/或PR1表位的信息可以從以下的參考文獻(xiàn)中公開(kāi)地獲得美國(guó)專利編號(hào)5,180,819，Molldrem等人，Blood，902529-2534(1997)；Molldrem等人，Cancer Research，592675-2681(1999)；Molldrem等人，Nature Medicine，61018-1023(2000)；以及Molldrem等人，Oncogene，218668-8673(2002)，
因此，在一些實(shí)施方案中，改變的微生物包含的核酸分子編碼的抗原有例如，間皮素，SPAS-1，蛋白酶3，EphA2，SP-17，gp100，PAGE-4，TARP，Her-2/neu，WT-1，NY-ESO-1，PSMA，K-ras或者CEA，或者衍生自這些蛋白的抗原。在一些實(shí)施方案中，改變的微生物包含的核酸分子編碼的抗原有例如，間皮素，SPAS-1，蛋白酶3，SP-17，gp100，PAGE-4，TARP，WT-1，NY-ESO-1或者CEA，或者衍生自這些蛋白的抗原。在一些實(shí)施方案中，改變的微生物包含的核酸分子編碼的抗原是人間皮素，或者是衍生自人間皮素的抗原。在其他實(shí)施方案中，改變的微生物包含的核酸分子編碼人EphA2，或者是衍生自人EphA2的抗原。
可以改變本發(fā)明的微生物使其含有編碼特異的傳染性疾病抗原的異源核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自人或者動(dòng)物病原。病原可選擇地是病毒、細(xì)菌、真菌或者原生動(dòng)物。例如，抗原可以是病毒或者真菌或者細(xì)菌的抗原。
例如，抗原可以來(lái)源于人免疫缺陷病毒(例如gp 120，gp 160，gp41，gag抗原例如p24gag和p55gag，以及來(lái)源于HIV的pol，env，tat，vif，rev，nef，vpr，vpu和LTR區(qū)域的蛋白)、貓科免疫缺陷病毒或者人或動(dòng)物的皰疹病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自單純皰疹病毒(HSV)類(lèi)型1和2(例如gD，gB，gH，即早蛋白例如ICP27)、來(lái)自巨細(xì)胞病毒(例如gB和gH)，來(lái)自人metapneumovirus毒、來(lái)自EB病毒或者來(lái)自水痘-帶狀皰疹病毒(例如gpI，II或III)。(參見(jiàn)例如Chee等人(1990)Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，ed.，Springer Verlag，pp.125-169；McGeoch等人(1988)J.Gen.Virol.691531-1574；美國(guó)專利5,171,568號(hào)；Baer等人(1984)Nature310207-211；以及Davison等人(1986)J.Gen.Virol.671759-1816.)
在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自肝炎病毒例如乙型肝炎病毒(例如乙肝表面抗原)，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或者庚型肝炎病毒。參見(jiàn)例如WO 89/04669；WO90/11089；和WO 90/14436。HCV基因組編碼幾種病毒蛋白，包括E1和E2。參見(jiàn)例如Houghton等人，Hepatology 14381-388(1991).
屬于病毒抗原的抗原可以選擇性地來(lái)自以下各科中的任何一種細(xì)小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒、鼻病毒等)；杯狀病毒科；披膜病毒科(例如風(fēng)疹病毒、登革病毒等)；黃病毒科；冠狀病毒科；呼腸孤病毒科(例如輪狀病毒等)；雙RNA病毒科；彈狀病毒科(例如狂犬病毒等)；正黏病毒科(例如流感病毒A、B、C型等)；線狀病毒科；副黏病毒科(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體毒素、副流感病毒等)；布尼亞病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如HTLV-I；HTLV-11；HIV-1(也被稱為HTLV-111，LAV，ARV，hTLR，等))，包括但是不限于來(lái)自以下分離株的抗原HIVIllb，HIVSF2，HTVLAV，HIVLAI，HIVMN)；HIV-1CM235，HIV-1；HIV-2等；猴免疫缺陷病毒(SIV)；乳頭瘤病毒，蜱傳腦炎病毒等。參見(jiàn)例如Virology，第三版(W.K.Joklik編1988)；Fundamental Virology，第二次增補(bǔ)版(B.N.Fields andD.M.Knipe，eds.1991)，中對(duì)這些病毒和其他病毒的描述。
在另一些實(shí)施方案中，抗原來(lái)自細(xì)菌病原例如分支桿菌屬、芽孢桿菌屬、耶爾森氏菌屬、沙門(mén)氏菌屬、奈瑟氏菌屬，疏螺旋體屬(例如，OspA或者OspB或者它們的衍生物)，衣原體或者博德特氏桿菌屬(例如P.69，PT和FHA)，或者來(lái)自寄生蟲(chóng)例如瘧原蟲(chóng)屬或者弓形蟲(chóng)屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原來(lái)自結(jié)合分支桿菌(例如ESAT-6，85A，85B，72F)，炭疽芽孢桿菌(例如PA)，或者鼠疫耶爾森氏菌(例如F1，V)。此外適于用于本發(fā)明的抗原可以從導(dǎo)致以下疾病的病原中獲得或者衍生，這些疾病包括，但是不限于，白喉，百日咳，破傷風(fēng)，結(jié)核，細(xì)菌性或者真菌性肺炎，中耳炎，淋病，霍亂，傷寒，腦膜炎，單核細(xì)胞增多癥，鼠疫，痢疾或者沙門(mén)氏菌病，軍團(tuán)桿菌病、lyme氏疏螺旋體病，麻風(fēng)病，瘧疾，鉤蟲(chóng)病，盤(pán)尾絲蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病，錐蟲(chóng)病，利什曼病，Giardia，阿米巴病，絲蟲(chóng)病，Borelia以及旋毛蟲(chóng)病。
可以改變本發(fā)明的微生物使其含有編碼自身免疫疾病特異抗原的異源核酸序列。在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病中，T細(xì)胞對(duì)于自身抗原的應(yīng)答導(dǎo)致了自身免疫疾病。用于利用本發(fā)明的疫苗治療自身免疫疾病的抗原可以以造成自身免疫應(yīng)答的T細(xì)胞作為目標(biāo)。例如抗原可以是對(duì)于那些導(dǎo)致自身免疫應(yīng)答的T細(xì)胞特異的T細(xì)胞受體的一部分、獨(dú)特型，其中摻入到本發(fā)明疫苗中的抗原會(huì)引發(fā)對(duì)那些導(dǎo)致自身免疫應(yīng)答的T細(xì)胞特異的免疫應(yīng)答。除去那些T細(xì)胞是一種減輕自身免疫疾病的治療機(jī)制。另一種可能性是摻入產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原，這些抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答針對(duì)的是自身免疫疾病中針對(duì)自身抗原產(chǎn)生的抗體，或者是分泌這些抗體的特異B細(xì)胞克隆。例如獨(dú)特型抗原可以摻入到微生物中，這樣會(huì)產(chǎn)生抗獨(dú)特型免疫應(yīng)答，該應(yīng)答針對(duì)的是這種B細(xì)胞和/或在自身免疫疾病中與自身抗原反應(yīng)的抗體?？梢杂帽景l(fā)明中的疫苗微生物治療的自身免疫疾病包括，但是不限于，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥、克羅恩氏病(節(jié)段性回腸炎)、狼瘡、重癥肌無(wú)力、白癲風(fēng)、硬皮病、銀屑病、尋常性天皰瘡、肌纖維痛、結(jié)腸炎和糖尿病。治療過(guò)敏應(yīng)答，可以采取相似的方法，其中摻入到疫苗微生物中的抗原針對(duì)的是T細(xì)胞、B細(xì)胞或者在調(diào)節(jié)過(guò)敏反應(yīng)中起作用的抗體。在一些自身免疫疾病中，例如銀屑病，該疾病導(dǎo)致了細(xì)胞增生型細(xì)胞生長(zhǎng)，表達(dá)的抗原也會(huì)成為疫苗攻擊的對(duì)象。也考慮能夠產(chǎn)生這種針對(duì)細(xì)胞增生型細(xì)胞的免疫應(yīng)答的抗原。
本發(fā)明的微生物包含的抗原針對(duì)的不是疾病中有功能障礙的細(xì)胞，而是與疾病有關(guān)的獨(dú)特的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這方面的一個(gè)實(shí)例是使用以上討論的獨(dú)特型抗原靶向抗體、B細(xì)胞或者T細(xì)胞。另一種可能性是針對(duì)由于某種疾病產(chǎn)生的獨(dú)特的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這方面的一個(gè)實(shí)例是摻入抗原會(huì)產(chǎn)生對(duì)導(dǎo)致淀粉樣斑塊發(fā)生的蛋白的免疫應(yīng)答，淀粉樣斑塊在阿爾茨海默氏病，克雅氏病(CJD)以及牛海綿狀腦病(BSE)中會(huì)觀察到。盡管這一方法可能只能使斑塊的形成減少，但是對(duì)于類(lèi)似CJD的疾病而言有可能提供一種有療效的疫苗。該疾病是由于朊蛋白的感染性形式所導(dǎo)致的。疫苗摻入了是針對(duì)朊蛋白感染性形式的抗原，這樣由疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答就可以消除、降低或者控制導(dǎo)致CJD的感染性蛋白。
含有突變的微生物
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了包含微生物的疫苗，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖受到衰減，其中的微生物群體仍然能夠表達(dá)所需的蛋白，表達(dá)水平足以誘發(fā)免疫應(yīng)答，并且其中的微生物被至少一種基因突變進(jìn)一步地衰減。微生物中的突變可能影響微生物的許多性質(zhì)。在一些情況下，突變影響微生物侵入某些細(xì)胞的能力。例如，某些細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌可以侵入許多不同的細(xì)胞類(lèi)型，這取決于細(xì)菌上存在的受體。突變可能改變某些受體的表達(dá)，這樣細(xì)菌就會(huì)被某些細(xì)胞攝入而不被其他細(xì)胞攝入。作為這方面的一個(gè)實(shí)例，利斯特氏菌通常被吞噬細(xì)胞攝取，并且也活躍地侵入非吞噬細(xì)胞(例如肝細(xì)胞)?？梢允褂美固厥暇耐蛔儯@樣對(duì)非吞噬細(xì)胞的侵入被顯著降低或消除，而吞噬細(xì)胞的攝取仍然足夠活躍。這樣的突變可能提供更好的免疫應(yīng)答，因?yàn)橐呙鐣?huì)被吞噬細(xì)胞優(yōu)先攝取，這對(duì)于向免疫系統(tǒng)呈遞細(xì)菌抗原是重要的。應(yīng)當(dāng)理解突變可以發(fā)生在任何基因上，導(dǎo)致微生物侵入某些類(lèi)型細(xì)胞能力的衰減，這可以由利斯特氏菌中內(nèi)化素基因(例如inlA，inlB)的突變來(lái)說(shuō)明。在其他細(xì)菌中可能存在相似的基因(例如在沙門(mén)氏菌屬，炭疽芽孢桿菌屬，和耶爾森氏菌屬中的侵襲素基因)，這些基因的突變也包括在本發(fā)明中。突變可能影響到微生物的其他性質(zhì)，例如毒力因子或者使微生物生長(zhǎng)和擴(kuò)散的基因，這樣就降低了微生物的毒性。例如，利斯特氏菌的actA基因突變導(dǎo)致宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合的缺陷，這抑制了利斯特氏菌向其他細(xì)胞的擴(kuò)散。利斯特氏菌的hly基因(利斯特溶素(listeriolysin)(LLO)蛋白)突變影響了利斯特氏菌逃脫受感染細(xì)胞吞噬溶酶體的能力。利斯特氏菌的plcA或plcB基因發(fā)生突變影響了利斯特氏菌從細(xì)胞向細(xì)胞的擴(kuò)散。耶爾森氏菌的yop基因發(fā)生突變影響了耶爾森氏菌防止被巨噬細(xì)胞吞噬的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基團(tuán)突變減弱了某些抗原的表達(dá)，例如通常導(dǎo)致對(duì)微生物自身產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原。如果用于疫苗的微生物包含異源抗原，目的是刺激產(chǎn)生針對(duì)異源抗原的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，而與未突變的微生物相比，對(duì)于傳輸微生物的免疫應(yīng)答下降，則這樣的突變是有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)一個(gè)以上基因的突變使微生物減毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變中的一個(gè)位于利斯特氏菌的內(nèi)化素基因或者其他細(xì)菌的相似基因上。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變位于一個(gè)或者多個(gè)利斯特氏菌的內(nèi)化素基因或者其他細(xì)菌的相似基因上。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變之一位于actA基因上。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，它在actA基因上具有突變，并且在一個(gè)或者多個(gè)內(nèi)化素基因上有突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在actA基因和inlB基因上含有突變，優(yōu)選地，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含actA/inlB缺失突變(在這里既可以表示為ΔactAΔinlB，又可以表示為actA-inlB-)。多種利斯特氏菌的基因的序列，包括那些在這里進(jìn)行描述的基因的序列可以在Genbank登錄號(hào)NC_003210中找到。
微生物可能含有突變，該突變顯著降低了微生物修復(fù)對(duì)它們的核酸改變的能力。這種突變可以位于參與微生物DNA修復(fù)機(jī)制的多種不同的基因中[Aravind等人，Nucleic Acids Research 27(5)1223-1242(1999)]。在修復(fù)對(duì)其核酸造成的損傷的能力上有缺陷的微生物，為本發(fā)明的微生物的使用提供了更進(jìn)一步的安全性和有效性。使用適當(dāng)?shù)男迯?fù)缺陷突變體，微生物對(duì)核酸的改變極度敏感?？梢暂^小幅度地改變微生物的核酸而仍然保證所需的增殖衰減。這提供了更大的對(duì)效力進(jìn)行操作的窗口，這樣微生物核酸的表達(dá)仍然足夠以產(chǎn)生所需的蛋白。在需要抗原的重新表達(dá)時(shí)，這提供了可以引發(fā)有效免疫應(yīng)答的疫苗。它還提供了更高水平的安全性，因?yàn)橐呀?jīng)獲得的增殖衰減不會(huì)因?yàn)閷?duì)于改變核酸的修復(fù)而受到損害。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變改變了微生物對(duì)核酸靶向化合物處理的易感性，例如改變微生物對(duì)于該化合物的通透性或者改變化合物接觸和結(jié)合微生物核酸的能力。這種突變還可能影響增殖衰減這一過(guò)程的效力，而同時(shí)使微生物的基因表達(dá)基本上不受影響。
為了詳細(xì)闡明使用修復(fù)缺陷突變體的優(yōu)勢(shì)，可以考慮微生物增殖衰減的機(jī)制。微生物核酸通過(guò)鏈斷裂或者嘧啶二聚體，或者通過(guò)化學(xué)修飾例如單加合物或者交聯(lián)而被改變。如果對(duì)于這些改變的修復(fù)機(jī)制完好無(wú)缺，則需要一定數(shù)量的改變才能達(dá)到有效的增殖衰減。對(duì)核酸改變得越大，蛋白質(zhì)表達(dá)減少得越多。盡管衰減增殖所需的改變水平與終止蛋白質(zhì)表達(dá)所需的改變水平相比要低得多，蛋白質(zhì)的表達(dá)仍然會(huì)有一定程度的下降，很可能到達(dá)一個(gè)不能被接受的水平。使用修復(fù)缺陷突變體顯著降低了衰減增殖所需的水平，這樣低水平的核酸改變就會(huì)導(dǎo)致充分的增殖衰減。由于核酸的改變少得多，蛋白質(zhì)表達(dá)受到的影響減小，目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平提高。這種修復(fù)缺陷突變體可能在制備疫苗中是非常有用的，例如針對(duì)微生物自身的疫苗，這時(shí)可以通過(guò)對(duì)核酸進(jìn)行微小的改變提高疫苗的安全性，而仍然保留足夠高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)，特別是免疫應(yīng)答所針對(duì)的抗原的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修復(fù)缺陷突變體不能制造PhrB(一種光裂解酶)，PhrB的作用是修復(fù)嘧啶二聚體。例如，突變可以位于phrB基因或者功能等價(jià)的基因中(這取決于微生物的種屬)。這種突變體可以與紫外線輻射(例如UVB，UVC)微生物聯(lián)合使用，在微生物的核酸中產(chǎn)生嘧啶二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中修復(fù)缺陷突變體不能修復(fù)鏈間交聯(lián)。這種突變體包含，但是不限于，uvr基因即uvrA，uvrB，uvrC，和uvrD以及recA基因，或者功能等價(jià)的基因(這取決于微生物的種屬)的突變。突變可以出現(xiàn)在這些基因中的一個(gè)或者多個(gè)中。這些突變導(dǎo)致了相應(yīng)的酶UvrA(ATP酶)，UvrB(解旋酶)，UvrC(核酸酶)，UvrD(解旋酶II)以及RecA(重組酶)的活性的減弱。這些突變體可以與交聯(lián)化合物例如補(bǔ)骨脂素聯(lián)合使用。因?yàn)槲⑸锖怂嵩谝恍┪恢檬墙宦?lián)的，而這些交聯(lián)不能夠被修復(fù)，所以微生物由于最初的核酸鏈不能夠分開(kāi)而不能復(fù)制。由于交聯(lián)不能被修復(fù)，所以只需要非常少的交聯(lián)，微生物核酸的大部分仍然可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)的表達(dá)沒(méi)有出現(xiàn)顯著改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一群不能修復(fù)鏈間交聯(lián)的修復(fù)缺陷微生物突變體進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕宦?lián)，這樣幾乎該群中每一個(gè)微生物都含有至少一個(gè)交聯(lián)，這樣復(fù)制的衰減幾乎是完全的，其中該群體的微生物基因表達(dá)是足夠活躍的。在一個(gè)實(shí)施方案中，recA基因的突變是一個(gè)條件突變。在這種突變中，recA基因的突變導(dǎo)致recA的活性僅僅在某些條件下(即非允許條件)減弱，例如微生物群體適宜的pH或者溫度。包含條件recA突變的微生物可以在允許條件下進(jìn)行培養(yǎng)，目的是使微生物生長(zhǎng)到足夠水平，然后將其置于非允許條件中進(jìn)行處理改變核酸，然后在非允許條件下保存，這樣核酸的損傷不能得到充分的修復(fù)。作為這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)例，將recA溫度敏感突變體在30℃培養(yǎng)，這時(shí)它生長(zhǎng)得很好，在42℃處理以改變核酸，42℃對(duì)于recA是非允許的，這使得微生物對(duì)于例如補(bǔ)骨脂素的交聯(lián)等處理非常敏感。盡管經(jīng)過(guò)處理的微生物可以在非允許條件下儲(chǔ)存，但是有可能在免疫接種以后，環(huán)境可能允許recA的表達(dá)，導(dǎo)致一些修復(fù)，出現(xiàn)安全性問(wèn)題?？梢詷?gòu)建recA處于lac阻遏物控制下的微生物，這樣在滅活和/或免疫步驟以前需要生長(zhǎng)的時(shí)候，菌株的生長(zhǎng)可以被異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)。在滅活和/或免疫步驟時(shí)，不再進(jìn)一步添加IPTG或者從菌株的環(huán)境中除去IPTG，則recA表達(dá)的可能性可以被消除。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含至少一個(gè)突變，該突變顯著降低了微生物修復(fù)其核酸的改變的能力；微生物還至少包含一個(gè)與修復(fù)機(jī)制無(wú)關(guān)的突變。與修復(fù)機(jī)制無(wú)關(guān)的突變可能影響微生物的多種性質(zhì)，例如微生物侵入某些細(xì)胞的能力，使微生物生長(zhǎng)或者擴(kuò)散的毒力因子或者基因中的突變，或者使某些抗原表達(dá)減弱的突變。這些突變?cè)谝陨嫌兴懻摚鼈儼?，但是不限于以下基因的突變利斯特氏菌的?nèi)化素基因(例如inlB)，actA基因，hly基因，plcA基因，或者plcB基因；侵入基因(例如沙門(mén)氏菌屬，炭疽芽孢桿菌和耶爾森氏菌屬)或者耶爾森氏菌屬的yop基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含具有actA基因突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含actA基因的突變和內(nèi)化素基因的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含actA突變和uvrAB突變，優(yōu)選為actA/uvrAB缺失突變(可以稱作ΔactAΔuvrAB或者actA-uvrAB-)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌包含actA突變，inlB突變和uvrAB突變，優(yōu)選為actA/inlB/uvrAB缺失突變。在一些其他的實(shí)施方案中，微生物包含具有uvrB突變，例如缺失的炭疽芽孢桿菌。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的利斯特氏菌突變株，例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株，它包含的基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。在一些實(shí)施方案中，利斯特氏菌突變株在至少一個(gè)DNA修復(fù)酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，利斯特氏菌突變株包含的基因突變位于uvrA基因和/或uvrB基因中。在一些實(shí)施方案中，突變菌株是保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號(hào)PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔuvrAB菌株。在其他實(shí)施方案中，菌株是保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的編號(hào)PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ΔactAΔuvrAB菌株的突變株，其中被保藏菌株的突變株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在至少一個(gè)DNA修復(fù)酶上有缺陷(相對(duì)于野生型)的自生的微生物。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型，在至少一個(gè)DNA修復(fù)酶上有缺陷的自生的微生物，其DNA修復(fù)減弱。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型，該微生物修復(fù)DNA的能力降低了至少大約10％，至少大約25％，至少大約50％，至少大約75％，或者至少大約90％。評(píng)價(jià)微生物修復(fù)其DNA能力的方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的。在一些實(shí)施方案中，微生物在以下酶中的一種或者多種上有缺陷PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD，和RecA。在一些實(shí)施方案中，微生物在UvrA、UvrB上有缺陷或者二者都有缺陷。在一些實(shí)施方案中，微生物在RecA或者其功能等價(jià)物上有缺陷。在一些實(shí)施方案中，微生物在選自以下基因組成的組的一個(gè)或者多個(gè)基因中包含基因突變phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者在上述基因的功能等價(jià)物的一個(gè)或者多個(gè)中包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，微生物在uvrA和uvrB二基因上，或者二者的功能等價(jià)物上都有基因突變。在一些實(shí)施方案中，微生物在recA基因上有遺傳突變。在一些實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，微生物是結(jié)核分支桿菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌或者炭疽芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供了分離的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株，該突變株包含了基因突變，減弱了該菌株修復(fù)其核酸的能力。在一些實(shí)施方案中，突變的菌株在至少一個(gè)DNA修復(fù)酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變的菌株在uvrA基因和/或uvrB基因中包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，uvrA基因或uvrB基因被刪除，或者都被刪除。在一些實(shí)施方案中，突變株的RecA減弱。在一些實(shí)施方案中，突變株的recA基因包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，突變體微生物是保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的編號(hào)PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-/uvrAB-菌株，或者是保藏的菌株的突變株，突變株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。
本發(fā)明還提供了炭疽芽孢桿菌的分離突變株，該突變株包含了基因突變，減弱了該菌株修復(fù)其核酸的能力。在一些實(shí)施方案中，突變的菌株在至少一種DNA修復(fù)酶上(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，突變株在uvrA基因和/或uvrB基因中有缺陷。在一些實(shí)施方案中，uvrA基因(SEQ ID NO18)或者uvrB基因(SEQID NO19)被刪除或者二者均被刪除。在一些實(shí)施方案中，突變株的RecA減弱。在一些實(shí)施方案中，突變株的recA基因中包含基因突變。在一些實(shí)施方案中，突變株的recA上的突變使得recA的蛋白表達(dá)變得溫度敏感。在另一些實(shí)施方案中，構(gòu)建炭疽芽孢桿菌的突變株，使其在lac阻遏物(可被IPTG誘導(dǎo))的控制下，這樣允許recA蛋白在生長(zhǎng)中表達(dá)，但是不能在滅活(例如使用S-59/UVA)和/或免疫接種以后表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，突變株在lef基因和cya基因中的一個(gè)或者全部中包含一個(gè)或者更多突變，這些突變降低了菌株的毒性。
對(duì)于本發(fā)明中的任何微生物，使用補(bǔ)骨脂素對(duì)修復(fù)缺陷(例如uvr缺陷)細(xì)菌的DNA進(jìn)行改變可以通過(guò)調(diào)整化合物濃度、反應(yīng)條件和光照劑量進(jìn)行控制。根據(jù)前面的詳述，對(duì)濃度、反應(yīng)條件和光照劑量對(duì)復(fù)制和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響進(jìn)行估計(jì)，從而確定適當(dāng)?shù)臐舛?、反?yīng)條件和光劑量。使用修復(fù)缺陷突變體對(duì)于增殖提供了額外的控制，同時(shí)保持了足夠的蛋白質(zhì)表達(dá)，這樣濃度、反應(yīng)條件和光照劑量等參數(shù)可以在一個(gè)更廣的條件范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，以提供適宜的微生物群體。例如會(huì)有一個(gè)更廣泛的核酸改變強(qiáng)度范圍，在這個(gè)范圍中，增殖可以被完全抑制而幾乎不影響蛋白的表達(dá)。與非修復(fù)缺陷突變株相比，完全抑制修復(fù)缺陷突變株的最低改變水平要低得多(參見(jiàn)實(shí)施例3，7，11和21)。因此改變的水平可以高于終止增殖所需的最低水平(保證了完全的滅活)，而改變的水平仍然低于對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)有損害的水平。這樣，盡管本發(fā)明對(duì)于非修復(fù)缺陷菌株已經(jīng)是有效的，但是uvr缺陷菌株在制備目的微生物群(這些微生物有效作為疫苗)時(shí)提供了更大的彈性。補(bǔ)骨脂素化合物在10pM到10mM的濃度內(nèi)是有效的，還有在大約100pM-1mM，還有在大約1nM到10μM，還有在大約1-500nM，還有在大約1-200nM或者大約1-100nM，UVA紫外線的劑量范圍從大約0.1-100J/cm2，還有是大約0.1-20J/cm2，還有是大約0.5-10J/cm2，或大約0.5-6J/cm2，或者是大約2-6J/cm2。在一個(gè)實(shí)施方案中，在下列濃度的補(bǔ)骨脂素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在時(shí)處理微生物大約10pM-10mM，還大約1-5000nM，還大約1-500nM，還大約5-500nM或大約10-400nM。在一個(gè)實(shí)施方案中，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在時(shí)處理微生物，使其在補(bǔ)骨脂素存在時(shí)生長(zhǎng)到OD 0.5-1，補(bǔ)骨脂素的濃度為大約10pM-10mM，還有在大約1-5000nM，還有在大約1-500nM，還有在大約5-500nM或者大約10-400nM。在生長(zhǎng)達(dá)到OD0.5-1以后，使用UVA紫外線輻射該微生物群，輻射劑量為大約0.1-100J/cm2，還有是大約0.1-20J/cm2，或是大約0.5-10J/cm2，0.5-6J/cm2，或者是大約2-6J/cm2。
為了在任何微生物中，特別是uvr缺陷突變細(xì)菌中，產(chǎn)生初級(jí)的補(bǔ)骨脂素交聯(lián)，可以先用一劑量的補(bǔ)骨脂素和UVA照射形成加合物，然后再單獨(dú)使用另一劑量的UVA使一些或者大部分單加合物轉(zhuǎn)化為交聯(lián)物。補(bǔ)骨脂素的光化學(xué)是吸收了具有適當(dāng)能量的光子會(huì)首先形成單加合物。再吸收另外的光子會(huì)將該單加合物轉(zhuǎn)化為交聯(lián)物，這時(shí)呋喃側(cè)單加合物會(huì)正確地嵌入在DNA雙螺旋中[Tessman等人，Biochemistry 241669-1676(1985)]?？梢栽谒璧难a(bǔ)骨脂素濃度下使用低劑量的UVA照射樣品，未反應(yīng)的補(bǔ)骨脂素可以通過(guò)例如洗滌、透析或者超濾細(xì)菌除去。含有補(bǔ)骨脂素加合物(單加合物和交聯(lián)物)的細(xì)菌可以進(jìn)一步使用UVA照射將一些或者大部分的單加合物轉(zhuǎn)化為交聯(lián)物，而不會(huì)導(dǎo)致在細(xì)菌中加入大量額外的加合物。這使得可以在初次照射中有控制地加入少量的補(bǔ)骨脂素加合物，然后使用二次照射使加合物中的絕大部分轉(zhuǎn)化為交聯(lián)物。這在足夠低的水平上提供了微生物基因組的改變，其中形成的加合物中大部分是交聯(lián)物。這對(duì)于阻斷uvr缺陷突變體的復(fù)制是非常有效的。在這種實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素化合物在10pM-10mM的濃度是有效的，還有在大約100pM-1mM，還有在大約1-500nM，還有在大約1-200nM或者大約1-100nM，UVA紫外線的劑量范圍從大約0.1-10J/cm2，還有是大約0.1-2J/cm2，或大約0.5-2J/cm2。通過(guò)例如將細(xì)菌漂洗、透析或者超濾除去未反應(yīng)的大部分補(bǔ)骨脂素后，用UVA照射細(xì)菌，照射劑量為大約0.1-100J/cm2，還有是大約0.1-20J/cm2，或大約0.5-10J/cm2，或者是大約2-6J/cm2。
疫苗組合物及體內(nèi)效力
本發(fā)明的疫苗組合物包含核酸發(fā)生了改變的微生物，和/或包含由于感染了微生物而已經(jīng)被抗原荷載的和/或活化的/成熟的抗原呈遞細(xì)胞，所述微生物其核酸被改變以致微生物的增殖被衰減而微生物的基因表達(dá)幾乎未受影響，如前面所討論的。本發(fā)明的疫苗組合物可以用于在個(gè)體中刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答。制劑可以通過(guò)多種不同的給藥途徑向個(gè)體施用。施用這種疫苗組合物的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括口、鼻、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴內(nèi)以及皮下等給藥途徑。疫苗組合物還可以包含本領(lǐng)域內(nèi)已知的額外組分以增強(qiáng)對(duì)于疫苗的免疫應(yīng)答，例如佐劑或者T細(xì)胞共刺激分子。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明藥物組合物的藥物。即將接受這種疫苗治療的個(gè)體是任何的脊椎動(dòng)物，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，包括家養(yǎng)動(dòng)物，用于體育的動(dòng)物和包括人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。疫苗可以作為預(yù)防藥物施用，這時(shí)個(gè)體接受免疫接種目的是保護(hù)個(gè)體不罹患某種疾病。盡管疫苗可以給服給任何個(gè)體，但是在一些情況下，例如癌癥疫苗，接受治療的個(gè)體可能要限于那些具有高度罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。疫苗還可以作為治療藥物施用，這時(shí)具有某種疾病的個(gè)體接受免疫接種目的是提高個(gè)體對(duì)該疾病或者疾病相關(guān)蛋白的免疫應(yīng)答。在該實(shí)施方案中，疫苗可能導(dǎo)致與疾病相關(guān)的物理癥狀的減輕。例如接種癌癥疫苗可能使腫瘤的生長(zhǎng)停止，優(yōu)選為減少平均腫瘤體積，更為優(yōu)選是消滅任何的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，平均腫瘤體積減小了至少大約5％，還有大約10％，還有大約25％，還有大約50％，還有大約75％，還有大約90％，或者大約100％。類(lèi)似地，接種可能導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的停止，優(yōu)選為腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量的下降。癌癥疫苗的額外作用有延長(zhǎng)個(gè)體的平均存活時(shí)間。對(duì)于人類(lèi)，平均存活時(shí)間可能延長(zhǎng)至少大約3個(gè)月，還有至少大約6個(gè)月，或者至少大約12個(gè)月。
疫苗的配制在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，它包含多種添加劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、佐劑、抗生素和其他物質(zhì)。加入防腐劑，例如柳硫汞或者2-苯氧基乙醇，減緩或者終止由于疏忽的污染導(dǎo)致的細(xì)菌或者真菌的生長(zhǎng)，特別是污染在用于多次使用或給藥的疫苗瓶中可能出現(xiàn)。加入穩(wěn)定劑，例如乳糖或者谷氨酸單鈉鹽(MSG)，目的是使疫苗制劑在多種不同條件下保持穩(wěn)定，例如溫度的變化或者凍干過(guò)程。加入佐劑例如氫氧化鋁或者磷酸鋁，以提高疫苗引發(fā)、增加或者延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的能力。其他的物質(zhì)例如細(xì)胞因子、化學(xué)因子以及細(xì)菌核酸序列如CpG，也是可能的疫苗佐劑。加入抗生素例如新霉素和鏈霉素的目的是阻止可能有害菌的生長(zhǎng)。疫苗中還可能包含懸浮液體例如無(wú)菌水或者鹽水。疫苗中還可能含有生產(chǎn)過(guò)程中帶來(lái)的少量殘留物質(zhì)，例如細(xì)胞或者細(xì)菌蛋白，卵(egg)蛋白(使用卵生產(chǎn)的蛋白)，DNA或者RNA，或者來(lái)自加工類(lèi)毒素過(guò)程中的甲醛。
疫苗的效力可以在個(gè)體體內(nèi)進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如在小鼠體內(nèi)。小鼠模型被認(rèn)為是人體效力的模型，在評(píng)價(jià)和測(cè)定本發(fā)明的疫苗時(shí)是有用的。使用小鼠模型證明了疫苗在任何個(gè)體內(nèi)產(chǎn)生效果的能力?？梢酝ㄟ^(guò)疫苗提供針對(duì)某種疾病的預(yù)防性或者治療性作用的能力來(lái)評(píng)價(jià)疫苗。例如，對(duì)于感染性疾病，一群小鼠可以用所需量的本發(fā)明中的適當(dāng)疫苗進(jìn)行接種，其中的微生物表達(dá)傳染性疾病相關(guān)的抗原?？乖梢詠?lái)自傳輸微生物自身或者是異源抗原。接下來(lái)用與疫苗抗原相關(guān)的感染性病原感染小鼠，評(píng)價(jià)疫苗對(duì)感染的抵御?？梢詤⒄諏?duì)照群體(或者未進(jìn)行免疫接種，或者只接種了載體，或者接種的微生物不含有正確的抗原)觀察感染性疾病的發(fā)展。
對(duì)于癌癥疫苗，可以利用腫瘤細(xì)胞模型，可以在使用本發(fā)明中的含有所需腫瘤抗原的微生物對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種之前(治療模型)或之后(預(yù)防模型)，將表達(dá)有所需腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞系注射到小鼠中。使用含有腫瘤抗原的微生物進(jìn)行免疫接種可以與未進(jìn)行接種的、接種了載體的或者接種了表達(dá)不相關(guān)抗原的微生物的對(duì)照群體進(jìn)行比較。此外，本發(fā)明疫苗的相對(duì)效力可以與微生物核酸未被改變的微生物群進(jìn)行比較。在這種模型中疫苗的有效性可以用腫瘤體積作為腫瘤注射后時(shí)間的函數(shù)或者存活群體作為腫瘤注射后時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)(例如實(shí)施例4)。在一個(gè)實(shí)施方案中，接種了核酸被改變的微生物的小鼠的腫瘤體積比未進(jìn)行接種的、接種了載體的或者接種了表達(dá)不相關(guān)抗原的微生物的小鼠的腫瘤體積低大約5％、大約10％、大約25％、大約50％、大約75％、大約90％或者大約100％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在向小鼠體內(nèi)移植腫瘤后至少大約10天、大約17天、或者大約24天，即觀察到這種腫瘤體積的差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，接種了核酸被改變的微生物的小鼠，相對(duì)于未進(jìn)行接種的、接種了載體的或者接種了表達(dá)不相關(guān)抗原的微生物的小鼠，其存活時(shí)間至少長(zhǎng)大約2天、大約5天、大約7天或者至少大約10天。除了對(duì)本發(fā)明的疫苗產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答以外，改變的微生物提供了額外的安全性，這樣與相應(yīng)的未改變的微生物相比，可以施用更高的劑量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用核酸被改變的微生物進(jìn)行接種，微生物的劑量與相應(yīng)的未改變的微生物的劑量相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸被改變的微生物的接種劑量與相應(yīng)的未改變的微生物相比，可以安全地提高大約2倍、大約5倍、大約10倍、大約102倍、大約103倍、或者至少大約104倍，而對(duì)核酸改變的微生物同樣觀察到上面討論的腫瘤體積的減小和平均存活時(shí)間的延長(zhǎng)。
使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了多種不同的使用這里描述的被改變的微生物、抗原呈遞細(xì)胞、疫苗和藥物組合物的方法。例如，提供了使用這里描述的被改變的微生物、抗原呈遞細(xì)胞、疫苗和藥物組合物以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和/或治療或預(yù)防疾病的方法。還提供了使用改變的微生物和/或突變菌株制備疫苗和其他組合物的方法。
例如，一方面，本發(fā)明提供了在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的組合物，組合物包含表達(dá)抗原的自生的微生物，其中的微生物核酸被改變使微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，包含微生物的組合物是疫苗。在一些實(shí)施方案中，包含微生物的組合物是專職化抗原呈遞細(xì)胞?？乖瓕?duì)于微生物可以是異源的或者是自身的，如上面描述的。在一些實(shí)施方案中，微生物的核酸通過(guò)與核酸直接反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。
本發(fā)明還提供了在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的組合物，組合物包含表達(dá)抗原的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株，其中的突變株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱?？乖梢允抢固厥暇幕蛘叻抢固厥暇目乖Ｔ谝恍?shí)施方案中，利斯特氏菌的核酸被改變使微生物的增殖衰減(例如通過(guò)S-59/UVA處理)。
本發(fā)明還提供了在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的組合物，組合物包含表達(dá)抗原的炭疽芽孢桿菌突變株，其中的突變株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。在一些實(shí)施方案中，芽孢桿菌的核酸被改變使微生物的增殖衰減(例如通過(guò)S-59/UVA處理)。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或者治療宿主疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的組合物，組合物包含表達(dá)抗原的自生的微生物，其中的微生物核酸被改變使微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，包含微生物的組合物是疫苗。在一些實(shí)施方案中，包含微生物的組合物是專職化抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或者治療宿主疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的組合物，組合物包含單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株，其中的突變株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。在一些實(shí)施方案中，利斯特氏菌的核酸被改變使微生物的增殖衰減(例如通過(guò)S-59/UVA處理)。在一些實(shí)施方案中，疾病是傳染性疾病。在另一些實(shí)施方案中，疾病是癌癥。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或者治療宿主疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的組合物，組合物包含炭疽芽孢桿菌突變株，其中的突變株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。在一些實(shí)施方案中，芽孢桿菌的核酸被改變使微生物的增殖衰減(例如通過(guò)S-59/UVA處理)。
本發(fā)明還提供了用于醫(yī)療用途的自生的微生物，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖衰減和/或微生物的DNA修復(fù)酶出現(xiàn)缺陷。應(yīng)當(dāng)理解醫(yī)療用途包括治療性和預(yù)防性(例如用于疫苗)的醫(yī)療應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，微生物通過(guò)和直接同核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，使微生物的增殖衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌或者炭疽芽孢桿菌。
在其他方面，本發(fā)明提供了專職化抗原呈遞細(xì)胞用于醫(yī)療用途，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含自生的微生物，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖衰減和/或微生物的DNA修復(fù)酶出現(xiàn)缺陷。在一些實(shí)施方案中，微生物通過(guò)和直接同核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，使微生物的增殖衰減。在一些實(shí)施方案中，微生物是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌或者炭疽芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供了突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株用于醫(yī)療用途，其中的突變單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株包含基因突變，使其修復(fù)其核酸的能力減弱。
此外，本發(fā)明提供了突變的炭疽芽孢桿菌菌株用于醫(yī)療用途，其中的突變炭疽芽孢桿菌菌株包含基因突變，使其修復(fù)其核酸的能力減弱。
本發(fā)明還提供了自生的微生物用于藥物的生產(chǎn)的用途，藥物針對(duì)的是與該自生的微生物無(wú)關(guān)的和/或并非該自生的微生物導(dǎo)致的疾病，其中的微生物核酸被改變使微生物的增殖受到衰減。在一些實(shí)施方案中，疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，疾病是與自生的微生物無(wú)關(guān)的傳染性疾病。
本發(fā)明還提供了自生的微生物用于藥物的生產(chǎn)的用途，藥物針對(duì)的是與該微生物無(wú)關(guān)的和/或并非該微生物導(dǎo)致的疾病，其中的微生物至少一個(gè)DNA修復(fù)酶具有缺陷。在一些實(shí)施方案中，疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，疾病是與微生物無(wú)關(guān)的傳染性疾病。
此外，本發(fā)明還提供了專職化抗原呈遞細(xì)胞用于藥物的生產(chǎn)的用途，藥物針對(duì)的是與自生的微生物無(wú)關(guān)的和/或并非該自生的微生物導(dǎo)致的疾病，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含自生的微生物，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖衰減和/或其中的微生物至少有一個(gè)DNA修復(fù)酶具有缺陷。在一些實(shí)施方案中，疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，疾病是與自生的微生物無(wú)關(guān)的傳染性疾病。
本發(fā)明還提供了單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株用于藥物的生產(chǎn)的用途，藥物針對(duì)的是與單核細(xì)胞增生利斯特氏菌無(wú)關(guān)的和/或者并非由單核細(xì)胞增生利斯特氏菌導(dǎo)致的疾病，其中的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌突變株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。在一些實(shí)施方案中，疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，疾病是與單核細(xì)胞增生利斯特氏菌無(wú)關(guān)的傳染性疾病。
另一方面，本發(fā)明提供了活化原初T細(xì)胞的方法，該方法包括使原初T細(xì)胞在適宜的條件下與專職化抗原呈遞細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間以活化原初T細(xì)胞，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含自生的微生物，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖衰減。該方法的接觸步驟可以在體外或者體內(nèi)進(jìn)行?；罨鮐細(xì)胞的適宜條件和足夠的時(shí)間對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是已知的。此外，這種條件在特異的實(shí)施例中予以舉例，見(jiàn)下面。
還提供了使用抗原荷載專職化抗原呈遞細(xì)胞的方法。該方法包括使專職化抗原呈遞細(xì)胞在適宜的條件下與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸足夠的時(shí)間以使專職化抗原呈遞細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞)荷載，其中微生物的核酸被改變使微生物的增殖衰減和/或其中微生物至少有一個(gè)DNA修復(fù)酶具有缺陷。該方法的接觸步驟可以在體外、離體或者體內(nèi)進(jìn)行。抗原對(duì)于微生物可以是異源的或者是自體抗原。荷載抗原呈遞細(xì)胞的適宜條件和足夠的時(shí)間對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員一般是已知的。此外，這種條件在特異的實(shí)施例中予以舉例，見(jiàn)下面。
另一方面，本發(fā)明提供了使專職化抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟的方法，該方法包括使專職化抗原呈遞細(xì)胞(體外、離體或者體內(nèi))在適宜的條件下與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸足夠的時(shí)間以使專職化抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變，這樣微生物的增殖被衰減。該方法的接觸步驟可以在體外或者體內(nèi)進(jìn)行?？乖瓕?duì)于微生物可以是異源的或者是自體抗原。使抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟的適宜條件和足夠的時(shí)間對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員一般已知的。此外，在特異的實(shí)施例中提供了這種條件的實(shí)例，見(jiàn)下面。
另一方面，本發(fā)明提供了在宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括以下步驟(a)使專職化抗原呈遞細(xì)胞與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸使其荷載抗原，其中微生物的核酸經(jīng)過(guò)改變，這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)向宿主施用有效量的包含荷載的專職化抗原呈遞細(xì)胞的組合物。
另一方面，本發(fā)明提供了在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟(a)使抗原呈遞細(xì)胞與自生的微生物接觸而荷載抗原，該微生物包含編碼抗原的核酸序列，其中的微生物核酸被改變這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)向宿主施用有效量的包含荷載的專職化抗原呈遞細(xì)胞的組合物。
試劑盒
本發(fā)明還提供了試劑盒(或者生產(chǎn)的物質(zhì))，試劑盒包含本發(fā)明的改變的微生物以及突變菌株。
一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含(a)組合物，它包含突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，該菌株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱；突變的炭疽芽孢桿菌菌株，該菌株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱；或者自生的微生物，其中的微生物核酸被改變這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)使用本發(fā)明的組合物預(yù)防或者治療宿主中疾病的用法說(shuō)明。在一些實(shí)施方案中，說(shuō)明標(biāo)注在標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，說(shuō)明在試劑盒內(nèi)包含的插頁(yè)中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了試劑盒，包含(a)組合物，它包含突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，該菌株包含基因突變，使其修復(fù)其核酸的能力減弱；突變的炭疽芽孢桿菌菌株，該菌株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱；或者自生的微生物，其中的微生物核酸被改變這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)將組合物施用給宿主的說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，說(shuō)明標(biāo)注在標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，說(shuō)明在試劑盒內(nèi)包含的插頁(yè)中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了試劑盒，包含(a)組合物，它包含突變的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，該菌株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱；突變的炭疽芽孢桿菌菌株，該菌株包含基因突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱；或者自生的微生物，其中的微生物核酸被改變這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)選擇欲施用組合物的宿主的說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，說(shuō)明標(biāo)注在標(biāo)簽上。在其他實(shí)施方案中，說(shuō)明在試劑盒內(nèi)包含的插頁(yè)中。
在前面提到的每個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，組合物是疫苗。在前面提到的每個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，組合物是專職化抗原呈遞細(xì)胞。在前面提到的每個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，自生的微生物的核酸通過(guò)和直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一些實(shí)施方案中，微生物經(jīng)過(guò)S-59/UVA處理。在一些實(shí)施方案中，微生物的DNA修復(fù)酶有缺陷。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括疫苗組合物，該組合物包含自生的微生物，其中的微生物核酸經(jīng)過(guò)改變使微生的增殖受到衰減，和/或包含抗原呈遞細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)被自生的微生物感染而被抗原荷載和/或活化或成熟，該微生物核酸被改變使微生物的增殖衰減，其中微生物的基因表達(dá)基本上未受影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的基因表達(dá)基本上未受影響，這樣微生物表達(dá)的抗原水平足以使施用該微生物給個(gè)體之后誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群的增殖衰減了至少大約0.3log，至少大約1log，大約2log，大約3log，大約4log，大約6log，或者至少大約8log。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物群的增殖衰減大約從0.3到＞10log、大約從2到＞10log、大約從4到＞10log、大約從6到＞10log、大約0.3-8log、大約0.3-6log、大約0.3-5log、大約1-5log或者大約2-5log。在一個(gè)實(shí)施方案中，由微生物表達(dá)的抗原至少為微生物核酸未被改變的微生物表達(dá)的抗原量的大約10％、大約25％、大約50％、大約75％或者至少大約90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的抗原是來(lái)自微生物自身的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是與疾病有關(guān)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原與選自下列的疾病有關(guān)傳染性疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏、癌癥以及其他細(xì)胞增生型疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是腫瘤相關(guān)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自由以下抗原組成的組分化抗原、組織特異抗原、發(fā)育抗原、腫瘤相關(guān)病毒抗原、癌-睪丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、過(guò)量表達(dá)蛋白抗原以及突變蛋白抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自由以下組成的組間皮素、Sp17，gp100，PR3，PAGE-4，TARP，WT-1，NY-ESO-1以及SPAS-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物核酸通過(guò)選自以下的方法改變暴露微生物于輻射中以及使微生物與引起微生物核酸改變的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物的核酸通過(guò)和直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物通過(guò)選自以下的方式靶向核酸嵌入、小溝結(jié)合、大溝結(jié)合、靜電結(jié)合以及序列特異結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物包含核酸烷化劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，與核酸直接發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物在輻射，優(yōu)選為UVA輻射，活化的情況下發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由UVA輻射活化的核酸靶向化合物是補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物間接地導(dǎo)致核酸的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物在輻射，優(yōu)選為UVA輻射，活化的情況下間接地導(dǎo)致改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含基因突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致微生物修復(fù)其經(jīng)過(guò)改變的微生物核酸能力的衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)的基因選自以下基因組成的組phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因(取決于微生物的種屬)。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變出現(xiàn)在選自下列基因的一個(gè)或多個(gè)中phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA殘基功能等價(jià)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致DNA修復(fù)酶活性的衰減，該DNA修復(fù)酶選自由以下酶組成的組PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有這些突變的微生物通過(guò)與被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物選自由細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌是利斯特氏菌，優(yōu)選為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含突變，導(dǎo)致利斯特氏菌侵入非吞噬細(xì)胞能力的減弱，而對(duì)吞噬細(xì)胞攝取利斯特氏菌沒(méi)有顯著影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于內(nèi)化素基因內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變出現(xiàn)的基因選自由以下基因組成的組inlA，inlB，以及任何編碼內(nèi)化素的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB兩個(gè)基因上都包含突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變使其逃脫受感染細(xì)胞吞噬溶酶體的能力減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于hly基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含使利斯特氏菌肌動(dòng)蛋白的聚合減弱的突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于actA基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于actA基因和一個(gè)或者多個(gè)的內(nèi)化素基因中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含在actA和inlB基因中的突變，優(yōu)選地，利斯特氏菌包含actA/inlB缺失突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突變體還包含uvrAB基因上的缺失突變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括疫苗組合物，該組合物包含細(xì)菌，其中細(xì)菌的核酸經(jīng)過(guò)改變使細(xì)菌的增殖受到衰減，其中細(xì)菌基因表達(dá)基本未受影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌的基因表達(dá)基本上未受影響，這樣表達(dá)的抗原水平足以使個(gè)體在接受細(xì)菌之后刺激對(duì)該細(xì)菌的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌增殖衰減至少大約0.3log，還有至少大約1log，大約2log，大約3log，大約4log，大約6log或者至少大約8log。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的增殖衰減從大約0.3到＞10log、從大約2到＞10log、從大約4到＞10log、從大約6到＞10log、大約0.3-8log、大約0.3-6log、大約0.3-5log、大約1-5log或者大約2-5log。在一個(gè)實(shí)施方案中，由細(xì)菌表達(dá)的抗原至少為細(xì)菌核酸未被改變的細(xì)菌表達(dá)的抗原量的大約10％、大約25％、大約50％、大約75％或者至少大約90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌核酸通過(guò)選自以下的方法改變暴露細(xì)菌于輻射中以及使細(xì)菌與引起細(xì)菌核酸改變的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌的核酸通過(guò)和直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物通過(guò)選自以下方式靶向核酸嵌入、小溝結(jié)合、大溝結(jié)合、靜電引力結(jié)合以及序列特異結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物包含核酸烷化劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，與核酸直接發(fā)生反應(yīng)的核酸定位化合物在輻射，優(yōu)選為UVA輻射，活化的情況下發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由UVA輻射活化的核酸靶向化合物是補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物間接地導(dǎo)致核酸的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物在輻射，優(yōu)選為UVA輻射，活化的情況下間接地導(dǎo)致核酸的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌包含基因突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致細(xì)菌修復(fù)其經(jīng)過(guò)改變的細(xì)菌核酸能力的衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變位于選自以下的基因phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因(取決于微生物的種屬)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)在一個(gè)或者多個(gè)選自以下組的基因中phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳突變導(dǎo)致DNA修復(fù)酶活性的衰減，該DNA修復(fù)酶選自以下酶組成的組PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有這些突變的細(xì)菌通過(guò)與被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素發(fā)生反應(yīng)而被改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌選自由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和分支桿菌組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌選自以下細(xì)菌組成的組炭疽芽孢桿菌，霍亂弧菌(Cholera)，百日咳博德特氏菌，白喉棒狀桿菌，大腸桿菌，布氏疏螺旋體(Lyme)，肺炎鏈球菌，沙門(mén)氏菌，葡萄球菌屬，結(jié)核分支桿菌，牛布魯氏菌，山羊布魯氏菌，流感嗜血桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，鼠疫耶爾森氏菌，志賀氏菌屬，土拉熱弗朗西絲氏菌和釀膿鏈球菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌是分支桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，分支桿菌是結(jié)核分支桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)核分支桿菌包含uvrAB缺失突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)核分支桿菌包含recA條件突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌是炭疽芽孢桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，炭疽芽孢桿菌包含uvrAB缺失突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，炭疽芽孢桿菌包含recA條件突變。一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌是鼠疫耶爾森氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼠疫耶爾森氏桿菌包含uvrAB缺失突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼠疫耶爾森氏菌包含recA條件突變。
本發(fā)明包括包含以上組合物的藥物和使用以上組合物(例如個(gè)體疫苗)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用本發(fā)明疫苗的方法，該方法包括向個(gè)體施用疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫接種通過(guò)施用疫苗進(jìn)行，施用的途徑選自以下途徑組成的組口、鼻、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴內(nèi)以及皮下等給藥途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗使用預(yù)防性方案施用，個(gè)體沒(méi)有出現(xiàn)疫苗所針對(duì)的疾病的征兆。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗使用治療性方案施用，個(gè)體出現(xiàn)疫苗所針對(duì)的疾病的癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含了針對(duì)癌癥的腫瘤抗原，且治療性免疫接種使癌癥的癥狀減輕。在一個(gè)實(shí)施方案中，接種的個(gè)體的平均腫瘤體積減少了至少大約5％，還有是大約10％，還有是大約25％，還有是大約50％，還有是大約75％，還有是大約90％，或者大約100％。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用預(yù)防性的或者治療性的方案向小鼠施用疫苗，其中的小鼠是模型系統(tǒng)，可以將腫瘤細(xì)胞移植到小鼠以在其中形成腫瘤，其中的疫苗含有至少一種移植腫瘤的抗原。在向小鼠施用疫苗之后(預(yù)防性方案)或者之前(治療性方案)向小鼠中植入腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用預(yù)防性或者治療性方案進(jìn)行免疫接種的小鼠中的平均腫瘤體積，小于未進(jìn)行接種的、接種了表達(dá)無(wú)關(guān)抗原的相似疫苗載體的相似小鼠(對(duì)照小鼠)體內(nèi)的腫瘤體積。在一個(gè)實(shí)施方案中，在進(jìn)行免疫接種的小鼠中的平均腫瘤體積，與對(duì)照小鼠中的平均腫瘤體積相比，減少了至少大約5％，大約10％，大約25％，大約50％，大約75％，大約90％，或者大約100％。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用預(yù)防性或者治療性方案進(jìn)行接種的小鼠的平均存活時(shí)間比對(duì)照小鼠長(zhǎng)至少大約2天，大約5天，大約7天或者至少大約10天。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了制備疫苗組合物的方法，該方法包括處理微生物群使微生物的核酸被改變，這樣微生物群的增殖被衰減，其中的微生物基因表達(dá)基本上未受影響。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了制備疫苗組合物的方法，該方法包括處理微生物群使微生物的核酸被改變，這樣微生物群的增殖被衰減，其中的微生物基因表達(dá)基本上未受影響，然后使用該微生物群用抗原荷載抗原呈遞細(xì)胞，并且誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的活化/成熟。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用輻射處理微生物群。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)與間接引起核酸改變的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)，對(duì)微生物群進(jìn)行處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物通過(guò)輻射被活化，其中化合物的活化導(dǎo)致核酸的間接改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物的活化產(chǎn)生了改變核酸的活性氧。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)和能與核酸直接發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)，對(duì)微生物群進(jìn)行處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物的反應(yīng)濃度是大約10pM-10mM，還有是大約100pM-1mM，還有是大約1-500nM，還有是大約1-200nM或者是大約1-100nM。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是烷化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，烷化劑選自由以下各項(xiàng)組成的組芥子、芥子中間產(chǎn)物、芥子等價(jià)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物包含核酸靶向基團(tuán)，該基團(tuán)選自以下各項(xiàng)組成的組嵌入劑、小溝結(jié)合物、大溝結(jié)合物、靜電結(jié)合物以及序列特異結(jié)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸靶向化合物在其被活化后與核酸直接發(fā)生反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物被輻射活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，輻射是UVA輻射。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸靶向化合物是被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，補(bǔ)骨脂素化合物的濃度是大約10pM-10mM，還有是大約100pM-1mM，還有是大約1-500nM，還有是大約1-200nM或者1-100nM；UVA輻射的劑量是大約0.1-100J/cm2，還有是大約0.1-20J/cm2，還有是大約0.5-5J/cm2，還有是大約2-4J/cm2。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物增殖衰減至少大約0.3log，還有至少大約1log，大約2log，大約3log，大約4log，大約6log或者至少大約8log。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的增殖衰減從大約0.3到＞10log、從大約2到＞10log、從大約4到＞10log、從大約6到＞10log、大約0.3-8log、大約0.3-6log、大約0.3-5log、大約1-5log或者大約2-5log。在一個(gè)實(shí)施方案中，由該微生物群表達(dá)的抗原至少為微生物群未被處理使核酸發(fā)生改變時(shí)抗原量表達(dá)的大約10％、大約25％、大約50％、大約75％或者至少大約90％。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的抗原是來(lái)自微生物自身的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是結(jié)核分支桿菌且抗原來(lái)自結(jié)核分支桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是炭疽芽孢桿菌且抗原來(lái)自炭疽芽孢桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是與疾病有關(guān)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原與選自以下的疾病有關(guān)傳染性疾病、自身免疫疾病、過(guò)敏、癌癥以及其他細(xì)胞增生型疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是腫瘤相關(guān)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自由以下抗原組成的組分化抗原、組織特異抗原、發(fā)育抗原、腫瘤相關(guān)病毒抗原、癌-睪丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、過(guò)量表達(dá)蛋白抗原以及突變蛋白抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自由以下組成的組間皮素、Sp17，gp100，PR3，PAGE-4，TARP，WT-1，NY-ESO-1以及SPAS-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包含基因突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致微生物修復(fù)其經(jīng)過(guò)改變的微生物核酸能力的衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)在選自以下基因組成的組的基因中phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因(取決于微生物的種屬)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變出現(xiàn)在一個(gè)或者多個(gè)選自以下組的基因中phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它們的功能等價(jià)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因突變導(dǎo)致DNA修復(fù)酶活性的衰減，該DNA修復(fù)酶選自以下酶組成的組PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素處理具有這些突變的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物選自由細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌是利斯特氏菌，優(yōu)選為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含突變，導(dǎo)致利斯特氏菌侵入非吞噬細(xì)胞能力的減弱，而對(duì)吞噬細(xì)胞攝取利斯特氏菌沒(méi)有顯著影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于內(nèi)化素基因內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變出現(xiàn)的基因選自由以下基因組成的組inlA，inlB，以及任何編碼內(nèi)化素的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB兩個(gè)基因上都包含突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含突變使其逃脫受感染細(xì)胞吞噬溶酶體的能力減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌的突變位于hly基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌包含的突變使利斯特氏菌肌動(dòng)蛋白的聚合減弱。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌突變位于內(nèi)化素基因中。在一個(gè)實(shí)施方案中，利斯特氏菌在actA基因和一種或多種內(nèi)化素基因中包含突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB兩個(gè)基因中都有突變，優(yōu)選地，利斯特氏菌包含actA/inlB缺失突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突變體還包含uvrAB基因上的缺失突變。
實(shí)施例
實(shí)施例1
補(bǔ)骨脂素處理利斯特氏菌株提供了增殖衰減同時(shí)保持了OVA抗原的表達(dá)
許多經(jīng)過(guò)改變表達(dá)卵清蛋白(異源的雞OVA抗原)的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，與4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(S-59，由固體(Ash-Stevens，Riverview，MI)制備的3mM溶液(Ben Venue，Cleveland，OH)，(參見(jiàn)美國(guó)專利5,399,719)和UVA(320-400nm)反應(yīng)。檢測(cè)產(chǎn)生的利斯特氏菌，估計(jì)可生存的利斯特氏菌的對(duì)數(shù)滴度降低以及OVA抗原在利斯特氏菌中的表達(dá)。利斯特氏菌株由University of California，Berkeley的Dan Portnoy博士提供，其被改變以含有OVA抗原，如實(shí)施例8中討論的。這些菌株是DP-L4056(野生型)，DP-L4029(10403S ΔactA，在ActA基因中的噬菌體去除缺失突變，參見(jiàn)Skoble等人，Journal of CellBiology，150527-537(2000)以及Lauer等人，Journal ofBacteriology 184(15)4177-4186(2002))，DP-L4364(10403SΔlplA，磷酯酶A基因的缺失突變)以及DP-L4017(10403S hlyL461T，溶血素基因中的點(diǎn)突變，參見(jiàn)Glomski等，Journal of Cell Biology156(6)1029-1038，(2002)).菌株在37℃、300rpm下在BHI培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion，F(xiàn)isher Scientific)上生長(zhǎng)至濃度為大約1×109CFU/mL(600nm吸光度為0.5)。每個(gè)菌株取兩份1.0毫升分別轉(zhuǎn)移到15毫升的試管中。每個(gè)管在4℃2300g離心20分鐘。去掉上清，在兩管中分別加入含有和不含S-59的含有1％BSA的5毫升PBS(磷酸鹽緩沖液，Hyclone)(1×108CFU/mL)。加入的S-59的濃度為100nM。將樣品置于6孔培養(yǎng)板上，用UVA輻射，輻射劑量為2J/cm2(FXl019輻射裝置，Baxter Fenwal，Round Lake，IL)。然后將每一個(gè)樣品轉(zhuǎn)移到一個(gè)15毫升的管內(nèi)，按上述離心，去掉上清。用5毫升PBS漂洗，離心去掉上清，將最終的菌體沉淀用0.5毫升PBS重懸。從每個(gè)樣品中取100微升通過(guò)連續(xù)稀釋測(cè)量其細(xì)菌滴度。每個(gè)稀釋度涂布于一塊LB(Luria-Bertani，Q-Biogene，Carlsbad，CA)平板上，37℃孵育過(guò)夜，計(jì)數(shù)菌落以測(cè)定細(xì)菌滴度。
使用小鼠DC 2.4細(xì)胞系(來(lái)自Dana Farber Cancer Institute的樹(shù)突細(xì)胞系，參見(jiàn)Shen等人，J Immunol 158(6)2723-30(1997))和B3Z T細(xì)胞雜交瘤(從University of California，Berkeley的Shastri博士處獲得)對(duì)細(xì)菌樣品的抗原呈遞進(jìn)行測(cè)定。B3Z是lacZ可誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞雜交瘤，它在MHC I類(lèi)分子的背景下識(shí)別OVA抗原以后會(huì)表達(dá)β-半乳糖苷酶基因。使用CPRG(氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖糖苷(galactopyranoside)，Calbiochem，La Jolla，CA)，β-半乳糖苷酶的底物的代謝對(duì)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶水平進(jìn)行測(cè)定，這一水平與DC2.4細(xì)胞呈遞的OVA抗原含量直接相關(guān)。DC2.4細(xì)胞和B3ZT細(xì)胞雜交瘤在RPIM 1640培養(yǎng)基(RPMI，Invitrogen)中維持，加入10％FBS(胎牛血清，HyClone)。在96孔培養(yǎng)板的孔中加入200微升DC2.4細(xì)胞(每孔1×105個(gè)DC 2.4細(xì)胞)。細(xì)菌樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋(50微升儲(chǔ)液加入450微升PBS進(jìn)行稀釋，直至1×105CFU/mL)(對(duì)于S-59處理的樣品使用等價(jià)的CFU，即在S-59處理之前的菌落形成單位的數(shù)目)。每個(gè)稀釋度20微升轉(zhuǎn)移到含有DC2.4細(xì)胞的孔中，得到大約1×104，1×105，1×106，1×107，或者1×108CFU/mL，此外，只加入20微升PBS作為陰性對(duì)照。樣品在37℃下5％二氧化碳中孵育1小時(shí)。用PBS漂洗培養(yǎng)板3次去除細(xì)胞外的細(xì)菌。每孔中加入200微升B3Z T細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞)和100微克/毫升慶大霉素(Sigma)。100nM的SL8 OVA257-264肽(SL8OVA抗原，SIINFEKL，SEQ IDNO1，Invitrogen，San Diego，CA)加入到含有DC2.4和B3Z細(xì)胞各1×105細(xì)胞的孔中，作為陽(yáng)性對(duì)照。樣品在37℃下5％二氧化碳中孵育過(guò)夜。培養(yǎng)板在400g下離心3分鐘，用250微升的PBS漂洗每一個(gè)孔。每孔中加入100微升含有100μM 2-巰基乙醇，9mM氯化鎂，0.125％Igepal CA-630((八苯氧基)聚乙氧基乙醇((octaphenoxy)polyethoxyethanol)，Sigma)和0.15mM CPRG的PBS。樣品在37℃下孵育至少4小時(shí)。使用讀板儀在595nm下測(cè)量光吸收值，參考波長(zhǎng)是655nm。S-59處理的和未處理的細(xì)菌滴度和抗原呈遞結(jié)果(每個(gè)DC2.4細(xì)胞100個(gè)細(xì)菌細(xì)胞)在表1中給出。結(jié)果表明，在每個(gè)DC2.4細(xì)胞中加入100個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的水平下，抗原呈遞是未處理樣品的55-85％。由于細(xì)菌的滴度下降了大約104，這表明利斯特氏菌在增殖有明顯衰減的情況下仍然保留了充分的抗原呈遞。
表1使用100nM補(bǔ)骨脂素S-59和2J/cm2 UVA紫外線處理的、表達(dá)OVA抗原的利斯特氏菌的Log衰減和抗原呈遞
*表達(dá)為未處理的百分比，在每個(gè)DC2.4細(xì)胞100個(gè)利斯特氏菌時(shí)測(cè)量。
使用DP-L4056野生型菌株進(jìn)行相似的步驟。使用100，200，400，800或者1000nM S-59處理細(xì)菌，根據(jù)上面的詳述測(cè)定剩余的滴度和抗原呈遞。細(xì)菌滴度和抗原呈遞結(jié)果(每個(gè)DC2.4細(xì)胞100個(gè)利斯特氏菌)在表2中給出，并在圖1中作圖。這一數(shù)據(jù)表明在利斯特氏菌生長(zhǎng)受到衰減的一個(gè)廣闊范圍內(nèi)都有顯著的抗原呈遞，包括增殖受到完全抑制時(shí)(即到達(dá)檢測(cè)限度時(shí))也有抗原呈遞。
表2使用不同濃度補(bǔ)骨脂素S-59和2J/cm2 UVA處理的、表達(dá)OVA抗原的利斯特氏菌株DP-L4056的Log衰減和抗原呈遞。
*表達(dá)為未處理的百分比，在每個(gè)DC2.4細(xì)胞100個(gè)利斯特氏菌時(shí)測(cè)量。
實(shí)施例2
DNA靶向烷化劑處理利斯特氏菌株提供了增殖衰減而同時(shí)保持了OVA抗原的呈遞
采用與實(shí)施例1中相似的步驟，只使用化合物β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯(化合物1，ChemSyn，Harrisonville，MO，參見(jiàn)美國(guó)專利6,093,725)。使用的利斯特氏菌株是DP-L4056和DP-L4017?；衔?(濃度為1mM，溶于酸性BBS(blood bank saline)中，即每100毫升BBS中加入135微升1.48M的磷酸)加入到5毫升1×108CFU/mL的大腸桿菌中，至終濃度為0，0.5，1，2，5，和10μM。樣品在室溫下孵育2小時(shí)。孵育以后，根據(jù)實(shí)施例1測(cè)定細(xì)菌滴度和抗原呈遞。對(duì)于抗原呈遞，將利斯特氏菌株稀釋到1×102，1×103，1×104，1×105，1×106，或者1×107CFU/mL。相對(duì)于未處理的細(xì)菌(每個(gè)DC2.4細(xì)胞1個(gè)利斯特氏菌)的log滴度、log衰減和抗原呈遞的百分比作為化合物1濃度的函數(shù)，在表3中和圖2A和B中給出。結(jié)果表明化合物1在例如1μM時(shí)，對(duì)于既使利斯特氏菌出現(xiàn)顯著的增殖衰減又保留足夠的抗原呈遞也是有效的。
表3使用不同濃度化合物1處理的利斯特氏菌的Log衰減和抗原呈遞
*表達(dá)為未處理的百分比，在每個(gè)DC2.4細(xì)胞1個(gè)利斯特氏菌時(shí)測(cè)量。
實(shí)施例3
補(bǔ)骨脂素處理大腸桿菌uvrAB突變體和野生型之后增殖衰減的比較
用補(bǔ)骨脂素處理修復(fù)核酸損傷能力有缺陷的大腸桿菌突變株和處理野生型大腸桿菌菌株進(jìn)行比較。大腸桿菌菌株AB1157(野生型)和CSR603(uvrA，recA，phr突變株，從University of North CarolinaAziz Sancar博士處獲得，參見(jiàn)Harm，Mutation Research 60263-270(1979))。本實(shí)施例比較了AB1157和突變株CSR603的衰減，細(xì)菌培養(yǎng)在3毫升添加鏈霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃下環(huán)形振蕩器中250rpm振蕩過(guò)夜。2毫升的過(guò)夜培養(yǎng)物加入到100毫升的LB培養(yǎng)基中，在30℃下在振蕩器上振蕩大約5小時(shí)，直至600nm光吸收達(dá)到0.90D，即大約1×109CFU/mL。對(duì)于每個(gè)菌株，取大約0.5毫升的細(xì)菌儲(chǔ)液加入到15毫升的試管中，4℃2300g離心20分鐘。去掉上清，用含有0、1、10、100和1000nM補(bǔ)骨脂素S-59的5毫升PBS重懸沉淀。每個(gè)樣品轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板中，根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行輻射。根據(jù)實(shí)施例1對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，測(cè)定滴度。結(jié)果在表4和圖3中給出。結(jié)果表明，對(duì)于一個(gè)給定的補(bǔ)骨脂素濃度，補(bǔ)骨脂素對(duì)uvrABC突變體的處理使細(xì)菌的增殖產(chǎn)生更大的衰減(即剩余的滴度降低)。
表4使用補(bǔ)骨脂素處理后野生型大腸桿菌與uvrABC突變株衰減的比較
實(shí)施例4
使用經(jīng)過(guò)S-59處理和未經(jīng)處理的利斯特氏菌株對(duì)小鼠進(jìn)行治療性接種
為了評(píng)價(jià)經(jīng)S-59處理的利斯特氏菌作為疫苗的有用性，使用C57B1/6小鼠黑色素瘤腫瘤模型。C57B1/6小鼠(Charles River，Hollister，CA)剔毛，皮下移植懸于100微升HBSS的2×105個(gè)B16.Fl0.Mo520.10細(xì)胞(表達(dá)B16-OVA的黑色素瘤細(xì)胞，從University of Massuchesetts，Kenneth Rock博士處獲得，參見(jiàn)Mandl等人，Proc Natl Acad Sci USA 958216(1998))。含有OVA抗原的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4056和DP-L4017使用S-59處理或者不作處理(20nM S-59，如實(shí)施例1進(jìn)行UVA輻射)。此外，沒(méi)有OVA抗原的野生型菌株DP-L4056作為對(duì)照。確定S-59處理的樣品的log滴度，以測(cè)定由于補(bǔ)骨脂素處理造成的log衰減(表6)。將利斯特氏菌重懸于HBSS(Hanks平衡鹽培養(yǎng)基，Gibco)中，腹膜接種每組10-12只小鼠每個(gè)菌株100微升，接種3次，有一組小鼠注射HBSS載體。不同菌株的接種劑量(每次接種的總CFU數(shù)目)在表6中給出。給出的劑量對(duì)應(yīng)的是未使用S-59處理的利斯特氏菌的0.1LD50以及使用S-59處理的利斯特氏菌的最高可能劑量。在腫瘤移植后的第3、10和17天進(jìn)行接種。觀察小鼠是否出現(xiàn)可觸摸到的腫瘤。一旦觀察到有腫瘤出現(xiàn)，則每周測(cè)量?jī)纱文[瘤的兩個(gè)相互垂直的直徑。如果腫瘤的大小在任何方向達(dá)到了20mm，則處死小鼠。在圖4和表5中表示了平均腫瘤體積作為B16-OVA移植后天數(shù)的函數(shù)。每組中小鼠的存活百分比在圖5中繪出，平均存活在表6中給出。本實(shí)施例顯示可以給小鼠安全施用經(jīng)高劑量的S-59處理過(guò)的利斯特氏菌菌株，而仍產(chǎn)生好的抗腫瘤應(yīng)答。
表5移植B16-OVA并使用鑒定出的利斯特氏菌株進(jìn)行接種的小鼠在移植后不同時(shí)間時(shí)的腫瘤體積。
平均腫瘤體積(mm2)
表6使用和未用20nM S-59處理(2J/cm2UVA)的利斯特氏菌株的接種劑量和平均存活時(shí)間。
*數(shù)值是三次制備物的平均值
實(shí)施例5
接種以后對(duì)抗原特異的免疫應(yīng)答的測(cè)定
可以使用多種不同的體外和體內(nèi)方法評(píng)價(jià)本發(fā)明的疫苗。用基于利斯特氏菌的疫苗對(duì)這些方法進(jìn)行舉例說(shuō)明，但是這些方法可以用于評(píng)價(jià)本發(fā)明中基于任何微生物的疫苗的潛在效力。
一些檢測(cè)涉及對(duì)抗原特異的T細(xì)胞的分析，這些細(xì)胞來(lái)自已經(jīng)進(jìn)行接種的小鼠的脾臟。免疫接種C57B1/6小鼠，例如通過(guò)腹膜注射0.1LD50利斯特氏菌-OVA菌株，這里的利斯特氏菌可能經(jīng)過(guò)處理使增殖衰減(例如S-59處理)。免疫接種7天以后，收集小鼠的脾臟細(xì)胞(通常每組3只小鼠)，方法是通過(guò)將脾臟置于冰冷的RPMI 1640培養(yǎng)基中，制備單細(xì)胞懸液。作為另一種可能性，可以類(lèi)似地收集小鼠的淋巴結(jié)，制備成單細(xì)胞懸液，替代以下描述的檢測(cè)中的脾臟細(xì)胞。通常通過(guò)靜脈內(nèi)和腹膜給藥的疫苗用脾臟細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)，而對(duì)于肌肉內(nèi)、皮下或者皮內(nèi)給藥的疫苗則可用脾臟細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。
除非特別說(shuō)明，在這些實(shí)施例中使用的所有抗體都可以從Pharmingen，San Diego，CA獲得。
ELISPOT檢測(cè)
使用ELISPOT檢測(cè)，在小鼠模型中用具有OVA抗原的利斯特氏菌株進(jìn)行免疫接種以后，測(cè)定抗原特異的T細(xì)胞的定量產(chǎn)生頻率。進(jìn)行評(píng)價(jià)的抗原特異的T細(xì)胞是OVA特異的CD8+或者LLO特異的CD8+或者CD4+T細(xì)胞。該OVA抗原模型測(cè)定了對(duì)于插入到疫苗中的異源腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，腫瘤抗原可以用任何目標(biāo)抗原代替。LLO抗原是利斯特氏菌特異的，可以用任何用作疫苗載體的微生物載體上的適當(dāng)抗原代替。通過(guò)檢測(cè)識(shí)別特異抗原的細(xì)胞因子(例如IFN-γ)的釋放來(lái)測(cè)定特異的T細(xì)胞。用抗小鼠的IFN-γ單克隆抗體(mAb R4；5μg/mL)包被PVDF材質(zhì)的96孔板(BD Biosciences，San Jose，CA)，4℃過(guò)夜。漂洗96孔板，在室溫下用200微升的完全RPMI封閉2小時(shí)。每孔加入2×105個(gè)來(lái)自接種小鼠(或者未進(jìn)行接種的對(duì)照小鼠)的脾臟細(xì)胞，在37℃下，在大約0.01到10μM的不同濃度的肽的存在下孵育20到22小時(shí)。使用的肽有SL8(OVA的MHC I類(lèi)表位)，LLO190(NEKYAQAYPNVS，SEQ ID NO2，Invitrogen)，它是利斯特氏菌溶胞素O(利斯特氏菌的抗原)的MHC II類(lèi)表位，或者是LLO296(VAYGRQVYL，SEQ ID NO3)，它是利斯特氏菌溶胞素O的MHC I類(lèi)表位。漂洗后，平板中用對(duì)IFN-γ特異的生物素化的二抗(XMG1.2)孵育，二抗用PBS稀釋至0.5μg/ml。室溫孵育2小時(shí)以后，漂洗96孔板，加入1nm金山羊抗生物素綴合物(GAB-1；1∶200稀釋；Ted Pella，Redding，CA)37℃孵育1小時(shí)，該綴合物用含有1％BSA的PBS稀釋。在徹底漂洗以后，平板與底物(Silver Enhancing Kit；每孔30微升；Ted Pella)，在室溫下孵育2到10分鐘，進(jìn)行斑點(diǎn)顯影。然后使用蒸餾水沖洗96孔板，終止底物的反應(yīng)。平板在空氣中干燥后，使用自動(dòng)化的ELISPOT讀板儀(CTL，Cleveland，OH)計(jì)數(shù)每孔中的斑點(diǎn)。對(duì)于OVA特異的T細(xì)胞或者利斯特氏菌特異的T細(xì)胞，細(xì)胞因子的應(yīng)答表示為每106個(gè)脾臟細(xì)胞的IFN-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFCs)的數(shù)目。
細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)(ICS)
為了進(jìn)一步評(píng)估抗原特異的CD8+或者CD4+T細(xì)胞的數(shù)目，將結(jié)果與ELISPOT檢測(cè)得到的結(jié)果聯(lián)系起來(lái)，進(jìn)行ICS，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。接種小鼠和對(duì)照組小鼠的脾臟細(xì)胞與SL8(刺激OVA特異的CD8+細(xì)胞)或者LLO190(刺激LLO特異的CD4+細(xì)胞)，在Brefeldin A(Pharmningen)存在的情況下共同孵育5小時(shí)。Brefeldin A抑制了T細(xì)胞被刺激以后產(chǎn)生的細(xì)胞因子的分泌。與一種無(wú)關(guān)的MHC I類(lèi)肽共同孵育的脾臟細(xì)胞用作對(duì)照。用20ng/mL PMA(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯，Sigma)和2μg/mL離子霉素(Sigma)刺激的脾臟細(xì)胞用作IFN-γ和TNF-α細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的陽(yáng)性對(duì)照。為了檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞因子表達(dá)，用FITC-抗-CD4mAb(RM 4-5)和PerCP-抗-CD8mAb(53-6.7)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用Cytofix/CytoPerm溶液(Pharmingen)進(jìn)行固定和通透化，用PE-綴合的抗-TNF-αmAb(MP6-XT22)和APC-綴合的抗-IFN-γmAb(XMG1.2)在冰上染色30分鐘。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IFN-γ和/或TNF-α的細(xì)胞的百分比由流式細(xì)胞術(shù)(FACScalibur，Becton Dickinson，Mountain View，CA)測(cè)定，使用CELLQuest軟件(Becton DickinsonImmunocytometry System)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。由于FACScalibur可以區(qū)別不同抗體上的熒光標(biāo)記，通過(guò)門(mén)控那些被抗IFN-γ或者抗TNF-α之一或兩者染色的CD8+和CD4+，可以鑒定出合適的細(xì)胞。該方法也可以用于測(cè)定微生物疫苗的免疫原性，其中用樹(shù)突細(xì)胞群或者另一個(gè)抗原呈遞細(xì)胞如巨噬細(xì)胞群與微生物載體共同孵育。得到的抗原呈遞細(xì)胞注射到小鼠的腳中，根據(jù)上述檢測(cè)來(lái)自淋巴結(jié)的細(xì)胞群中的T細(xì)胞。
在受到刺激的脾臟細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)
也可以檢測(cè)對(duì)照和接種的C57B1/6小鼠的脾臟細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌水平。使用SL8或者LLO190刺激脾臟細(xì)胞24小時(shí)。使用無(wú)關(guān)肽HSV-gB2(Invitrogen，SSIEFARL，SEQ ID NO4)進(jìn)行刺激作為對(duì)照。收集經(jīng)過(guò)刺激的細(xì)胞的上清，使用ELISA檢測(cè)(eBiosciences，CO)或者細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列試劑盒(Pharmingen)，確定輔助性T細(xì)胞1和輔助性T細(xì)胞2細(xì)胞因子的水平。
細(xì)胞毒T細(xì)胞活性的測(cè)定
還可以通過(guò)對(duì)OVA特異的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)它們進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以在體外測(cè)定或者直接在C57B1/6小鼠中進(jìn)行體內(nèi)測(cè)定。CD8+T細(xì)胞以抗原特異的方式識(shí)別并且裂解它們的各自的靶細(xì)胞。體外細(xì)胞毒性使用鉻釋放檢測(cè)進(jìn)行確定。使用輻射過(guò)的EG7.OVA細(xì)胞(表達(dá)OVA的轉(zhuǎn)染EL-4腫瘤細(xì)胞系，ATCC，Manassas，VA)或者100nM SL8按照10∶1的比例刺激原初的和利斯特氏菌-OVA(內(nèi)標(biāo))接種的小鼠的脾臟細(xì)胞，目的是使OVA特異的T細(xì)胞在脾臟細(xì)胞群中進(jìn)行擴(kuò)增。培養(yǎng)7天之后，用標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)使用EG7.OVA或者SL8沖擊的EL-4細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)作為靶細(xì)胞，EL-4細(xì)胞自身作為陰性對(duì)照，測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。YAC-1細(xì)胞系(ATCC，Manassas，VA)用作靶細(xì)胞，以確定NK細(xì)胞的活性，目的是區(qū)別由于T細(xì)胞造成的活性和由于NK細(xì)胞造成的活性。特異性細(xì)胞毒性的百分比如下計(jì)算100×(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)。在沒(méi)有效應(yīng)細(xì)胞的情況下孵育靶細(xì)胞以測(cè)定自發(fā)釋放。使用0.1％的Triton X-100裂解細(xì)胞確定最大釋放。如果自發(fā)釋放小于20％的天然釋放，則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)行分析。
來(lái)自原初C57B1/6小鼠的脾臟細(xì)胞分成兩等份，用于體內(nèi)測(cè)定OVA特異的CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。每一組細(xì)胞使用特異肽沖擊，或者是靶物(SL8)或者是對(duì)照(HSV-gB2)，濃度為0.5μg/ml，在37℃作用90分鐘。然后用培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞3次，再用PBS+0.1％BSA漂洗兩次。使用溫暖的PBS+0.1％BSA(10毫升或者更少)將細(xì)胞重懸至1×107個(gè)/毫升，用于用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE，Molecular Probes，Eugene，OR)進(jìn)行標(biāo)記。在靶細(xì)胞懸液中加入1.25微升的5mM CFSE儲(chǔ)液，用旋渦振蕩混和樣品。在對(duì)照細(xì)胞懸液中，加入10倍稀釋的CFSE儲(chǔ)液，用旋渦振蕩混和樣品。細(xì)胞在37℃孵育10分鐘。加入大量(大于40毫升)冰冷的PBS終止染色。室溫下用PBS漂洗細(xì)胞兩次，然后重懸并計(jì)數(shù)。每種細(xì)胞懸液稀釋到50×106個(gè)/毫升，每種混合100微升并通過(guò)尾靜脈對(duì)原初的或者已接種的小鼠進(jìn)行注射。12-24小時(shí)以后，收獲脾臟，使用流式細(xì)胞術(shù)分析總共5×106個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)高的(靶)和低的(對(duì)照)熒光峰，二者的比例用于建立靶細(xì)胞裂解的百分比。體內(nèi)細(xì)胞毒性檢測(cè)可以對(duì)抗原特異T細(xì)胞的裂解活性進(jìn)行檢測(cè)而不需要在體外重新刺激。而且這一檢測(cè)評(píng)價(jià)的是T細(xì)胞在它們天然環(huán)境中的功能。
實(shí)施例6
用ELISPOT和ICS對(duì)經(jīng)過(guò)S-59處理和未經(jīng)處理的利斯特氏菌DP-L4056接種小鼠后的脾臟細(xì)胞進(jìn)行分析
使用S-59處理或者不處理制備具有或者沒(méi)有OVA抗原的利斯特氏菌DP-L4056菌株，按照實(shí)施例4對(duì)C57B1/6小鼠進(jìn)行接種(也包括HBSS對(duì)照)，區(qū)別是靜脈內(nèi)給藥。根據(jù)表7和表8列出的劑量對(duì)原初小鼠進(jìn)行接種。接種后12天收獲脾臟。根據(jù)實(shí)施例5使用ICS和ELISPOT檢測(cè)對(duì)脾臟進(jìn)行分析。此外，還對(duì)這些利斯特氏菌的LD50進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于LLO190特異的CD4+T細(xì)胞和OVA特異的CD8+T細(xì)胞的ICS檢測(cè)結(jié)果，TNF-α和IFN-γ均為陽(yáng)性的細(xì)胞的百分比，在表7和圖6A、B中給出。ELISOPT檢測(cè)結(jié)果，每2×105脾臟細(xì)胞的IFN-γSFC，在表8和圖7中給出。這些結(jié)果表明，經(jīng)S-59處理的具有OVA的樣品，當(dāng)其劑量超過(guò)沒(méi)有用S-59處理的樣品100倍時(shí)，刺激產(chǎn)生了OVA特異的應(yīng)答。盡管在較低劑量時(shí)沒(méi)有觀察到陽(yáng)性O(shè)VA特異的應(yīng)答，但這仍然為安全性的提高提供了余地，因?yàn)镾-59處理的樣品衰減了4log。此外，S-59處理的樣品其LD50相對(duì)于未處理樣品高103倍，表明即使在高出100倍的劑量水平時(shí)，它的安全性仍然比未處理的利斯特氏菌高10倍。
表7使用具有或者沒(méi)有OVA、使用或者未使用S-59處理的DP-L4056接種小鼠，既是TNF-α陽(yáng)性又是IFN-γ陽(yáng)性的小鼠脾臟細(xì)胞的百分比
表8使用具有或者沒(méi)有OVA，使用或者未使用S-59處理的DP-L4056免疫接種小鼠，每106個(gè)小鼠的脾臟細(xì)胞中的IFN-γSFC
實(shí)施例7
構(gòu)建pKSV7-d1BsrFI uvrAB用于通過(guò)等位交換從利斯特氏菌中刪除uvrAB。
不能修復(fù)由于補(bǔ)骨脂素和UVA處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA損傷的利斯特氏菌突變株，通過(guò)基本上刪除利斯特氏菌中的紫外線抗性(uvr)AB基因(uvrAB)而獲得。這些突變體已知為DNA修復(fù)突變體，或者核苷酸切除修復(fù)(NER)突變體。通過(guò)等位交換從利斯特氏菌中缺失uvrAB[Camilli等人，Molecular Microbiology 8143-147(1993)]。作為一個(gè)uvrAB能夠從任何利斯特氏菌中刪除的示例，將uvrAB從表9中所示的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株中刪除。
表9用于通過(guò)等位交換刪除uvrAB的親本單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株
在利斯特氏菌中和其他細(xì)菌菌株中，由UV和其他藥劑造成的DNA損傷后的核苷酸切除修復(fù)(NER)所需的ABC核酸外切酶復(fù)合體中的3個(gè)蛋白，有兩個(gè)由uvrA基因和uvrB基因編碼。uvrA和uvrB基因組成了利斯特氏菌基因組中的同一個(gè)操縱子，這樣在表9中所示的利斯特氏菌株中可以一起刪除。uvrA基因在利斯特氏菌中的圖上定位為2562547號(hào)核苷酸到2565461號(hào)核苷酸(SEQ ID NO5)；uvrB基因在利斯特氏菌中的圖上定位為2565469號(hào)核苷酸到2567459號(hào)核苷酸(SEQ ID NO6)[Glaser等人，Science 294849-852(2001)]。為了通過(guò)等位交換刪除uvrAB，首先用PCR擴(kuò)增出uvrAB基因，使用的正向和反向引物分別位于uvrAB上下游的大約900bps處。使用DP-L4056作為模板和PCR引物L(fēng)m-2561677F(SEQ ID NO7)和Lm-2568330R(SEQ ID NO8)產(chǎn)生利斯特氏菌的uvrAB擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子長(zhǎng)6654bp，包括了利斯特氏菌的2561677號(hào)到2568330號(hào)核苷酸(SEQ ID NO9)。利斯特氏菌野生型菌株DP-L4056在30℃培養(yǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)基是Brain Heart Infusion培養(yǎng)基(BHI，Difco)，將10微升漂洗后的細(xì)菌懸液(3毫升過(guò)夜培養(yǎng)物離心后，用5毫升PBS重懸菌體，再次離心，最后用1毫升PBS再次重懸利斯特氏菌菌體沉淀而制備)，加入到一個(gè)終體積為100微升的PCR反應(yīng)體系中，體系中還含有0.2μM的每種引物L(fēng)m-2561677F和Lm-2568330R，2μL pf Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)以及脫氧核苷酸三磷酸，緩沖液和硫酸鎂，這些物質(zhì)的添加根據(jù)供應(yīng)商的建議。在TAE緩沖液中進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后在紫外光下觀察，存在6654bp的單一條帶，證實(shí)了PCR反應(yīng)成功進(jìn)行。使用GeneClean(Qbiogene，Carlsbad，CA)從PCR反應(yīng)體系中純化出擴(kuò)增子產(chǎn)物，純化后的終體積為50微升。接下來(lái)將擴(kuò)增子插入到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在連接混合物中使用5微升純化的uvrAB擴(kuò)增子。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs(Beverly，MA)。通過(guò)使用BsrFI(NewEngland Biolabs)酶切，進(jìn)行1％的瓊脂糖/TAE電泳，產(chǎn)生4612，1388，1094，181，886和2424bp的片段而鑒定正確構(gòu)建的pCR2.1-TOPO-uvrAB質(zhì)粒。
接下來(lái)使用質(zhì)粒pCR2.1-TOPO-uvrAB產(chǎn)生用于等位交換的質(zhì)粒，其中uvrAB基因的2562709位到2567320位核苷酸(4612bp)被刪除。所有的用于重組質(zhì)粒構(gòu)建的限制性酶和T4連接酶購(gòu)自NewEngland Biolabs。為了完成uvrAB序列的刪除，使用HindIII，BsrFI和BglII對(duì)一份pCR-TOPO/uvrAB質(zhì)粒(大約2微克)進(jìn)行消化，得到的1092bp的片段用1％瓊脂糖/TAE凝膠電泳和GeneClean進(jìn)行純化。同時(shí)另外一份(大約2微克)用XhoI，BsrFI和BglII消化，得到的1050bp的片段用1％瓊脂糖/TAE凝膠電泳和GeneClean進(jìn)行純化。上述1092bp和1050bp兩個(gè)片段含有相容的BsrFI末端，將其連接在一起，得到的2142bp的產(chǎn)物用GeneClean進(jìn)行純化。2142bp連接產(chǎn)物的一部分使用PstI酶切，得到的1486bp片段用1％瓊脂糖/TAE凝膠電泳和GeneClean進(jìn)行純化。2142bp連接產(chǎn)物的另一部分使用KnpI和PstI酶切，得到的622bp的片段用1％瓊脂糖/TAE凝膠電泳和GeneClean進(jìn)行純化。用于等位交換的親本質(zhì)粒載體，pKSV7[Camilli等人，Molecular Microbiology 8143-147(1993)]使用KpnI和PstI消化，然后用小牛腸堿性磷酸酯酶(CIAP，New England Biolabs)處理，然后將具有KpnI和PstI相容末端的622bp的片段插入pKSV7質(zhì)粒載體中，得到pKSV7-K/P-338。接下來(lái)，將具有PstI相容末端的1486bp的片段插入到用PstI消化和CIAP處理的pKSV7-K/P-338載體構(gòu)建體中。使用KpnI和HindIII消化后產(chǎn)生大小為1253bp、865bp和6.9kb片段，證明1486bp片段以正確方向插入。產(chǎn)生的質(zhì)粒構(gòu)建體被稱為pKSV7-dlBsrFI uvrAB。對(duì)該pKSV7重組質(zhì)粒中的利斯特氏菌的dlBsrFI uvrAB部分進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)利斯特氏菌序列的保真性以及uvrAB基因中2562709位到2567320位核苷酸的被精確刪除(從uvr對(duì)應(yīng)的2562547位到2567459位核苷酸中刪除)。刪除的區(qū)域是SEQ ID NO10，剩余的擴(kuò)增子序列在SEQ ID NO11中給出。
使用pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒的等位交換，刪除利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029(表9)中的uvrAB基因，如以前所描述的[Camilli等人，Molecular Microbiology 8143-147(1993)]。質(zhì)粒pKSV7-dlBsrFI uvrAB通過(guò)電穿孔引入到利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029中。用于電穿孔的感受態(tài)利斯特氏菌株制備如下首先在BHI中生長(zhǎng)分離細(xì)菌菌落的10毫升的過(guò)夜培養(yǎng)物，37℃振蕩。然后將2毫升的過(guò)夜培養(yǎng)物接種到250毫升的搖瓶中的100毫升的0.5M蔗糖/BHI(過(guò)濾除菌)培養(yǎng)基中，得到每個(gè)菌株的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物。培養(yǎng)物在37℃振蕩2-3小時(shí)直至細(xì)菌的密度OD600達(dá)到0.2，到達(dá)對(duì)數(shù)中期生長(zhǎng)階段。接下來(lái)，處理培養(yǎng)物，產(chǎn)生沒(méi)有肽聚糖細(xì)胞壁的細(xì)菌，稱為原生質(zhì)球。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的培養(yǎng)物中加入100微升的青霉素G儲(chǔ)液(10mg/mL，過(guò)濾除菌)，在37℃振蕩2小時(shí)。原生質(zhì)球培養(yǎng)物在100毫升的離心瓶中沉淀，用45毫升冰冷的HEPES/蔗糖儲(chǔ)液(1mM HEPES，pH 7.0/0.5M蔗糖，過(guò)濾除菌)重懸，然后再次離心沉淀。細(xì)菌沉淀用20毫升的HEPES/蔗糖溶液重懸，轉(zhuǎn)移到40毫升的離心管中，沉淀，用10毫升HEPES/蔗糖溶液重懸。在細(xì)菌懸液中加入100微升的10mg/mL溶菌酶儲(chǔ)液，充分混和，培養(yǎng)物在37℃孵育15分鐘，不振蕩，每隔5分鐘輕輕顛倒混和。然后在5000rpm(3000xg)離心溶菌酶處理的培養(yǎng)物，4℃10分鐘，然后重懸于10毫升HEPES/蔗糖溶液，重復(fù)該過(guò)程兩次，每次仔細(xì)并完全地重懸。最后一步用500微升HEPES/蔗糖溶液重懸菌體，得到電感受態(tài)的利斯特氏菌。
2微克的pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒DNA加入到10微升的DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029電感受態(tài)利斯特氏菌中，將溶液加入到0.1厘米的電轉(zhuǎn)化小杯中進(jìn)行電穿孔。將電轉(zhuǎn)化小杯置于電穿孔裝置中，設(shè)置參數(shù)為1kV，400歐姆，25μFD，然后脈沖。這通常導(dǎo)致時(shí)間常數(shù)為5毫秒。立刻將細(xì)胞加入到1毫升預(yù)先溫?zé)岬?0℃的BHI/蔗糖培養(yǎng)基中，然后30℃孵育1小時(shí)，不振蕩。孵育之后，沉淀細(xì)菌，用200mlBHI培養(yǎng)基重懸，將懸液涂布于含有10μg/ml氯霉素(BHI/CM10)的BHI瓊脂平板上。然后將平板在30℃孵育過(guò)夜，之后即可見(jiàn)對(duì)應(yīng)于pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌落。由于pKSV7質(zhì)粒含有溫度敏感的利斯特氏菌復(fù)制子，所以平板必須在30℃孵育，才能看到氯霉素抗性菌落。
用包含在uvrAB中4612bp缺失的pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化的利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029中天然的uvrAB基因的等位交換分兩步完成首先是質(zhì)粒整合，然后是質(zhì)粒切除(包括天然的uvrAB)以及去除(curing)，這在以前有所描述[Camilli等人，Molecular Microbiology 8143-147(1993)]。選擇來(lái)自使用pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒DNA電穿孔的利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029的每一種中的兩個(gè)分離的氯霉素抗性菌落，將它們分別劃線在新鮮的BHI/CM10平板上，在30℃孵育過(guò)夜。第二天，從每塊平板上挑選菌落，接種于250毫升搖瓶中的10毫升BHI/CM10培養(yǎng)基中，然后在30℃振蕩下孵育過(guò)夜。然后使用10微升每種過(guò)夜培養(yǎng)物接種10毫升新鮮BHI/CM10培養(yǎng)基(1∶1000稀釋)，然后在41℃振蕩培養(yǎng)直至培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期。每種培養(yǎng)物取10微升后，使用剩余的利斯特氏菌過(guò)夜培養(yǎng)物制備質(zhì)粒，保證pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒DNA的存在。10微升的穩(wěn)定生長(zhǎng)期培養(yǎng)物接種預(yù)熱到41℃的10毫升新鮮BHI/CM10培養(yǎng)基中，然后在41℃振蕩孵育過(guò)夜。然后從每一個(gè)41℃過(guò)夜培養(yǎng)物種取樣，劃線在預(yù)熱到41℃的BHI/CM10平板上，以產(chǎn)生獨(dú)立的菌落。由于pKSV7質(zhì)粒含有溫度敏感的利斯特氏菌復(fù)制子，所以在41℃孵育選出的菌落是由于pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒與利斯特氏菌基因組的天然uvrAB基因的同源重組整合，這樣氯霉素抗性標(biāo)記在細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂中擴(kuò)增和表達(dá)而產(chǎn)生。這時(shí)利斯特氏菌株對(duì)于uvrAB基因是部分二倍體，由天然的uvrAB基因和4612bp刪除的uvrAB基因組成，由于pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合產(chǎn)生。
對(duì)于用pKSV7質(zhì)粒切除和除去(curing)天然的uvrAB基因，從上述步驟中每一個(gè)41℃培養(yǎng)的BHI/CM10平板上選擇單菌落，接種不含氯霉素的10毫升BHI培養(yǎng)基，在30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。然后在10毫升不含氯霉素的新鮮BHI培養(yǎng)基中1∶1000稀釋培養(yǎng)物。然后再次在30℃培養(yǎng)過(guò)夜，振蕩6小時(shí)。此步驟重復(fù)兩次。由于部分二倍體中間體菌株在沒(méi)有藥物選擇壓力的條件下傳代多次，培養(yǎng)溫度是pKSV7質(zhì)粒復(fù)制子的允許溫度，則出現(xiàn)整合的pKSV7質(zhì)粒自發(fā)切除，最終從先前細(xì)菌中除去質(zhì)粒[Camilli等人，Molecular Microbiology 8143-147(1993)]。在第三次1∶1000稀釋和6小時(shí)孵育階段之后，從每個(gè)培養(yǎng)物中取樣，劃線于BHI平板上(沒(méi)有氯霉素)用于產(chǎn)生獨(dú)立的菌落，然后在37℃孵育過(guò)夜。用牙簽從每個(gè)BHI平板上選取100個(gè)獨(dú)立的菌落，每個(gè)菌落先后在BHI/CM10平板和BHI平板上劃5毫米長(zhǎng)的線。用格子標(biāo)記平板，使每對(duì)相配的BHI/CM10和BHI平板是相同的復(fù)制品。BHI/CM10和BHI一式兩份的平板在37℃孵育過(guò)夜。使用pKSV7-dlBsrFI uvrAB質(zhì)粒DNA電穿孔轉(zhuǎn)化DP-L4056，DP-L4017或者DP-L4029菌株后產(chǎn)生的兩種氯霉素抗性菌落的大約5％的同時(shí)涂布在BHI/CM10和BHI平板上的菌落表現(xiàn)為藥物敏感(即只在BHI平板上生長(zhǎng))。這些藥物敏感菌落代表了含有4612bp uvrAB基因缺失的候選菌株。每種藥物敏感菌落重新劃線于BHI/CM10和BHI平板上，37℃孵育過(guò)夜，以得到獨(dú)立的菌落，以保證候選克隆是純的和藥物敏感的。對(duì)氯霉素敏感克隆進(jìn)行PCR，使用Lm-2561677F和Lm-2568330R引物(同前)，目的是鑒定出還包含uvrAB刪除的克隆。具有天然uvrAB基因的擴(kuò)增子大小為6654bp而具有刪除uvrAB基因的擴(kuò)增子大小是2042bp；大約50％的氯霉素敏感克隆也含有刪除的uvrAB基因。選擇兩個(gè)來(lái)自DP-L4056，DP-L4017和DP-LA029包含uvrAB刪除的菌株的克隆用于進(jìn)一步鑒定。每一個(gè)uvrAB突變體菌株制備甘油儲(chǔ)備物(30℃的過(guò)夜培養(yǎng)物用無(wú)菌的LB/40％甘油1∶1進(jìn)行稀釋)，在-80℃保存。這些菌株的名稱在表10中給出。DP-L4029uvrAB(actA/uvrAB)于2003年10月3日保存于ATCC，編號(hào)PTA-5563。
表10通過(guò)等位交換產(chǎn)生的利斯特氏菌株uvrAB突變株。
利斯特氏菌株uvrAB突變株親本利斯特氏菌株
L4056/uvrAB克隆1 DP-L4056
L4056/uvrAB克隆2 DP-L4056
L4017/uvrAB克隆1 DP-L4017
L4017/uvrAB克隆2 DP-L4017
L4029/uvrAB克隆1 DP-L4029
L4029/uvrAB克隆2 DP-L4029
為了證明對(duì)S-59補(bǔ)骨脂素和UVA光的敏感性提高，將1×109CFU的表10中所示的利斯特氏菌菌株uvrAB突變體制備物，分別使用2，20，100和500nM S-59(對(duì)于克隆L4017/uvrAB的兩個(gè)克隆和L4056/uvrAB的兩個(gè)克隆)或者2，10，20和100nM S-59(對(duì)于克隆L4017/uvrAB的克隆1和L4029/uvrAB的兩個(gè)克隆)處理，UVA的輻射劑量為6J/cm2(FX1019)，將稀釋液涂布在BHI平板上，測(cè)試菌株的存活能力，完全如實(shí)施例1中所述。本研究的結(jié)果在表11A-B中(log衰減作為S-59劑量的函數(shù))和圖8A-B中(剩余的log滴度作為S-59劑量的函數(shù))給出。結(jié)果清除地表明，與親本菌株比較，表10給出的DNA NER修復(fù)突變菌株對(duì)于使用補(bǔ)骨脂素和UVA輻射的光化學(xué)衰減，具有明顯更高的易感性。這一數(shù)據(jù)提供了無(wú)可爭(zhēng)議的證據(jù)表明，與它們同源的對(duì)應(yīng)菌株相比，對(duì)于uvrAB突變體菌株可以使用明顯低得多的S-59補(bǔ)骨脂素使uvrAB突變體細(xì)菌失活到同與它們同源的對(duì)應(yīng)菌株失活相當(dāng)?shù)某潭取?br> 表11A在所指定的S-59濃度下輻射(6J/cm2UVA)后的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株的log衰減
表11B在所指定的S-59濃度下輻射(6J/cm2UVA)后的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株的log衰減
可以直接使用uvrAB突變菌株作為親本株，在其中加入編碼與惡性或者傳染性疾病有關(guān)的異源抗原的表達(dá)盒。在這種背景下，在使用S-59和UVA光進(jìn)行光化學(xué)衰減后，細(xì)菌保持了其進(jìn)行MHC I類(lèi)限制應(yīng)答的能力，因?yàn)楸M管通過(guò)交聯(lián)使細(xì)菌復(fù)制其DNA的能力喪失，但是表達(dá)其遺傳互補(bǔ)殘留物的能力基本上保持完好。而且，由于使uvrAB突變體失活所需的DNA交聯(lián)大大減少，就構(gòu)成一劑疫苗的細(xì)菌基因組群而言，任何一個(gè)基因的表達(dá)都不會(huì)受到顯著的影響，原因是DNA交聯(lián)的水平很低，導(dǎo)致某個(gè)給定基因的表達(dá)基本上沒(méi)有被中斷。最后，uvrAB突變可以與任何其他衰減突變組合在一起，目的是將光化學(xué)和遺傳衰減組合起來(lái)得到一個(gè)安全有效的疫苗平臺(tái)。在這里描述的組合物中，uvrA、uvrB或uvrC基因或者任何涉及NER的利斯特氏菌基因，都可以單獨(dú)或者以任何組合被突變，這樣蛋白的有功能形式不能被表達(dá)。這些組合物可以作為一種方法，得到安全有效的疫苗，該疫苗來(lái)自挑選出的細(xì)菌病原，目的是在接受疫苗接種的個(gè)體中保護(hù)不受野生型抗原的攻擊?；蛘?，這些組合物可以作為一種方法，得到安全有效的重組疫苗平臺(tái)，用于表達(dá)與任何目的惡性或者傳染性疾病有關(guān)的異源抗原。
實(shí)施例8
通過(guò)等位交換或者位點(diǎn)特異整合載體向目的利斯特氏菌株中的基因組中插入抗原表達(dá)盒
在實(shí)施例7中描述的菌株，任何目的利斯特氏菌菌株，或者任何細(xì)菌菌株，可以被進(jìn)一步改變以表達(dá)與惡性或者傳染性疾病有關(guān)的異源蛋白或抗原。異源蛋白的表達(dá)可以通過(guò)含有復(fù)制子的質(zhì)粒，該復(fù)制子與目的宿主細(xì)菌相容，這樣質(zhì)?？梢苑€(wěn)定地維持。或者可以使用多種不同的方法，包括如實(shí)施例7中描述的等位交換或者使用隨機(jī)或位點(diǎn)特異整合的載體(這些載體來(lái)自目的轉(zhuǎn)座子或者細(xì)菌噬菌體)，將原核表達(dá)盒穩(wěn)定整合進(jìn)入宿主細(xì)菌的基因組中。
作為一個(gè)實(shí)例，這里描述了來(lái)自如實(shí)施例7中描述的uvrAB核苷酸切除修復(fù)(NER)突變體菌株--重組單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的來(lái)源過(guò)程，使用了位點(diǎn)特異整合載體pPL2，該載體來(lái)自利斯特氏菌噬菌體PSA(來(lái)自ScottA的噬菌體)[Lauer等人，J.Bacteriol.1844177-4186(2002)]。特別地，對(duì)pPL2整合載體進(jìn)行改造，使其表達(dá)雞卵清蛋白(OVA)模型抗原作為融合配偶體，與利斯特氏菌溶胞毒素O(LLO)蛋白的氨基末端部分融合，該蛋白包括分泌信號(hào)以及PEST序列[Decatur和Portnoy，Science 290992-995(2000)]，但是缺少溶血素活性，該蛋白與OVA按照讀碼框融合。截短的LLO-OVA融合蛋白的表達(dá)由hly啟動(dòng)子引導(dǎo)，hly啟動(dòng)子是依賴于prfA的啟動(dòng)子，引導(dǎo)利斯特氏菌毒力基因，包括LLO的表達(dá)。該載體稱為pPL2/LLOss- PEST-OVA。pPL2載體整合到利斯特氏菌的tRNAArg基因中，整合方式使得tRNA基因的天然序列在成功整合之后得以恢復(fù)，這樣使其天然表達(dá)的功能保持完好。
構(gòu)建pPL2/LLOss-PEST-OVA的第一步是從DP-L4056野生型利斯特氏菌的基因組DNA中一起擴(kuò)增出hly啟動(dòng)子和LLOss-PEST序列，通過(guò)PCR使用正向引物KpnI-LLO核苷酸1257-1276(SEQ ID NO12)和反向引物XhoI-LLO1665R(SEQ ID NO13)的引物對(duì)。426bp的擴(kuò)增子用GeneClean純化，用KpnI和XhoI消化，然后連接到pPL2質(zhì)粒中，該質(zhì)粒事先用KpnI和XhoI消化，小牛腸堿性磷酸酯酶(CIAP)處理，GeneClean純化。含有LLOss-PEST序列的正確質(zhì)粒通過(guò)用KpnI和XhoI消化和1％瓊脂糖/TAE電泳來(lái)確證，產(chǎn)生的DNA片段為418bp和6112bp。這個(gè)中間質(zhì)粒DNA構(gòu)建體稱為pPL2/LLOss-PEST。
可以從很多本領(lǐng)域內(nèi)使用的那些質(zhì)粒，包括來(lái)自DP-E3616大腸桿菌[Higgins等人，Mol.Molbiol.311631-1641(1999)]的pDP3616質(zhì)粒DNA，中通過(guò)PCR擴(kuò)增出OVA序列，使用正向引物XhoI-NcoI OVA cDNA核苷酸174-186(SEQ ID NO14)和反向引物XhoI-NotI-HindIII(SEQ ID NO15)的引物對(duì)。
1013bp的擴(kuò)增子用GeneClean純化，用XhoI和NotI消化，連入用XhoI和NotI消化、CIAP處理、GeneClean純化的pPL2/LLOss-PEST質(zhì)粒中。含有LLOss-PEST和OVA序列的正確質(zhì)粒構(gòu)建體通過(guò)用KpnI、XhoI和NotI消化和1％瓊脂糖/TAE電泳來(lái)確證，產(chǎn)生的DNA片段為994bp，1560bp和6039bp。通過(guò)測(cè)序確證質(zhì)粒pPL2/LLOss-PEST-OVA中LLO和OVA區(qū)域的精確預(yù)期序列。
pPL2/LLOss-PEST-OVA質(zhì)粒插入到從實(shí)施例7中描述的目的利斯特氏菌uvrAB突變株的基因組的tRNAArg基因中，完全根據(jù)以前描述的方法進(jìn)行[Lauer等人，J.Bacteriol.184，4177-4186(2002)]。簡(jiǎn)而言之，首先將質(zhì)粒pPL2/LLOss-PEST-OVA，通過(guò)電穿孔或者化學(xué)方式，引入大腸桿菌宿主菌株SM10[Simon等人，Bio/Technology 1784-791(1983)]中。接下來(lái)，將質(zhì)粒pPL2/LLOss-PEST-OVA從轉(zhuǎn)化的SM10中通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移到目的利斯特氏菌中。在含有7.5微克每毫升氯霉素和200微克每毫升鏈霉素的藥物選擇BHI瓊脂平板上孵育后，目的克隆通過(guò)在含有相同組合物的平板上傳代三次進(jìn)行純化。為了證實(shí)pPL2載體整合在噬菌體結(jié)合位點(diǎn)處，挑取單個(gè)菌落，用PCR進(jìn)行篩選，使用的引物對(duì)是正向引物NC16(SEQ ID NO16)和反向引物PL95(SEQID NO17)。具有pPL2/LLOss-PEST-OVA質(zhì)粒插入到目的利斯特氏菌uvrAB突變株基因組的tRNAArg基因中的目的菌落，會(huì)產(chǎn)生499bp的特征性DNA擴(kuò)增子。
包含穩(wěn)定整合的pPL2/LLOss-PEST-OVA的重組利斯特氏菌uvrAB突變株，對(duì)其被抗原呈遞細(xì)胞攝取的能力以及接下來(lái)通過(guò)MHC I類(lèi)途徑呈遞OVA的能力進(jìn)行檢測(cè)，使用克隆的衍生自C57B1/6的樹(shù)突細(xì)胞系DC2.4，如實(shí)施例1中的描述。利斯特氏菌被胞吞之后，DC2.4細(xì)胞在I類(lèi)分子上對(duì)OVA多肽的呈遞，在與B3Z細(xì)胞共同孵育后測(cè)定，也按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行。這些步驟證實(shí)重組的利斯特氏菌菌株是有功能的，可以按照本發(fā)明中包含的實(shí)施例中的描述進(jìn)一步使用。
這樣，本實(shí)施例提供了說(shuō)明指導(dǎo)，用于將編碼與目的傳染性和惡性疾病有關(guān)的任何所需抗原的原核表達(dá)盒引入在含有在uvrAB基因中有缺失的DNA修復(fù)突變利斯特氏菌菌株中。所述的重組利斯特氏菌菌株可以通過(guò)使用補(bǔ)骨脂素處理而被滅活，如實(shí)施例1中的描述，并且接下來(lái)可以用于多種不同的應(yīng)用，包括例如針對(duì)傳染性和惡性疾病的預(yù)防性和治療性疫苗。
實(shí)施例9
來(lái)自核苷酸切除修復(fù)(NER)突變體的細(xì)菌疫苗
本發(fā)明中描述的實(shí)施例舉例說(shuō)明了疫苗組合物的效力，其通過(guò)對(duì)編碼涉及傳染性和惡性疾病的抗原的重組傳輸平臺(tái)進(jìn)行光化學(xué)處理達(dá)到基因組滅活。根據(jù)該組合物，盡管基因組被滅活且在復(fù)制中不能分離，但轉(zhuǎn)錄基本上保持完好，這使得在接受接種的個(gè)體中出現(xiàn)抗原表達(dá)的重新開(kāi)始，以及對(duì)病原特異免疫應(yīng)答(包括CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL))的最佳誘導(dǎo)。而且如實(shí)施例7中所描述的，通過(guò)在該組合物中使用疫苗平臺(tái)，其中通過(guò)任何手段(包括遺傳工程刪除)使DNA核苷酸切除修復(fù)(NER)機(jī)制失活，這些突變體對(duì)光化學(xué)失活的敏感性顯著提高。
DNA修復(fù)突變體失活所需的DNA交聯(lián)明顯較少，其結(jié)果是就組成一劑疫苗的細(xì)菌基因組群而言，任何一個(gè)基因的表達(dá)都不會(huì)受到顯著影響，原因是低水平的DNA交聯(lián)使得在某個(gè)給定基因上基本上沒(méi)有表達(dá)的中斷。
因此，使用了來(lái)自病原的細(xì)菌平臺(tái)并且以基因?yàn)榛A(chǔ)的疫苗的整體效用，可以通過(guò)將光化學(xué)滅活與NER有缺陷的載體相結(jié)合而顯著提高。盡管滅活的疫苗不會(huì)導(dǎo)致疾病，但它仍然保持其誘導(dǎo)有效免疫力(包括T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)于載體表達(dá)的異源抗原特異的細(xì)胞免疫)的有效能力。而且，為了獲得將光化學(xué)和遺傳突變組合在一起的安全有效的疫苗平臺(tái)，可以將uvrAB突變與任何其他的衰減突變組合在一起。
顯而易見(jiàn)地，這些組合物可以作為得到安全有效疫苗的途徑，該疫苗來(lái)自目的細(xì)菌病原，在接受疫苗接種的個(gè)體中保護(hù)不受野生型抗原的攻擊。根據(jù)這一應(yīng)用，在許多情況下從某種病原的減毒的有生活力形式獲得安全有效的疫苗是行不通的，原因是疫苗在接受疫苗的某些個(gè)體中的反應(yīng)性和疾病的致病原性仍然很高的可能性。盡管與目的細(xì)菌病原有關(guān)的亞單位疫苗或滅活疫苗可能是安全的，但另一方面這些疫苗常常沒(méi)有效用，因?yàn)樗鼈儾荒苡行У卣T發(fā)廣泛、深入和持久的病原特異的免疫應(yīng)答，而這種應(yīng)答正是保護(hù)接受免疫接種的個(gè)體不受所述的病原的野生型攻擊所必需的。因此，在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的是，迫切需要將安全性與在接受接種的個(gè)體中誘發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的有效能力相結(jié)合的疫苗組合物。
同樣地，致病性微生物的核苷酸切除修復(fù)(NER)途徑的突變體，提供了組合物，該組合物可以用于安全有效的疫苗，該疫苗在接受所述微生物免疫接種的個(gè)體中誘發(fā)針對(duì)攻擊的保護(hù)，所述微生物的量足以在未接種的個(gè)體中導(dǎo)致疾病。NER由依賴ATP的核酸酶催化，該酶由3個(gè)亞基組成，被稱為ABC切除核酸酶，3個(gè)亞基由uvrA，uvrB和uvrC基因編碼。這三個(gè)uvr基因中任何一個(gè)或者多個(gè)基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞，包括病原性微生物，對(duì)使用補(bǔ)骨脂素和UVA光的光化學(xué)滅活極端敏感。
作為一個(gè)實(shí)例，提供了炭疽芽孢桿菌--炭疽病的病原--的uvr基因的突變。目前得到許可的用于人類(lèi)的非細(xì)胞炭疽疫苗是基于用氫氧化鋁吸附(美國(guó)疫苗)或者用磷酸鋁沉淀(英國(guó)疫苗)減毒的炭疽芽孢桿菌的無(wú)菌培養(yǎng)物上清。眾所周知這些疫苗的效果相當(dāng)微弱，它們需要至少6次免疫才能有保護(hù)效果，并且需要每年進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
在這里描述的組合物中，uvrA，uvrB或uvrC基因，或者任何涉及NER的炭疽芽孢桿菌基因，它們可以單獨(dú)或以任意組合被突變，使得該蛋白的有功能形式不被表達(dá)。
作為一個(gè)實(shí)例，可以通過(guò)例如實(shí)施例7中描述的等位交換，使uvrA，uvrB或uvrC基因，或者任何涉及NER的炭疽芽孢桿菌基因發(fā)生突變。盡管炭疽芽孢桿菌的uvr基因不是通過(guò)定位刪除和對(duì)產(chǎn)生突變株的表型進(jìn)行特征描述而鑒定出來(lái)的，這些uvr基因可以通過(guò)用相關(guān)生物體的基因組進(jìn)行同源搜索來(lái)進(jìn)行鑒定，在這些生物體中uvr基因是已知的。例如，炭疽芽孢桿菌的基因組，即主要染色體和兩個(gè)毒力質(zhì)粒，可以與同炭疽芽孢桿菌同屬一個(gè)屬的相關(guān)細(xì)菌，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)進(jìn)行比較。代表Florida.炭疽芽孢桿菌分離株(Read等人2002.Science 296，2028-2033)的主染色體的基因組支架的GenBank登錄編號(hào)為AAAC010000001?？莶菅挎邨U菌的GenBank登錄編號(hào)是NC-000964?？莶菅挎邨U菌uvrA基因包括核苷酸3609064到3611997，而枯草芽孢桿菌uvrB基因包括核苷酸3612005到3613990。使用枯草芽孢桿菌uvrA和uvrB編碼序列與炭疽芽孢桿菌的序列進(jìn)行BLAST搜索。這個(gè)分析在炭疽芽孢桿菌的基因組中鑒定出了具有72％序列一致性的區(qū)域，該區(qū)域?qū)?yīng)于炭疽芽孢桿菌的uvrA和uvrB基因。炭疽芽孢桿菌的uvrA基因在圖上定位為226021-228783位核苷酸，與枯草芽孢桿菌uvrA基因有72％的序列同源性(2082/2867相同序列同源性比對(duì))。炭疽芽孢桿菌的uvrB基因在圖上定位為228864-230771位核苷酸，與枯草芽孢桿菌uvrB基因有72％的序列同源性(1401/1925相同序列同源性比對(duì))。因此，炭疽芽孢桿菌uvrAB基因包括炭疽芽孢桿菌主要染色體的226021到230771位核苷酸。
可以根據(jù)實(shí)施例7中描述的對(duì)于單核細(xì)胞增生利斯特氏菌uvrAB基因的刪除方法，對(duì)炭疽芽孢桿菌包括主要細(xì)菌染色體226021到230771位核苷酸的uvrAB基因進(jìn)行刪除。簡(jiǎn)而言之，炭疽芽孢桿菌基因組中包括該區(qū)域以及上下游各1000bp的區(qū)域由PCR擴(kuò)增，接下來(lái)克隆到pKSV7等位交換質(zhì)粒載體中。另一種方法是，將pKSV7等位交換質(zhì)粒載體中的利斯特氏菌溫度敏感復(fù)制子替換為芽孢桿菌屬特異的或者炭疽芽孢桿菌特異的溫度敏感復(fù)制子。使用特異定位于uvrAB區(qū)域中的便利的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，可以刪除uvrA，uvrB，或者所有uvrAB基因序列中的任何部分。最后將等位交換質(zhì)粒引入炭疽芽孢桿菌中，根據(jù)實(shí)施例7中的描述篩選NER突變體。任何挑選出的炭疽芽孢桿菌菌株都可以用作親本菌株，用于產(chǎn)生NER缺陷的疫苗，包括，例如以下的菌株Ames，Vollum，A1.a/10，A1.b/23，A2/29，A3.a/34，A3.b/57，A4/69，B/80，Δsterne，VN41Δ1，Dames，NNR1Δ1，和DNH1。此外，可以向挑選出的NER突變體炭疽芽孢桿菌菌株的基因組中引入其他的衰減突變，使疫苗組合物組合光化學(xué)失活和遺傳失活。這種炭疽芽孢桿菌疫苗組合物能夠誘導(dǎo)針對(duì)已知的炭疽免疫性和保護(hù)性相關(guān)因素的免疫應(yīng)答，這些因素包括致死因子(LF)、水腫因子(EF)以及保護(hù)性抗原(PA)。另外，由于NER突變體疫苗組合物的表達(dá)特征保持完好，針對(duì)其他未知的炭疽免疫性和保護(hù)性相關(guān)因素(包括那些從兩個(gè)毒力質(zhì)粒pXO1和pXO2以及主要染色體上表達(dá)的因素)的免疫應(yīng)答也被誘導(dǎo)。
這里描述的用炭疽芽孢桿菌作為實(shí)例，使用NER突變體作為疫苗組分的組合物，可以根據(jù)感染的途徑即皮膚、胃腸道和呼吸系統(tǒng)感染，用于三種類(lèi)型炭疽的預(yù)防性或者治療性免疫接種設(shè)置。而且，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到可以采納制備炭疽芽孢桿菌的NER突變體用于獲得安全有效疫苗的途徑，以得到針對(duì)任何使用NER的微生物病原的安全有效的疫苗。
實(shí)施例10
本發(fā)明的疫苗用人的癌癥體內(nèi)治療的用途
作為治療或者預(yù)防人癌癥的實(shí)例，向個(gè)體施用疫苗，該疫苗包含微生物群體，其中的微生物核酸被改變，這樣微生物群體的增殖被衰減，其中的微生物基因表達(dá)基本未受影響。微生物可以根據(jù)實(shí)施例7和8中的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行制備，其中任何所需的編碼人腫瘤抗原的原核表達(dá)盒，通過(guò)使用例如實(shí)施例8中描述的pPL2整合載體或者該載體的任何改變形式、或者任何本領(lǐng)域內(nèi)人員通曉的方法，插入到微生物中。產(chǎn)生的微生物群可以以其天然未純化的形式配制，或者優(yōu)選地以純化形式配制。它們可以制備為液體懸液或者凍干并重懸于適宜的載體中用于給藥。此外，它們可以與添加劑例如防腐劑(例如柳硫汞、2-苯氧基乙醇)、穩(wěn)定劑(例如乳糖、谷氨酸單鈉鹽)、佐劑(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、細(xì)胞因子)、抗生素(例如新霉素、鏈霉素)或者其他物質(zhì)一起配制?？梢詫⒅苿┲貞一蛘哂眠m宜的稀釋液如無(wú)菌水、鹽水、等滲緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖至生理pH)或者其他適宜的稀釋液稀釋。
可以通過(guò)多種途徑施用疫苗，包括口、鼻、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、淋巴內(nèi)和皮下途徑，以及與給定的惡性或者傳染性疾病相應(yīng)的任何途徑。向個(gè)體施用有效量的疫苗用于治療。對(duì)于治療性治療，有效量是指將產(chǎn)生所需免疫應(yīng)答的劑量，其中的免疫應(yīng)答或者減緩了目標(biāo)腫瘤的生長(zhǎng)、減小了腫瘤大小或者優(yōu)選地完全根除腫瘤。疫苗的施用可以在適當(dāng)?shù)拈g隔重復(fù)進(jìn)行，也可以同時(shí)在接受接種的個(gè)體的多個(gè)不同的位置同時(shí)進(jìn)行。對(duì)于預(yù)防性治療，有效量是指產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的劑量，這樣個(gè)體發(fā)生癌癥的可能性顯著降低。免疫程序可以包含單劑、或者在適宜的間隔重復(fù)進(jìn)行直至產(chǎn)生了保護(hù)性免疫應(yīng)答。
對(duì)于個(gè)體的治療性治療可以在已經(jīng)被診斷為患有癌癥的個(gè)體身上開(kāi)始，作為一種起始治療，或者可以與其他治療聯(lián)合使用。例如，已經(jīng)通過(guò)外科手術(shù)去掉腫瘤的個(gè)體或者已經(jīng)使用放療或化療進(jìn)行治療的個(gè)體可以使用疫苗治療，以減少或者去除個(gè)體中任何殘留的腫瘤，或者降低癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于個(gè)體的預(yù)防性治療可以在或者由于環(huán)境條件或者由于遺傳誘因使患有某種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)升高的個(gè)體開(kāi)始。
實(shí)施例11
具有或者沒(méi)有uvrAB突變的利斯特氏菌DP-L4029菌株在S-59補(bǔ)骨脂素UVA處理之后的抗原呈遞。
使用實(shí)施例8中的步驟，改變實(shí)施例7中的利斯特氏菌DP-L4029uvrAB突變體克隆1使其表達(dá)OVA抗原。使用不同濃度補(bǔ)骨脂素S-59處理該菌株或者經(jīng)過(guò)改變表達(dá)OVA的DP-L4029菌株。利斯特氏菌株在37℃生長(zhǎng)過(guò)夜，然后取2毫升稀釋到100毫升BHI中，在37℃生長(zhǎng)大約4小時(shí)至OD600達(dá)到0.5(大約1×109CFU/mL)。每個(gè)利斯特氏菌株取5毫升的一份培養(yǎng)物加入到15毫升的試管中，2300g離心20分鐘，去掉上清，然后用5毫升PBS重懸細(xì)菌，達(dá)到大約1×109CFU/mL。對(duì)于uvrAB突變體菌株，取33.3微升3mM S-59儲(chǔ)液，用10毫升PBS稀釋，得到10μM的溶液，取合適量的該稀釋液加入到利斯特氏菌中使終濃度達(dá)10，20，30，40，50，60，70，80，90和100nM；而對(duì)于DP-L4029，加入S-59至終濃度為100，200，400，800和1000nM，終體積為5毫升。將這些轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板中，用0.5J/cm2(FX1019UVA裝置)輻射。樣品轉(zhuǎn)移到15毫升的試管中，加入5毫升PBS，2300g離心20分鐘洗掉未反應(yīng)的補(bǔ)骨脂素。除去上清，用5毫升PBS重懸細(xì)菌，并將其轉(zhuǎn)移到新的6孔培養(yǎng)板中。使用5.5J/cm2劑量的UVA輻射樣品，目的是將補(bǔ)骨脂素單加合物轉(zhuǎn)化為交聯(lián)物。還將每種利斯特氏菌株的樣品在72℃處理3小時(shí)將其殺死。根據(jù)實(shí)施例1對(duì)log滴度和OVA抗原的呈遞進(jìn)行測(cè)定。S-59處理的樣品的結(jié)果在表12A和圖9A和9B中給出(抗原呈遞是在每個(gè)DC2.4細(xì)胞1個(gè)利斯特氏菌，計(jì)算沒(méi)有減去背景水平)。兩種熱殺死菌株的結(jié)果顯示，其滴度低于檢測(cè)限度(完全滅活)，并且在B3Z檢測(cè)中，熱殺死的細(xì)菌不呈遞OVA抗原。結(jié)果顯示uvrAB突變體即使在其增殖已經(jīng)衰減到檢測(cè)限度的水平，也表現(xiàn)了很強(qiáng)的抗原呈遞，相反非uvrAB突變體菌株由于增殖衰減(增殖衰減大約到了背景水平，基本上完全滅活)的結(jié)果，抗原呈遞顯示了較大的下降。這證明在補(bǔ)骨脂素衰減的利斯特氏菌中，uvrAB突變體保持了MHC I類(lèi)的呈遞，所以應(yīng)該提供疫苗，該疫苗具有有效的免疫應(yīng)答以及顯著提高的安全水平。
表12A使用不同濃度補(bǔ)骨脂素S-59處理、UVA照射的利斯特氏菌株Log衰減和OVA抗原呈遞
*表達(dá)為未處理的百分比，在每個(gè)DC2.4細(xì)胞1個(gè)利斯特氏菌時(shí)測(cè)量。
使用相同的菌株進(jìn)行另一項(xiàng)研究。在該研究中將利斯特氏菌培養(yǎng)在BHI中，37℃過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋50倍于BHI，在37℃300rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5，這時(shí)將50毫升的溶液轉(zhuǎn)移到潔凈的搖瓶中，加入S-59至表12B所示的水平。將這些樣品在37℃300rpm孵育大約1小時(shí)(OD600達(dá)到約1.0，大約相當(dāng)于1×109/mL)。取出1毫升檢測(cè)其滴度，剩余的轉(zhuǎn)移到150毫米的培養(yǎng)皿中，在6J/cm2(FX1019)下輻射。根據(jù)前面的描述，確定輻射后每個(gè)樣品的滴度以及OVA抗原的呈遞。結(jié)果在表12B中以及圖9C和9D中給出(抗原呈遞是在每個(gè)DC2.4細(xì)胞10個(gè)利斯特氏菌，計(jì)算沒(méi)有減去背景水平)。結(jié)果顯示對(duì)于親本株，在基本上完全被滅活時(shí)，抗原呈遞處于背景水平，而對(duì)于uvrAB突變株，有大約10倍的S-59濃度范圍，在該濃度范圍中具有幾乎完全的滅活和充分的抗原呈遞。
表12B在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中使用不同補(bǔ)骨脂素S-59濃度處理、UVA照射的利斯特氏菌株Log衰減和OVA抗原呈遞。
*為未處理的百分比，在每DC2.4細(xì)胞10個(gè)利斯特氏菌測(cè)量的。
實(shí)施例12
S-59/UVA處理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029與DP-L4029uvrAB蛋白合成的比較。
單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029以及DP-L4029uvrAB在BHI中37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。然后1∶50稀釋于BHI，在37℃300rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5，這時(shí)50毫升的溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)潔凈的搖瓶中，加入S-59至2500nM(對(duì)于4029菌株)和200nM水平(對(duì)于4029uvrAB突變體菌株)。這些樣品在37℃300rpm下孵育大約1小時(shí)(OD600大約為1.0)。取出1毫升培養(yǎng)物檢測(cè)其滴度，剩余的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到150毫米的培養(yǎng)皿中，在6J/cm2(FX1019)下輻射。測(cè)定了輻射后每個(gè)樣品的滴度，以評(píng)價(jià)滅活的水平，結(jié)果是基本上完全滅活。已經(jīng)確定本處理是使兩種菌株滅活到檢測(cè)限度的大致最低的S-59劑量。根據(jù)OD600對(duì)滴度CFU/mL生長(zhǎng)曲線，每個(gè)菌株取1×1010個(gè)細(xì)菌，轉(zhuǎn)移到15毫升的離心管中。樣品在4℃下2300g離心20分鐘，去掉上清，用50毫升PBS洗滌沉淀。這一步驟共重復(fù)3次洗滌。最后的沉淀用2毫升不含甲硫氨酸或者半胱氨酸的DMEM(Gibco)重懸，37℃ 5％二氧化碳的孵箱中振蕩孵育30分鐘。樣品在2毫升離心管中，1600rpm離心2分鐘。去掉上清，加入2毫升不含甲硫氨酸或者半胱氨酸的DMEM。加入80μCi的35S甲硫氨酸-半胱氨酸(Perkin Elmer LifeSciences)，樣品在37℃ 5％二氧化碳的孵箱中振蕩孵育30分鐘。同上離心樣品，去掉上清。每份上清取50微升上樣于SDS-PAGE凝膠(Invitrogen，NuPage 4-12％Bis-Tris膠)中相鄰的泳道中，100伏電泳大約1.5小時(shí)。用10％乙酸和30％乙醇固定凝膠，然后浸泡在enhancer(Enlightning，NEN Life Sciences)中15分鐘。凝膠在80℃干燥3小時(shí)，通過(guò)在X光片中曝光以顯示條帶。兩項(xiàng)研究的結(jié)果在圖10中給出，表明uvrAB突變體菌株有大量的蛋白質(zhì)合成，而親本菌株只有有限的蛋白質(zhì)合成。
實(shí)施例13
在利斯特氏菌的生長(zhǎng)中，在存在S-59或者不存在的情況下對(duì)S-59/UVA滅活進(jìn)行比較。
比較兩種滅活單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株的方法。在第一種方法中，利斯特氏菌在BHI中37℃下300rpm培養(yǎng)過(guò)夜，然后1∶50稀釋于BHI中，在37℃300rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.7-1.0。離心，并用含1％BSA的PBS重懸至1×109/ml。對(duì)于親本株，加入S-59至120nM，對(duì)于uvrAB突變株，加入S-59至30nM。樣品在冰上孵育大約60分鐘，然后轉(zhuǎn)移到150毫米的培養(yǎng)皿中，在6J/cm2劑量(FX1019)下輻射。在第二種方法中，利斯特氏菌進(jìn)行相似的培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5，這時(shí)50毫升菌液轉(zhuǎn)移到一個(gè)潔凈的搖瓶中，對(duì)于親本株，加入S-59至2500nM，對(duì)于uvrAB株，加入S-59至200nM。樣品在37℃300rpm孵育大約1小時(shí)(OD600大約1.0，大約1×109/mL)。取出1毫升樣品測(cè)定滴度，剩余的樣品轉(zhuǎn)移到150毫米的培養(yǎng)皿中，同第一種方法進(jìn)行輻射。每一個(gè)樣品測(cè)定輻射后的滴度，結(jié)果是所有樣品的增殖基本上完全被抑制(大于8log的滅活)。在一項(xiàng)用DP-L4029和DP-L4029uvrAB的研究中，用第二種方法處理包含大約1×1011個(gè)細(xì)菌的整個(gè)樣品，將整個(gè)樣品涂板，顯示大約9log的親本株被殺死而大于10log的uvrAB突變株被殺死。四種不同的利斯特氏菌制備物的結(jié)果在表13中給出。
表13使用S-59/UVA滅活單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-以及actA-uvrAB-，對(duì)整個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)量，以測(cè)定log滴度滅活。
在一項(xiàng)研究中，使用單核細(xì)胞增生利斯特氏菌DP-L4029-OVA和DP-L4029uvrAB-OVA比較了兩種方法。同上制備樣品，2300g離心20分鐘，去掉上清，細(xì)菌用PBS洗一次。離心和去掉PBS漂洗液后，最終的沉淀用含8％DMSO的PBS重懸，然后迅速置于凍存管中，用液氮或者干冰冷凍，儲(chǔ)存于-80℃。每組三只小鼠(C57B1/6)靜脈內(nèi)注射200微升的1×108個(gè)利斯特氏菌(凍存的儲(chǔ)液大約1∶40稀釋于HBSS中)。除了用S-59/UVA處理的菌株以外，還使用活的和熱殺死的DP-L4029uvrAB-OVA，以及HBSS對(duì)照進(jìn)行注射。對(duì)于兩種S-59方法的比較，在0天注射小鼠。對(duì)于用第二種方法制備的樣品，另取數(shù)組小鼠，在第2、3天或者第2、3、4和5天注射。所有的小鼠在接種后第7天處死，取出脾臟進(jìn)行分析。用實(shí)施例5中描述的ELISPOT方法檢測(cè)脾臟細(xì)胞的OVA特異的免疫應(yīng)答，使用SL8(OVA特異的)刺激細(xì)胞群。結(jié)果在圖11A中顯示，表明通過(guò)第二種方法制備的利斯特氏菌，不論是親本株還是uvrAB突變株，都較第一種方法制備的菌株具有更有效的OVA特異的免疫應(yīng)答。還使用LLO II類(lèi)抗原LLO190或者I類(lèi)抗原LLO296進(jìn)行刺激，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。比較了所有三種抗原的ELISPOT結(jié)果在圖11B中顯示，表明LLO特異的CD4+應(yīng)答與OVA特異的應(yīng)答相似。還使用實(shí)施例5中描述的ICS檢測(cè)了脾臟細(xì)胞，使用SL8、LLO190或者LLO296刺激。結(jié)果在圖12A-C中顯示，結(jié)果表明在第二種方法中，對(duì)于OVA和LLO都出現(xiàn)了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。數(shù)據(jù)還表明uvrAB菌株較親本株具有增強(qiáng)的應(yīng)答。在兩個(gè)菌株中，在接下來(lái)的日子里增加免疫接種，對(duì)OVA和LLO抗原都產(chǎn)生增強(qiáng)的應(yīng)答(1天與3天)。
在另一項(xiàng)研究中，評(píng)價(jià)DP-L4029和DP-L4029 uvrAB菌株在小鼠中提供針對(duì)野生型攻擊的保護(hù)性免疫性的能力。Balb/c小鼠分組根據(jù)表14中的描述進(jìn)行接種，使用HBSS、DP-L4056野生型(+/-熱殺死)、DP-L4027(LLO刪除)、DP-L4029S-59/UVA處理(以上的第一種和第二種方法)、DP-L4029uvrAB S-59/UVA處理(以上的第一種和第二種方法)。接種后27天，每組中3只小鼠使用2×LD50、6只小鼠使用100×LD50的野生型單核細(xì)胞增生利斯特氏菌攻擊。攻擊后3天，處死用2×LD50攻擊的小鼠，分離脾臟和肝臟，并進(jìn)行培養(yǎng)，使利斯特氏菌生長(zhǎng)。每只小鼠的脾臟或者肝臟在含0.5％Triton X-100(Sigma)的無(wú)菌蒸餾水中勻漿。將連續(xù)10倍稀釋液涂布于含有鏈霉素(50μg/mL)BHI瓊脂平板上，37℃孵育過(guò)夜。測(cè)定每個(gè)脾臟或者肝臟的菌落形成單位數(shù)目，作為對(duì)野生型菌株攻擊免疫性的指示。圖13A和B顯示與HBSS(未免疫接種)對(duì)照相比，S-59/UVA處理的樣品給出了大約每個(gè)器官3log的CFU下降，與第一種方法制備的樣品相比，第二種方法制備的樣品顯示了更大的CFU下降。此外，處理的uvrAB突變株比處理的親本株表現(xiàn)出略高的CFU下降。盡管CFU的降低不如用野生型免疫接種的效果，但是S-59/UVA處理的菌株也顯示了一些降低CFU的效力，而CFU的降低一般與保護(hù)性免疫性相關(guān)。使用100×LD50攻擊的6只小鼠繼續(xù)觀察10天，監(jiān)測(cè)其存活，只有一只使用了野生型利斯特氏菌免疫接種的小鼠存活。
表14Balb/c小鼠的免疫劑量，用于測(cè)定保護(hù)性免疫性，比較兩種S-59/UVA方法
在Balb/c小鼠中進(jìn)行另外一項(xiàng)研究，使用HBSS，DP-L4056野生型(+/-熱殺死)，DP-L4027(LLO刪除)，DP-L4406actA(actA/inlB雙缺失突變體，于2003年10月3日保存，ATCC編號(hào)PTA-5562)，DP-L4029+S-59/UVA(第二種方法)，DP-L4029uvrAB+/-S-59/UVA處理(只用第二種方法)或者+熱殺死的，對(duì)于S-59和熱殺死的菌株，每天接種連續(xù)進(jìn)行1、3或5天。劑量總結(jié)與表15中。第一次免疫接種后29天，每組3只小鼠使用20×LD50、6只小鼠使用100×LD50的野生型單核細(xì)胞增生利斯特氏菌攻擊。這些小鼠監(jiān)測(cè)其10天的存活。第一次免疫接種后32天，每組另外3只小鼠使用2×LD50野生型攻擊，3天后處死，分離脾臟和肝臟，并進(jìn)行培養(yǎng)，使利斯特氏菌生長(zhǎng)。此外，進(jìn)行ELISA檢測(cè)測(cè)定小鼠血清中抗利斯特氏菌的抗體滴度。在碳酸氫鈉緩沖液中的冷凍ground利斯特氏菌涂板并且與連續(xù)稀釋的免疫小鼠的血清一起孵育，然后用綴合HRP的山羊抗小鼠抗體檢測(cè)結(jié)合上的抗體。加入HRP的底物，抗體水平通過(guò)定量測(cè)定顏色的改變而確定。這些與原初小鼠比較，評(píng)價(jià)利斯特氏菌特異的抗體，如果樣品的測(cè)量值高于原初小鼠血清樣品測(cè)量值1個(gè)sd(Standarddeviation)，則認(rèn)為樣品是利斯特氏菌陽(yáng)性。每個(gè)脾臟或者肝臟的CFU在圖14A和B中顯示，抗利斯特抗體滴度在圖15中顯示，存活結(jié)果在圖16中顯示。本研究表明S-59處理的uvrAB菌株接種3次或者5次，具有良好的CFU降低和保護(hù)性免疫性，接近未處理的uvrAB菌株的結(jié)果，并且?guī)缀跖c野生型菌株同樣有效。
表15使用S-59/UVA處理的菌株進(jìn)行多次免疫接種Balb/c小鼠用于測(cè)定保護(hù)性免疫性。
實(shí)施例14
使用S-59/UVA處理的菌株在小鼠模型中破壞免疫耐受的證明
使用實(shí)施例13中的第二種方法用S-59/UVA處理表達(dá)Gp-70-AH1A5和OVA的DP-L4029和DP-L4029uvrAB菌株。Gp-70是一種小鼠自體抗原，由CT-26腫瘤細(xì)胞表達(dá)。AH1A5是天然序列中的一個(gè)單堿基突變，在活菌株中表達(dá)時(shí)會(huì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[AH1肽是SPSYVYHQF(SEQ ID NO20)，AH1A5肽是SPSYAYHQF(SEQ ID NO21)]。在一項(xiàng)預(yù)防性免疫接種研究中，根據(jù)表16對(duì)每組8只Balb/c小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)接種(100微升)(第一組接種完成后7天，處死每組3只小鼠，收集脾臟)。初次接種21天后，每組剩余的5只小鼠靜脈內(nèi)注射1×105個(gè)CT-26結(jié)腸上皮腫瘤細(xì)胞(ATCC)并監(jiān)測(cè)其存活。
表16疫苗株和處理程序
根據(jù)實(shí)施例5，用ICS對(duì)收集的脾臟細(xì)胞的T細(xì)胞群進(jìn)行分析，使用LLO91，AH1，AH1/A5肽或者P815和CT26細(xì)胞(使用150mM S-59和3J/cm2 UVA使其完全滅活)刺激細(xì)胞。P815細(xì)胞作為CT26全細(xì)胞刺激的陰性對(duì)照，因?yàn)镻815不表達(dá)gp70抗原。結(jié)果在圖17中表示，表明處理的uvrAB突變株產(chǎn)生了AH1A5或者AH1特異的免疫應(yīng)答，此應(yīng)答可以被增加的免疫接種提高。還用根據(jù)實(shí)施例5的ELISPOT檢測(cè)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。使用AH1A5或者AH1肽刺激細(xì)胞。結(jié)果在圖18A、B中表示，表明使用uvrAB突變株產(chǎn)生了對(duì)AH1A5或者AH1的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例15
使用補(bǔ)骨脂素減毒的uvrAB缺失利斯特氏菌株對(duì)小鼠進(jìn)行治療性免疫接種。
使用B16.F10.MO5.10.H3(OVA+，這是一個(gè)實(shí)施例4中使用的細(xì)胞的亞克隆，它表達(dá)OVA的均一性有所提高)黑色素腫瘤細(xì)胞(1×106每100微升HBSS，靜脈內(nèi))注射到C57B1/6小鼠中以建立肺部轉(zhuǎn)移灶。使用單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029-OVA，DP-L4027-OVA，DP-L4038-OVA(actA/461T雙突變體)，以及DP-L4029uvrAB-OVA接種每組10只小鼠。使用或者不用S-59處理DP-L4029uvrAB-OVA菌株(用實(shí)施例13中的方法一得到8log以上的殺死)；熱殺死的DP-L4029-OVA以及HBSS作為對(duì)照。在腫瘤移植后第三天，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種(靜脈內(nèi)100微升HBSS中的樣品)，使用的劑量在表16中給出。在腫瘤移植30天后，每組處死5只小鼠，收集肺臟。計(jì)數(shù)每個(gè)肺臟中的轉(zhuǎn)移灶。每組剩余的5只小鼠繼續(xù)監(jiān)測(cè)其存活。每個(gè)肺臟中的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目以及中值存活時(shí)間在表17中給出。在圖19A中顯示了actA-，actA-OVA，以及actA-uvrAB-OVA S-59/UVA處理和熱殺死菌株的肺臟，肺臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目在圖19B中作出，存活情況在圖19C中作出。此數(shù)據(jù)顯示S-59/UVA處理的uvrAB突變株可以作為治療性疫苗施用，可以導(dǎo)致肺臟轉(zhuǎn)移灶的顯著下降，并且與未免疫接種的、熱殺死的對(duì)照或者沒(méi)有OVA的DP-L4029相比，存活時(shí)間延長(zhǎng)。
表17在OVA肺部腫瘤模型中的小鼠治療性免疫接種
實(shí)施例16
使用表達(dá)gp70小鼠抗原的S-59滅活的利斯特氏菌株進(jìn)行治療性免疫接種
將經(jīng)過(guò)改變表達(dá)人抗原(該人抗原與本實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān))的CT26腫瘤細(xì)胞(表達(dá)AH1)，注射到Balb/c小鼠中(100μL HBSS中含有2×105個(gè)細(xì)胞，靜脈內(nèi)途徑)，建立肺臟轉(zhuǎn)移灶。單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029，DP-L4029-AH1A5，DP-L4029uvrAB-AH1A5，以及DP-L4406actA-AH1A5(actA/inlB雙突變體)用于接種每組13只小鼠。AH1A5菌株還表達(dá)OVA抗原。使用未經(jīng)處理的、熱殺死的或者S-59處理(實(shí)施例13中的第二種方法)的DP-L4029uvrAB-AH1A5菌株。腫瘤移植后4天按照表18開(kāi)始對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種(靜脈內(nèi)，100微升，HBSS)。腫瘤移植后19天，每組3只小鼠處死，收集肺臟。計(jì)數(shù)每個(gè)肺臟中的轉(zhuǎn)移灶。每組剩余的10只小鼠繼續(xù)監(jiān)測(cè)其存活。肺臟中轉(zhuǎn)移灶的結(jié)果在圖20A(肺臟照片)和20B(繪出了肺臟中的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目)中顯示，存活結(jié)果在表18中以及圖20C(ΔactA樣品)和20D(ΔactAΔuvrAB樣品)中給出。AH1A5抗原是小鼠的內(nèi)源抗原，這樣任何免疫接種效果都會(huì)打破小鼠中的免疫耐受。結(jié)果表明S-59處理的uvrAB突變株能夠打破小鼠中的耐受，使肺臟的轉(zhuǎn)移灶顯著下降，且存活延長(zhǎng)。與單次接種相比，在三天接種的治療效果有所提高(三天接種的疫苗總劑量與一天接種的總劑量相等)。
表18使用經(jīng)過(guò)改變表達(dá)AH1A5的利斯特氏菌對(duì)小鼠進(jìn)行治療性接種
實(shí)施例17
使用熒光顯微術(shù)對(duì)S-59/UVA處理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在樹(shù)突細(xì)胞中的定位進(jìn)行估計(jì)。
通過(guò)熒光顯微術(shù)對(duì)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)的攝取和分布進(jìn)行評(píng)價(jià)。樹(shù)突細(xì)胞系DC2.4在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為5×105個(gè)細(xì)胞每皿，培養(yǎng)基是RPMI完全培養(yǎng)基，即RPMI-1640(Gibco)添加10％FBS(Hyclone)，1x非必需氨基酸(Cellgro)，5×104I.U.青霉素/5×104微克鏈霉素(IrvineScientific)，2mM L-谷氨酰胺(Irvine Scientific)和1nM丙酮酸鈉(Sigma)，在37℃孵育過(guò)夜(可以對(duì)其他細(xì)胞系例如巨噬細(xì)胞J774，采用相似的處理)。穩(wěn)定生長(zhǎng)期的利斯特氏菌株(DP-L4056，DP-L4027(LLO-)和DP-L4056uvrAB)的培養(yǎng)物制備如下取一個(gè)細(xì)菌菌落接種于3毫升BHI培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)過(guò)夜。
利斯特氏菌的過(guò)夜培養(yǎng)物1∶20稀釋于新鮮的BHI培養(yǎng)基，再在30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5到0.6得到穩(wěn)定生長(zhǎng)期培養(yǎng)物。取大約1毫升的DP-L4056和DP-L4056uvrAB菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物在72℃處理3-4小時(shí)，將其殺死。融化補(bǔ)骨脂素滅活的DP-L4056和DP-L4056uvrAB利斯特氏菌株(根據(jù)實(shí)施例13的第二種方法制備)的凍存儲(chǔ)備物，在37℃復(fù)蘇1小時(shí)到穩(wěn)定期。在感染前，讀取所有利斯特氏菌制備物的OD600值，計(jì)數(shù)每個(gè)蓋玻片上的DC2.4細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算每個(gè)菌株的感染復(fù)數(shù)(MOI，每個(gè)DC 2.4細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)目)。使用新鮮的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物感染細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)為5；熱殺死的培養(yǎng)物MOI為20；S-59/UVA處理的菌株MOI為10。
將蓋玻片轉(zhuǎn)移到24孔的培養(yǎng)皿中用無(wú)青霉素/鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基漂洗3次，然后將要提供所需MOI的適當(dāng)稀釋度的利斯特氏菌菌株與細(xì)胞在無(wú)青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基中，37℃下孵育30分鐘。然后蓋玻片用沒(méi)有青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基漂洗3次，在37℃再孵育30分鐘。孵育結(jié)束時(shí)，漂洗蓋玻片，用含有50μg/ml慶大霉素的培養(yǎng)基中在37℃孵育4小時(shí)。然后用PBS漂洗蓋玻片，在3.5％甲醛/PBS中室溫固定15分鐘。固定后，蓋玻片用TBS-Tx緩沖液(25mM Tris-HClpH 8.0，150mM NaCl，0.1％Triton X-100)漂洗/透化，用1％BSA/TBS-Tx在室溫下封閉15分鐘。用兔抗利斯特氏菌O抗原的抗血清(Difco)室溫染色蓋玻片30分鐘，然后用TBS-Tx緩沖液漂洗。然后用熒光素標(biāo)記的抗兔二抗(Vector Laboratories)對(duì)樣品進(jìn)行染色，用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Molecular Probes)對(duì)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色。蓋玻片用TBS-Tx漂洗，裝到VectaShield+DAPI-hardset(VectorLaboratories)中的載玻片上，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。使載玻片干燥至少8小時(shí)，使用Nikon TE 300-U倒置顯微鏡觀察細(xì)胞。使用CCD HamamatsuC4742-95-12NR照相機(jī)照相，使用Phase 3 Imaging Systems的Image-Pro軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。
每一個(gè)視野照三張照片一張使用UV-2E/C濾光片(CHROMATechnology Corp，觀察DAPI/細(xì)胞核)；第二張使用HYQ TRITC濾光片(CHROMA Technology Corp，觀察肌動(dòng)蛋白)；第三張使用B-1A(HYQ-FITC)濾光片(CHROMA Technology Corp，觀察利斯特氏菌)。三張照片合并，以確定利斯特氏菌的染色是否與肌動(dòng)蛋白的染色位置一致。不能逃脫吞噬溶酶體的利斯特氏菌呈現(xiàn)綠色而能夠逃脫吞噬溶酶體達(dá)到胞漿中的利斯特氏菌能夠使肌動(dòng)蛋白成核，因此由于肌動(dòng)蛋白(紅色)和利斯特氏菌(綠色)位于同一位置而呈現(xiàn)黃色。為了定量確定能夠逃脫溶酶體的利斯特氏菌的百分比，先計(jì)數(shù)視野中的利斯特氏菌總數(shù)，再計(jì)數(shù)黃色細(xì)菌或者從羅達(dá)明照片(參見(jiàn)圖21A)對(duì)肌動(dòng)蛋白的存在進(jìn)行確證，從而確定呈現(xiàn)黃色的利斯特氏菌的數(shù)目。逃脫吞噬細(xì)胞溶酶體的利斯特氏菌的數(shù)目除以計(jì)數(shù)的利斯特氏菌總數(shù)，計(jì)算逃脫吞噬細(xì)胞溶酶體的利斯特氏菌的百分比，如表19中給出和圖21B中表示的。結(jié)果表明熱殺死的菌株以及S-59/UVA處理的野生型菌株與LLO-菌株的行為相似，即不能逃脫吞噬細(xì)胞溶酶體，而S-59/UVA處理的uvrAB突變體具有明顯的逃脫吞噬細(xì)胞溶酶體的能力。
表19DP-L4056(+/-S-59/UVA，熱殺死)，DP-L4027，以及DP-L4056uvrAB(+/-S-59/UVA，熱殺死)逃脫吞噬溶酶體的利斯特氏菌的百分比
實(shí)施例18
使用革蘭氏染色觀察S-59UVA處理的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌uvrAB-菌株
單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的野生型和uvrAB-菌株培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5，這時(shí)轉(zhuǎn)移50毫升的溶液到一個(gè)潔凈的搖瓶中，加入S-59，對(duì)于野生型菌株加入的濃度為2500nM，對(duì)于uvrAB-突變菌株加入的濃度為200nM。這些樣品在37℃300rpm孵育大約1小時(shí)(OD600大約1.0，大約1×109/mL)。取1毫升的樣品檢測(cè)滴度，剩余的樣品轉(zhuǎn)移到150毫米的培養(yǎng)皿中，用6J/cm2UVA(FX-1019)輻射，使兩種菌株的滅活都在8log以上。處理的菌株根據(jù)實(shí)施例13的描述冷凍儲(chǔ)存。凍存的菌株融化，在一個(gè)15毫升的試管中以1∶10的比例稀釋于BHI培養(yǎng)基至濃度為大約1-2×109個(gè)每mL。37℃300rpm孵育，在0，2，4，6，8小時(shí)以及過(guò)夜(大約18小時(shí))分別取等分試樣。樣品涂布在玻璃載玻片上(大約50微升)，在空氣中干燥。將涂片通過(guò)火焰三次，使其固定，冷卻后用Fisher Gram Stain Set(目錄編號(hào)282-407)進(jìn)行革蘭氏染色。在顯微鏡下觀察載玻片，進(jìn)行照相，負(fù)片在圖22中顯示。這清楚表明了經(jīng)過(guò)處理的修復(fù)缺陷菌株的獨(dú)特性質(zhì)，它們表現(xiàn)為鏈狀表明基因的表達(dá)，但是不能分裂所以細(xì)菌不能增殖。
實(shí)施例19
其他突變體利斯特氏菌株的構(gòu)建
制備突變體利斯特氏菌株。利斯特氏菌株來(lái)自10403S(Bishop等人，J Immunol.1392005(1987))。使用已有的方法(Camilli等人，Mol.Microbiol.8143(1993))通過(guò)SOE-PCR以及等位交換產(chǎn)生按讀碼框缺失所示基因的利斯特氏菌株。突變菌株LLO L461T(DP-L4017)在Glomski等，J.Cell.Biol.1561029(2002)中有所描述，在這里引用作為參考。actA-突變體(DP-L4029)是其噬菌體已經(jīng)去除(cured)的(噬菌體去除在Lauer等人，J.Bacteriol.1844177(2002)；和美國(guó)專利出版編號(hào)2003/0203472中有所描述)DP-L3078菌株(在Skoble等人，J.of Cell Biology，150527-537(2000)有所描述，這里將其作為整體引用作為參考)。LLO-突變體(DP-L4027)(Lauer等人，J.of Bacteriology，1844177-4186(2002))，以及LLO Δ26(DP-L4042)(Decatur等，Science 290992(2000))以前都有所描述。actA-uvrAB-菌株的構(gòu)建在未決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/446,051中描述為L(zhǎng)4029/uvrAB(參見(jiàn)例如該申請(qǐng)中的實(shí)施例7)，該申請(qǐng)于2003年2月6日提交。DP-L4029uvrAB(actA-/uvrAB-)于2003年10月3日保存于ATCC，編號(hào)PTA-5563。
構(gòu)建pKSV7-dl inlB用于在利斯特氏菌中通過(guò)等位交換刪除inlB可以通過(guò)等位交換實(shí)現(xiàn)從利斯特氏菌DP-L4029(或者其他挑選出的突變體菌株或者野生型利斯特氏菌)中刪除inlB，這在Camilli等，Mol.Microbiol.8143-147(1993)中有所描述。重疊PCR可以用于制備用于等位交換步驟的構(gòu)建體。內(nèi)化素B基因的來(lái)源是由GenBank登錄號(hào)AL591975(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株EGD，完整基因組，片段3/12；inlB基因區(qū)域核苷酸97008-98963)列出的序列和/或登錄號(hào)NC_003210(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株EGD，完整基因組，；inlB基因區(qū)域核苷酸457008-458963)列出的序列。兩個(gè)序列在這里整體引用作為參考。
在初級(jí)PCR反應(yīng)中，用以下的模板和引物將利斯特氏菌inlB基因5′端和3′端上游和下游大約1000bp的序列分別擴(kuò)增出來(lái)。
模板DP-L4056或者DP-L4029基因組DNA
引物對(duì)1(用于擴(kuò)增出inlB 5′端上游的區(qū)域)
Lm-96031F5′-GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG(SEQ ID NO22)(Tm72℃)
Lm-(3′inlB-R+)97020R5′-AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCCTCTCCTTGATTCTAGTTAT(SEQ ID NO23)(Tm114℃)
(劃線的序列與InlB羧基端下游的區(qū)域互補(bǔ)。)
(擴(kuò)增子大小1007bp)
引物對(duì)2(用于擴(kuò)增出inlB 3′端下游的區(qū)域)
Lm-(5′inlB-F+)98911F
5′-CAAGGAGAGGATAGTTAACTGAAAAAGACCTAAAAAAGAAGGC(SEQ ID NO24)(Tm118℃)(劃線的序列與InlB氨基端上游的區(qū)域互補(bǔ)。)
Lm-99970R5′-TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC(SEQ ID NO25)(Tm74℃)
(擴(kuò)增子大小1074bp)
在二級(jí)PCR反應(yīng)中，初級(jí)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增子通過(guò)重疊PCR融合在一起，重疊PCR利用了引物對(duì)1中的反向引物和引物對(duì)2中的正向引物之間的互補(bǔ)性。結(jié)果是inlB編碼序列97021-98910核苷酸＝1889bps被精確刪除。在二級(jí)PCR反應(yīng)中，使用以下的模板和引物
模板純凈的初級(jí)PCR反應(yīng)產(chǎn)物
引物對(duì)
Lm-96043F5′-GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG(SEQ ID NO26)(Tm74℃)
Lm-99964R5′-GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC(SEQ ID NO27)(Tm74℃)
(擴(kuò)增子大小2033bp)
完成構(gòu)建過(guò)程的實(shí)驗(yàn)方案如下
初級(jí)PCR反應(yīng)(三個(gè)溫度循環(huán))使用Vent DNA聚合酶(NEB)以及10微升漂洗后的30℃的利斯特氏菌DP-L4056或DP-L4029過(guò)夜培養(yǎng)物進(jìn)行。利斯特氏菌擴(kuò)增子的預(yù)期大小(1007bps和1074bps)，通過(guò)1％的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。初級(jí)PCR反應(yīng)使用凝膠純化，用GeneClean(BIO 101)洗脫DNA。
二級(jí)PCR反應(yīng)使用大致等量的每個(gè)初級(jí)PCR產(chǎn)物作為模板(約5微升)。二級(jí)PCR反應(yīng)的利斯特氏菌擴(kuò)增子的預(yù)期大小由1％瓊脂糖凝膠確證(2033bp)。用Taq聚合酶在利斯特氏菌dl inlB擴(kuò)增子的3′端加上腺嘌呤核苷酸殘基。
然后將利斯特氏菌dl inlB擴(kuò)增子插入到pCR2.1-TOPO載體中。使用XhoI和KpnI對(duì)pCR2.1-TOPO-dl inlB質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切，凝膠純化2123bp的片段。KpnI/XhoI 2123bp片段插入經(jīng)KpnI和XhoI酶切、CIAP處理的pKSV7載體中(pKSV7-dlinlB)。然后確認(rèn)pKSV7-dlinlB中dl inlB序列的保真性。使用pKSV7-dl inlB質(zhì)粒，通過(guò)等位交換在所需的利斯特氏菌株中刪除inlB基因。
抗原表達(dá)菌株的構(gòu)建。制備表達(dá)截短形式的模型抗原卵清蛋白(OVA)的突變利斯特氏菌株，制備來(lái)自小鼠結(jié)腸癌(CT26)的免疫優(yōu)勢(shì)表位，稱為AH1(SPSYVYHQF；SEQ ID NO20)，以及其改變后的表位AH1-A5(SPSYAYHQF；SEQ ID NO21；Slansky等，Immunity，13529-538(2000))。使用pPL2整合載體(Lauer等，J.Bacteriol.1844177(2002)；美國(guó)專利出版編號(hào)2003/0203472)，得到OVA和AH1-A5/OVA重組利斯特氏菌株，菌株中含有一個(gè)拷貝整合到利斯特氏菌基因組的一個(gè)無(wú)害的位置上。
表達(dá)OVA的利斯特氏菌(DP-L4056)的構(gòu)建。首先制備整合載體pPL2/LLO-OVA，該載體中含有由刪除了溶血素的LLO與截短的OVA融合后組成的抗原表達(dá)盒。將pPL2/LLO-OVA引入噬菌體去除(cured)的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4056的PSA(Phage From ScottA)附著位置tRNAArg-attBB′中。
使用以下模板和引物用PCR擴(kuò)增刪除了溶血素的LLO
來(lái)源DP-L4056基因組DNA
引物
正向(KpnI-LLO核苷酸1257-1276)
5′-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQ ID NO28)(TmLLO-特異52℃.全長(zhǎng)80℃)
反向(BamHI-XhoI-LLO核苷酸2811-2792)
5′-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC(SEQ ID NO29)(TmLLO-特異52℃。全長(zhǎng)102℃)
使用以下模板和引物用PCR擴(kuò)增出截短的OVA
來(lái)源pDP3616質(zhì)粒DNA，來(lái)自DP-E 3616大腸桿菌(Higgins等，Mol.Molbiol.311631-1641(1999)).
引物
正向(XhoI-NcoI OVA cDNA 核苷酸174-186)
5′-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC(SEQ ID NO30)(Tm OVA-特異60℃.全長(zhǎng)88℃.)
反向(XhoI-NotI-HindIII)
5′-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT
(SEQ ID NO31)(Tm全長(zhǎng)82℃)
完成構(gòu)建過(guò)程的一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案包括首先使用KpnI和BamHI酶切LLO擴(kuò)增子，將KpnI/BamHI載體插入到pPL2載體中(pPL2-LLO)。然后用XhoI和NotI酶切OVA擴(kuò)增子，將其插入XhoI/NotI酶切的pPL2-LLO中(注意pPL2載體不含有任何XhoI位點(diǎn)；pDP-3616含有一個(gè)XhoI位點(diǎn)，這在設(shè)計(jì)OVA反向引物時(shí)已經(jīng)利用上了)。通過(guò)限制性酶切分析(KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI)和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建體pPL2/LLO-OVA。質(zhì)粒pPL2/LLO-OVA通過(guò)轉(zhuǎn)化引入到大腸桿菌中，然后通過(guò)接合引入并且整合到利斯特氏菌(DP L4056)中，完全按照Lauer等所描述的(或者引入另一個(gè)所需的利斯特氏菌菌株中，例如inlB突變株或者inlB-actA-雙突變株)。
也可以在實(shí)施例8中的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)(標(biāo)題為“基于自生的微生物的疫苗組合物”，美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/511,869，2003年10月15日提交)中找到關(guān)于插入表達(dá)OVA的抗原表達(dá)盒的描述。
表達(dá)AH1/OVA或者AH1-A5/OVA的利斯特氏菌菌株的構(gòu)建。為了制備表達(dá)AH1/OVA或者AH1-A5/OVA抗原序列的利斯特氏菌，首先從寡聚核苷酸制備編碼抗原的插入物，然后將其連接到載體pPL2-LLO-OVA(如前述制備)中。
在制備AH1或者AH1-A5插入物時(shí)使用了以下的寡聚核苷酸AH1表位插入物(ClaI-PstI相容末端)
上鏈寡聚核苷酸(AH1 Top)
5′-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA(SEQ ID NO32)
下鏈寡聚核苷酸(AH1 Bottom)
5′-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT(SEQ ID NO33)
AH1-A5表位插入物(ClaI-AvaII相容末端)
AH1-A5表位的序列是SPSYAYHQF(SEQ ID NO21)
(5′-AGT CCA AGT TAT GCA TAT CAT CAA TTT-3′(SEQ ID NO34)).
上5′-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC(SEQ ID NO35)
下5′-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT(SEQ ID NO36)
對(duì)于給定表位的寡聚核苷酸對(duì)按照等摩爾的比例混和在一起，95℃加熱5分鐘。然后使寡聚核苷酸混合物緩慢冷卻。然后將退火的寡聚核苷酸對(duì)以200∶1的摩爾比與使用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切的pPL2-LLO/OVA質(zhì)粒連接。可以通過(guò)限制性酶切和/或測(cè)序?qū)π聵?gòu)建體進(jìn)行確證。
然后可以通過(guò)轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒引入到大腸桿菌中，再通過(guò)接合引入并整合進(jìn)入利斯特氏菌(DP-L4056)中，完全按照Lauer等人的描述。(或者引入另一個(gè)所需的利斯特氏菌菌株中，例如inlB突變株或者inlB-actA-雙突變株)。
實(shí)施例20
接種了單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)
進(jìn)行一系列研究評(píng)價(jià)免疫接種的小鼠在體內(nèi)裂解抗原特異的靶細(xì)胞的能力。在第一項(xiàng)研究中，使用單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029(actA-)，表達(dá)AH1/A5的DP-L4029以及表達(dá)AH1/A5的DP-L4029uvrAB-，通過(guò)靜脈內(nèi)(IV)接種Balb/c小鼠。還根據(jù)實(shí)施例13中的第二種方法，使用S-59UVA處理表達(dá)AH1/A5的菌株。表達(dá)AH1-A5的利斯特氏菌構(gòu)建體還表達(dá)LLO和OVA。第0天對(duì)所有的組進(jìn)行接種，對(duì)S-59處理的菌株在第1和第2天進(jìn)行補(bǔ)充接種，接種劑量(0.1 LD50)在表20中指明。對(duì)于每個(gè)菌株和對(duì)照，接種兩組各三0只小鼠。收集20只原初Balb/c小鼠的脾臟，用RPMI 1640培養(yǎng)基制備靶細(xì)胞群。解離細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞。計(jì)數(shù)白細(xì)胞，將其均分為等量的四群。每一組使用一種特異的肽脈沖，或者是靶肽AH1(SPSYVYHQF(SEQ ID NO20)，來(lái)自SynPep，Dublin，CA)，或者是靶肽AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO21)，SynPep)，或兩組對(duì)照群(β-gal，TPHPARIGL(SEQ ID NO37)，濃度為0.5μg/mL，37℃處理90分鐘。然后用培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞三次，PBS+0.1％BSA漂洗兩次。細(xì)胞用溫?zé)岬腜BS+0.1％BSA(10毫升或者更少)重懸至1×107每毫升，用于羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE，Molecular Probes，Eugene，OR)的標(biāo)記。在靶細(xì)胞懸液中加入1.25微升的5mM CFSE儲(chǔ)液，旋渦振蕩混合樣品。在對(duì)照細(xì)胞懸液中，加入10倍稀釋的CFSE儲(chǔ)液，旋渦振蕩混合樣品。細(xì)胞在37℃孵育10分鐘。加入大量(大于40毫升)冰冷的PBS終止染色。細(xì)胞在室溫下用PBS漂洗兩次，然后重懸并且計(jì)數(shù)。每細(xì)胞懸液稀釋至50×106每毫升，第6天，每一種細(xì)胞群混勻后取100微升通過(guò)尾靜脈注射原初或者已接受接種的小鼠。對(duì)于每一種菌株或者對(duì)照，每組3只小鼠注射β-gal和AH-1，或者β-gal和AH1-A5。12-24小時(shí)后，收集脾臟，用流式細(xì)胞術(shù)分析總共5×106個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)高(靶)和低(對(duì)照)熒光峰，用二者的比例得到相對(duì)于HBSS對(duì)照細(xì)胞群的靶細(xì)胞裂解百分比。這些結(jié)果在表20中以及圖23A中給出。(在本實(shí)施例中的表格顯示了三只小鼠的平均值，而圖是所指樣品的代表性柱狀圖，使用的是單只小鼠(不一定是同一只小鼠)。)使用S-59處理的uvrAB-突變株接種后對(duì)AH1顯示了略好的應(yīng)答，而與S-59處理的actA-菌株相比，S-59處理的uvrAB-突變株對(duì)AH1-A5的應(yīng)答明顯升高。
表20使用S-59處理的菌株在第0天以及第2和第3天接種Balb/c小鼠，小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒性
在第14天對(duì)所有的組增加免疫一次，對(duì)S-59處理的菌株在第15和16天增加免疫，重復(fù)本研究。標(biāo)記的靶細(xì)胞在第20天注射。結(jié)果在表21中和圖23B中顯示。對(duì)S-59處理的uvrAB-突變株的應(yīng)答可以通過(guò)增強(qiáng)免疫而顯著提高，而對(duì)S-59處理的actA-菌株則不是這樣。
表21使用S-59處理的菌株在第0、14天以及第2、3和15、16天免疫接種Balb/c小鼠，小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒性
使用actA-、表達(dá)OVA的actA-以及表達(dá)OVA的actA-uvrAB-進(jìn)行相似的研究，對(duì)于表達(dá)OVA的菌株使用或者不用S-59處理。本研究使用C57B1/6小鼠。在第0天對(duì)每組6只小鼠進(jìn)行免疫接種(對(duì)于S-59處理的菌株，還在第1和2天進(jìn)行接種)，在第6天每組中取3只注射標(biāo)記的靶細(xì)胞。剩余的小鼠在第14天接種(對(duì)于S-59處理的菌株還在15和16天接種)并在第20天注射標(biāo)記的靶細(xì)胞。在本研究中，原初靶脾臟細(xì)胞用β-gal(低CFSE)或者SL8(高CFSE)進(jìn)行脈沖。結(jié)果在表22和圖23C中顯示。同樣，使用加強(qiáng)免疫顯著提高了對(duì)S-59處理的uvrAB-突變株的應(yīng)答。
表22根據(jù)表中所示免疫接種Balb/c小鼠的體內(nèi)細(xì)胞毒性
實(shí)施例21
對(duì)uvrAB刪除或者沒(méi)有uvrAB刪除的炭疽芽孢桿菌進(jìn)行S-59/UVA處理
使用實(shí)施例7-9中以及Camilli等人，Molecular Micro.，8143-147(1993)中詳細(xì)描述的等位交換方法，改變炭疽芽孢桿菌Sterne菌株。該菌株的毒力被衰減(pXO1+，pXO2-)。
鑒定出了炭疽芽孢桿菌的uvrAB基因(GenBank登錄號(hào)AE017040，炭疽芽孢桿菌Ames菌株，完整基因組共18部分中的第17部分，uvrAB的編碼序列核苷酸212613-217471)，使用拼接重疊延伸(SOE)PCR以及以下描述的方法構(gòu)建了基于pKSV7、含有uvrAB基因刪除的質(zhì)粒(pKSV7-dl uvrAB)
初級(jí)PCR反應(yīng)將炭疽芽孢桿菌uvrAB基因5′端和3′端上游和下游大約1000bp的序列分別擴(kuò)增出來(lái)。
模板炭疽芽孢桿菌Sterne基因組DNA
引物對(duì)1uvrB基因5′端上游1000bp的擴(kuò)增。
(擴(kuò)增子大小1029bp)
Ba-225099F5′-CTGTGCTTTGCGAATGGAAAGAAGC(SEQ ID NO38)(Tm74℃)
Ba-(3′uvrA-R+)226109R
5′-GTTTTCATTCATACACTTAGACAAGCGTTGGCTTTTGCACTTC(SEQ ID NO39)(Tm 120℃)(劃線的序列與uvrA羧基端下游的區(qū)域互補(bǔ)。)或者Ba-226109R5′-GACAAGCGTTGGCTTTTGCACTTC(SEQ ID NO40)(Tm72℃).
引物對(duì)2uvrA 3′端下游區(qū)域的擴(kuò)增。
(擴(kuò)增子大小990bp)
Ba-(3′uvrA-R+)230779F5′-CAAAAGCCAACGCTTGTCTAAGTGTATGAATGAAAACCGAGTGG(SEQ ID NO41)(Tm126℃)(劃線的序列與uvrB氨基端上游的區(qū)域互補(bǔ)。)
或者
Ba-230779F5′-AAGTGTATGAATGAAAACCGAGTGG(SEQ ID NO42)(Tm70℃)
Ba-231769R5′-CATATAAAGGTTCCACAATTGCCTTTTC(SEQ ID NO43)(Tm76℃)
二級(jí)PCR反應(yīng)初級(jí)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增子通過(guò)SOE PCR融合在一起，SOE PCR利用了引物對(duì)1中的反向引物和引物對(duì)2中的正向引物之間的互補(bǔ)性。結(jié)果是uvrAB編碼序列226110-230779核苷酸＝4670bps被精確刪除。
模板純凈的初級(jí)PCR反應(yīng)產(chǎn)物
引物對(duì)(擴(kuò)增子大小1973bp)
Ba-225118F5′-GAAGCAGAAATGAAGCCAATACTCAATC(SEQ ID NO44)(Tm78℃)
Ba-231761R5′-GGTTCCACAATTGCCTTTTCAATAATC(SEQ ID NO45)(Tm74℃)
構(gòu)建初級(jí)PCR反應(yīng)(三個(gè)溫度循環(huán))使用Vent DNA聚合酶(NEB)以及Sterne菌株基因組DNA。用或者不用拼接重疊延伸(SOE)中使用的引物，進(jìn)行四個(gè)初級(jí)PCR反應(yīng)。(如果含有Ba-(3′uvrA-R+)226109R或Ba-(3′uvrA-R+)226109R引物的反應(yīng)不能產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增子產(chǎn)物，則將這些引物用于通過(guò)Ba-225099F/Ba-226109R或者Ba-230779F/Ba-231769R引物對(duì)擴(kuò)增出的擴(kuò)增子。)通過(guò)1％的瓊脂糖凝膠確證炭疽芽孢桿菌初級(jí)擴(kuò)增子的預(yù)期大小(1029bps和990bps)。初級(jí)PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用S6層析柱(BioRad)或者GeneClean(BIO 101)純化。
二級(jí)PCR反應(yīng)使用大致等量的每個(gè)初級(jí)PCR產(chǎn)物作為模板(約5微升)。二級(jí)PCR反應(yīng)的利斯特氏菌擴(kuò)增子的預(yù)期大小(1973bps)由1％瓊脂糖凝膠確證。
炭疽桿菌dl uvrAB擴(kuò)增子插入到pCR2.1-Blunt II-TOPO載體中。使用KpnI和PstI酶切質(zhì)粒pCR2.1-TOPO-dl uvrAB，凝膠純化2033bp的片段。將KpnI/PstI 2033bp的片段插入到用KpnI和PstI酶切，CIAP處理的pKSV7載體中(pKSV7-dl uvrAB)。對(duì)pKSV7-dl uvrAB中dl uvrAB序列的保真性進(jìn)行確證。
使用pKSV7-dl uvrAB質(zhì)粒，通過(guò)等位交換從炭疽芽孢桿菌Sterne中刪除uvrAB基因。通過(guò)電穿孔將pKSV7-dl uvrAB質(zhì)粒引入炭疽芽孢桿菌Sterne菌株中，篩選氯霉素抗性。使用一個(gè)冷凍步驟進(jìn)行電穿孔，顯著提高電穿孔的機(jī)率。炭疽芽孢桿菌培養(yǎng)物在添加0.5％甘油的3毫升BHI培養(yǎng)基中37攝氏度振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將0.5毫升的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到添加0.5％甘油的50毫升BHI培養(yǎng)基中(OD600＝0.1)，在500毫升的搖瓶中。37攝氏度下200rpm孵育樣品。(或者0.1-0.2毫升培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到25毫升BHI 0.5％甘油中，用250毫升搖瓶)。在OD600＝0.6-0.8(大約1小時(shí)45分鐘)，用500毫升一次性的無(wú)菌過(guò)濾裝置收獲細(xì)菌。細(xì)菌用25毫升的冷電穿孔緩沖液(1mM HEPES 10％甘油pH 7.4)漂洗三次。細(xì)胞用1/20原來(lái)培養(yǎng)物體積的緩沖液重懸(50毫升培養(yǎng)物用2.45毫升電穿孔緩沖液重懸)，置冰上備用。取1微克(1到5微升小提質(zhì)粒的產(chǎn)物)的“非常純凈的”未甲基化的質(zhì)粒DNA加入到0.2毫升細(xì)胞懸液中，置于0.2厘米具蓋電穿孔小杯中(對(duì)照＝?jīng)]有DNA)。然后將樣品在冰上放置15分鐘。然后在25μFD，200Ω，2.5kV(或者將0.4毫升細(xì)胞置于0.4厘米的小杯中400Ω)脈沖。時(shí)間常數(shù)大約為4-5毫秒。在脈沖后立即加入1毫升的BGGM(含有10％甘油、0.4％葡萄糖和10mM氯化鎂的BHI)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的聚丙烯試管中，在37℃下孵育1.5小時(shí)，振蕩。沉淀細(xì)胞，用200微升的BGGM重懸，涂布于選擇培養(yǎng)基上。
41℃下pKSV7-dl uvrAB整合進(jìn)入炭疽芽孢桿菌染色體中。在允許溫度下，使pKSV7-dl uvrAB切下并且去除，產(chǎn)生氯霉素敏感的菌落。設(shè)計(jì)PCR引物來(lái)檢測(cè)染色體上的刪除。20％的氯霉素敏感菌落在炭疽芽孢桿菌染色體中帶有缺失。對(duì)uvrAB-菌株進(jìn)行PCR分析，表明其保留了pXO1毒力質(zhì)粒。
兩個(gè)uvrAB-克隆(克隆8和克隆32A)使用S-59處理，同時(shí)處理親本株，將菌株接種于BHI中在37℃下300rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.3，這時(shí)將50毫升的菌液轉(zhuǎn)移到一個(gè)潔凈的搖瓶中，根據(jù)表23中所示的濃度加入S-59。這些樣品在37℃下300rpm劇烈振蕩大約1小時(shí)(OD600大約1.0，大約1×109/mL)。取出1毫升測(cè)量滴度，剩余的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到150毫米的培養(yǎng)皿中，在6J/cm2(FX-1019)UVA的劑量下輻射，與親本株相比，產(chǎn)生6log的滴度下降，如下面表23和圖24中所示。這證明炭疽芽孢桿菌對(duì)于補(bǔ)骨脂素處理的敏感性與在單核細(xì)胞增生利斯特氏菌uvrAB-菌株中觀察到的敏感性相似。
表23使用補(bǔ)骨脂素S-59UVA處理對(duì)炭疽芽孢桿菌Sterne菌株和uvrAB-突變株的衰減
實(shí)施例22
本發(fā)明的疫苗在人癌癥的體內(nèi)治療中的用途
作為治療或者預(yù)防人癌癥的一個(gè)實(shí)例，向個(gè)體施用疫苗，該疫苗包含通過(guò)微生物感染而荷載并被活化的抗原呈遞細(xì)胞，該微生物被改變使其增殖受到衰減，其中的微生物基因表達(dá)幾乎未受影響?？梢愿鶕?jù)實(shí)施例4和5中的實(shí)驗(yàn)方案制備微生物，其中通過(guò)使用例如實(shí)施例8中描述的pPL2整合載體或者其任何修飾產(chǎn)物，或者使用任何對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)人員熟知的方法將任何所需的編碼人腫瘤抗原的原核表達(dá)盒插入到微生物中。使用例如這里概述的方法對(duì)抗原呈遞細(xì)胞(APCs)進(jìn)行荷載和活化。
產(chǎn)生的APC疫苗可以以其天然未純化的形式配制，或者優(yōu)選地，以純化的形式配制。它們可以制備為液體懸液。此外，它們可以與添加劑例如防腐劑(例如柳硫汞、2-苯氧基乙醇)、穩(wěn)定劑(例如乳糖、谷氨酸單鈉鹽)、佐劑(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、細(xì)胞因子)、抗生素(例如新霉素、鏈霉素)或者其他物質(zhì)一起配制?？梢詫⒅苿┲貞一蛘呦♂層谟谶m宜的稀釋液中如無(wú)菌水、鹽水、等滲緩沖鹽溶液(例如磷酸鹽緩沖pH至生理pH)或者其他適宜的稀釋液。
可以通過(guò)多種途徑施用疫苗，包括口、鼻、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜、肌內(nèi)、淋巴內(nèi)和皮下途徑，以及與給定的惡性或者傳染性疾病有關(guān)的任何途徑。向個(gè)體施用有效量的疫苗用于治療。對(duì)于治療性治療，有效量是指能夠產(chǎn)生所需免疫應(yīng)答的劑量，其中的免疫應(yīng)答或者減緩了目標(biāo)腫瘤的生長(zhǎng)、減小了腫瘤大小或者優(yōu)選地完全根除腫瘤。疫苗的施用可以在適當(dāng)?shù)拈g隔重復(fù)進(jìn)行，也可以在接受接種的個(gè)體的多個(gè)不同的位置同時(shí)進(jìn)行。對(duì)于預(yù)防性治療，有效量是指產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的劑量，使個(gè)體發(fā)生癌癥的可能性顯著降低。免疫程序可以包含單劑、或者在適宜的間隔重復(fù)進(jìn)行直至產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
對(duì)于個(gè)體的治療性治療可以從一個(gè)已經(jīng)被診斷為患有癌癥的個(gè)體開(kāi)始，作為一種起始治療，或者可以與其他治療聯(lián)合使用。例如，已經(jīng)通過(guò)外科手術(shù)去掉腫瘤的個(gè)體或者已經(jīng)使用放療或化療進(jìn)行治療的個(gè)體可以使用疫苗治療，以減少或者去除個(gè)體中任何殘留的腫瘤，或者降低癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于個(gè)體的預(yù)防性治療可以從由于環(huán)境條件或者由于遺傳誘因使患有某種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)升高的個(gè)體開(kāi)始。
實(shí)施例23
基于減毒利斯特氏菌株的重組腫瘤抗原分泌疫苗的產(chǎn)生
將雞卵清蛋白(OVA)與截短形式的利斯特氏菌溶胞素(LLO)融合以促進(jìn)抗原分泌以及MHC I型加工過(guò)程在研究中作為模型抗原以評(píng)價(jià)挑選出的減毒利斯特氏菌菌株的免疫原性。使用專有的pPL2整合載體，將腫瘤抗原表達(dá)盒位點(diǎn)特異地插入到一組減毒利斯特氏菌株染色體上的無(wú)害位點(diǎn)中。重組的利斯特氏菌菌株表達(dá)和分泌預(yù)測(cè)的經(jīng)過(guò)改變的LLO-OVA融合蛋白，這由Western印跡分析確定(結(jié)果未顯示)。這些重組子中的每一個(gè)在液體培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)以及細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)與其親本都沒(méi)有差異。而且，重組的表達(dá)OVA的菌株，其靜脈內(nèi)注射的IVLD50與未改變的親本菌株相比，變化在兩倍以內(nèi)(表24)。
表24所選擇的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株
整合載體促進(jìn)多重組利斯特氏菌疫苗候選物的快速產(chǎn)生。可以同時(shí)將單一構(gòu)建體配成任何數(shù)目的獨(dú)特遺傳背景以快速產(chǎn)生同源菌株。
實(shí)施例24
補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)的DNA交聯(lián)產(chǎn)生不能存活但是代謝活躍的利斯特氏菌。
為了保證基于利斯特氏菌的離體抗原傳輸平臺(tái)的安全性，除了使用遺傳衰減的利斯特氏菌以外，發(fā)明者還對(duì)利斯特氏菌株進(jìn)行改造，使其可以被補(bǔ)骨脂素的處理完全滅活，而仍然代謝活躍，這樣就保留了其感染細(xì)胞、逃脫吞噬細(xì)胞溶酶體以及促進(jìn)編碼抗原通過(guò)I類(lèi)途徑呈遞的能力。改造后的利斯特氏菌株對(duì)補(bǔ)骨脂素的滅活極為敏感，補(bǔ)骨脂素是一組化合物，在使用UVA照射后，它們?cè)诩?xì)菌的基因組中形成不可逆的交聯(lián)，這樣細(xì)菌不能增殖。不能修復(fù)補(bǔ)骨脂素介導(dǎo)的DNA損傷的利斯特氏菌突變株通過(guò)刪除紫外線抗性(uvr)AB基因(uvrAB)產(chǎn)生，uvrAB對(duì)于利斯特氏菌和其他細(xì)菌的核苷酸切除修復(fù)是必需的(Sancar等，Ann.Rev.Biochem.，5729-67(1988))。補(bǔ)骨脂素S-59是在被稱為Helinx的DNA交聯(lián)技術(shù)(Lin，L.，Psoralenphotochemical treatment of platelets，Science and Medicine，1998；Hei等人，Transfusion，39239-48(1999))中使用的眾多Cerus化合物中的一種。在使利斯特氏菌uvrAB刪除突變株滅活到檢測(cè)限度以下的補(bǔ)骨脂素濃度下，親本未突變菌株的DNA修復(fù)機(jī)制保持完好，它對(duì)UVA光滅活的敏感性要低4個(gè)log以上(圖25B)。S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB保持了其線粒體活性(這由MTT檢測(cè)確定)并且保持了它們表達(dá)它們整個(gè)基因組成分的能力(這由35S甲硫氨酸標(biāo)記的脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)確定)(圖26和圖10)。S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB連續(xù)表達(dá)它們基因組的全部成分，而滅活的親本株不能。滅活親本株的表達(dá)水平顯著減弱，表明用完全滅活所需的S-59濃度的S-59/UVA處理，顯著降低了利斯特氏菌基因產(chǎn)物的表達(dá)，包括編碼的腫瘤抗原表達(dá)也可能降低。
實(shí)施例25
不能存活的利斯特氏菌uvrAB菌株保留了感染DC和逃脫吞噬溶酶體的能力。
除了保存代謝能力，重要的是證明S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB菌株在感染樹(shù)突細(xì)胞(DC)后使抗原有效荷載進(jìn)入MHC I類(lèi)途徑。發(fā)明者現(xiàn)在已經(jīng)證明使用利斯特氏菌突變株(DP-L4027)(由于編碼LLO的hly基因的刪除，該菌株不能逃脫吞噬溶酶體)感染DC，已經(jīng)不能在MHC I類(lèi)分子的存在下呈遞抗原。
為了證明利斯特氏菌uvrAB感染的DC逃脫吞噬溶酶體，發(fā)明者利用了細(xì)胞質(zhì)中的利斯特氏菌被宿主細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白絲，即所謂的“肌動(dòng)蛋白云”包圍的事實(shí)，“肌動(dòng)蛋白云”可以通過(guò)熒光顯微術(shù)看到。在利斯特氏菌表面的肌動(dòng)蛋白聚合由細(xì)菌的ActA蛋白以及其他的宿主細(xì)胞因子介導(dǎo)。使用野生型利斯特氏菌、S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB、以及利斯特氏菌ΔLLO(DP-L4027)感染小鼠的DC細(xì)胞系DC2.4，感染復(fù)數(shù)(MOI)為1，37℃感染30分鐘。小心漂洗幾次將細(xì)胞外的細(xì)菌除去，將DC在37℃下繼續(xù)孵育5小時(shí)，加入慶大霉素防止細(xì)胞外細(xì)菌的生長(zhǎng)。使用野生型利斯特氏菌或者完全滅活的利斯特氏菌uvrAB感染的DC2.4細(xì)胞，顯示典型的肌動(dòng)蛋白云或者肌動(dòng)蛋白彗狀尾，這是利斯特氏菌位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的典型特點(diǎn)(圖27)。但是，在感染了利斯特氏菌LLO缺失突變體的DC2.4細(xì)胞中，不能看到肌動(dòng)蛋白和利斯特氏菌共定位，表明細(xì)菌不能逃脫吞噬溶酶體。這一結(jié)果證明這些DNA修復(fù)突變株保留了逃脫吞噬溶酶體、并且進(jìn)入到被感染細(xì)胞的胞漿中的能力，在胞漿中抗原可以被分泌，這是通過(guò)MHC I類(lèi)途徑進(jìn)行直接抗原呈遞所需的步驟。還請(qǐng)參見(jiàn)上面的實(shí)施例17以及圖21。
實(shí)施例26
不能存活的利斯特氏菌uvrAB有效荷載抗原進(jìn)入被感染樹(shù)突細(xì)胞(DC)的MHC I類(lèi)途徑
由于在感染細(xì)胞內(nèi)，S-59補(bǔ)骨脂素滅活的利斯特氏菌uvrAB菌株具有逃脫吞噬溶酶體的獨(dú)特能力，位于胞漿的利斯特氏菌分泌的基因產(chǎn)物被加工并且通過(guò)MHC I類(lèi)途徑呈遞。為了檢測(cè)S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB荷載抗原進(jìn)入DC細(xì)胞的MHC I類(lèi)途徑中的能力，使用表達(dá)OVA的利斯特氏菌株L4029uvrAB OVA感染DC2.4細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為1，利斯特氏菌株L4029uvrAB OVA使用不同濃度的S-59滅活。親本利斯特OVA菌株以及熱殺死的利斯特uvrAB OVA菌株作為對(duì)照。利斯特氏菌被胞吞之后，OVA肽被DC2.4細(xì)胞在I類(lèi)分子上的呈遞，通過(guò)與B3Z細(xì)胞共同孵育進(jìn)行測(cè)量。B3Z細(xì)胞是可被LacZ誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞雜交瘤，它對(duì)于小鼠KbI類(lèi)分子上具有的OVA257-264(SL8)表位是特異的(Sanderson，Int.Immunol.，6369-76(1994))。SL8向B3Z細(xì)胞的I類(lèi)限制呈遞導(dǎo)致β-gal被B3Z誘導(dǎo)合成。可以通過(guò)生色底物CPRG的水解來(lái)測(cè)量產(chǎn)生的β-gal的量，這指示了在抗原呈遞細(xì)胞表面的SL8/Kb復(fù)合物的量。如圖9A和9B所示，S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB OVA菌株，而非其來(lái)源的親本株，保持了荷載抗原進(jìn)入MHC I類(lèi)途徑中的能力，這與其增殖的能力無(wú)關(guān)。(這與實(shí)施例11中描述的數(shù)據(jù)相同)。即使使用70-100nM的S-59進(jìn)行完全滅活，仍然保留了90％以上的B3Z活化。相反，DNA修復(fù)保持完好的親本利斯特氏菌OVA菌株，在使用較高濃度的S-59滅活時(shí)，喪失了其活化B3Z T細(xì)胞雜交瘤的能力。與利斯特氏菌uvrAB OVA菌株相反，B3Z的活化以及親本利斯特氏菌OVA菌株在BHI瓊脂平板上形成菌落的能力是緊密相關(guān)的，提示只有能夠存活的利斯特氏菌OVA才能感染DC2.4細(xì)胞并且荷載抗原進(jìn)入MHC I類(lèi)途徑中。另外，熱殺死的利斯特氏菌uvrAB OVA不能使B3Z活化。該結(jié)果證明，使用S-59/UVA滅活、經(jīng)過(guò)改變抑制其修復(fù)由補(bǔ)骨脂素介導(dǎo)DNA損傷的能力的利斯特氏菌，利斯特氏菌荷載抗原進(jìn)入MHC I類(lèi)途徑中的能力可以與對(duì)于增殖的需要無(wú)關(guān)。
為了檢測(cè)利斯特氏菌uvrAB OVA荷載抗原進(jìn)入初級(jí)DC細(xì)胞MHC I類(lèi)途徑中的能力，使用完全滅活的S-59/UVA處理的利斯特氏菌uvrABOVA感染未成熟的小鼠BM-DC細(xì)胞?？纱婊畹睦固厥暇鷘vrAB OVA，親本株以及L4027株作為對(duì)照。如圖28中所示，感染表達(dá)OVA的菌株但不是親本株的BM-DC，在體外刺激B3Z細(xì)胞。在活的和不能存活的S-59/UVA處理的利斯特氏菌uvrAB突變株(L4029uvrAB OVA)之間未觀察到顯著區(qū)別，這提示在細(xì)菌逃脫吞噬溶酶體進(jìn)入胞漿以后，初級(jí)DC的MHC I類(lèi)分子被有效地荷載了來(lái)自利斯特氏菌的肽，盡管利斯特氏菌uvrAB株無(wú)增殖能力。重要的是，熱殺死滅活的利斯特氏菌actAOVA不能產(chǎn)生任何明顯的OVA肽在MHC I類(lèi)途徑中的呈遞，這提示DC細(xì)胞與熱殺死的細(xì)菌共同孵育不會(huì)使MHC I類(lèi)分子出現(xiàn)任何明顯的抗原荷載。
實(shí)施例27
利斯特氏菌直接感染并且活化人DC細(xì)胞
為了開(kāi)發(fā)出有效的抗原傳輸平臺(tái)，廣泛認(rèn)為除了有效地將抗原傳輸進(jìn)入MHC I類(lèi)途徑中以外，還需要DC的活化/成熟。原位的未成熟DC細(xì)胞位于外圍組織中，在那里它們不斷地?cái)z取并且加工抗原，但是只有遇到了一種活化刺激，例如由細(xì)菌提供的活化刺激，才使活化/成熟過(guò)程開(kāi)始，引起化學(xué)因子受體的調(diào)節(jié)和DC細(xì)胞遷移到流入淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)域。我們分析了野生型利斯特氏菌(L4056)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞衍生的DC細(xì)胞表型成熟和產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。如圖29所示，人未成熟的DC遇到利斯特氏菌使活化標(biāo)記CD86和HLA-DR上調(diào)(圖29A)，也使成熟標(biāo)記CD83上調(diào)(圖29B)。此外，人未成熟DC細(xì)胞與利斯特氏菌接觸，提高了它們的免疫刺激能力，這可以由它們分泌高水平促炎細(xì)胞因子(例如IL-12p70和TNF-α)的能力顯示出來(lái)(圖29C)。
實(shí)施例28
S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB OVA在體外誘導(dǎo)OVA特異的免疫性
我們測(cè)定了S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB OVA疫苗在體內(nèi)誘導(dǎo)OVA特異的免疫性的能力。1×108個(gè)S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB OVA通過(guò)靜脈內(nèi)接種雌性C57BL/6小鼠。免疫后7天檢測(cè)OVA特異的免疫性的誘導(dǎo)。引人注目的是，接種S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB OVA的小鼠出現(xiàn)非常顯著的OVA特異的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，而接種親本利斯特OVA菌株的小鼠沒(méi)有出現(xiàn)應(yīng)答，如圖30所示。此外，使用熱殺死的利斯特氏菌uvrAB OVA免疫接種小鼠不能誘導(dǎo)產(chǎn)生OVA特異的免疫性。
實(shí)施例29
兩個(gè)表達(dá)全長(zhǎng)CEA(含有天然的(CAP1)或者增強(qiáng)激動(dòng)劑細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位(CAP1-6D))的重組減毒利斯特actA/uvrAB菌株的構(gòu)建
CEA是一個(gè)180kDa大的蛋白質(zhì)，在內(nèi)胚層衍生的消化系統(tǒng)上皮和胚胎結(jié)腸的腺癌中發(fā)現(xiàn)。CEA通過(guò)一個(gè)GPI錨定物附著在細(xì)胞膜上。該蛋白含有7個(gè)類(lèi)似免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域，在C端具有與非特異性交叉反應(yīng)蛋白NCA的同源性，NCA是癌胚抗原基因家族的一個(gè)成員。我們提議構(gòu)建全長(zhǎng)的CEA，其中含有HLA*A0201-限制性-CEA天然T細(xì)胞表位CAP1(YLSGANLNL)(SEQ ID NO51)或者增強(qiáng)的激動(dòng)劑細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞肽CAP1-6D(YLSGADLNL)(SEQ ID NO52)(Zaremba等人，Cancer Res.，574570-7(1997))，其已經(jīng)證明在癌癥患者中有更強(qiáng)的誘導(dǎo)CEA特異的免疫性的能力(表25)(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，988809-14(2001))。
表25
CEA腫瘤抗原表達(dá)質(zhì)粒在pPL2主鏈上構(gòu)建，pPL2能位點(diǎn)特異地整合到利斯特基因組中(Lauer等人，J.Bacteriol.，1844177-86(2002))。構(gòu)建兩個(gè)質(zhì)粒，使來(lái)自利斯特氏菌LLO的分泌信號(hào)和PEST元件與全長(zhǎng)的CEA cDNA形成基因融合。從基因構(gòu)建體的5′端開(kāi)始，融合蛋白由LLO的N末端區(qū)域組成，以促進(jìn)細(xì)菌分泌信號(hào)與CEA的融合。通過(guò)重疊PCR使結(jié)構(gòu)域之間精確連接。所有質(zhì)粒構(gòu)建體的保真性通過(guò)DNA測(cè)序確證。
實(shí)施例30
包含pPL2CEAwt和pPL2CEA-610D整合到利斯特氏菌株L4029uvrAB(ΔactA，ΔuvrAB)中的兩個(gè)減毒的重組利斯特氏菌株的產(chǎn)生，以及CEA抗原表達(dá)和分泌的確證
根據(jù)以前Lauer等人，J.Bacteriol.，1844177-86(2002)的描述將pPL2-CEA構(gòu)建體整合到利斯特氏菌L4029uvrAB突變株基因組中的tRNAArg基因旁邊。簡(jiǎn)而言之，首先通過(guò)轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒引入大腸桿菌SM10菌株中，然后再通過(guò)接合將質(zhì)粒引入到所需的利斯特氏菌株中。利斯特氏菌的轉(zhuǎn)化接合子使用氯霉素(pPL2)和鏈霉素(利斯特氏菌株)選擇培養(yǎng)基篩選；該過(guò)程的效率大約是1×10-4。為了保證轉(zhuǎn)化接合子的純度，以及保證pPL2主鏈整合到細(xì)菌染色體中，挑選有限的候選菌落，劃線到新鮮的選擇培養(yǎng)基上，連續(xù)傳3次，通過(guò)菌落PCR確證CEA構(gòu)建體精確整合進(jìn)入利斯特基因組中。
對(duì)全細(xì)胞裂解物以及TCA沉淀的細(xì)菌培養(yǎng)物液體部分進(jìn)行Western印跡分析，確定LLO-CEA融合蛋白的抗原表達(dá)和分泌。使用LLO特異的兔多克隆抗體和CEA特異的單克隆抗體確證重組利斯特氏菌表達(dá)和分泌LLO-CEA融合蛋白?？梢员容^表達(dá)CEA的重組利斯特氏菌菌株以及它們的親本菌株的生物學(xué)性質(zhì)。將穩(wěn)定生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物1∶100稀釋于新鮮培養(yǎng)基接種之后測(cè)定腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。以前我們?cè)?jīng)在利斯特氏菌中表達(dá)過(guò)類(lèi)似大小或者更大的蛋白質(zhì)。但是在細(xì)菌中哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物的重組蛋白表達(dá)可能產(chǎn)生問(wèn)題，這取決于每一個(gè)特定的蛋白。如果利斯特氏菌中CEA的表達(dá)產(chǎn)生問(wèn)題，則可以構(gòu)建表達(dá)CEA片段或者T細(xì)胞小表位(mini-epitope)的利斯特氏菌株。HLA*A0201-限制性-CEA天然T細(xì)胞表位CAP1(YLSGANLNL)(SEQ ID NO51)或者增強(qiáng)的激動(dòng)劑細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞肽CAP1-6D(YLSGADLNL)(SEQ ID NO52)與已經(jīng)構(gòu)建的表達(dá)構(gòu)建體中的卵清蛋白(OVA)形成讀碼框融合，這樣來(lái)自利斯特氏菌LLO的分泌信號(hào)和PEST元件與OVA形成基因融合。T細(xì)胞小表位的表達(dá)和免疫原性是保守的，如以前使用gp70T細(xì)胞小表位，AH1和AH1-A5以及B16Trp1，Trp2，和gp100所證明的(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例31
通過(guò)S-59/UVA處理使利斯特氏菌actA/uvrAB CEA完全失活，同時(shí)仍然保留最佳的代謝活性、腫瘤抗原表達(dá)、對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的感染以及逃脫吞噬溶酶體的條件的建立
使用最少量的交聯(lián)最好地保持了由于基因表達(dá)的代謝活性。完全滅活利斯特氏菌actA/uvrAB CEA疫苗，而使抗原表達(dá)水平保持完好的最小量的S-59/UVA處理?xiàng)l件可以容易地建立。滅活條件的一個(gè)實(shí)例是在OD600＝0.5的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物中加入S-59補(bǔ)骨脂素至200nM，然后在培養(yǎng)物的光密度達(dá)到1時(shí)使用6J/m2的UVA進(jìn)行滅活。通過(guò)改變S-59的濃度、UVA劑量、UVA處理之前S-59的處理時(shí)間以及在利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株生長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)行處理的時(shí)刻，優(yōu)化滅活的條件。親本利斯特氏菌株作為對(duì)照。根據(jù)細(xì)菌無(wú)法在BHI瓊脂平板上形成菌落來(lái)確定利斯特氏菌的滅活(log殺死)。此外，可以使用35S脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)確證S-59/UVA滅活的利斯特氏菌表達(dá)CEA以及毒力因子如LLO和p60，從而測(cè)定在S-59/UVA滅活后新表達(dá)的蛋白的合成和分泌。使用35S代謝標(biāo)記表達(dá)LLO和p60可以根據(jù)常規(guī)進(jìn)行。S-59/UVA滅活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA在35S甲硫氨酸存在的條件下孵育1小時(shí)。確定全細(xì)胞裂解物、TCA沉淀的細(xì)菌培養(yǎng)物液體中LLO-CEA融合蛋白、內(nèi)源LLO以及p60的抗原表達(dá)和分泌。使用LLO-、p60-以及CEA-特異的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀，以確證重組利斯特氏菌在滅活后持續(xù)的表達(dá)和分泌。S-59/UVA滅活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA的表達(dá)水平與我們現(xiàn)在的誘導(dǎo)有效抗原特異T細(xì)胞應(yīng)答的利斯特氏菌OVA疫苗株進(jìn)行比較。人們可以選擇S-59/UVA條件，在該條件下能夠出現(xiàn)可重復(fù)的完全滅活，而對(duì)所分析的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平只有有限的影響。
實(shí)施例32
建立使用滅活(S-59/UVA)利斯特氏菌actA/uvrAB CEA疫苗感染人未成熟樹(shù)突細(xì)胞(DC)(結(jié)果是在MHC I類(lèi)分子的情況下出現(xiàn)有效的CEA呈遞)的實(shí)驗(yàn)方案以及疫苗株。
根據(jù)三次獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果，確定離體感染DC的最佳條件(1)人未成熟DC在感染后的表型和細(xì)胞因子特征的改變；(2)被利斯特氏菌感染的DC誘導(dǎo)同種異型T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力；以及(3)利斯特氏菌actA/uvrAB CEA感染的DC在體外刺激CEA特異的HLA*A0201-限制的T細(xì)胞系的效力。
1.確定和比較使用活的和完全滅活的利斯特氏菌CEA菌株感染的人未成熟DC細(xì)胞表型和細(xì)胞因子分泌特征。使用通常使用的活化信號(hào)例如LPS，TNF-α和α-CD40比較被利斯特氏菌感染的人DC的活化。
可以鑒別和優(yōu)化S-59/UVA滅活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株感染和活化初級(jí)人DC的效率。根據(jù)以前的描述，從未動(dòng)員的(unmobilized)外周血液富集人DC細(xì)胞(Fong等人，J.Virol.，7611033-41(2002)。簡(jiǎn)而言之，在Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)中進(jìn)行離心獲得PBMC，然后根據(jù)Mayordomo等人，Nat.Med.，11297-302(1995)，使用Percoll(Pharmacia)密度離心完全去除單核細(xì)胞。完全去除單核細(xì)胞的PBMC在添加了10％混和人AB血清且沒(méi)有添加外源細(xì)胞因子的RPMI 1640(BioWhittaker，Walkersville，MD)中孵育。在37℃潮濕的含10％二氧化碳的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，通過(guò)使用15％(w/v)的三碘苯甲酰氨基葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)密度梯度離心從淋巴細(xì)胞中進(jìn)一步富集DC。富集的DC細(xì)胞群的表型通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(有HLA-DR表達(dá)，沒(méi)有CD3，CD14，CD19和CD56的表達(dá))和葡聚糖的攝取進(jìn)行確證。為了檢測(cè)利斯特氏菌對(duì)DC的感染性，在不同MOI下DC與S-59/UVA滅活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株共同孵育1小時(shí)。使用活的利斯特氏菌作為對(duì)照。在充分漂洗除去任何細(xì)胞外的利斯特氏菌以后，感染的DC在50μg/ml慶大霉素存在下進(jìn)一步孵育，以殺死細(xì)胞外的細(xì)菌。通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)在感染后的不同時(shí)刻確定細(xì)胞表面CD80，CD83，CD86和MHC II類(lèi)分子的表達(dá)情況，對(duì)利斯特氏菌ΔactAΔuvrAB CEA菌株感染DC細(xì)胞后的表型改變進(jìn)行測(cè)定。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列試劑盒(Pharmingen)對(duì)感染的DC細(xì)胞培養(yǎng)物上清中輔助性T細(xì)胞1和輔助性T細(xì)胞2類(lèi)型細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。感染和活化的條件與通常使用的刺激物例如LPS、TNF-α和α-CD40比較。選出的感染條件導(dǎo)致人DC在體外有效的和持續(xù)的刺激和活化以及細(xì)胞因子的分泌，這些性質(zhì)要與活的親本利斯特氏菌株誘導(dǎo)的結(jié)果非常相似。如果在不使用細(xì)胞因子時(shí)從外周血液中分離的DC的整體感染性低，則可以檢測(cè)在密度梯度離心之前的DC感染。另外，將評(píng)價(jià)其他的DC來(lái)源例如單核細(xì)胞衍生的DC對(duì)不能存活的和活的利斯特氏菌的感染性。簡(jiǎn)而言之，使用負(fù)篩選富集人單核細(xì)胞，用培養(yǎng)基(RPMI-1640+10％FCS)懸浮至1×106細(xì)胞/毫升，添加1000U/mlGM-CSF和1000U/mlIL-4。6-7天的培養(yǎng)之后，使用流式細(xì)胞術(shù)和葡聚糖攝取對(duì)體外培養(yǎng)的DC細(xì)胞群的表型進(jìn)行確認(rèn)。如以前所述對(duì)單核細(xì)胞衍生的DC在利斯特氏菌感染之后的表型改變以及細(xì)胞因子的分泌特征進(jìn)行測(cè)定。
2.確定和比較使用活的或者完全滅活的利斯特氏菌CEA菌株感染的人未成熟DC細(xì)胞，在體外活化同種異型T細(xì)胞的刺激能力
為了檢測(cè)利斯特氏菌感染的DC細(xì)胞群的刺激能力，可以用混和白細(xì)胞反應(yīng)(MLR)確定它們刺激初級(jí)同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的能力。廣泛認(rèn)為APC誘發(fā)體內(nèi)免疫應(yīng)答的相對(duì)效力(它取決于APC的活化/成熟狀態(tài))反映在它們?cè)隗w外刺激一種同種異型T細(xì)胞應(yīng)答的能力上(Jung等人，Immunity，17211(2002))。簡(jiǎn)而言之，分離DC并且用完全滅活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA使其感染。被感染細(xì)胞群的表型通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。不同數(shù)目的經(jīng)過(guò)輻射的(3000rad)DC與5×104個(gè)同種異型底平效應(yīng)器細(xì)胞在96孔U型底平板(Costar，Cambridge，MA)中共同培養(yǎng)。來(lái)自隨機(jī)供體的PBMC作為效應(yīng)器細(xì)胞。6天后，培養(yǎng)物用1μCi的[3H]胸腺嘧啶脈沖18小時(shí)。將細(xì)胞收獲到玻璃纖維紙上，通過(guò)用液閃計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性來(lái)測(cè)定[3H]胸腺嘧啶的摻入。比較感染了不能存活的利斯特氏菌的DC和感染了活利斯特氏菌的DC以及使用刺激物例如LPS、TNF-α和α-CD40活化的DC的刺激能力。
3.評(píng)價(jià)利斯特氏菌感染的人DC細(xì)胞在體外活化CEA特異的HLA*A0201限制性T細(xì)胞系的效力。比較感染了活的或者完全滅活的利斯特氏菌的未成熟人DC與肽脈沖的DC。
DC的表型改變、細(xì)胞因子分泌特征以及同種異型刺激能力是對(duì)DC在體內(nèi)刺激抗原特異的T細(xì)胞應(yīng)答的能力的間接量度。DC呈遞由完全滅活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株表達(dá)的重組腫瘤抗原的能力是根據(jù)CEA特異的HLA*A0201限制性T細(xì)胞系的活化進(jìn)行評(píng)價(jià)的(該細(xì)胞系由L.Fong制備，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)Milestone3-1中的描述，從HLA*A0201陽(yáng)性的供體的外周血液中分離DC。不同數(shù)目的經(jīng)過(guò)輻射的(3000rad)DC與5×104個(gè)CEA特異的HLA*A0201限制性T細(xì)胞在96孔U型底平板(Costar，Cambridge，MA)中共同培養(yǎng)。24小時(shí)后收集細(xì)胞上清。根據(jù)IFN-γ，GM-CSF或者IL-2的分泌測(cè)量T細(xì)胞的活化。使用商品化的細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列試劑盒(Pharmingen)測(cè)定分泌的細(xì)胞因子。比較感染了不能存活的利斯特氏菌的DC和感染了活利斯特氏菌的DC以及使用刺激物例如LPS、TNF-α和α-CD40活化的DC的刺激能力。
實(shí)施例33
利斯特氏菌荷載的初級(jí)人DC在體外致敏CEA特異的免疫性能力的確證以及選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的首要(lead)利斯特氏菌株
為了確證S-59/UVA滅活的利斯特氏菌感染的DC能夠在體外致敏CEA-特異的原初CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，使用在已經(jīng)確立的最佳條件下用利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株感染的人未成熟DC，在體外刺激原初T細(xì)胞。含有天然或者改變的T細(xì)胞表位的首要利斯特氏菌actA/uvrABCEA菌株的選擇是根據(jù)其誘導(dǎo)原初CEA-特異的T細(xì)胞應(yīng)答的能力，這是由三種互相獨(dú)立的檢測(cè)測(cè)定的(1)[3H]胸腺嘧啶摻入到接觸過(guò)DC的T細(xì)胞培養(yǎng)中；(2)被致敏的CEA特異的T細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞毒活性，通過(guò)51Cr釋放試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量；以及(3)CEA特異的T細(xì)胞的頻率，由肽MHC四聚體染色測(cè)定。通過(guò)DC的表型改變來(lái)確證最佳的感染，表型改變通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)，測(cè)定CD80，CD83，CD86，以及MHC II類(lèi)分子的細(xì)胞表面表達(dá)以及通過(guò)檢測(cè)由被感染的DC分泌的細(xì)胞因子的特征來(lái)測(cè)定。對(duì)于初級(jí)T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，恒定數(shù)目的CD45RA+T淋巴細(xì)胞(2×105/孔)與不同數(shù)目的經(jīng)過(guò)輻射的(3,000R)荷載利斯特氏菌的DC在96孔圓底微量滴定板中共同孵育7天。6天后使用1μCi的[3H]胸腺嘧啶脈沖培養(yǎng)物18小時(shí)。將細(xì)胞收獲到玻璃纖維紙上，通過(guò)用液閃計(jì)數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)測(cè)量放射性來(lái)確定[3H]胸腺嘧啶的摻入。此外，通過(guò)細(xì)胞毒T細(xì)胞測(cè)定來(lái)檢測(cè)CEA特異的T細(xì)胞的誘導(dǎo)。簡(jiǎn)而言之，5×106 CD45RA+T淋巴細(xì)胞與經(jīng)過(guò)輻射的(3,000R)利斯特氏菌荷載的DC同時(shí)培養(yǎng)，比例是10∶1，使用24孔板(Costar)，培養(yǎng)密度為5×106細(xì)胞/1.5毫升培養(yǎng)基。7天后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。簡(jiǎn)而言之，靶細(xì)胞系SW403，SW1417，A375和T2與250μCi的[51Cr]共同孵育2小時(shí)。在標(biāo)記步驟中，T2細(xì)胞還在HLA*0201限制性目標(biāo)肽CAP1和CAP1-6D存在或者不存在的情況下孵育。使用RPMI漂洗靶細(xì)胞系三次，將靶細(xì)胞以每孔5000的密度一式三份加入96孔U型底板(Costar)中。在描述的效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞的比例下，將效應(yīng)細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞共同孵育。4小時(shí)培養(yǎng)后，收獲上清，在Microbeta計(jì)數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)中計(jì)數(shù)。百分比特異裂解的計(jì)算按照如下的公式100％×(試驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)。根據(jù)靶細(xì)胞在含有0.5％Triton X-100(Sigma)的PBS中的裂解測(cè)定最大釋放。最后，可以確定使用呈遞CAP1或者CAP1-6D的MHC/四聚體在體外接觸后CEA特異的T細(xì)胞頻率，方法在以前有所描述(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，988809-14(2001))。在分析體外致敏的T細(xì)胞培養(yǎng)物的同時(shí)，分析體外致敏前獲得的冷凍保存的CD45RA+T細(xì)胞。用相應(yīng)的HLA*A0201藻紅素標(biāo)記的MHC/四聚體對(duì)總計(jì)1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫進(jìn)行30分鐘。CD8的抗體(用作陽(yáng)性門(mén)控)以及CD4，CD14，CD19和CD56的抗體(陰性門(mén)控)按照推薦的濃度加入，4攝氏度孵育30分鐘。染色后，樣品漂洗兩次，使用四色流式細(xì)胞術(shù)分析。我們?cè)谝郧霸@得四聚體染色的背景。使用同樣的方法測(cè)定了20名志愿獻(xiàn)血者，結(jié)果是對(duì)于CEA605-613和610D四聚體分別為0.30％±0.18％和0.27％±0.14％(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，988809-14(2001))。
實(shí)施例34
使用蛋白酶3或者PR1作為異源抗原
盡管以上特別的實(shí)施例中概述的一些方法描述了使用CEA抗原作為改變的利斯特氏菌表達(dá)的抗原，本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員可以容易地認(rèn)識(shí)到可以使用相似的方法制備表達(dá)不同抗原(例如蛋白酶3或者蛋白酶3衍生的抗原)的改變的利斯特氏菌，用來(lái)在體外或者離體感染樹(shù)突細(xì)胞，以達(dá)到荷載和活化/成熟的目的。本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到產(chǎn)生的DC疫苗可能可以施用給動(dòng)物或者病人，以誘導(dǎo)針對(duì)蛋白酶3和/或PR1的免疫應(yīng)答。
例如，可以使用包含編碼蛋白酶3基因和/或PR1表位的pPL2載體骨架等，將抗原表達(dá)序列整合到以上實(shí)施例中描述的L4029-uvrAB利斯特氏菌株的基因組中，使其改變。在一個(gè)實(shí)例中，PR1抗原可以作為融合蛋白的一部分(例如LLO-OVA/PR1融合蛋白，該蛋白包含截短的LLO序列與OVA融合，其中嵌入了PR1表位)表達(dá)。這種可以被改變的利斯特氏菌表達(dá)的抗原性蛋白(LLO-OVA/PR3)的序列在圖31中給出。
實(shí)施例35
突變體利斯特氏菌逃脫吞噬溶酶體以及促進(jìn)I類(lèi)抗原呈遞能力的測(cè)量
以下給出的示例性實(shí)驗(yàn)方案，用于評(píng)價(jià)一個(gè)特定候選利斯特氏菌突變株逃脫抗原呈遞細(xì)胞吞噬溶酶體并促進(jìn)I類(lèi)抗原被細(xì)胞呈遞的能力首先在蓋玻片上培養(yǎng)DC2.4細(xì)胞。然后用所需的利斯特氏菌株感染細(xì)胞(MOI＝100)。感染后0.5小時(shí)(0.5hpi)，潤(rùn)洗細(xì)胞，洗掉沒(méi)有感染的利斯特氏菌。1hpi時(shí)，加入50微克每毫升的慶大霉素。5hpi時(shí)，漂洗蓋玻片，在3.5％甲醛中固定。封閉后，用兔抗利斯特氏菌抗體(Difco)染色，用山羊抗兔FITC二抗(Vector Labs)檢測(cè)。用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(MoleGular Probes)檢測(cè)肌動(dòng)蛋白。將蓋玻片裝在Vectamount+DAPI(Vector Labs)上面，進(jìn)行檢查。還請(qǐng)參見(jiàn)上面的實(shí)施例17和實(shí)施例25。
實(shí)施例36
來(lái)源于人單核細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞的制備以及用利斯特氏菌疫苗的感染
以下給出一個(gè)示例性實(shí)驗(yàn)方案，概述了來(lái)源于人單核細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞的制備以及用利斯特氏菌疫苗的感染
材料人外周血(優(yōu)選為來(lái)自供血者的血沉棕黃色層)；Ficoll-Hypaque(Amersham)；無(wú)鈣鎂的dPBS(MediaTech)；添加L谷氨酰胺的RPMI-1640(MediaTech)；胎牛血清，精純并熱滅活的(HyClone)；人GM-CSF(R&D Systems)儲(chǔ)液，濃度為500U/微升，儲(chǔ)存于-20℃；人IL-4(R&D Systems)儲(chǔ)液，濃度為200U/微升，儲(chǔ)存于-20℃；Costar24孔板(Fisher)。
單核細(xì)胞分離培養(yǎng)基(MIM)50毫升的NaCl溶液(500mL dH2O，43.84g NaCl(1.5M))加入到450mL Percoll中混勻，制成溶液1(等滲Percoll)。將1000mL dH2O，205.6mg NaH2PO4*2H2O(1.49mM)，1.30g Na2HPO4(9.15mM))，8.18g NaCl(139.97mM)，和3.82gC6H5Na3O7*2H2O(13mM)混和，調(diào)節(jié)pH至7.2，制成溶液2(PBS/檸檬酸)。然后將250mL等滲Percoll與250mL PBS/檸檬酸混和。溶液過(guò)濾除菌，4℃儲(chǔ)存。
培養(yǎng)基RPMI-1640w.GlutaMax(Gibco)+10％胎牛血清(使用HyClone的精純、熱滅活的FCS)。
方法Ficoll和MIM預(yù)熱至室溫。每個(gè)250ml conical管中加入20毫升Ficoll。用dPBS將血液稀釋2倍，混勻。將25毫升血液加在每管中Ficoll的上面成為一層。18-20℃下400g離心試管30分鐘。
將單核界面從離心產(chǎn)生的梯度中小心收集出來(lái)，放入潔凈的50毫升試管中，補(bǔ)充dPBS至滿。100g離心試管15分鐘。沉淀是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，血小板仍然懸浮。將上清虹吸去掉。再重復(fù)上述的補(bǔ)充dPBS至滿、離心和虹吸的步驟兩次，共漂洗三次。
沉淀用20毫升dPBS重懸。懸液加在20毫升的MIM上面形成一層。樣品在室溫下400g離心35分鐘。從交界面中收獲單核細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)基的潔凈試管中。如果培養(yǎng)DC的目的是感染細(xì)菌，則不要使用抗生素。
樣品在400g離心10分鐘，吸去掉上清。沉淀用dPBS漂洗4次。最后一次漂洗以后，細(xì)胞沉淀用RPMI-1640+10％FCS重懸。然后將樣品置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上，使用臺(tái)盼藍(lán)或者自動(dòng)計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液稀釋至1×106個(gè)細(xì)胞每毫升。每毫升的細(xì)胞懸液中加入500U GM-CSF和200U IL-4(如果根據(jù)上面的描述制備儲(chǔ)液，則每毫升細(xì)胞懸液加1微升儲(chǔ)液)。每孔取1毫升加入到Costar 24孔板中。板在37℃、5％二氧化碳、100％相對(duì)濕度下放置48小時(shí)。
第二天，制備樹(shù)突細(xì)胞的飼養(yǎng)培養(yǎng)基。對(duì)于每個(gè)培養(yǎng)孔，飼養(yǎng)培養(yǎng)基由0.5毫升培養(yǎng)基(使用前預(yù)熱至37℃)添加500U/mL GM-CSF和200U/mLIL-4組成。從每一個(gè)培養(yǎng)孔的上層吸出0.5毫升，用0.5毫升的新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)基替代。將培養(yǎng)板置于37℃、5％二氧化碳、100％相對(duì)濕度下再放置48小時(shí)。在第4天重復(fù)補(bǔ)飼。第五天細(xì)胞就可以使用了。細(xì)胞必須永遠(yuǎn)保存在含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中，否則它們就會(huì)回復(fù)為巨噬細(xì)胞。在細(xì)胞計(jì)數(shù)器上檢查樹(shù)突細(xì)胞的表型，檢查它們的HLA-DR、CD1a、CD83和CD86。
利斯特氏菌對(duì)人DC的感染
第5天，沉淀樹(shù)突細(xì)胞(DC)，用含有GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基重懸至每毫升2×106個(gè)細(xì)胞。在24孔培養(yǎng)板的每孔中加入500微升的懸液。500微升中加入成熟刺激物或者細(xì)菌。使用1微克LPS作為成熟刺激物對(duì)照。(可以加入1000U的IFN-γ或者1微克的sCD40L，增強(qiáng)該應(yīng)答)。對(duì)于利斯特氏菌的感染，每個(gè)DC細(xì)胞使用10-100個(gè)利斯特氏菌。感染細(xì)胞1小時(shí)，然后洗掉細(xì)胞外的細(xì)菌，將細(xì)胞重懸于含50微克每毫升慶大霉素的培養(yǎng)基中。可以加入sCD40L提高DC的存活，促進(jìn)更大量的IL-12p70的釋放。可以加入1000U/mL IFN-γ促進(jìn)成熟與IL-12p70的分泌。在細(xì)胞計(jì)數(shù)器上檢查樹(shù)突細(xì)胞的表型，檢查它們的HLA-DR、CD1a、CD83和CD86。
實(shí)施例37
不產(chǎn)芽孢的炭疽芽孢桿菌疫苗菌株
spoIIE按讀碼框刪除。炭疽芽孢桿菌的spoIIE區(qū)域是通過(guò)與枯草芽孢桿菌中的相同基因的同源性而鑒定出來(lái)的。為了分離出炭疽芽孢桿菌SpoIIE按讀碼框刪除株，首先用PCR將spoIIE基因擴(kuò)增，克隆到pCR-Blunt-II-TOPO(Invitrogen)中。然后通過(guò)重疊延伸(SOE)(Horton等人，Biotechniques 8528-35(1990))使用基因拼接技術(shù)將大部分的spoIIE基因刪除。這個(gè)按讀碼框刪除的sopIIE基因克隆到穿梭載體pKSV7中，該載體攜帶氯霉素抗性基因，不能在42℃復(fù)制(Smith等人，Biochimie，74705-11(1992))。含有刪除spoIIE基因的pKSV7通過(guò)電穿孔進(jìn)入炭疽芽孢桿菌，細(xì)胞在42℃有氯霉素的條件下生長(zhǎng)，篩選質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合到spoIIE基因中的菌株。然后在30℃沒(méi)有氯霉素選擇的條件下培養(yǎng)，使質(zhì)粒切除并喪失。應(yīng)該發(fā)現(xiàn)約有1％的氯霉素敏感菌株，其中大約有一半應(yīng)該含有刪除的spoIIE等位基因(Camilli等人，(1993))。通過(guò)PCR和Southern印跡分析確證刪除的存在。
spoIIE/uvrAB雙刪除菌株。從spoIIE刪除菌株開(kāi)始，再進(jìn)行按讀碼框的uvrA和uvrB基因刪除。同樣，擴(kuò)增出目標(biāo)基因，克隆到pCR-Blunt II-TOPO中。然后我們使用SOE技術(shù)將大部分的uvrA和uvrB基因刪除。按讀碼框刪除的uvrAB區(qū)域克隆到pKSV7中，將該構(gòu)建體電穿孔轉(zhuǎn)移到炭疽芽孢桿菌spoIIE刪除菌株中。在42℃篩選氯霉素抗性，用來(lái)選擇質(zhì)粒整合進(jìn)入uvrAB區(qū)域。30℃沒(méi)有藥物選擇的條件下培養(yǎng)，促進(jìn)喪失了該質(zhì)粒的分離子的生長(zhǎng)。挑取氯霉素敏感菌落，通過(guò)PCR檢測(cè)uvrAB區(qū)域的丟失，用Southern印跡分析對(duì)丟失進(jìn)行確證。
實(shí)施例38
溫度敏感的炭疽芽孢桿菌recA突變株
為了產(chǎn)生在30℃下生長(zhǎng)良好而在42℃時(shí)對(duì)補(bǔ)骨脂素非常敏感的溫度敏感炭疽芽孢桿菌recA突變株，在炭疽芽孢桿菌中進(jìn)行突變，該突變與大腸桿菌recA溫度敏感突變體recA44(Kawashima等人，193288-92(1984))的V246M突變相似。為了制備該炭疽芽孢桿菌突變體，將在大腸桿菌和炭疽芽孢桿菌之間保守的序列245KVVKNK250(SEQ ID NO46)進(jìn)行突變。使用Stratagene Quick Change試劑盒，用錯(cuò)配寡聚核苷酸突變，將V246M突變引入克隆的炭疽芽孢桿菌recA基因中。通過(guò)序列分析確證突變，突變的基因克隆到pKSV7中，目的是使這些基因通過(guò)等位交換引入到炭疽芽孢桿菌spoIIE uvrAB的染色體中。另一種方法是，將來(lái)自炭疽芽孢桿菌菌株的recA基因刪除，替換為大腸桿菌的recA44(ts)等位基因。(已知炭疽芽孢桿菌recA基因在大腸桿菌中起作用(Ko等人，J.Bacteriol 1843917-22(2002)))。
實(shí)施例39
將突變引入到炭疽芽孢桿菌抗原活性位點(diǎn)中
致死因子突變H686A使其蛋白酶活性失活，且水腫因子突變K346Q和K353Q(一起)使其腺苷酸環(huán)化酶活性失活(Brossier等人，Infect.Immun.，681781-6(2000))。將這些突變引入將要用于疫苗的炭疽芽孢桿菌菌株中，例如spoIIE uvrAB和spoIIE uvrAB recA ts菌株中?？寺ef(致死因子)和cya(水腫因子，腺苷酸環(huán)化酶)基因，使用Quick Change試劑盒(Stratagene)進(jìn)行突變產(chǎn)生突變的基因。突變的基因然后轉(zhuǎn)到pKSV7中，最終通過(guò)等位交換引入到宿主pXO1的質(zhì)粒中。
實(shí)施例40
使用SOS調(diào)控序列用于高水平表達(dá)保護(hù)性抗原
Cheo等人(Cheo等人，J.Bacteriol.，1755907-15(1993))的研究顯示，共有序列GAACN4GTTC(SEQ ID NO47)確定了枯草芽孢桿菌中SOS應(yīng)答的基因的LexA阻遏物位點(diǎn)。要定位炭疽芽孢桿菌recA和uvrAB基因啟動(dòng)子上游中相似的共有序列，它們是SOS調(diào)控子的一部分。為了制備高水平表達(dá)保護(hù)性抗原的炭疽芽孢桿菌菌株，將保護(hù)性抗原基因置于SOS調(diào)控序列的控制下，并引入炭疽芽孢桿菌spoIIE uvrAB菌株中，這樣在使用補(bǔ)骨脂素處理時(shí)會(huì)導(dǎo)致高水平的保護(hù)性抗原的形成。為了將這個(gè)人工基因插入到炭疽芽孢桿菌染色體中，使用整合載體例如pPL2(Lauer等人，J.Bacteriol.，1844177-86(2002))。將目標(biāo)基因，在這里是啟動(dòng)子控制下的保護(hù)性抗原基因，插入到多克隆位點(diǎn)中。質(zhì)粒從大腸桿菌中接合到炭疽芽孢桿菌菌株中。由于質(zhì)粒不能在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中復(fù)制，它只能通過(guò)整合到染色體中而維持。pPL2載體含有來(lái)自單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的噬菌體整合酶以及噬菌體結(jié)合位點(diǎn)，所以必須進(jìn)行改變，將來(lái)自單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的噬菌體整合酶基因以及噬菌體結(jié)合位點(diǎn)刪除，代之以來(lái)自炭疽芽孢桿菌噬菌體，例如γ噬菌體(Brown等人，J.Infect Dis.，9634-9(1955))的相似元件。而且，pPL2載體通常含有氯霉素抗性基因用于篩選。由于藥物抗性基因?qū)τ谝呙绻ぷ鱽?lái)講是不能有的，所以也要?jiǎng)h除。其中一個(gè)藥物抗性基因用D-丙氨酸消旋酶基因代替，該基因可以合成D-丙氨酸，使D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷子在不添加D-丙氨酸的豐富培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。另一個(gè)藥物抗性基因被谷氨酰胺合成酶基因替代，該基因合成谷氨酰胺合成酶，使谷氨酰胺合成酶突變細(xì)菌在沒(méi)有谷氨酰胺合成酶的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
實(shí)施例41
炭疽芽孢桿菌突變株示例
使用以上實(shí)施例中描述的方法的組合，制備出多種不同的突變體炭疽芽孢桿菌菌株。將要用于疫苗組合物中的炭疽芽孢桿菌突變株示例在表26中列出。
表26炭疽芽孢桿菌菌株和候選疫苗
1NER，核苷酸切除修復(fù)
3將獲得在lacI可抑制啟動(dòng)子控制下的條件recA菌株，
4HR，同源重組
實(shí)施例42
在補(bǔ)骨脂素滅活的炭疽芽孢桿菌菌株中蛋白質(zhì)表達(dá)水平，包括保護(hù)性抗原和莢膜的性質(zhì)描述
為了顯示滅活的炭疽芽孢桿菌菌株仍然可以進(jìn)行代謝，將細(xì)胞在含有碳酸氫鹽的基本培養(yǎng)基(Thorne等人，J.Gen.Microbiol.，17505-16(1957))中孵育。孵育后離心去掉細(xì)胞，保留上清。上清進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。用考馬斯亮藍(lán)染色后，顯示保護(hù)性抗原來(lái)，用Western印跡(Brossier等人，Infect.Immun.，685731-4(2000))以及質(zhì)譜證實(shí)其存在。此外，使用Lenz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，10012432-12437(2003)中描述的方法，用質(zhì)譜鑒定在這些條件下分泌出的其他蛋白質(zhì)。為了檢測(cè)在這些條件下是否合成出多聚谷氨酸莢膜，將編碼莢膜合成基因的pXO2通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)引入到這些菌株中(Green等人，Infect.Immun.，49291-7(1985)。用火箭免疫電泳測(cè)量英膜(Uchida等人，Mol.Microbiol，231229-40(1997))。
實(shí)施例43
減毒炭疽芽孢桿菌菌株免疫接種的Swiss Webster和A/J小鼠的體液和粘膜應(yīng)答
小鼠免疫接種。通過(guò)肌肉內(nèi)(IM)或者皮下(SC)途徑用S-59/UVA疫苗注射小鼠，確定哪種途徑免疫產(chǎn)生最好的細(xì)菌特異的體液和細(xì)胞應(yīng)答。也檢驗(yàn)小鼠的鼻內(nèi)(IN)免疫接種，評(píng)價(jià)候選疫苗誘導(dǎo)的粘膜應(yīng)答。根據(jù)以前的描述(Boyaka等人，J.Immunol.，1705636-43(2003))，取5微升的指定疫苗制品，鼻內(nèi)免疫接種到輕微麻醉的小鼠的每個(gè)鼻孔中。小鼠免疫接種0.1LD50劑量的候選疫苗。8個(gè)S-59/UVA滅活的候選疫苗中的任何一個(gè)，如果對(duì)其中值致死水平未觀察，則起始給藥劑量是108個(gè)顆粒。通過(guò)一種以上途徑免疫接種的小鼠，其組合免疫劑量不超過(guò)0.1LD50劑量，或者不超過(guò)108個(gè)顆粒。進(jìn)行多次免疫接種的小鼠在所有的注射中，疫苗劑量保持一致。由于連續(xù)三天使用S-59/UVA滅活的利斯特氏菌uvrAB株進(jìn)行免疫接種產(chǎn)生的體液和細(xì)胞免疫性要比單次免疫接種高，所以對(duì)于炭疽芽孢桿菌菌株疫苗采取同樣的措施。在初次免疫接種后第14和第28天對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
抗PA、LF、EF、莢膜和全細(xì)菌抗體的定量對(duì)使用不同候選疫苗進(jìn)行免疫接種的小鼠體內(nèi)的粘膜和抗體應(yīng)答進(jìn)行研究。免疫前以及每次免疫接種后1周從眼眶后靜脈叢中取血清(我們有IACUUC的許可，對(duì)于每只小鼠進(jìn)行最多5次眼眶后靜脈叢操作，每周取血不超過(guò)一次，并且從兩只眼中交替取血)。最后一次免疫接種后一周，處死時(shí)取唾液和鼻沖洗液，測(cè)量IgA的水平。在最后一次免疫接種后45天，對(duì)由候選疫苗誘導(dǎo)的體液和粘膜免疫的持久性進(jìn)行研究。使用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)測(cè)定(ELISA)對(duì)PA、莢膜和營(yíng)養(yǎng)性細(xì)菌(Sterne株)的體液和粘膜應(yīng)答，按照以前出版的方法進(jìn)行(Ballard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，9312531-4(1996)；Rhie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，10010925-30(2003))。簡(jiǎn)而言之，首先用5微克純化的PA，LF，EF以及綴合有多聚γ-D-谷氨酸(PGA)莢膜(根據(jù)以前的描述進(jìn)行制備，Rhie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，10010925-30(2003))的BSA包被Immulon 96孔Maxisorp板(Nalge Nunc)，或者用研棒研缽在液氮條件下研磨S-59補(bǔ)骨脂素/UVA滅活的細(xì)菌研磨物包被，4℃下，包被物在50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中包被16小時(shí)，然后用TSTA緩沖液(50mMTris[pH 7.6]，142mM NaCl，0.05％疊氮鈉，0.05％Tween 20，2％牛血清白蛋白)封閉。小鼠的血漿或者粘膜分泌物進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋，加入到分別用PA、PGA-BSA或者Sterne菌包被的96孔板中。通過(guò)與同型特異的過(guò)氧化物酶山羊抗小鼠μ、γ或者α重鏈特異的抗體〔來(lái)自SouthernBiotechnology Associates(Birmingham，AL)〕共同孵育，檢測(cè)待檢抗體與被固定抗原的結(jié)合。生物素化的大鼠抗小鼠γ1(克隆G1-7.3)，γ2a(克隆R19-15)，γ2b(克隆R12-3)，或者γ3(克隆R40-82)重鏈特異的單抗(BD PharMingen，San Diego，CA)，以及鏈親和素綴合的過(guò)氧化物酶用于IgG抗體亞類(lèi)的分析(Cole，J.Bacteriol，107846-52(1971)；Cole等人，Basic Life Sci.，5B487-95(1975))。加入ABTS底物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)進(jìn)行生色反應(yīng)。終點(diǎn)滴度表示為OD415值較對(duì)照未免疫接種小鼠的OD415值大兩個(gè)sd時(shí)log2稀釋度的倒數(shù)。
使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)測(cè)定檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞。使用ELISPOT測(cè)定PA特異的Ig分泌淋巴細(xì)胞的頻率(Boyaka等人，J.Immunol.，1705636-43(2003))。簡(jiǎn)而言之，迅速將免疫接種的和對(duì)照小鼠的脾臟或頸部淋巴結(jié)取出，置于冰冷的RPMI1640培養(yǎng)基中，制備單細(xì)胞懸液。用2.5微克每毫升的純化PA(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA)過(guò)夜包被PVDF材質(zhì)的96孔板(BDBiosciemces，San Jose)。洗滌96孔板，在37℃用200微升完全RPMI封閉2小時(shí)，將細(xì)胞懸液進(jìn)行連續(xù)稀釋，加入到96孔板中。細(xì)胞在37℃，5％二氧化碳中在板上孵育6小時(shí)。使用同型特異的生物素標(biāo)記的抗小鼠μ、γ或者α重鏈特異的抗體(Southern BiotechnologyAssociates)檢測(cè)抗原特異的抗體形成細(xì)胞(AFC)。室溫孵育2小時(shí)后，漂洗96孔板，加入山羊抗生物素1nm金綴合物(GAB1；Ted Pella)室溫作用1小時(shí)。充分漂洗后，每孔中加入30微升銀底物(SilverEnhancing Kit；Ted Pella)，監(jiān)測(cè)斑點(diǎn)的形成。每孔中的斑點(diǎn)使用自動(dòng)的ELISPOT讀板儀(CTL，Cleveland)計(jì)數(shù)。體液應(yīng)答表示為每106個(gè)脾臟或者淋巴結(jié)細(xì)胞中抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。
毒素中和試驗(yàn)。對(duì)候選疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)出的中和抗體保護(hù)J774巨噬細(xì)胞細(xì)胞系不受致命毒素(PA+LF)(Mock等人，Annu.Rev.Microbiol.，55647-71(2001)；Boyaka等人(2003)；Rhie等人(2003))損害的能力進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，將J774細(xì)胞(ATCC，Manassus，VA)加入到96孔平底板(Nunc)中，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，在37℃5％二氧化碳中孵育12小時(shí)。待測(cè)血清或者粘膜分泌物在TSTA緩沖液中進(jìn)行連續(xù)兩倍稀釋。在抗血清稀釋液中加入PA和LF(400ng/ml PA和40ng/ml LF)。孵育1小時(shí)后，抗血清/致命毒素復(fù)合物混合物加入到細(xì)胞懸液中，繼續(xù)孵育5小時(shí)。通過(guò)MTT試驗(yàn)(在540nm測(cè)量光吸收)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的活力。試驗(yàn)作三個(gè)平行，每個(gè)板上還包括一個(gè)陰性對(duì)照(正常血清)和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(單抗14B7和1G3)(Mikesell等人，Infect Immun.，39371-6(1983)；Starnbach等人，Nature，9，(2003))。計(jì)算每三個(gè)樣品稀釋度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。終點(diǎn)表示為與正常對(duì)照血清相比表現(xiàn)出50％炭疽毒素中和的最高的血清稀釋度。
實(shí)施例44
使用經(jīng)過(guò)改變的炭疽芽孢桿菌免疫接種的A/J小鼠中，PA-，LF-和EF-特異的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的性質(zhì)
T細(xì)胞增殖。使用免疫接種的和原初A/J小鼠的PBMC、脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞測(cè)定CD4+T細(xì)胞增殖。根據(jù)以前的描述(Boyaka等人，J.Immunol，162122-8(1999)；Lillard等人，J.Immunol.，166162-169(2001)；Little等人，Infect.Immun.，655171-5(1997))，將脾臟和頸部淋巴結(jié)分散以獲得單細(xì)胞懸液。使用小鼠CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec(Auburn，CA))，通過(guò)負(fù)選擇分離CD4+T細(xì)胞。來(lái)自每一只小鼠脾臟、混和的淋巴結(jié)或者PBMC純化的CD4+T細(xì)胞，以4×106個(gè)細(xì)胞/毫升的密度進(jìn)行培養(yǎng)，在T細(xì)胞耗盡的、不分裂的同源原初脾臟滋養(yǎng)細(xì)胞的存在下(8×106，細(xì)胞/毫升)，在完全RPMI(RPMI補(bǔ)充10％FBS，10mM Hepes，2mM L-谷胺酰胺，1mM丙酮酸鈉，非必需氨基酸，23.8mM碳酸氫鈉，5×10-5Mμ-巰基乙醇，100U/ml青霉素和100微克每毫升鏈霉素)用不同濃度的PA，LF或者EF進(jìn)行刺激。使用S-59補(bǔ)骨脂素進(jìn)行短暫的光化學(xué)處理，使脾臟滋養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)制停止。細(xì)胞在37℃5％二氧化碳中孵育4天，然后加入0.5μCi的氚胸腺嘧啶([3H]TdR)，最后再孵育18-20小時(shí)。將細(xì)胞收獲在玻璃纖維紙上，用液閃計(jì)數(shù)器(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)測(cè)量放射性，測(cè)出摻入的胸腺嘧啶的量。
PA-，EF-或者LF-誘導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答的分析。使用小鼠CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec(Auburn，CA))，通過(guò)負(fù)選擇分離CD4+T細(xì)胞。來(lái)自每一只小鼠的脾臟或者淋巴結(jié)的純化的CD4+T細(xì)胞在圓底96孔板上培養(yǎng)，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，然后在T細(xì)胞耗盡的、不分裂的同源原初脾臟滋養(yǎng)細(xì)胞的存在下(每孔1×105個(gè)細(xì)胞)，在完全RPMI中使用不同濃度的PA，LF或者EF進(jìn)行刺激。使用S-59進(jìn)行短暫的光化學(xué)處理，使T細(xì)胞耗盡的脾臟滋養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)制停止。T細(xì)胞培養(yǎng)在37℃5％二氧化碳中孵育2天。使用Th1/Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列試劑盒(BD Pharmingen，San Diego，CA)測(cè)定來(lái)自抗原刺激的CD4+T細(xì)胞上清中輔助性T細(xì)胞1和輔助性T細(xì)胞2細(xì)胞因子的表達(dá)。
實(shí)施例44
使用改變的炭疽芽孢桿菌疫苗接種Swiss Webster和A/J小鼠，最后一次免疫后45天對(duì)芽孢和致命毒素攻擊保護(hù)程度的性質(zhì)研究
小鼠對(duì)致命毒素攻擊的保護(hù)。使用挑選出的候選疫苗免疫小鼠，然后通過(guò)尾靜脈注射致命毒素進(jìn)行攻擊，如以前所描述的(Price等人，Infect.Immun.，694509-15(2001)；Rhie等人(2003))。根據(jù)描述(Rhie等人(2003))將重組PA和LF重組蛋白(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA)混和，制備致命毒素。致命毒素在每只小鼠的靜脈內(nèi)注射LD50大約是12微克的PA與6微克的LF混和。在已發(fā)表的數(shù)值的0.1-10LD50劑量范圍內(nèi)通過(guò)尾靜脈注射小鼠，測(cè)定新鮮制備的致病毒素對(duì)小鼠的平均致死性。保護(hù)研究可能將使用的致命毒素攻毒的劑量在LD50劑量的5-10倍范圍之間。在本模型中，未經(jīng)保護(hù)的小鼠24小時(shí)內(nèi)死亡。最初，炭疽致死是這樣確證的選擇死亡的小鼠，將其血液涂布在胰蛋白大豆瓊脂平板上，37℃孵育過(guò)夜。在平板上注意觀察2-3毫米、具有典型炭疽樣“毛玻璃”外表的菌落。所有用致命毒素處理的小鼠進(jìn)行每日監(jiān)測(cè)，2周后終止實(shí)驗(yàn)，處死所有的小鼠。
芽孢制備。根據(jù)描述(Barnard and Friedlander，1999)制備Sterne菌株的芽孢。簡(jiǎn)而言之，將單菌落接種在5毫升FA培養(yǎng)基(3.3％胰蛋白胨，2％酵母提取物[對(duì)水透析過(guò)夜]，0.2％L-組氨酸，0.8％Na2HPO4，0.4％KH2PO4，0.74％NaCl)中，在100毫升的瓶中，37℃振蕩5小時(shí)。將0.1毫升的培養(yǎng)物鋪在L瓊脂平板上，37℃孵育。從平板上刮取細(xì)菌菌苔，用無(wú)菌水充分漂洗，60℃熱激30分鐘，水洗，根據(jù)以前的描述(Palucka等人，Nature Medicine，5868-870(1999))用58％的Renografin-76(Bristo1-Myers Squibb，Princeton，N.J.)水溶液進(jìn)行純化，再用水洗一次。然后10000g離心將芽孢沉淀，重懸于含1％苯酚的水中。根據(jù)發(fā)表的數(shù)據(jù)，該過(guò)程的產(chǎn)量在每平板0.5×109到5.0×109個(gè)芽孢的范圍內(nèi)。
小鼠對(duì)致命芽孢攻擊的保護(hù)。在劑量范圍103到108個(gè)芽孢之間，確定肌肉內(nèi)(IM)注射的熱激的Sterne菌株芽孢的LD50數(shù)值。為了評(píng)價(jià)接受接種的小鼠對(duì)吸入炭疽的保護(hù)，攻擊實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行根據(jù)以前的描述(Brook等人，J.Med.Microbiol.，50702-11(2001))將芽孢通過(guò)氣管內(nèi)途徑給藥。簡(jiǎn)而言之，將固定好并且麻醉的小鼠的舌頭輕輕拉出，兩側(cè)用鉗子固定，使用安裝鈍頭1.5英寸的22號(hào)針頭(從針尖以輕微角度彎折大約1英寸)注射器輸運(yùn)疫苗。我們預(yù)計(jì)經(jīng)IM或者IT途徑的Sterne菌株LD50數(shù)值在A/J小鼠中大約是103，在SwissWebster小鼠中至少高10倍。保護(hù)研究包括最高達(dá)100LD50劑量的芽孢攻擊。所有用芽孢處理的小鼠每日監(jiān)測(cè)，2周后終止實(shí)驗(yàn)，處死所有的小鼠。在所有的攻擊實(shí)驗(yàn)中，到死亡的平均時(shí)間在未存活的組中測(cè)定。
實(shí)施例45
利斯特氏菌疫苗在小鼠中對(duì)表達(dá)OVA模型抗原的痘病毒(vaccinia)攻擊的保護(hù)性免疫性
本發(fā)明的疫苗對(duì)于利斯特氏菌的攻擊顯示了保護(hù)性免疫。為了進(jìn)一步闡明疫苗免疫以及針對(duì)病原的保護(hù)，使用表達(dá)或者不表達(dá)OVA抗原和用S-59UVA處理(實(shí)施例13中的第二種方法，見(jiàn)前面)或者不處理的利斯特氏菌疫苗，對(duì)另外一種微生物，例如表達(dá)OVA抗原(VV-OVA)的痘病毒，產(chǎn)生免疫。這將證明使用利斯特氏菌疫苗可以獲得對(duì)其他微生物的抗原特異免疫作用。
從La Jolla Research Institute獲得表達(dá)OVA的痘病毒(vaccinia)(WR株)，它是使用Opticell培養(yǎng)小室(BioCrystal，OH)在Vero細(xì)胞中制備的。Opticell小室中接種Vero細(xì)胞，培養(yǎng)基是Eagle′s基本必需培養(yǎng)基，補(bǔ)充L-谷氨酰胺，P/S(青霉素/鏈霉素)，NEAA(非必需氨基酸)，NaHCO3，和10％FBS。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到75％鋪滿時(shí)，去掉生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換為含有大約1×105PFU/mL VV-OVA的新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)單層細(xì)胞顯示大于50％的細(xì)胞病變時(shí)，收獲細(xì)胞和上清，凍融三次，澄清后在-80℃儲(chǔ)存。在Vero-76細(xì)胞上進(jìn)行空斑試驗(yàn)測(cè)定滴度。卵清蛋白在痘病毒中的表達(dá)在注射到小鼠中之前，通過(guò)Western印跡進(jìn)行確證。
根據(jù)表27，通過(guò)靜脈內(nèi)接種C57B1/6小鼠(每組3只)，在第7天通過(guò)腹膜內(nèi)途徑注射1×107PFU的VV-OVA進(jìn)行攻擊。在第12天，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，收獲卵巢，觀察大體病理。卵巢還用于痘病毒空斑形成單位的測(cè)定。來(lái)自每只小鼠的成對(duì)卵巢在1毫升緩沖液中勻漿，進(jìn)行三次冷凍(液氮)融化(37℃)循環(huán)，每次循環(huán)之間進(jìn)行旋渦振蕩，然后儲(chǔ)存于-80℃。檢測(cè)時(shí)，將樣品融化，4℃離心除去殘?jiān)?，進(jìn)行連續(xù)稀釋，加到Vero細(xì)胞上。Vero-76細(xì)胞培養(yǎng)在6孔組織培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-85％鋪滿時(shí)，把每孔中的培養(yǎng)基吸出來(lái)，然后將1毫升適當(dāng)稀釋度的卵巢勻漿制備物接種在細(xì)胞上。至少1小時(shí)以后，吸出培養(yǎng)基，替換為3毫升1∶1的2x生長(zhǎng)培養(yǎng)基1.5％瓊脂糖。培養(yǎng)3-4天后計(jì)數(shù)空斑。
表27使用表達(dá)OVA的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株接種小鼠，并且用表達(dá)OVA的痘病毒攻擊
*初次接種劑量，第1、2天的劑量要低10倍。所有的劑量都是在100微升的HBSS中。
這里引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和登錄編號(hào)(包括多聚核苷酸和多肽的序列)在這里以其整體引用作為參考，用于所有的目的，其范疇與每個(gè)獨(dú)立的出版物、專利、專利申請(qǐng)?zhí)貏e地、單獨(dú)地指明在這里引用作為參考是相當(dāng)?shù)摹?br> 關(guān)于保藏的微生物或其它生物材料的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
PCT/RO/134表
ATCC
10801 University Blvd·Manassas，VA 20110-2209·Telephone703-365-2700·FAX703-365-2745
BUDAPEST TREATY ON THE IN TERNATIONAL RECOGNITION OF
THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENTPR OCEDURE
INTERNATIONAL FORM
RECE IPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT ISSUED PURSUANT TO RULE 7.3
AND VIABILITY STATEMENT ISSUED PURSUANT TO RULE 10.
To(Name and Address of Depositor or Attorney)
Cerus Corporation
AttnJohn Tessman
2411 Stanwell Drive
Concord，CA 94520
Deposited on Behalf ofCerus Corporation
Identification Reference by DepositorPatent Deposit Designation
Listeria monocytogenes actA/inIB double mutantactA/inIB PTA-5562
Listeria monocytogenes actA/uvrAB double mutantactA/uvrABPTA-5563
The deposits were accompanied by＿a scientific description_a proposed taxonomic description indicatedabove.The deposits were received October 3，2003 by this International Depository Authority and have beenaccepted.
AT YOUR REQUESTX We will inform you of requests for the strains for 30 years.
The strains will be made available if a patent office signatory to the Budapest Treaty certifies one′s right toreceive，or if a U.S.Patent is issued citing the strains，and ATCC is instructed by the United States Patent &Trademark Office or the depositor to release sald strains.
If the cultures should die.or be destroyed during the effective term of the deposit，it shall be yourresponsibility to replace them with living cultures of the same.
The strains will be maintained for a period of at least 30 years from date of deposit，or five years after themost recent request for a sample，whichever Is longer.The United States and many other countries aresignatory to the Budapest Treaty.
The viability of the cultures cited above was tested October 15，2003，.On that date，the cultures were viable.International Depository AuthorityAmerican Type Culture Collection，Manassas，VA20 110-2209 USA.
Signature of person having authority to represent ATCC
DateNovember 10，2003
Marie Harris，Patent Specialist，ATCC Patent Depository
ccAlicia Hager
(Ref:Docket or Case No.28217-3002900)
關(guān)于保藏的微生物或其它生物材料的說(shuō)明
(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)
PCT/RO/134表
ATCC
10801 University Blvd·Manassas，VA 20110-2209·Telephone703-365-2700·FAX703-365-2745
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF
THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROC EDURE
INTERNATIONALFORM
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT ISSUED PURSUANT TO RULE 7.3
AND VIABILITY STATEMENT ISSUED PURSUANT TO RULE 10.
To(Name and Address of Depositor or Attorney)
Cerus Corporation
AttnJohn Tessman
2411 Stanwell Drive
Concord，CA 94520
Deposited on Behalf ofCerus Corporation
Identification Reference by Depositor Patent Deposit Designation
Listeria monocytogenes actA/inIB double mutantactA/inIBPTA-5562
Listeria monocytogenes actA/uvrAB double mutantactA/uvrAB PTA-5563
The deposits were accompanied by＿a scientific description_a proposed taxonomic description indicatedabove.Tbe deposits were received October 3，2003 by this International Depository Authority and have beenaccepted.
AT YOUR REQUESTX We will inform you of requests for the strains for 30 years.
The strains will be made available if a patent office signatory to the Budapest Treaty certifies one′s right toreceive，or if a U.S.Patent is issued citing the strains，and ATCC is instructed by the United Sta tes Patent&Trademark Ofrice or the depositor to release said strains.
If the cultures should die or be destroyed during the effective term of the deposit，it shall be yourresponsibility to replace them with living cultures of the same.
The strains will be maintained for a period of at least 30 years from date of deposit，or five year-s after themost recent request for a sample，whichever is longer.The United States and many other countries aresignatory to the Budapest Treaty.
The viability of the cultures cited above was tested October 15，2003.On that date，the cultures were viable.International Depository AuthorityAmerican Type Culture Collection，Manassas，VA 20110-2209 USA.
Signature of person having authority to represent ATCC
DateNovember 10，2003
Marie Harrls，Patent Specialist，ATCC Patent Depository
ccAlicia Hager
(RefDocket or Case No.28217-3002900)
序列表
<110>CERUS CORPORATION
DUBENSKY Jr.，Thomas W.
BROCKSTEDT，Dirk G.
BAHJAT，Keith
HEARST，John E.
COOK，David
<120>修飾的自生的微生物、疫苗組合物及其使用方法
<130>282172002840
<140>Not Yet Assigned
<141>2004-02-06
<150>US 60/446,051
<151>2003-02-06
<150>US 60/449,153
<151>2003-02-21
<150>US 60/490,089
<151>2003-07-24
<150>US 60/511,869
<151>2003-10-15
<150>Not Yet Assigned
<151>2004-02-02
<160>52
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>鼠
<400>1
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>單核細(xì)胞增生利斯特氏菌
<400>2
Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser
1 5 10
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>3
Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
1 5
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>單純皰疹病毒
<400>4
Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu
1 5
<210>5
<211>2915
<212>DNA
<213>單核細(xì)胞增生利斯特氏菌
<400>5
atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat aagcgggatt ttgattattt tttcttagct 60
gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta tcgcgttcta aaattggttt caagtattta 120
cctgtataag atttttttga gcgagcgatt ttttcaggtg tgccggttgc aataatttga 180
ccgccaccat cgccaccttc tggacctaaa tcaatcaagt aatcagcttg tttgataacg 240
tcaagattat gctcaataac aagtactgta tcgccattct cttctacaag tctttgtaat 300
actttgagta aacgaccaat atcatctgcg tggagtccgg tagttggttc atccagaata 360
tagaaagatt ttccgttact acgtttatga agttccgaag ctagtttgac gcgctgcgct 420
tcaccacctg aaagcgtagt tgcaggttgt ccaagtcgaa tatagccaag accaacatct 480
acaattgttt gaagtttacg cgcaattctt ggttggttgg tgaaatattc tagtccttcc 540
tctacagtca tttctaatac ttcagcaata tttttgcctt tataacgaat atctaacgtc 600
tcaccattgt atcgttttcc atgacaaact tcacagggta catatacatc aggcaagaaa 660
tgcatttcaa ttttgatgat tccgtcgcct ttacacgcct cgcaacggcc accttttacg 720
ttaaaactaa agcgaccttt tttataacca cgaactttgg cttcattagt acttgcgaaa 780
aggtcacgaa tatcatcgaa agctcctgta taagtagctg gattcgatct cggtgttctt 840
ccgattggtg attggtcaat attgataatt ttttctaggt tttcgatgcc ttttatttct 900
ttgtgttcac ctggttttgc gtggtttcta tttagttttc tcgctaacgc ttttcgcagt 960
acttcattca ctaacgaact tttacctgaa cctgaaactc cagttacaca ggaaaaagta 1020
gctagtggaa tttttgcatt tacgtttttg agattatttg ctttagcacc aataatttct 1080
aattctagtc cgttaccttt tctacgttta gcagggactg gaataaattt tttacctgaa 1140
agatagtcac cagtgatgga atttttatta ttggcaactt cttctggtgt tccggctgca 1200
acaattcgtc cgccgtgttc tcctgcacct ggaccaatat caataagata atctgcggcc 1260
atcatcgtat cttcgtcatg ctcaacgaca ataagcgtgt ttccaatgtc acgcatactt 1320
tggagtgtgc tgattaaacg atcattatct cgttgatgaa gaccgatgga aggttcatct 1380
aaaatataaa gtacaccagt aagtctggaa ccgatttgtg tagcaagtcg aattcgttgc 1440
gcttcgccac cagaaagcgt cccagctgca cggctcattg ttaggtagtc gagcccaaca 1500
ttttttaaga agcctagtct agcacgaact tctttgaaaa ttggcgctgc aatttgtgtt 1560
tctttttcag atagttctaa gccatcgaag aaagcaagtg cttcattaat agaaaactca 1620
ctgatttgcc caatatgatg gtcgtttact ttaacggaaa gtgtttcttc ttttagacga 1680
tagcctttac aagatggaca tggtaaatca gtcatatatt gcgccatttg atcgcgtgtg 1740
aaatcggaat ttgtttcacg atagcgacgt tcgatatttg gaagtatccc ttcaaacgga 1800
atccacgttt cgcgtgtcat accgaaatca tttttgtatt cgaagtagaa ttctttatct 1860
tttgatccat ttaaaataat atctaattct tctttggata gcttctcaag aggtgtatcc 1920
atatctattc caaattcttt acaggcagaa gctagcattt gcgggtagta ctgtgaacta 1980
attgggcgcc aaggaataat agcaccttca tttagagaca tacttctatc aggaataacc 2040
gtgtcgacat cgacttcaag tttagtccca agtccatcac at gtggggca agcgccaaat 2100
gggctgttga aagagaacat tcttggttct aattcaccaa cg gaaaaacc acaataaggg 2160
cacgcatagt gttcactaaa taataattct ttatccccca tt atatcaac aaccgcataa 2220
ccatcagcta aacgaagagc agcttcaatg gaatcataca ga cgagtatt gatgccctct 2280
ttaatcacaa tgcgatcaat aatgatttca atagaatgct tt ttgttttt ctcaatttca 2340
atttcgtcat tgatatcata aatttctcca tcaacacgaa tt cgaacata tccttctttt 2400
ttgatttcct caatagtttt cttatgtgtc ccttttttac ca gaaacgat tggagccatt 2460
atttgaatac gtgttttttc tgggtattct agaacacgat ct accatttg ttcgattgtt 2520
tgagaagtga tttcaatacc gtgatttgga caaaccggat gc ccaacacg agcataaagt 2580
aagcgcaaat agtcatggat ttctgtaact gtcccaacag tg gaacgtgg attacggctt 2640
gttgtttttt gatcaatcga aatggcaggg cttaatcctt ca attaaatc cacatctggt 2700
ttatccattt gccctaaaaa ttggcgtgca tatgcggaca aa gactctac ataacgtctt 2760
tgtccttctg cataaatcgt atcaaaagca agcgaagatt ta cctgaacc tgaaagccca 2820
gtcataacta ctaatttgtc tctaggaatc tctacatcaa tg ttttttaa gttatgggct 2880
cttgcaccct gaattactat tttctcttta tccaa 2915
<210>6
<211>1991
<212>DNA
<213>單核細(xì)胞增生利斯特氏菌
<400>6
tcatccttcc gcttttattt ccagtaaagc atcgcgaagt tcagcagcac gttcgaaatc 60
aagtgcttta gctgcttctt tcatttcatg ttccatacct tcaatgaata catcgcgttc 120
tttcttagac attttgctta aatcatgttg cttcactgct tctctttcat ctgcggcaga 180
agtcgctgcg atgataccac gaatttcttt tttgattgtt tttggcgtaa tgccgtgttt 240
ttcattatat tcaatttgga ttttacgacg gcgttctgtt tcgccaatag aattgcgcat 300
cgaatcggtc attttatcag catacatgat tactcgaccg ttttcattac gagcagctcg 360
acccattgtt tgaattaagg aacgctcgga acgaaggaat ccttctttgt ccgcatctaa 420
aatagcgaca agagatactt caggtaaatc gattccttca cgaagtaagt taattccaac 480
gataacatca tacacaccaa gtcgaaggtc acgaatgatt tcgattcgct cgagcgtctt 540
cacttccgag tggagatact gtactttaac accagcttct ttgagatagt tggttaaatc 600
ctcggacatt tttttcgtta aggtggtgat taaaacacgt tcatttttct cgacgcgatc 660
gttaatctca tccattaagt catcaatttg tccttgaatc ggacggattt ctacgattgg 720
gtctagcaag ccagttggtc gaatgatttg ttcaatgaca tctggatttt tttctaattc 780
gtaagggcct ggtgtagcgg atataaacat aatttgattg atatgcttct caaattcttc 840
taaacgaagc ggcctattat ctagagcgct aggcaatcta aagccatgat caactagcat 900
ttgttttctg gcttggtccc cgttaaacat accacgaatt tgcggcatcg taacgtgtga 960
ctcatcaatt accatttgga aatcatctgg gaagtaatcg agtaacgtgt atggtgtaac 1020
tcccgctgga cgaagggata aatgtctaga atagttctca ataccagagc aatagcccat 1080
ttcttccatc atttccaaat cataattcgt tcgctgttca aggcgctgag cttctagcaa 1140
tttattatct gcacgtaaaa ctttaagacg gtcttcgagt tcagctttta tattaacaat 1200
tgcttttttc ataatatcag gtctggtgac aaagtgagat gccgggaaaa tggaaacatg 1260
ttctctttct cctataattt caccagtaag tgcatctact tctctaattc gttcaatttc 1320
atcaccgaaa aattcaatcc gcatacagtg ttcatctctt gaagctggga aaatttcgac 1380
aacatcaccg cgaacacgga agcgtccacg ttgaaaatct atatcatttc gatcatattg 1440
aatatctact aatttgcgca gtagctgatc acggctaatt tccatgccaa cacgaagcga 1500
aacgagcatc tctccatatt caatcggcga acctaagcca tagatacacg atacactcgc 1560
aatgataatt acatcgcgac gttcaaaaag cgcagcagta gcagagtgac gaagcttatc 1620
gatttcatca ttgatacttg catctttttc gatatatgtg tcactttgcg gaacataggc 1680
ttctggttga tagtaatcat agtaactgac aaaatattct acagcgttat ttgggaaaaa 1740
ctctttaaac tcgctataca gctgtcccgc taacgtctta ttgtgagcca tgacaagtgt 1800
cggcttattt acttcttgaa tcacattgga tacggtaaaa gttttccctg taccggttgc 1860
accaagtaaa gtttggtgtt tcaagccttt ttttaatccc gcaactaatt gttctatcgc 1920
tctaggttgg tctccttgtg ggctatactt agaaactaac tcaaatttat ccttcaactc 1980
ggattccccc t 1991
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>7
gcaagtatac agttaagttt gtaacg26
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>8
ctttccgaag tggaagaaag catg 24
<210>9
<211>6654
<212>DNA
<213>單核細(xì)胞增生利斯特氏菌
<400>9
gcaagtatac agttaagttt gtaacgattt gttttgattt agactcaaaa cgtaaagttt 60
cttcatctac acgtaaagtc gttttatcaa agaagatttt aagtgcttca tcttctggat 120
attctttgaa tagtttaatc atcgcgtgaa ctttgatatc gttcgaatcg gatggtttaa 180
attcaatatt accattagca atttcgaatt ctaaaataga aagtgttgtg tcatgataaa 240
tgaaatcacg ttcgattttc gttgaagtta agaacgggaa tggcatatct ttcacttgtt 300
taaatgcact atttaggaaa gaaccgattt tttcaccagc ttgggataaa tcattaacca 360
tattgcgcat ggagtcttca cgatctttag aagaattttc gccgccttct tcttcatctc 420
tttcatgatt ttctggagtc ggttctgggc gtcttttacg actttttgga ggtgtataag 480
gatttccttg attgttccaa cctttactgt aatcatatga tggttcttct tttgtttctt 540
cttcgatttg ttcttcttct ctcggagctg cagatcgacg aatattttct tttgctgctg 600
ttttaccttc ttttttggaa atattttcaa gtagagtaag ggcttcttca gtggatataa 660
taccttgttt tactaattcg agaatacgtt tacgttcatt ttccattttc atttcctcct 720
ataatttagg ctaaactatt ttaggcttgc tttcacatgc aagtgacata tctgttttat 780
ctatgactct attatgaagg aaaatataat ttctgtcata caaccagagg atgattattt 840
gtttggactt tgggtggttt ggtcttaaga atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat 900
aagcgggatt ttgattattt tttcttagct gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta 960
tcgcgttcta aaattggttt caagtattta cctgtataag atttttttga gcgagcgatt 1020
ttttcaggtg tgccggttgc aataatttga ccgccaccat cgccaccttc tggacctaaa 1080
tcaatcaagt aatcagcttg tttgataacg tcaagattat gctcaataac aagtactgta 1140
tcgccattct cttctacaag tctttgtaat actttgagta aacgaccaat atcatctgcg 1200
tggagtccgg tagttggttc atccagaata tagaaagatt ttccgttact acgtttatga 1260
agttccgaag ctagtttgac gcgctgcgct tcaccacctg aaagcgtagt tgcaggttgt 1320
ccaagtcgaa tatagccaag accaacatct acaattgttt gaagtttacg cgcaattctt 1380
ggttggttgg tgaaatattc tagtccttcc tctacagtca tttctaatac ttcagcaata 1440
tttttgcctt tataacgaat atctaacgtc tcaccattgt atcgttttcc atgacaaact 1500
tcacagggta catatacatc aggcaagaaa tgcatttcaa ttttgatgat tccgtcgcct 1560
ttacacgcct cgcaacggcc accttttacg ttaaaactaa agcgaccttt tttataacca 1620
cgaactttgg cttcattagt acttgcgaaa aggtcacgaa tatcatcgaa agctcctgta 1680
taagtagctg gattcgatct cggtgttctt ccgattggtg attggtcaat attgataatt 1740
ttttctaggt tttcgatgcc ttttatttct ttgtgttcac ctggttttgc gtggtttcta 1800
tttagttttc tcgctaacgc ttttcgcagt acttcattca ctaacgaact tttacctgaa 1860
cctgaaactc cagttacaca ggaaaaagta gctagtggaa tttttgcatt tacgtttttg 1920
agattatttg ctttagcacc aataatttct aattctagtc cgttaccttt tctacgttta 1980
gcagggactg gaataaattt tttacctgaa agatagtcac cagtgatgga atttttatta 2040
ttggcaactt cttctggtgt tccggctgca acaattcgtc cgccgtgttc tcctgcacct 2100
ggaccaatat caataagata atctgcggcc atcatcgtat cttcgtcatg ctcaacgaca 2160
ataagcgtgt ttccaatgtc acgcatactt tggagtgtgc tgattaaacg atcattatct 2220
cgttgatgaa gaccgatgga aggttcatct aaaatataaa gtacaccagt aagtctggaa 2280
ccgatttgtg tagcaagtcg aattcgttgc gcttcgccac cagaaagcgt cccagctgca 2340
cggctcattg ttaggtagtc gagcccaaca ttttttaaga agcctagtct agcacgaact 2400
tctttgaaaa ttggcgctgc aatttgtgtt tctttttcag atagttctaa gccatcgaag 2460
aaagcaagtg cttcattaat agaaaactca ctgatttgcc caatatgatg gtcgtttact 2520
ttaacggaaa gtgtttcttc ttttagacga tagcctttac aagatggaca tggtaaatca 2580
gtcatatatt gcgccatttg atcgcgtgtg aaatcggaat ttgtttcacg atagcgacgt 2640
tcgatatttg gaagtatccc ttcaaacgga atccacgttt cgcgtgtcat accgaaatca 2700
tttttgtatt cgaagtagaa ttctttatct tttgatccat ttaaaataat atctaattct 2760
tctttggata gcttctcaag aggtgtatcc atatctattc caaattcttt acaggcagaa 2820
gctagcattt gcgggtagta ctgtgaacta attgggcgcc aaggaataat agcaccttca 2880
tttagagaca tacttctatc aggaataacc gtgtcgacat cgacttcaag tttagtccca 2940
agtccatcac atgtggggca agcgccaaat gggctgttga aagagaacat tcttggttct 3000
aattcaccaa cggaaaaacc acaataaggg cacgcatagt gttcactaaa taataattct 3060
ttatccccca ttatatcaac aaccgcataa ccatcagcta aacgaagagc agcttcaatg 3120
gaatcataca gacgagtatt gatgccctct ttaatcacaa tgcgatcaat aatgatttca 3180
atagaatgct ttttgttttt ctcaatttca atttcgtcat tgatatcata aatttctcca 3240
tcaacacgaa ttcgaacata tccttctttt ttgatttcct caatagtttt cttatgtgtc 3300
ccttttttac cagaaacgat tggagccatt atttgaatac gtgttttttc tgggtattct 3360
agaacacgat ctaccatttg ttcgattgtt tgagaagtga tttcaatacc gtggatttgga 3420
caaaccggat gcccaacacg agcataaagt aagcgcaaat agtcatggat ttctgtaact 3480
gtcccaacag tggaacgtgg attacggctt gttgtttttt gatcaatcga aatggcaggg 3540
cttaatcctt caattaaatc cacatctggt ttatccattt gccctaaaaa ttggcgtgca 3600
tatgcggaca aagactctac ataacgtctt tgtccttctg cataaatcgt atcaaaagca 3660
agcgaagatt tacctgaacc tgaaagccca gtcataacta ctaatttgtc tctaggaatc 3720
tctacatcaa tgttttttaa gttatgggct cttgcaccct gaattactat tttctcttta 3780
tccaatttcg cttcatcctt ccgcttttat ttccagtaaa gcatcgcgaa gttcagcagc 3840
acgttcgaaa tcaagtgctt tagctgcttc tttcatttca tgttccatac cttcaatgaa 3900
tacatcgcgt tctttcttag acattttgct taaatcatgt tgcttcactg cttctctttc 3960
atctgcggca gaagtcgctg cgatgatacc acgaatttct tttttgattg tttttggcgt 4020
aatgccgtgt ttttcattat attcaatttg gattttacga cggcgttctg tttcgccaat 4080
agaattgcgc atcgaatcgg tcattttatc agcatacatg attactcgac cgttttcatt 4140
acgagcagct cgacccattg tttgaattaa ggaacgctcg gaacgaagga atccttcttt 4200
gtccgcatct aaaatagcga caagagatac ttcaggtaaa tcgattcctt cacgaagtaa 4260
gttaattcca acgataacat catacacacc aagtcgaagg tcacgaatga tttcgattcg 4320
ctcgagcgtc ttcacttccg agtggagata ctgtacttta acaccagctt ctttgagata 4380
gttggttaaa tcctcggaca tttttttcgt taaggtggtg attaaaacac gttcattttt 4440
ctcgacgcga tcgttaatct catccattaa gtcatcaatt tgtccttgaa tcggacggat 4500
ttctacgatt gggtctagca agccagttgg tcgaatgatt tgttcaatga catctggatt 4560
tttttctaat tcgtaagggc ctggtgtagc ggatataaac ataatttgat tgatatgctt 4620
ctcaaattct tctaaacgaa gcggcctatt atctagagcg ctaggcaatc taaagccatg 4680
atcaactagc atttgttttc tggcttggtc cccgttaaac ataccacgaa tttgcggcat 4740
cgtaacgtgt gactcatcaa ttaccatttg gaaatcatct gggaagtaat cgagtaacgt 4800
gtatggtgta actcccgctg gacgaaggga taaatgtcta gaatagttct caataccaga 4860
gcaatagccc atttcttcca tcatttccaa atcataattc gttcgctgtt caaggcgctg 4920
agcttctagc aatttattat ctgcacgtaa aactttaaga cggtcttcga gttcagcttt 4980
tatattaaca attgcttttt tcataatatc aggtctggtg acaaagtgag atgccgggaa 5040
aatggaaaca tgttctcttt ctcctataat ttcaccagta agtgcatcta cttctctaat 5100
tcgttcaatt tcatcaccga aaaattcaat ccgcatacag tgttcatctc ttgaagctgg 5160
gaaaatttcg acaacatcac cgcgaacacg gaagcgtcca cgttgaaaat ctatatcatt 5220
tcgatcatat tgaatatcta ctaatttgcg cagtagctga tcacggctaa tttccatgcc 5280
aacacgaagc gaaacgagca tctctccata ttcaatcggc gaacctaagc catagataca 5340
cgatacactc gcaatgataa ttacatcgcg acgttcaaaa agcgcagcag tagcagagtg 5400
acgaagctta tcgatttcat cattgatact tgcatctttt tcgatatatg tgtcactttg 5460
cggaacatag gcttctggtt gatagtaatc atagtaactg acaaaatatt ctacagcgtt 5520
atttgggaaa aactctttaa actcgctata cagctgtccc gctaacgtct tattgtgagc 5580
catgacaagt gtcggcttat ttacttcttg aatcacattg gatacggtaa aagttttccc 5640
tgtaccggtt gcaccaagta aagtttggtg tttcaagcct ttttttaatc ccgcaactaa 5700
ttgttctatc gctctaggtt ggtctccttg tgggctatac ttagaaacta actcaaattt 5760
atccttcaac tcggattccc cctattctgt atctgtccga ttctggtatc tgaaaagctt 5820
tgtttgtaaa aggtctagca aagcaaaaag cggatttttc agatccgtta atgtttctat 5880
tttatcataa atattttaat tagcctagca aaaaccgaac atattttcgc atttgttgaa 5940
aaataaaaaa cgcaacctgt tgattacgct tttctttatt ttatcacttt tacgcttttc 6000
tacctatata tttgctttgt taaaaatcac tgccactctt ctttaaacgt cgcagcatat 6060
acgttgcaag cacaaaacca atggtcatcg aaaaagcatc aataataatt agccacatag 6120
aactcgtata acctaacttg gcagaagcag caatcaaaat caccatcaaa agcaagccga 6180
cataacgatt ataagtgatt ctcgcaaaaa gaataacaag gaggcaaggg aaaataagcg 6240
cagatataat ttgatccatc ttacgttcct cccccttttt tatgcgtctc gtaatgcttt 6300
ggtcgttatt tccgttgtaa gctgtggtaa ttctgttttt tcgatacctt tttcagcaag 6360
catatctggt aaaatttctt ttaaaaagta cttaacgctc gccatttctc ggtactcata 6420
aatggttgca agtgcctcac tatagatttc cacaaaaata ttttctggat ttcctttttg 6480
aatttcgcca aaggattcat ataacaaatc tactttatca gaaattgcga ggattttccc 6540
ttccaacgta ctgtccttac cttcttttag caaatgacga taaatcggct ggtacgtttc 6600
tggaatttcc cgttcaataa agttttttgt catgctttct tccacttcgg aaag 6654
<210>10
<211>4612
<212>DNA
<213>單核細(xì)胞增生利斯特氏菌
<400>10
ccggttgcaa taatttgacc gccaccatcg ccaccttctg gacctaaatc aatcaagtaa 60
tcagcttgtt tgataacgtc aagattatgc tcaataacaa gtactgtatc gccattctct 120
tctacaagtc tttgtaatac tttgagtaaa cgaccaatat catctgcgtg gagtccggta 180
gttggttcat ccagaatata gaaagatttt ccgttactac gtttatgaag ttccgaagct 240
agtttgacgc gctgcgcttc accacctgaa agcgtagttg caggttgtcc aagtcgaata 300
tagccaagac caacatctac aattgtttga agtttacgcg caattcttgg ttggttggtg 360
aaatattcta gtccttcctc tacagtcatt tctaatactt cagcaatatt tttgccttta 420
taacgaatat ctaacgtctc accattgtat cgttttccat gacaaacttc acagggtaca 480
tatacatcag gcaagaaatg catttcaatt ttgatgattc cgtcgccttt acacgcctcg 540
caacggccac cttttacgtt aaaactaaag cgaccttttt tataaccacg aactttggct 600
tcattagtac ttgcgaaaag gtcacgaata tcatcgaaag ctcctgtata agtagctgga 660
ttcgatctcg gtgttcttcc gattggtgat tggtcaatat tgataatttt ttctaggttt 720
tcgatgcctt ttatttcttt gtgttcacct ggttttgcgt ggtttctatt tagttttctc 780
gctaacgctt ttcgcagtac ttcattcact aacgaacttt tacctgaacc tgaaactcca 840
gttacacagg aaaaagtagc tagtggaatt tttgcattta cgtttttgag attatttgct 900
ttagcaccaa taatttctaa ttctagtccg ttaccttttc tacgtttagc agggactgga 960
ataaattttt tacctgaaag atagtcacca gtgatggaat ttttattatt ggcaacttct 1020
tctggtgttc cggctgcaac aattcgtccg ccgtgttctc ctgcacctgg accaatatca 1080
ataagataat ctgcggccat catcgtatct tcgtcatgct caacgacaat aagcgtgttt 1140
ccaatgtcac gcatactttg gagtgtgctg attaaacgat cattatctcg ttgatgaaga 1200
ccgatggaag gttcatctaa aatataaagt acaccagtaa gtctggaacc gatttgtgta 1260
gcaagtcgaa ttcgttgcgc ttcgccacca gaaagcgtcc cagctgcacg gctcattgtt 1320
aggtagtcga gcccaacatt ttttaagaag cctagtctag cacgaacttc tttgaaaatt 1380
ggcgctgcaa tttgtgtttc tttttcagat agttctaagc catcgaagaa agcaagtgct 1440
tcattaatag aaaactcact gatttgccca atatgatggt cgtttacttt aacggaaagt 1500
gtttcttctt ttagacgata gcctttacaa gatggacatg gtaaatcagt catatattgc 1560
gccatttgat cgcgtgtgaa atcggaattt gtttcacgat agcgacgttc gatatttgga 1620
agtatccctt caaacggaat ccacgtttcg cgtgtcatac cgaaatcatt tttgtattcg 1680
aagtagaatt ctttatcttt tgatccattt aaaataatat ctaattcttc tttggatagc 1740
ttctcaagag gtgtatccat atctattcca aattctttac aggcagaagc tagcatttgc 1800
gggtagtact gtgaactaat tgggcgccaa ggaataatag caccttcatt tagagacata 1860
cttctatcag gaataaccgt gtcgacatcg acttcaagtt tagtcccaag tccatcacat 1920
gtggggcaag cgccaaatgg gctgttgaaa gagaacattc ttggttctaa ttcaccaacg 1980
gaaaaaccac aataagggca cgcatagtgt tcactaaata ataattcttt atcocccatt 2040
atatcaacaa ccgcataacc atcagctaaa cgaagagcag cttcaatgga atcatacaga 2100
cgagtattga tgccctcttt aatcacaatg cgatcaataa tgatttcaat agaatgcttt 2160
ttgtttttct caatttcaat ttcgtcattg atatcataaa tttctccatc aacacgaatt 2220
cgaacatatc cttctttttt gatttcctca atagttttct tatgtgtccc ttttttacca 2280
gaaacgattg gagccattat ttgaatacgt gttttttctg ggtattctag aacacgatct 2340
accatttgtt cgattgtttg agaagtgatt tcaataccgt gatttggaca aaccggatgc 2400
ccaacacgag cataaagtaa gcgcaaatag tcatggattt ctgtaactgt cccaacagtg 2460
gaacgtggat tacggcttgt tgttttttga tcaatcgaaa tggcagggct taatccttca 2520
attaaatcca catctggttt atccatttgc cctaaaaatt ggcgtgcata tgcggacaaa 2580
gactctacat aacgtctttg tccttctgca taaatcgtat caaaagcaag cgaagattta 2640
cctgaacctg aaagcccagt cataactact aatttgtctc taggaatctc tacatcaatg 2700
ttttttaagt tatgggctct tgcaccctga attactattt tctctttatc caatttcgct 2760
tcatccttcc gcttttattt ccagtaaagc atcgcgaagt tcagcagcac gttcgaaatc 2820
aagtgcttta gctgcttctt tcatttcatg ttccatacct tcaatgaata catcgcgttc 2880
tttcttagac attttgctta aatcatgttg cttcactgct tctctttcat ctgcggcaga 2940
agtcgctgcg atgataccac gaatttcttt tttgattgtt tttggcgtaa tgccgtgttt 3000
ttcattatat tcaatttgga ttttacgacg gcgttctgtt tcgccaatag aattgcgcat 3060
cgaatcggtc attttatcag catacatgat tactcgaccg ttttcattac gagcagctcg 3120
acccattgtt tgaattaagg aacgctcgga acgaaggaat ccttctttgt ccgcatctaa 3180
aatagcgaca agagatactt caggtaaatc gattccttca cgaagtaagt taattccaac 3240
gataacatca tacacaccaa gtcgaaggtc acgaatgatt tcgattcgct cgagcgtctt 3300
cacttccgag tggagatact gtactttaac accagcttct ttgagatagt tggttaaatc 3360
ctcggacatt tttttcgtta aggtggtgat taaaacacgt tcatttttct cgacgcgatc 3420
gttaatctca tccattaagt catcaatttg tccttgaatc ggacggattt ctacgattgg 3480
gtctagcaag ccagttggtc gaatgatttg ttcaatgaca tctggatttt tttctaattc 3540
gtaagggcct ggtgtagcgg atataaacat aatttgattg atatgcttct caaattcttc 3600
taaacgaagc ggcctattat ctagagcgct aggcaatcta aagccatgat caactagcat 3660
ttgttttctg gcttggtccc cgttaaacat accacgaatt tgcggcatcg taacgtgtga 3720
ctcatcaatt accatttgga aatcatctgg gaagtaatcg agtaacgtgt atggtgtaac 3780
tcccgctgga cgaagggata aatgtctaga atagttctca ataccagagc aatagcccat 3840
ttcttccatc atttccaaat cataattcgt tcgctgttca aggcgctgag cttctagcaa 3900
tttattatct gcacgtaaaa ctttaagacg gtcttcgagt tcagctttta tattaacaat 3960
tgcttttttc ataatatcag gtctggtgac aaagtgagat gccgggaaaa tggaaacatg 4020
ttctctttct cctataattt caccagtaag tgcatctact tctctaattc gttcaatttc 4080
atcaccgaaa aattcaatcc gcatacagtg ttcatctctt gaagctggga aaatttcgac 4140
aacatcaccg cgaacacgga agcgtccacg ttgaaaatct atatcatttc gatcatattg 4200
aatatctact aatttgcgca gtagctgatc acggctaatt tccatgccaa cacgaagcga 4260
aacgagcatc tctccatatt caatcggcga acctaagcca tagatacacg atacactcgc 4320
aatgataatt acatcgcgac gttcaaaaag cgcagcagta gcagagtgac gaagcttatc 4380
gatttcatca ttgatacttg catctttttc gatatatgtg tcactttgcg gaacataggc 4440
ttctggttga tagtaatcat agtaactgac aaaatattct acagcgttat ttgggaaaaa 4500
ctctttaaac tcgctataca gctgtcccgc taacgtctta ttgtgagcca tgacaagtgt 4560
cggcttattt acttcttgaa tcacattgga tacggtaaaa gttttccctg ta 4612
<210>11
<211>2042
<212>DNA
<213>單核細(xì)胞增生利斯特氏菌
<400>11
gcaagtatac agttaagttt gtaacgattt gttttgattt agactcaaaa cgtaaagttt 60
cttcatctac acgtaaagtc gttttatcaa agaagatttt aagtgcttca tcttctggat 120
attctttgaa tagtttaatc atcgcgtgaa ctttgatatc gttcgaatcg gatggtttaa 180
attcaatatt accattagca atttcgaatt ctaaaataga aagtgttgtg tcatgataaa 240
tgaaatcacg ttcgattttc gttgaagtta agaacgggaa tggcatatct ttcacttgtt 300
taaatgcact atttaggaaa gaaccgattt tttcaccagc ttgggataaa tcattaacca 360
tattgcgcat ggagtcttca cgatctttag aagaattttc gccgccttct tcttcatctc 420
tttcatgatt ttctggagtc ggttctgggc gtcttttacg actttttgga ggtgtataag 480
gatttccttg attgttccaa cctttactgt aatcatatga tggttcttct tttgtttctt 540
cttcgatttg ttcttcttct ctcggagctg cagatcgacg aatattttct tttgctgctg 600
ttttaccttc ttttttggaa atattttcaa gtagagtaag ggcttcttca gtggatataa 660
taccttgttt tactaattcg agaatacgtt tacgttcatt ttccattttc atttcctcct 720
ataatttagg ctaaactatt ttaggcttgc tttcacatgc aagtgacata tctgttttat 780
ctatgactct attatgaagg aaaatataat ttctgtcata caaccagagg atgattattt 840
gtttggactt tgggtggttt ggtcttaaga atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat 900
aagcgggatt ttgattattt tttcttagct gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta 960
tcgcgttcta aaattggttt caagtattta cctgtataag atttttttga gcgagcgatt 1020
ttttcaggtg tgccggttgc accaagtaaa gtttggtgtt tcaagccttt ttttaatccc 1080
gcaactaatt gttctatcgc tctaggttgg tctccttgtg ggctatactt agaaactaac 1140
tcaaatttat ccttcaactc ggattccccc tattctgtat ctgtccgatt ctggtatctg 1200
aaaagctttg tttgtaaaag gtctagcaaa gcaaaaagcg gatttttcag atccgttaat 1260
gtttctattt tatcataaat attttaatta gcctagcaaa aaccgaacat attttcgcat 1320
ttgttgaaaa ataaaaaacg caacctgttg attacgcttt tctttatttt atcactttta 1380
cgcttttcta cctatatatt tgctttgtta aaaatcactg ccactcttct ttaaacgtcg 1440
cagcatatac gttgcaagca caaaaccaat ggtcatcgaa aaagcatcaa taataattag 1500
ccacatagaa ctcgtataac ctaacttggc agaagcagca atcaaaatca ccatcaaaag 1560
caagccgaca taacgattat aagtgattct cgcaaaaaga ataacaagga ggcaagggaa 1620
aataagcgca gatataattt gatccatctt acgttcctcc ccctttttta tgcgtctcgt 1680
aatgctttgg tcgttatttc cgttgtaagc tgtggtaatt ctgttttttc gatacctttt 1740
tcagcaagca tatctggtaa aatttctttt aaaaagtact taacgctcgc catttctcgg 1800
tactcataaa tggttgcaag tgcctcacta tagatttcca caaaaatatt ttctggattt 1860
cctttttgaa tttcgccaaa ggattcatat aacaaatcta ctttatcaga aattgcgagg 1920
attttccctt ccaacgtact gtccttacct tcttttagca aatgacgata aatcggctgg 1980
tacgtttctg gaatttcccg ttcaataaag ttttttgtca tgctttcttc cacttcggaa 2040
ag2042
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>12
ctctggtacc tcctttgatt agtatattc 29
<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>13
ctcctcgaga tccgcgtgtt tcttttcgat tg 32
<210>14
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>14
ctcctcgagt ccatgggggg ttctcatcat c31
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>15
ctcctcgagt gcggccgcaa gctt24
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>16
gtcaaaacat acgctcttat c 21
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>17
acataatcag tccaaagtag atgc24
<210>18
<211>2762
<212>DNA
<213>炭疽芽孢桿菌
<400>18
actacttgct ctggcgttcc ggaagcaacg atttgtccac ctttgtctcc gccttctggt 60
ccaaggtcaa cgatataatc cgctgtttta attacatcta aattatgttc aatgacaagt 120
accgtctcac cgctctcaac aagacgttgc agcacttcta gaagacgggc gatatcatgc 180
gcatgtaaac cagtcgttgg ctcgtctaaa atgtatagtg tacgtcctgt agaacgacgg 240
tgtaattcag aagctaattt cacacgctgt gcttcaccac cagataaagt cgtggctggt 300
tgccctaatt tcatataacc aagcccaacg tctacaagcg tttgaagttt acgtttaatt 360
tttgggatat tagcgaagaa ctctactccg tcttcaatcg tcatccctaa cacttcagaa 420
atgtttttat ctttatattt cacttctaac gtttcacggt tgtaacgttt accgtgacaa 480
acttcacacg gaacgtatac gtctggtaag aagtgcatct caattttaat aattccatca 540
ccacggcacg cttcacaacg tccacctttt acgttaaagc tgaaacgccc tttttgatat 600
ccgcgcactt tcgcttcatt cgtttgcgca aacacatcac gaatatcatc gaacacacct 660
gtataggttg ctggattaga acgtggtgta cgaccgattg gcgattgatc aatatcgata 720
actttatcta aatgctcaag acctttaatt tctttatgag tacctggctt cgctttcgct 780
ttatataact tttgcgctaa cgatttatat agtacttcat taatcatcgt acttttacct 840
gatccagata cacccgttac cgctacaaac gtaccaagcg ggaatgacat cttcgcgttc 900
tttaagttat tctcttttgc accgacaatc tccactttac gtccatcacc tttacgtctt 960
tcaagtggaa ctggaataaa ctctttaccg cttaaatact tacctgttag tgaattctca 1020
tcttgcatca cttcagctgg tgtacccgct gatacaactt gtccaccgtg aatacctgcg 1080
ccaggcccga tatccagtaa ataatcagct gccatcatcg tatcttcatc atgctcaaca 1140
acaattaacg tattacctaa atcacgcatt tcttgcaatg tacgaataag acgatcgtta 1200
tcgcgctgat gcaaaccgat agaaggctca tcaagaatgt aaagcacccc agtaagacgc 1260
gaaccaattt gcgttgctaa acgaatacgt tgcgcctcac caccagataa agttcctgcg 1320
gcacgactta acgttaaata atctaaacca acgtttacta agaacccaac gcgctcttga 1380
atttctctta aaattaaatg ggcaattttt tgttgtttct ctgttagctc cacatttgag 1440
aagaattcct gtacttcttg aacagaatac ttcgttacat cagcaatcgt ttttccgcca 1500
acgaaaacag ctaaactttc aggctttaag cgtccgcctt tacacttcgg acaagcttgt 1560
tctgccatat acttttccat ttgctcacga atgtaatccg aactcgtctc acgataacga 1620
cgttcaatat ttggaataac accttcaaat aaaatctcat tttcctttac ttgaccaaat 1680
tcatttacat agcggaaata aactttctct tcaccgcttc cgtacaacac tttatcaaat 1740
aaatctttcg gtatatcttt tacaggcaca tccatatcca cgccataatg attacataca 1800
gattgtaaaa gctgtgggta atattgtgaa cttgtcggtt cccaaggcgc aatcgcatgc 1860
tcatttaatg ataaatccca gttcggaata acaagttcta aatctacctc taactttgag 1920
ccaagcccat cacaagaagg acatgcaccg aacggactat tgaatgagaa catacgcggc 1980
tctaattctc caattgaaaa accacaatgc ggacaagcat gatgttcact aaatagaagc 2040
tcctcttctc ccataacatc gattaacact cgtcccccgc caagctttaa tgcactttca 2100
agagaatcag caagacggct tgcgattcct tcttttacaa caatacggtc aattacaact 2160
tcaatagaat gcttcttatt tttatctaac gcaatatctt cagacacatc gagcatttca 2220
ccatcaacac gtacacgaac ataaccttgc ttcttaatat cttcaagtac ttttacatgt 2280
gcacctttac gcccagaaac gataggagct aacacttgta atttcgtacg ttcagggtac 2340
tcaagtacac ggtctaccat ttgctctact gtttgcgatg taatttcaat gccatgattc 2400
ggacaaattg gcgtaccaat tcgcgcaaat aataaacgta agtaatcata aatctccgtt 2460
accgttccaa cagttgaacg cggattacga ctcgtcgttt tttgatcgat tgaaatcgct 2520
ggagataagc cttcaatcgt atctacatcc ggcttatcca tttgccctaa aaactggcgt 2580
gcatacgcag ataacgattc tacgtatctg cgctgccctt ctgcataaat cgtatcaaat 2640
gctaatgagg atttccctga accagacaat cctgttacaa cgacaagttg atttctcgga 2700
atggttacat caatattttt taagttatgt gctctagcac cttttacaac gataaaatcc 2760
tt2762
<210>19
<211>1908
<212>DNA
<213>炭疽芽孢桿菌
<400>19
tgcttttgct gcttctttca tttctgcttc catcttcgca attgtctttt cacgctcttt 60
tttcgtcatc ttcttagctg gcgtcgcttc atatgtttcc ggctcttcag cagctgtcgt 120
tgcacggatt acatcacgca cacctttttg aatcgttttc ggcgtaatac catgctcttc 180
attgtaagct tcttgtatac tacgacgacg cttcgtctct tcaatcgcaa tccccatcga 240
tctcgttata cgatctgcgt acataataac gcgaccgttt tcattacgtg ctgcacggcc 300
aattgtttga attaacgaac gctctgaacg caagaatcct tccttatcgg catctaaaat 360
agctacaagg gatacttctg gaatatctaa tccttctcgc aataagttaa taccaacgag 420
aacatcaaac ttaccaaggc gaagatctcg tataatttca atacgttcta acgttttcac 480
ttcagaatgc agataattca ccttaattcc tacatctttt aagtagtctg ttaaatcctc 540
tgacatcttc ttcgttaaag ttgtaattaa tacacgttca ttttttgcaa tgcgatcttg 600
aatctctcct aatagatcgt caatctgccc ttcaattggt cgtatatcaa ttggcggatc 660
taaaagccct gttggacgaa taatttgttc tattacttct ggcgactgct ctaattcata 720
cggtcctggc gttgctgaaa cgtaaataac ttgattcgtt ttctcttcaa actcatcaaa 780
tgtgagcggt ctattatcta aagctgatgg cagacggaat ccatgatcca caagcacttg 840
tttacgcgct tggtccccgt tatacatcgc tcttacttgc ggcactgata cgtgggactc 900
atccataacg attaagaaat ctttcgggaa atagtctaat aacgtatacg gcgttgcacc 960
cgctggacga agtgttaaat gacgggaata gttttcaatc cctgaacaaa agcccatctc 1020
gcgcatcatt tctaaatcat aacgtgtacg ctgttctata cgctgcgctt ctaacaactt 1080
accgttatca tttaattcct ttaaacgctc ttctaattct ttttcgatat tttcaatagc 1140
gaccttcatc ttttcttcac gtgtaacgaa gtgagatgct gggaagattg ctacatgatc 1200
acgttctgct aatacttctc ccgttaaagc atttacttcg cgaatacgat caatttcatc 1260
gccaaaaaac tcaattcgaa tgcaatgctc gtcaagtgat gccgggaaga tttcaactac 1320
atctccgcgc acgcggaatg taccacgctt gaaatcaata tcattacgtc catactgcac 1380
atcaacaagt tcacgaagca attgattgcg gtccttttcc ataccaactc gaagtgaaac 1440
aactaactcg cggtattctt ctggagaacc taaaccatat atacacgaaa cactcgcaac 1500
aataattaca tcatcccgtt caaataatgc ggacgttgct gagtgacgca atttatcgat 1560
ttcatcatta atctgcgcgt ctttttcaat aaacgtatct gtttgtggca catacgcttc 1620
tggctgataa taatcgtaat aactaacaaa atattcaact gcattattcg ggaaaaagtc 1680
tttcaactca ctatataact gtcctgctaa cgttttattg tgagccatga caagcgttgg 1740
cttttgcact tctttaatga catttgaaat cgtaaatgtc ttacccgttc ctgtcgcccc 1800
aagcaacact tgctttttct ttccactatt aattccctct acaagcttct ctatagctac 1860
cggctgatca ccttgcgggg aatacgctga gacaatttca aattgacg 1908
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>20
Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe
1 5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>21
Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe
1 5
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>22
gttaagtttc atgtggacgg caaag 25
<210>23
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>23
aggtcttttt cagttaacta tcctctcctt gattctagtt at42
<210>24
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>24
caaggagagg atagttaact gaaaaagacc taaaaaagaa ggc 43
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>25
tcccctgttc ctataattgt tagctc 26
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>26
gtggacggca aagaaacaac caaag 25
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>27
gttcctataa ttgttagctc atttttttc 29
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>28
ctctggtacc tcctttgatt agtatattc 29
<210>29
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>29
caatggatcc ctcgagatca taatttactt catccc 36
<210>30
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>30
atttctcgag tccatggggg gttctcatca tc 32
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>31
ggtgctcgag tgcggccgca agctt 25
<210>32
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>32
cgattcccct agttatgttt accaccaatt tgctgca 37
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>33
gcaaattggt ggtaaacata actaggggaa t 31
<210>34
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>34
agtccaagtt atgcatatca tcaattt27
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>35
cgatagtcca agttatgcat atcatcaatt tgc 33
<210>36
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>36
gtcgcaaatt gatgatatgc ataacttgga ctat 34
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>E.coli
<400>37
Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu
1 5
<210>38
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>38
ctgtgctttg cgaatggaaa gaagc25
<210>39
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>39
gttttcattc atacacttag acaagcgttg gcttttgcac ttc43
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>40
gacaagcgtt ggcttttgca cttc 24
<210>41
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>41
caaaagccaa cgcttgtcta agtgtatgaa tgaaaaccga gtgg44
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>42
aagtgtatga atgaaaaccg agtgg 25
<210>43
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>43
catataaagg ttccacaatt gccttttc 28
<210>44
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>44
gaagcagaaa tgaagccaat actcaatc 28
<210>45
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>45
ggttccacaa ttgccttttc aataatc 27
<210>46
<211>6
<212>PRT
<213>炭疽芽孢桿菌
<400>46
Lys Val Val Lys Asn Lys
1 5
<210>47
<211>12
<212>DNA
<213>炭疽芽孢桿菌
<220>
<221>misc_特征
<222>5，6，7，8
<223>n＝A，T，C或G
<400>47
gaacnnnngt tc 12
<210>48
<211>331
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>48
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Ser Pro
50 55 60
Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu Leu Ile
65 70 75 80
Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn Val Leu
85 90 95
Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val Asn Ala
100 105 110
Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Thr Phe Lys Asp Glu Asp Thr
115 120 125
Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro Val Gln
130 135 140
Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala Ser Glu
145 150 155 160
Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala ser Gly Thr Met Ser Met
165 170 175
Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser
180 185 190
Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Val Leu Gln Glu Leu
195 200 205
Asn Val Thr Val Arg Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile
210 215 220
Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr
225 230 235 240
Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala
245 250 255
Asn Lau Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala
260 265 270
Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val
275 280 285
Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe
290 295 300
Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys Ile Lys His Ile Ala Thr Asn
305 310 315 320
Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val Ser pro
325 330
<210>49
<211>8
<212>PRT
<213>紅原雞(Gallus gallus)
<400>49
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>50
Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr Val
1 5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>51
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu
1 5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>52
Tyr Leu Ser Gly Ala Asp Leu Asn Leu
1 權(quán)利要求
1.包含自生微生物的疫苗，其中該微生物的核酸通過(guò)與直接與核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中的核酸靶向化合物是核酸烷化劑。
3.權(quán)利要求2的疫苗，其中的核酸烷化劑是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。
4.權(quán)利要求1的疫苗，其中的核酸靶向化合物通過(guò)輻射被活化。
5.權(quán)利要求4的疫苗，其中的核酸靶向化合物是被UVA輻射而活化的補(bǔ)骨脂素化合物。
6.權(quán)利要求5的疫苗，其中的核酸靶向化合物是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。
7.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述微生物包含基因突變，該突變使微生物修復(fù)其被改變的核酸的能力減弱。
8.權(quán)利要求7的疫苗，其中所述微生物在DNA修復(fù)酶上有缺陷。
9.權(quán)利要求8的疫苗，其中的基因突變位于一個(gè)或者多個(gè)選自以下的基因上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于選自以下的一個(gè)或者多個(gè)基因的功能等價(jià)物上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。
10.權(quán)利要求9的疫苗，其中所述微生物包含基因突變，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等價(jià)物上。
11.權(quán)利要求8的疫苗，該疫苗對(duì)于RecA，或者RecA功能等價(jià)物是缺陷的。
12.權(quán)利要求1的疫苗，其中的微生物是細(xì)菌。
13.權(quán)利要求12的疫苗，其中的微生物是結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。
14.權(quán)利要求12的疫苗，其中的微生物是炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)。
15.權(quán)利要求12的疫苗，其中的微生物是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。
16.權(quán)利要求15的疫苗，其中的微生物在uvrA和uvrB上至少包含一個(gè)突變。
17.權(quán)利要求16的疫苗，其中的微生物還在actA基因或inlB基因或者兩個(gè)基因上包含突變。
18.權(quán)利要求1的疫苗，其中的微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。
19.權(quán)利要求1的疫苗，其中疫苗還包含藥物上可接受的載體或者佐劑。
20.在宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求1中的疫苗。
21.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求1中的疫苗，其中的微生物表達(dá)該抗原。
22.分離的專職性抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞包含自生的微生物，其中該微生物的核酸通過(guò)與直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減。
23.權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞，它是樹(shù)突細(xì)胞。
24.權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的核酸靶向化合物是核酸烷化劑。
25.權(quán)利要求24的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的核酸烷化劑是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。
26.權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的核酸靶向化合物通過(guò)輻射而活化。
27.權(quán)利要求26的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的核酸靶向化合物是被UVA輻射活化的補(bǔ)骨脂素化合物。
28.權(quán)利要求27的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的核酸靶向化合物是4′-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5′，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。
29.權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物包含基因突變，該突變使微生物修復(fù)其被改變的核酸的能力減弱。
30.權(quán)利要求29的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物在DNA修復(fù)酶上有缺陷。
31.權(quán)利要求30的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的基因突變位于一個(gè)或者多個(gè)選自以下組的基因上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于選自以下組的一個(gè)或者多個(gè)基因的功能等價(jià)物上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。
32.權(quán)利要求31的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物包含基因突變，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等價(jià)物上。
33.權(quán)利要求31的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物對(duì)于RecA，或者RecA功能等價(jià)物是缺陷的。
34.權(quán)利要求23的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物是細(xì)菌。
35.權(quán)利要求34的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物是結(jié)核分支桿菌。
36.權(quán)利要求34的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。
37.權(quán)利要求32的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物在uvrA和uvrB上包含至少一個(gè)突變。
38.權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。
39.包含權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞的疫苗。
40.在宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞。
41.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物包含編碼表達(dá)該抗原的核酸序列。
42.在體外活化原初T細(xì)胞的方法，該方法包括在適宜的條件下，使原初T細(xì)胞與權(quán)利要求22的專職性抗原呈遞細(xì)胞接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以活化原初T細(xì)胞。
43.用抗原荷載專職性抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括使專職性抗原呈遞細(xì)胞在體外在適宜的條件下與包含有編碼該抗原的核酸序列的自生微生物接觸足夠的時(shí)間，以使專職性抗原呈遞細(xì)胞荷載，其中的微生物核酸通過(guò)與直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減。
44.使專職性抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟的方法，該方法包括使專職性抗原呈遞細(xì)胞在體外在適宜的條件下與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸足夠的時(shí)間，以使專職性抗原呈遞細(xì)胞活化和/或成熟，其中的微生物核酸通過(guò)與直接與核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減。
45.預(yù)防或者治療宿主體內(nèi)疾病的方法，包括以下步驟(a)使專職性抗原呈遞細(xì)胞與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸使其荷載抗原，其中的微生物核酸通過(guò)與直接與核酸發(fā)生反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)向宿主施用有效量的包含負(fù)載的專職性抗原呈遞細(xì)胞的組合物。
46.在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)于抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟(a)使專職性抗原呈遞細(xì)胞與包含有編碼抗原的核酸序列的自生微生物接觸使其荷載抗原，其中的微生物核酸通過(guò)與直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減；以及(b)向宿主施用有效量的包含負(fù)載的專職性抗原呈遞細(xì)胞的組合物。
47.分離的突變單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，該菌株包含基因突變，該突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。
48.權(quán)利要求47的突變體菌株，它在至少一種DNA修復(fù)酶上有缺陷。
49.權(quán)利要求47的突變菌株，它的UvrA，UvrB失活或者UvrA和UvrB二者均失活。
50.權(quán)利要求49的突變菌株，它在uvrA基因、uvrB基因或者uvrA和uvrB兩個(gè)基因上包含基因突變。
51.權(quán)利要求47的突變菌株，其中該菌株的細(xì)菌的核酸已經(jīng)被改變，使得細(xì)菌的增殖被衰減。
52.權(quán)利要求47的突變菌株，它選自由以下菌株組成的組保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的編號(hào)為PTA-5563的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-/uvrAB-菌株，或者所保藏的菌株的突變株，該突變株在UvrA、UvrB以及ActA上具有缺陷。
53.權(quán)利要求52的突變菌株，它是保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的編號(hào)PTA-5562的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA-/inlB-菌株。
54.包含(a)權(quán)利要求47的突變菌株以及(b)藥物上可以接受的載體或者佐劑的疫苗。
55.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的包含權(quán)利要求47的菌株的組合物，其中的菌株包含編碼該抗原的核酸分子。
56.在宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的包含權(quán)利要求47的菌株的組合物。
57.包含權(quán)利要求47的菌株的專職性抗原呈遞細(xì)胞。
58.分離的突變炭疽芽孢桿菌菌株，該菌株包含基因突變，該突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。
59.權(quán)利要求58的突變菌株，它至少在一種DNA修復(fù)酶上有缺陷。
60.權(quán)利要求59的突變菌株，它的UvrA、UvrB減弱或者UvrA和UvrB二者均減弱。
61.權(quán)利要求60的突變菌株，它在uvrA基因、uvrB基因或者uvrA和uvrB兩個(gè)基因上包含基因突變。
62.權(quán)利要求58的突變菌株，它在lef基因、cya基因或者兩個(gè)基因中包含一個(gè)或者多個(gè)降低該菌株毒性的突變。
63.權(quán)利要求58的突變菌株，其中該菌株的細(xì)菌的核酸已經(jīng)被改變，使得細(xì)菌的增殖被衰減。
64.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)炭疽芽孢桿菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的包含權(quán)利要求58的突變菌株的組合物。
65.在宿主中預(yù)防或者治療炭疽芽孢桿菌感染的方法，該方法包括向宿主施用有效量的包含權(quán)利要求58的突變菌株的組合物。
66.包含自生的微生物的疫苗，所述的微生物至少在一種DNA修復(fù)酶上有缺陷。
67.權(quán)利要求66的疫苗，其中的微生物包含基因突變，該突變位于一個(gè)或者多個(gè)選自以下組的基因上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于選自以下組的一個(gè)或者多個(gè)基因的功能等價(jià)物上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。
68.權(quán)利要求67的疫苗，其中的微生物包含基因突變，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等價(jià)物上。
69.權(quán)利要求66的疫苗，其在RecA或者RecA的功能等價(jià)物上有缺陷。
70.權(quán)利要求66的疫苗，其中的微生物是細(xì)菌。
71.權(quán)利要求66的疫苗，其中的微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。
72.權(quán)利要求66的疫苗，其中的疫苗還包含藥物上可接受的載體或者佐劑。
73.在宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求66的疫苗。
74.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求66的疫苗，其中的微生物表達(dá)該抗原。
75.分離的專職性抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞包含自生的微生物，所述的微生物至少在一種DNA修復(fù)酶上有缺陷。
76.權(quán)利要求75的抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物包含基因突變，該突變位于一個(gè)或者多個(gè)選自以下組的基因上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于選自以下組的一個(gè)或者多個(gè)基因的功能等價(jià)物上phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。
77.權(quán)利要求76的抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物包含基因突變，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等價(jià)物上。
78.權(quán)利要求75的抗原呈遞細(xì)胞，其在RecA或者RecA的功能等價(jià)物上有缺陷。
79.權(quán)利要求75的抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物是細(xì)菌。
80.權(quán)利要求75的抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物包含編碼抗原的異源核酸序列。
81.在宿主中預(yù)防或者治療疾病的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求75的抗原呈遞細(xì)胞。
82.在宿主中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向宿主施用有效量的權(quán)利要求75的抗原呈遞細(xì)胞，其中的微生物表達(dá)該抗原。
83.用于醫(yī)療用途的自生的微生物，其中的微生物核酸通過(guò)與直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減。
84.用于醫(yī)療用途的抗原呈遞細(xì)胞，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含自生的微生物，其中的微生物核酸通過(guò)與直接與核酸反應(yīng)的核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而被改變，這樣微生物的增殖被衰減。
85.用于醫(yī)療用途的突變單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，其中的突變單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株包含基因突變，該突變使其修復(fù)其核酸的能力減弱。
86.用于醫(yī)療用途的自生的微生物，其中的微生物至少在一種DNA修復(fù)酶上有缺陷。
87.權(quán)利要求86的微生物，它是炭疽芽孢桿菌或者單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。
88.用于醫(yī)療用途的抗原呈遞細(xì)胞，其中的抗原呈遞細(xì)胞包含自生的微生物，其中的微生物至少在一種DNA修復(fù)酶上有缺陷。
89.試劑盒，該試劑盒包含(a)包含權(quán)利要求47的突變單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株、權(quán)利要求58的突變炭疽芽孢桿菌菌株或者自生的微生物的組合物，其中自生的微生物的核酸與核酸靶向化合物發(fā)生反應(yīng)而已經(jīng)被改變；以及(b)使用本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或者治療宿主中的疾病的用法說(shuō)明。
全文摘要
本發(fā)明提供了自生微生物，其中的核酸被修飾使得增殖衰減，和/或其中包含遺傳突變，減弱了該微生物修復(fù)其核酸的能力。還提供了使用該修飾的微生物使抗原呈遞細(xì)胞荷載、活化和/或成熟的方法。還提供了包含該經(jīng)修飾的微生物和/或抗原呈遞細(xì)胞的疫苗組合物以及使用這些疫苗的方法。還可以進(jìn)一步修飾該微生物使其包含異源抗原，例如腫瘤抗原或者傳染性疾病抗原，用作抵御疾病或者傳染性疾病的疫苗。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1761483SQ20048000705
公開(kāi)日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者T·W·小杜本斯基, D·G·布羅克施泰特, K·巴赫賈特, J·E·赫斯特, D·庫(kù)克 申請(qǐng)人:塞魯斯公司