專利名稱：用于免疫活性或防治癌癥的包含從釀酒酵母is2中得到的可溶性葡聚糖低聚物的組合物 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含從釀酒酵母IS2中分離得到的可溶性葡聚糖低聚物的組合物及其制備方法，該組合物可用于免疫活性或者防治癌癥。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖可以從各種來(lái)源如酵母菌、微生物、蘑菇、谷物和藻類中分離得到。到目前為止，已對(duì)β-葡聚糖進(jìn)行了研究并以各種形式的產(chǎn)品加以應(yīng)用。特別是對(duì)從酵母菌細(xì)胞壁得到的β-葡聚糖進(jìn)行了研究，具有很深的了解。
酵母菌是一種微生物，F(xiàn)DA將其分類為GRAS(食品安全規(guī)范)，該菌用于包括食品領(lǐng)域在內(nèi)的各種領(lǐng)域，其內(nèi)層細(xì)胞膜包括作為主要成份的1，3-和1，6-葡聚糖，還有少量的甲殼質(zhì)和甘露蛋白質(zhì)；然而其外層細(xì)胞膜包括連接甘露聚糖的甘露蛋白質(zhì)。
β-葡聚糖是酵母菌細(xì)胞壁的主要成份。據(jù)報(bào)道，β-葡聚糖能夠通過(guò)激活和激增巨噬細(xì)胞來(lái)增加Ag-特異性免疫反應(yīng)，能提高對(duì)病原體如真菌、細(xì)菌、病毒等的抵抗力，能抑制外傷中出現(xiàn)的免疫消弱和能增加宿主對(duì)癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移的抵抗力。(Abel，G.and Czop，J.K.，INT.J.Immunophamacol.，14，pp1363-1373，1992；Babineau，et al.，220(5)，pp601-609，1994；Benach J.L.，et al.，Infection and Immunity，35(3)，pp947-951，1982；Di Renzo，L.，et al.，Eur.J.Immunol.，21，pp1755-1758，1991；Fukase，S.，et al.，Cancer Res.，47，pp4842-4847，1987；Janusz，M.J.，etal.，J.Immun.，142，pp959-965，1989；Olsen，E，J.，et al.，J.Immun.，64，pp3548-3554，1996，Sakurai，T.，et al.，Int.J.Immunopharmacol.，14，pp821-830，1992；Czop，J.K.，et al.，Prog.Clin.Biol.Res.，297，pp287-296，1989)。
因?yàn)榻湍妇摩?葡聚糖是水不溶性多糖，所以到目前為止，已經(jīng)發(fā)展出許多制備高溶解性β-葡聚糖的方法，如下所述。
美國(guó)專利No.5,576,015公開(kāi)了細(xì)微粒形式的β-葡聚糖的制備方法以提高其吸收率；美國(guó)專利No.4,877,777公開(kāi)了向葡聚糖上引入化學(xué)式以提高其溶解性的方法；美國(guó)專利No.5,037,972和美國(guó)專利No.6,143,883公開(kāi)了制備可溶性葡聚糖顆粒的方法，該方法包括用有機(jī)溶劑提取葡聚糖，然后用β-葡聚糖酶或者纖維素酶處理該葡聚糖，這些酶能降解葡聚糖的基本結(jié)構(gòu)β-1，3-D-葡萄糖鏈。
然而，上述引用文獻(xiàn)中并未報(bào)道或公開(kāi)從酵母變異菌株IS2(KCTC0959BP)分離得到的特定可溶性葡聚糖低聚物及該葡聚糖低聚物對(duì)癌癥疾病的治療效果，這些公開(kāi)在此并入作為參考。
本發(fā)明的發(fā)明人致力于研究從特定的酵母變異菌株中找到具有藥學(xué)活性的β-葡聚糖并最終完成本發(fā)明，確認(rèn)通過(guò)提取酵母菌突變體IS2細(xì)胞壁所得到的M.W.小于50,000D的可溶性葡聚糖低聚物顯示了強(qiáng)大的對(duì)免疫系統(tǒng)刺激活性和對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制活性。
對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的以下詳細(xì)描述會(huì)使本發(fā)明的上述目的和其它目的顯而易見(jiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了源自酵母菌變異菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物及其制備方法。
另外，本發(fā)明提供了用于提高免疫力和抗癌活性的包含利用本發(fā)明方法制備的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物。
相應(yīng)地，本發(fā)明的目的是提供具有免疫提高活性和癌細(xì)胞增殖抑制活性的可溶性葡聚糖低聚物，該可溶性葡聚糖低聚物源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細(xì)胞壁，通過(guò)用酶處理不溶性β-葡聚糖得到。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備可溶性葡聚糖低聚物的方法，該方法包括以下步驟(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母菌(釀酒酵母)變異IS2用于接種；(b)將上述酵母菌培養(yǎng)溶液接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)并離心得到酵母菌；(c)向其中加入NaOH以從酵母菌細(xì)胞壁中提取β-葡聚糖；(d)將提取的β-葡聚糖與水解酶反應(yīng)，然后經(jīng)過(guò)濾得到可溶性葡聚糖低聚物；和(e)最后冷凍干燥以得到本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物。
上述酵母變異IS2的特征是具有提高免疫力活性。
通過(guò)上述步驟制備的可溶性葡聚糖低聚物包括分子量小于50,000，優(yōu)選范圍1,000-10,000的葡聚糖低聚物。
本發(fā)明的又一目的是提供可作為有效成份的、以有效劑量治療或預(yù)防免疫缺陷疾病或癌癥的藥物組合物及其藥學(xué)可接受載體，該藥物組合物包括通過(guò)上述步驟獲得的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細(xì)胞壁的可溶性葡聚糖低聚物。
可根據(jù)下述優(yōu)選的實(shí)施方案制備該具有創(chuàng)造性的可溶性葡聚糖低聚物。
對(duì)于本發(fā)明，上述可溶性葡聚糖低聚物可通過(guò)以下步驟制備；(a)第一步，培養(yǎng)酵母菌IS2(KCTC0959BP)的步驟，包括在含有0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母菌提取物和0.1-10w/v％蛋白胨(pepton)的液態(tài)培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)酵母菌IS2(KCTC0959BP)；(b)第二步，從酵母菌培養(yǎng)介質(zhì)中得到酵母菌的步驟，包括將第一步制備的數(shù)量范圍為0.1-10v/v％的酵母菌培養(yǎng)介質(zhì)接種到PH范圍為5.0-6.0的含0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母菌提取物、0.01-2w/v％硫酸銨、0.001-1w/v％磷酸鉀和0.001-1w/v％的硫酸鎂的初級(jí)液態(tài)培養(yǎng)介質(zhì)中，在速度范圍100-400rpm下培養(yǎng)12-48小時(shí)，通氣量范圍從0.3-3vvm，生長(zhǎng)介質(zhì)的溫度范圍為20-40℃，然后經(jīng)離心以得到酵母菌；(c)第三步，從酵母菌細(xì)胞壁中提取濕的β-葡聚糖的步驟，包括向酵母菌中加入1-10％的氫氧化鈉溶液，分散，在70-100℃溫度范圍內(nèi)反應(yīng)30分鐘到5小時(shí)，然后經(jīng)離心就得到干燥的酵母菌細(xì)胞群，該過(guò)程可重復(fù)數(shù)次并合并，用強(qiáng)酸如鹽酸或硫酸將細(xì)胞群的PH滴定到4.0-5.0范圍內(nèi)，重新分散在氫氧化鈉溶液中，在75℃下進(jìn)一步反應(yīng)1小時(shí)，經(jīng)離心分離氫氧化鈉溶液和固體成份；最后，洗滌并純化該固體成份以得到濕的β-葡聚糖；(d)第四步，得到葡聚糖低聚物液態(tài)相的步驟，包括向上述所得物中加入數(shù)量等于葡聚糖體積(v/v％)1-10倍的蒸餾水和等于葡聚糖(v/w％)1/20到1/5量的β-葡聚糖水解酶，在30-80℃溫度范圍內(nèi)反應(yīng)6-24小時(shí)，淬滅反應(yīng)后經(jīng)離心回收上清液，用超濾膜過(guò)濾上清液以得到分子量小于50,000的具有發(fā)明性質(zhì)的可溶性葡聚糖低聚物
(e)第五步，得到最終可溶性葡聚糖低聚物干燥粉末形式的步驟，包括將第四步所制備的低聚物在低于-70℃下單獨(dú)放置12-48小時(shí)，然后經(jīng)冷凍干燥以得到本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物干燥粉末形式。
本發(fā)明的另一目的是提供制備上述可溶性葡聚糖低聚物的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供采用上述方法制備的、源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，另外，本發(fā)明的目的還包括提供可作為有效成份的、以有效劑量治療或預(yù)防免疫缺陷疾病或癌癥的藥物組合物及其藥學(xué)可接受載體，該藥物組合物包括通過(guò)上述步驟獲得的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細(xì)胞壁的可溶性葡聚糖低聚物。
本發(fā)明的組合物可用于加強(qiáng)或激活免疫系統(tǒng)。
上面提到的免疫缺陷疾病包括由各種細(xì)菌或病毒引起的傳染疾病。
上面提到的癌癥疾病包括各種疾病如肺癌、砷細(xì)胞(arsenic cellular)肺癌、結(jié)腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、腦或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、胃癌、肛周癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌(vulvul carcinoma)、何杰金淋巴瘤、食道癌、腸癌、內(nèi)分泌腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、平滑組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞瘤、膀胱癌、腎癌、輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎骨盆癌、CNS腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、脊髓瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤和垂體腺瘤。
本發(fā)明的另一方面還提供了藥物結(jié)合物，該結(jié)合物可適當(dāng)?shù)丶尤牖虺チ硪环N免疫增強(qiáng)劑或癌癥藥物，也可在保持它們藥效的限度內(nèi)增加或減少藥物的組合物比率。
本發(fā)明的目的之一為提供包括源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物在制備治療性藥物方面的用途，該治療性藥物主要用于治療或預(yù)防人體或哺乳動(dòng)物的免疫缺陷和癌癥疾病。
本發(fā)明的目的之一為提供治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物免疫缺陷和癌癥疾病的方法，包括將包含源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的組合物及其藥學(xué)可接受載體以有效劑量給藥到所述哺乳動(dòng)物這一步驟。
根據(jù)所使用的方法，該發(fā)明性組合物可另外包括常規(guī)的載體、輔料或稀釋劑。根據(jù)用途和應(yīng)用方法，所述載體優(yōu)選地用作合適物質(zhì)，但這并不是限制性的。合適的稀釋劑列于《雷氏藥學(xué)大全》(MackPublishing co，Easton PA)的書面文本中。
以下所述的配制方法和賦形劑僅僅是示例性的，而決不是對(duì)本發(fā)明的限制。
本發(fā)明的組合物可以藥物組合物的形式給出，包括藥學(xué)可接受載體、輔料或稀釋劑，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇糖、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、淀粉、金合歡橡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。配制中可另外包括填料、抗粘合劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、調(diào)味劑、乳化劑和防腐劑等。通過(guò)采用本領(lǐng)域熟知的任何操作來(lái)配制本發(fā)明的組合物，使其在對(duì)病人給藥后，有效成份能夠快速、持續(xù)或延遲釋放。
例如，本發(fā)明的組合物可溶解在油類、丙二醇或其它通常用來(lái)生產(chǎn)注射劑的溶劑中。合適的載體例子包括生理鹽水、丙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸異丙酯等，但并不限于這些。對(duì)于局部給藥，本發(fā)明的提取物可配制成軟膏和乳膏的形式。
包括原料藥組合物的藥學(xué)配制劑可以制備成任何形式，如口服劑量形式(粉末、片劑、膠囊、軟膠囊、水性藥物、糖漿、酏丸劑、粉末、小藥囊、粒劑)或局部制劑(乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、香膏、貼片、泥膏劑、噴霧溶液、氣霧劑等等)、栓劑或無(wú)菌可注射制劑(溶液、懸浮劑、乳劑)。
以藥學(xué)劑量形式存在的本發(fā)明組合物可以以它們藥學(xué)可接受的鹽的形式使用，也可單獨(dú)或適當(dāng)結(jié)合，及與其它藥學(xué)活性成份組合使用。
該發(fā)明性組合物所需的劑量隨被治療者的身體狀況和體重、嚴(yán)重程度、劑型、給藥途徑和給藥期的變化而變化，可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇。然而，為了獲得所需效果，通常建議本發(fā)明的發(fā)明性組合物的給藥量范圍為0.01-10g/kg，優(yōu)選0.1-1g/kg體重/天。這些劑量可以每天以一次或可多次給藥形式給藥。
本發(fā)明的組合物可以通過(guò)各種途徑給藥到接受治療的動(dòng)物如哺乳動(dòng)物(大鼠、小鼠、家畜或人)上。所有的給藥方式都考慮到了，例如，可以口服、直腸或者靜脈的、肌內(nèi)的、皮下的、皮內(nèi)的、鞘內(nèi)的、硬膜外的或腦室內(nèi)注射給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的也是提供用于預(yù)防和改善免疫缺陷和癌癥疾病的保健食品，該保健食品包括如下的組合物和飲食學(xué)可接受的添加劑，其中所述組合物不可缺少地包含源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物。
以組合物的總重量記，用于預(yù)防和改善免疫缺陷和癌癥疾病的保健食品應(yīng)包含大約0.01-80w/w％，優(yōu)選1-50w/w％的本發(fā)明上述源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物。
本發(fā)明提供了用于預(yù)防和改善免疫缺陷和癌癥疾病的包括源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的保健食品飲料組合物。
上述發(fā)明性低聚物組合物可加到食品和飲料中，用于預(yù)防和改善免疫缺陷和癌癥疾病。
為了發(fā)展保健食品，包括上述低聚物組合物的可加入食品的例子如，各種食品、飲料、面包、餅干、果醬、糖果、口香糖、茶、乳酪、維生素絡(luò)合物、康復(fù)食品及類似物，可以以粉末、顆粒、片劑、咀嚼片、膠囊或飲料等加以使用。
本發(fā)明的發(fā)明性組合物沒(méi)有毒性和副作用，因此可安全使用。
上面提到的組合物可加到食品、添加劑或飲料中，其中上述低聚物在食品或飲料中的量，對(duì)于保健食品來(lái)說(shuō)，以食品的總重量計(jì)，可大體上從約0.01到80w/w％；對(duì)于100ml健康飲料組合物來(lái)說(shuō)，為0.02-30g，優(yōu)選是0.3-5g。
在本發(fā)明的健康飲料組合物以所示比率包含作為必要成份的上述低聚物的前提下，對(duì)其它液態(tài)成份沒(méi)有特別限制，其中，其它成份可以是各種芳香劑或天然糖類等，如常規(guī)飲料。前面提到的天然糖類的例子是單糖如葡萄糖、果糖等；二糖如麥芽糖、蔗糖等；常規(guī)糖類如糊精、環(huán)糊精；糖醇如木糖醇和赤蘚醇等。除了前面提到的那些芳香劑，天然芳香劑如taumatin，甜菊提取物如levaudiosideA、甘草甜素等和合成芳香劑如糖精、阿巴斯甜等可優(yōu)先適用。上述天然糖類的量通常是100ml本發(fā)明飲料組合物用約1g到20g，優(yōu)選5到12g。
上面提到的組合物的其它組份是各種營(yíng)養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)或電介質(zhì)、合成調(diào)味劑、著色劑和在乳酪巧克力等中使用的改善劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠態(tài)粘合劑、PH控制劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、在碳酸酯飲料中使用的碳化劑等。除了前面提到的那些，其它組份還可以是制備天然果汁所用的果汁、果汁飲料和蔬菜飲料。
該發(fā)明性組合物可作為混合劑用于乳酸菌配制的飲料或醬等等中。
上述提到的組份可單獨(dú)使用，也可組合使用。
本發(fā)明提供的保健食品除了包括本發(fā)明組合物外，還包括約0.01到30w/w％的維生素、寡糖和可食用成份。
這些成份的比例不是嚴(yán)格的，但是通常范圍為每100w/w％本發(fā)明組合物包含0.01到30w/w％。包括上述提取物的可加入食品的例子是各種食品、飲料、口香糖、維生素復(fù)合物、康復(fù)食品等。
該發(fā)明性組合物可另外包括一種或多種有機(jī)酸如檸檬酸、反丁烯二酸、脂肪酸、蘋果酸、磷酸鹽如磷酸鹽，磷酸鈉，磷酸鉀、焦磷酸鹽、縮聚磷酸鹽；天然抗氧化劑如多元酚、兒茶酚、α-生育酚、迷迷香提取物、維生素C、干草根提取物、殼聚糖、鞣酸、植酸。
在不背離本發(fā)明思想和范圍的條件下可以對(duì)本發(fā)明組合物、用途和制備做各種修改和變動(dòng)，這一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。


通過(guò)下面的詳細(xì)說(shuō)明并結(jié)合附圖可更清楚地了解本發(fā)明的上述和其它目的、特征及優(yōu)點(diǎn)。其中；圖1顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞NO生成的影響；圖2顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對(duì)小鼠脾細(xì)胞IL-2生成的影響；
圖3顯示了可溶性葡聚糖低聚物對(duì)小鼠骨髓IL-3依賴的LyD9細(xì)胞系增殖的抑制效果；圖4顯示了可溶性葡聚糖低聚物對(duì)Raw264.7細(xì)胞系、小鼠巨噬細(xì)胞系增殖的抑制效果；圖5顯示了可溶性葡聚糖低聚物對(duì)EL4細(xì)胞系、小鼠T淋巴細(xì)胞系增殖的抑制效果；圖6顯示了可溶性葡聚糖低聚物對(duì)Jurkat細(xì)胞系、人T淋巴細(xì)胞系增殖的抑制效果；圖7顯示了可溶性葡聚糖低聚物對(duì)HeLa細(xì)胞系、人子宮頸癌細(xì)胞系增殖的抑制效果；圖8顯示了可溶性葡聚糖低聚物對(duì)KAT03細(xì)胞系、人胃癌細(xì)胞系增殖的抑制效果；下面，通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更明確的解釋。然而，從任何意義上來(lái)說(shuō)，不應(yīng)理解為本發(fā)明限于這些實(shí)施例。
最佳方式下列實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例用于解釋本發(fā)明，而沒(méi)有限制其范圍。
實(shí)施例1.酵母菌變異IS2的培養(yǎng)和采收將含有10g/L葡萄糖、6g/L酵母菌提取物、3g/L硫酸銨((NH4)2SO4)、1.5g/L磷酸鉀(K2PO4)、0.5g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)的液態(tài)介質(zhì)作為原介質(zhì)。
液態(tài)YPD介質(zhì)(葡萄糖20g/L、酵母菌提取物10g/L、蛋白胨20g/L)用于接種和生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含400g/L葡萄糖、30g/L酵母菌提取物、40g/L硫酸銨((NH4)2SO4)、15g/L磷酸鉀(K2PO4)和5.7g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基用高壓滅菌后，將100ml培養(yǎng)的酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)播種到其上，并在旋轉(zhuǎn)速度300rpm、通氣量1vvm、溫度30℃、PH5.5條件下培養(yǎng)，最終通過(guò)分批次培養(yǎng)系統(tǒng)得到50-55g/L干燥細(xì)胞群(DCW)。
實(shí)施例2.從酵母菌變異IS2中提取β-葡聚糖將上面實(shí)施例1中制備的80g酵母菌DCW懸浮在1,000ml 4％的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，然后在95℃下培養(yǎng)1小時(shí)。該培養(yǎng)的懸浮液在2,000rpm速度下離心15分鐘以分離成氫氧化鈉溶液部分和固體部分。
將分離得到的固體部分重新懸浮在2,000ml 3％的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，在75℃下培養(yǎng)3小時(shí)，然后在2,000rpm速度下離心15分鐘再次分離成氫氧化鈉溶液部分和固體部分。
將收集的固體部分用HCl調(diào)節(jié)到pH4.5并分散到最終體積為2,000ml的程度，然后在75℃下培養(yǎng)1小時(shí)。該培養(yǎng)的懸浮液在2,000rpm速度下離心15分鐘以分離成氫氧化鈉溶液部分和固體部分。
所得固體用蒸餾水洗滌三次，得到160g來(lái)自酵母菌變異細(xì)胞壁的濕β-葡聚糖。
實(shí)施例3.源自酵母菌變異IS2β-葡聚糖的可溶性葡聚糖低聚物的制備將實(shí)施例2制備的160g濕β-葡聚糖、480ml蒸餾水和等于葡聚糖1/10量的ββ-葡聚糖(v/w)加到1,000ml燒瓶中，在40℃下培養(yǎng)15小時(shí)。
停止反應(yīng)后，反應(yīng)混合物在7,000rpm下離心15分鐘，收集上清液。用超濾膜(Filtron Co.，MWCO 10K)過(guò)濾收集的上清液以除去未反應(yīng)的酶，就得到了含有分子量小于10,000道爾頓的葡聚糖低聚物的溶液。該溶液在-74℃下單獨(dú)放置過(guò)夜后，經(jīng)冷凍干燥得到5.8g粉末形式的可溶性葡聚糖低聚物。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1.可溶性葡聚糖低聚物對(duì)NO(氧化氮)生成的影響實(shí)施例3制備的可溶性葡聚糖低聚物溶解在濃度為5mg/ml磷酸鹽緩沖的鹽水中(PBS，2.56g/L NaH2PO4·H2O，22.5g/L Na2HPO4·7H2O，87.9g/L NaCl，PH7.2)，將0.2ml所得可溶性葡聚糖低聚物溶液腹腔注射到5-6周大的雄性C57BL/6小鼠(Biolink CO.)體內(nèi)。
作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組，源自野生型酵母菌(KCTC7911)菌株的可溶性葡聚糖低聚物根據(jù)上面實(shí)施例1和實(shí)施例3所描述的方法制備，并以與上述所描述的方法相同的方式給藥。
給藥3天后，使用滅菌篩和漢克斯(Hank’s)平衡鹽溶液(0.185g/LCaCl2·2H2O，0.09767g/L無(wú)水MgSO4，0.4g/L KCl，0.06g/L無(wú)水磷酸鉀單堿，0.8g/L氯化鈉，0.04788g/L無(wú)水磷酸氫二鈉，1.0g/LD-葡萄糖，0.011g/L苯酚紅·鈉，0.35g/L碳酸鈉，PH7.0)將上述小鼠的淋巴細(xì)胞從其脾中輕柔地分離。剩余的RBC用NH4Cl處理除去，并將分離出來(lái)的淋巴細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基中。
根據(jù)文獻(xiàn)公開(kāi)的方法制備腹膜巨噬細(xì)胞(Gallily，R.，and M.Feldman.，Immunology12，p197-，1967)。
腹腔注射可溶性葡聚糖低聚物后用漢克斯平衡鹽溶液收集巨噬細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基中。
在培養(yǎng)皿中，以濃度2×105細(xì)胞/ml再懸浮2×105細(xì)胞/ml的巨噬細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中、在測(cè)量NO(氧化氮)生成之前、在刀豆素A(ConA，5？g/ml)和LPS(1？g/ml)的刺激下培養(yǎng)20小時(shí)。
因?yàn)镹O在空氣中很容易被氧化為穩(wěn)定的亞硝酸鹽，所以亞硝酸鹽的量可通過(guò)油脂反應(yīng)測(cè)得。
將0.1ml包含30％乙酸中的1％磺胺和60％乙酸中的0.1％N-(1-萘基)乙二胺-二-氯化氫的混合物加到0.1ml培養(yǎng)基中，在室溫下培養(yǎng)20分鐘。通過(guò)ELISA讀取儀檢測(cè)到550nm處的吸收。
作為NO生成的測(cè)得結(jié)果，與用作陰性對(duì)照的PBS-處理組相比，注射了源自野生型酵母菌KCTC7911和源自酵母菌變異菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)了NO生成的更多增加。而且，確認(rèn)了源自酵母菌變異菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物比源自KCTC7911菌株的可溶性葡聚糖低聚物具有更高的NO生成能力(見(jiàn)圖1)。
圖1顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞NO生成的影響。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2.可溶性葡聚糖低聚物對(duì)IL-2生成的影響使用滅菌篩從用實(shí)施例3制備的可溶性葡聚糖低聚物處理的小鼠脾中分離淋巴細(xì)胞。同時(shí)，用NH4Cl處理除去紅細(xì)胞，并將分離的淋巴細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基中。
將收集的細(xì)胞調(diào)整到2×105細(xì)胞/ml并等分到96孔培養(yǎng)板上。脾細(xì)胞用ConA，(5？g/ml)處理并在37℃下、在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)酶免試劑盒(ELISA kit)(Endogen Co.)測(cè)定由Con-A刺激產(chǎn)生的IL-2釋放量。
將抗-IL-2抗體(Becton Dikinson Co.)加到96孔培養(yǎng)板上吸附24小時(shí)，洗去未吸附的抗體。接著，將0.1ml的樣品加到其上并培養(yǎng)1小時(shí)。然后，每一個(gè)孔用含10％吐溫-20的PBS清洗并向其上加入檢測(cè)Ab。再次清洗之后，處理細(xì)菌蛋白-HRP并在室溫下培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)。向其中加入TMB底物(Becton Dikinson Co.)并加入終止液以終止反應(yīng)。測(cè)定450nm處的吸收。
在給藥源自KCTC7911的可溶性葡聚糖低聚物的地方，IL-2生成沒(méi)有變化，甚至當(dāng)細(xì)胞受Con-A刺激時(shí)。
然而，在給藥源自酵母菌變異IS2的可溶性葡聚糖低聚物和細(xì)胞受Con-A刺激的地方，顯示了來(lái)自腹膜巨噬細(xì)胞IL-2的生成增加(見(jiàn)圖2)。
圖2顯示了腹腔注射后，可溶性葡聚糖低聚物對(duì)小鼠脾細(xì)胞IL-2生成的影響實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3.可溶性葡聚糖低聚物對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制效果對(duì)癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制效果由MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物)細(xì)胞增殖分析測(cè)定。
作為本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)用到6種類型的細(xì)胞系，即LyD9細(xì)胞系，該細(xì)胞系為小鼠骨髓IL-3依賴的造血干細(xì)胞系；Raw264.7細(xì)胞系，該細(xì)胞系為小鼠巨噬細(xì)胞系；EL4細(xì)胞系，該細(xì)胞系為小鼠T淋巴細(xì)胞系；Jurkat細(xì)胞系，該細(xì)胞系為人T淋巴細(xì)胞系；HeLa細(xì)胞系，該細(xì)胞系為人子宮頸癌細(xì)胞系和KAT03細(xì)胞系，該細(xì)胞系為人胃癌細(xì)胞系。
細(xì)胞用指定濃度的樣品處理并培養(yǎng)44小時(shí)，向其中加入MTT溶液以鑒定細(xì)胞活力。
將癌細(xì)胞的濃度調(diào)整到2×105細(xì)胞/ml并轉(zhuǎn)移到96孔板的每一個(gè)孔中。在早期的培養(yǎng)中，可溶性葡聚糖低聚物以濃度范圍0.5-5mg/ml內(nèi)的各種濃度加到培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在5％CO2培養(yǎng)箱中、在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。
用MTT分析測(cè)得細(xì)胞活力。
將MTT(Sigma Co.，USA)試劑加到每一個(gè)孔中，并進(jìn)一步培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。向其中加入100ml 0.04N的異丙醇鹽酸，該混合物在室溫下培養(yǎng)20分鐘，通過(guò)ELISA讀取儀檢測(cè)到550nm處的最終吸收。
如圖3到8所示的，本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物顯示了強(qiáng)大的對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制活性。特別地，源自酵母菌變異IS2的可溶性葡聚糖低聚物比源自KCTC7911的可溶性葡聚糖低聚物顯示了更強(qiáng)大的活性，具體來(lái)說(shuō)，在相同濃度下，與源自KCTC7911的可溶性葡聚糖低聚物相比，源自酵母菌變異IS2的可溶性葡聚糖低聚物顯示的效力是前者的2-6.6倍?？梢钥隙ǖ氖?，在大多數(shù)癌細(xì)胞系中，可溶性葡聚糖低聚物的有效濃度范圍為2.5-5.0mg。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4.毒性測(cè)試方法用實(shí)施例3的低聚物在ICR小鼠(平均體重25±5g)和斯普拉-道來(lái)氏大鼠(235±10g，Jung-Ang Lab Animal Inc.)上進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。對(duì)包括10只小鼠或大鼠的4組分別口服給藥測(cè)試樣品4mg/kg、40mg/kg、400mg/kg、4,000mg/kg或溶劑(0.2ml，i.p.)，觀察兩周。
結(jié)果在任一組中或?qū)θ我环N性別都沒(méi)有對(duì)死亡率、臨床表現(xiàn)、體重變化和總調(diào)查結(jié)果的治療相關(guān)影響。這些結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的提取物是有效和安全的。
下面將描述配制方法和賦形劑，但本發(fā)明并不限于這些。具有代表性的實(shí)施例如下所述。
粉末的制備實(shí)施例3的干粉末...............................50mg乳糖..........................................100mg滑石..........................................10mg通過(guò)混合上述成份及填充密封包裝進(jìn)行粉末制備。
片劑的制備實(shí)施例3的干粉末...............................50mg玉米淀粉......................................100mg乳糖..........................................100mg硬脂酸鎂......................................2mg通過(guò)混合上述成份及壓片進(jìn)行片劑的制備。
膠囊的制備實(shí)施例3的干粉末...............................50mg玉米淀粉......................................100mg乳糖..........................................100mg硬脂酸鎂......................................2mg通過(guò)混合上述成份及采用常規(guī)明膠制備方法填充明膠膠囊來(lái)制備片劑。
注射劑的制備實(shí)施例3的干粉末...............................50mg注射用蒸餾水..................................最優(yōu)量PH控制劑......................................最優(yōu)量通過(guò)溶解活性成份，控制PH到7.5，然后將所有成份填充到2ml安瓿瓶(ample)中，并用常規(guī)制備注射劑的方法滅菌進(jìn)行注射劑的制備。
液體的制備實(shí)施例3的干粉末...............................0.1-80g
糖........................................5-10g檸檬酸....................................0.05-0.3％焦糖......................................0.005-0.02％維生素C...................................0.1-1％蒸餾水....................................79-94％CO2氣.....................................0.5-0.82％通過(guò)溶解活性成份，填充所有成份及采用常規(guī)液體制備方法滅菌進(jìn)行液體的制備。
保健品的制備實(shí)施例3的干粉末...........................1000mg維生素混合物..............................最優(yōu)量？維生素A乙酸酯...........................70mg？維生素E.................................1.0mg？維生素B1................................0.13mg？維生素B2................................0.15mg？維生素B6................................0.5mg？維生素B12...............................0.2mg？維生素C.................................10mg？生物素..................................10mg？煙酰胺..................................1.7mg？葉酸....................................50mg？泛酸鈣..................................0.5mg礦物混合物................................最優(yōu)量？硫酸亞鐵................................1.75mg？氧化鋅..................................0.82mg？碳酸鎂..................................25.3mg？磷酸單鉀................................15mg磷酸二鈣..................................55mg檸檬酸鉀..................................90mg碳酸鈣....................................100mg
氯化鎂................................24.8mg上面提到的維生素和礦物混合物可以在很多方面進(jìn)行變化。但是不能認(rèn)為這些變化背離了本發(fā)明的思想和范圍。
健康飲料的制備實(shí)施例3的干粉末.......................1000mg檸檬酸................................1000mg低聚糖................................100g杏濃縮物..............................2g?；撬?...............................1g蒸餾水................................900ml通過(guò)溶解活性成份，混合，在85℃攪拌1小時(shí)，過(guò)濾，將所有成份填充到1000ml安瓿瓶中及采用常規(guī)健康飲料的制備方法滅菌進(jìn)行健康飲料的制備。
上述就是對(duì)本發(fā)明的描述，顯而易見(jiàn)地，可以在很多方面對(duì)它們進(jìn)行變化，但是不能認(rèn)為這些變化背離了本發(fā)明的思想和范圍。而且，是要將那些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的變化包括在下述權(quán)利要求的范圍之內(nèi)的。
工業(yè)實(shí)用性如本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明中描述的，本發(fā)明涉及M.W.范圍為1,000到10,000的可溶性葡聚糖低聚物，該低聚物通過(guò)用商業(yè)可得的β-葡聚糖水解酶處理由分離酵母變異IS2細(xì)胞壁得到的不溶性β-葡聚糖來(lái)制備。該可溶性葡聚糖低聚物在促進(jìn)免疫活性和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面顯示強(qiáng)大效力，可用作治療或保健食品來(lái)治療和預(yù)防免疫缺陷和癌癥疾病。
權(quán)利要求
1.源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細(xì)胞壁的通過(guò)用水解酶處理不溶性β-葡聚糖得到的可溶性葡聚糖低聚物，其具有免疫促進(jìn)活性和癌細(xì)胞增殖抑制活性。
2.制備可溶性葡聚糖低聚物的方法，該方法包括以下步驟(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母菌(釀酒酵母)變異IS2(KCTC 0959BP)以用于接種；(b)將上述酵母菌培養(yǎng)溶液接種到培養(yǎng)基中，分批進(jìn)料培養(yǎng)并離心得到酵母菌；(c)向其中加入NaOH以從酵母菌細(xì)胞壁中提取β-葡聚糖；(d)將提取的β-葡聚糖與水解酶反應(yīng)，然后經(jīng)過(guò)濾得到可溶性葡聚糖低聚物；和(e)最后冷凍干燥以得到分子量小于50,000的可溶性葡聚糖低聚物。
3.一種藥物組合物，該藥物組合物包括根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法得到的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細(xì)胞壁的可溶性葡聚糖低聚物，該組合物作為活性成份用來(lái)治療或預(yù)防免疫缺陷疾病。
4.一種藥物組合物，該藥物組合物包括根據(jù)權(quán)利要求2制備方法得到的源自酵母菌變異菌株(KCTC 0959BP)細(xì)胞壁的可溶性葡聚糖低聚物，該組合物作為活性成份用來(lái)治療或預(yù)防癌癥疾病。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中，所述癌癥選自肺癌、砷細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、腦或頸癌、皮膚或內(nèi)眼黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、胃癌、肛周癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金淋巴瘤、食道癌、腸癌、內(nèi)分泌腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、平滑組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞瘤、膀胱癌、腎癌、輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎骨盆癌、CNS腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、脊髓瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤或垂體腺瘤。
6.包括源于酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防人體或哺乳動(dòng)物的免疫缺陷和癌癥疾病的治療性藥物方面的用途。
7.包含如權(quán)利要求1所述的源自酵母菌變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物和飲食學(xué)可接受的添加劑的保健食品，所述保健食品用于治療或預(yù)防免疫缺陷和癌癥疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的保健食品，其中，所述保健食品可以以粉末、顆粒、片劑、咀嚼片、膠囊或飲料形式提供。
全文摘要
本發(fā)明涉及M.W.范圍為1,000到10,000的可溶性葡聚糖低聚物，該低聚物通過(guò)用商業(yè)可得的β－葡聚糖水解酶處理由分離出的酵母變異IS2細(xì)胞壁得到的不溶性β－葡聚糖來(lái)制備。該可溶性葡聚糖低聚物在促進(jìn)免疫活性和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面顯示強(qiáng)大效力，因此可用作治療或保健食品來(lái)治療和預(yù)防免疫缺陷和癌癥疾病。
文檔編號(hào)A23L1/30GK1767837SQ200480007032
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2004年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月18日
發(fā)明者鄭鳳鉉, 樸正勛, 姜晚植, 李廣鎬, 文元國(guó) 申請(qǐng)人:碧歐普羅吉有限公司, 天然F&P公司