專利名稱：使用islet1作為標(biāo)志分離或產(chǎn)生干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及體外擴(kuò)增和增殖未分化的祖細(xì)胞，更具體地，涉及含有Isletl的未分化祖細(xì)胞(undifferentiated progenitor cellscontaining Islet1)。
背景信息先天性心臟病(Congenital heart disease)在所有出生缺陷中是最常見的(Hoffman and Kaplan，2002)。為了成功地預(yù)防先天性心臟病，或?qū)ο忍煨孕呐K病進(jìn)行治療干預(yù)，對其病原學(xué)的了解是極其重要的。為了達(dá)到這個(gè)目的，對具體的心臟細(xì)胞譜系的起源和它們之間的相互關(guān)系的理解是至關(guān)重要的。理解心臟祖先細(xì)胞(cardiac progenitors)的起源和性質(zhì)，對于開發(fā)針對先天性心臟病和成人心臟病的心臟干細(xì)胞治療來說也具有重要意義。最近的研究工作已經(jīng)定義了心臟祖先細(xì)胞的兩個(gè)區(qū)(fields)，被稱為初級區(qū)，和次級區(qū)，或前心區(qū)(Kelly and Buckingham，2002)。據(jù)認(rèn)為，初級心區(qū)(primary heart field)形成心臟的心房和心室，而認(rèn)為次級區(qū)或前區(qū)(secondary or anterior field)形成流出道(outflow tract)。認(rèn)為次級區(qū)在早期線性心管階段(early linear heart tube stage)位于心臟的前部和背部。有關(guān)心流出道不存在于線性心管中的最初的證據(jù)，來自在小雞胚胎中所進(jìn)行的一系列體內(nèi)譜系研究，這些研究由de laCruz和同事從1977起向前推進(jìn)(de la Cruz，2000)。這些研究表明，在線性心管階段不存在流出道，但是沒有指出在后面的階段中，流出道來自何處。最近，由三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室所作的研究指出了流出道的起源，其中，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在小雞胚胎中進(jìn)行研究，一個(gè)在小鼠胚胎中進(jìn)行研究(Kelly et al.，2001；Mjaatvedt et al.，2001；Waldo et al.，2001)。這些研究結(jié)果表明，流出道中的一些細(xì)胞起源于靠近咽內(nèi)胚層(pharyngealendoderm)的臟壁中胚層(splanchnic mesoderm)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能最終評價(jià)“次級”或“前”心區(qū)的貢獻(xiàn)大小和界線。已經(jīng)用許多不同的方式對干細(xì)胞進(jìn)行了定義。然而，主要原則包括(1)自我更新，或能產(chǎn)生具有與原始的母細(xì)胞類似的特征的子細(xì)胞(daughter cells)的能力；(2)單個(gè)細(xì)胞的多譜系分化(multi-lineagedifferentiation)；和(3)受損組織的體內(nèi)功能重構(gòu)。胚胎干(ES)細(xì)胞——最初從小鼠獲得(Evans andKaufmann，1981)，最近從非人靈長類和人類胚泡獲得(Thomson，et al.，1998)——展示出所有三種特征。ES細(xì)胞是多能細(xì)胞，源自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，它可以在未分化的狀態(tài)下無限繁殖。小鼠和人ES細(xì)胞系都在培養(yǎng)中被連續(xù)保持，細(xì)胞倍增多于300次。在體外，當(dāng)ES細(xì)胞被注射入胚泡時(shí)，ES細(xì)胞分化為所有的體細(xì)胞類型，并形成具有全部三胚層的成熟子代細(xì)胞(mature progeny cells)。最終，ES細(xì)胞的所有分化的子代細(xì)胞都是功能細(xì)胞，因?yàn)橛伤谋扼w胚胎互補(bǔ)作用(tetraploid embryocomplementation)產(chǎn)生的小鼠是活的。盡管ES細(xì)胞已經(jīng)被從人類分離得到，但是它們在研究中的應(yīng)用以及它們的治療潛力受到倫理考慮因素的阻礙。盡管成體干細(xì)胞的自我更新和分化的程度低于ES中所看到的自我更新和分化的程度，多數(shù)成體干細(xì)胞也能達(dá)到上面提到的干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。研究得最透徹的成體干細(xì)胞——造血干細(xì)胞(HSC)(Weissman，2000)——進(jìn)行著體內(nèi)自我更新的細(xì)胞分裂，在單細(xì)胞水平分化成所有成熟血成分，并在機(jī)能上使得重度骨髓抑制的動(dòng)物和人的骨髓予以恢復(fù)。其他成體干細(xì)胞在更近時(shí)期才被定義，并因此，研究得不夠透徹。然而，神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)(Gage，2000)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)(Jiang，et al.，2002)和表皮干細(xì)胞(Toma，et al.，(2001)都達(dá)到這些基本標(biāo)準(zhǔn)。其他也被稱為干細(xì)胞的細(xì)胞，如成血管細(xì)胞或內(nèi)皮干細(xì)胞(Rafii，et al.，1994)，除了它們僅分化成一種單一類型的細(xì)胞外，展示出所有必要的特點(diǎn)。過去幾年中，發(fā)表了許多文獻(xiàn)，它們指出來自一個(gè)給定組織的細(xì)胞可以有能力分化成一個(gè)不同組織的細(xì)胞?！案杉?xì)胞可塑性(Stemcell plasticity)”是一個(gè)新的術(shù)語，其已被用來描述最近觀察資料，即在出生后的成體干細(xì)胞中，存在著比原先所期望的更大潛力。利用骨髓(BM)的大多數(shù)研究，或利用富集HSC的外周血的大多數(shù)研究，是基于性別錯(cuò)配細(xì)胞(sex-mismatched cells)或者遺傳標(biāo)記細(xì)胞的體內(nèi)移植，供體細(xì)胞(donor cells)的檢測是基于Y-染色體或標(biāo)記基因的存在。已經(jīng)有了關(guān)于使用任一標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行的、在供體細(xì)胞檢測中所涉及的陷阱的綜述(Tisdale and Dunbar，2002)。已經(jīng)描述了下述分化作用，不但分化成造血細(xì)胞，而且分化成具有骨骼肌細(xì)胞(Gussoni，et al.，1999)、心肌細(xì)胞(Orlic，et al.，2001)、內(nèi)皮細(xì)胞(Jackson，et al.，2001)、神經(jīng)外胚層細(xì)胞(Brazelton，et al.，2000)特征的細(xì)胞，和內(nèi)胚層細(xì)胞(Krause，etal.，2001)，包括肝細(xì)胞。在這些研究的80％中，新鮮的BM細(xì)胞未經(jīng)預(yù)前體外培養(yǎng)而被移植，這樣不能確定具有可塑性的細(xì)胞是否能夠進(jìn)行自我更新的可能性。在大多數(shù)的這些研究中，未純化的細(xì)胞群或純化得到的部分同質(zhì)性的細(xì)胞被移植，因此，使得無法研究分化細(xì)胞的無性繁殖起源或具有次級組織(second tissue)特性的細(xì)胞的起源組織。最后，這些研究，依賴于表型性狀，來確定分化為與起源組織不同的細(xì)胞的分化作用，但仍不得不證明次級組織的細(xì)胞具有那個(gè)譜系的功能性狀。因此，本領(lǐng)域需要新的且更好的方法，來體外擴(kuò)增和增殖未分化的心臟祖細(xì)胞(undifferentiated cardiac progenitor cells)。該方法包括在足以使祖細(xì)胞生長的條件下，培養(yǎng)分離的未分化祖細(xì)胞，其中這些細(xì)胞表達(dá)Islet1。研究。
發(fā)明概述對缺少Islet1——一種LIM同源轉(zhuǎn)換域轉(zhuǎn)錄因子——的小鼠的分析已經(jīng)顯示出心臟發(fā)育的一個(gè)新模式。Islet1敲除小鼠的心臟完全缺失流出道、右心室和大部分的心房。Islet1的表達(dá)和表達(dá)Islet1的祖先細(xì)胞的譜系追蹤表明，Islet1是未分化的心臟祖細(xì)胞群特有的標(biāo)志，其產(chǎn)生在isl 1突變體中發(fā)現(xiàn)為缺失的心臟節(jié)段。Islet1的功能是這些祖細(xì)胞形成心臟所必須的。在islet1突變體中，表達(dá)islet1的祖細(xì)胞在數(shù)量上逐漸減少，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和纖維原細(xì)胞生長因子(FGFs)被下調(diào)。本文中描述的研究定義了兩個(gè)生心區(qū)(cardiogenic fields)，在它們中，一個(gè)表達(dá)并需要Islet，另一個(gè)則不是如此。這些研究的結(jié)果對于特定心臟譜系發(fā)育、心臟成環(huán)(cardiac looping)、左右不對稱性(leftright asymmetry)、心臟演變(cardiac evolution)和心臟干細(xì)胞具有啟示意義。因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測干細(xì)胞的方法，包括測定細(xì)胞中Islet1核酸的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離或富集干細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與對Islet1有反應(yīng)性的試劑相接觸，并將反應(yīng)陰性細(xì)胞和反應(yīng)陽性細(xì)胞分離，從而分離或富集干細(xì)胞。在又一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生干細(xì)胞的方法，包括將表達(dá)Islet 1的未分化祖細(xì)胞與激活或增強(qiáng)該細(xì)胞中Islet1表達(dá)的試劑相接觸，以便激活和增強(qiáng)Islet 1在該細(xì)胞中的表達(dá)。在再一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了擴(kuò)增和增殖未分化的心臟祖細(xì)胞的體外方法。該方法包括在足以使祖細(xì)胞生長的條件下，培養(yǎng)分離得到的未分化的祖細(xì)胞，該祖細(xì)胞表達(dá)Islet1。在該方法中，祖細(xì)胞足以生長的條件包括在物種特異性的心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上培養(yǎng)細(xì)胞，或者在來自心臟的纖維原細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其是Islet1陽性干細(xì)胞的富集群，相比起其他細(xì)胞類型，包括大于90％的Islet1陽性干細(xì)胞。
附圖簡述

圖1是Islet 1的一個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的mRNA序列(SEQID NO1)。圖2是Islet 1(小鼠)的DNA序列，可以從GenBank獲得，編號NM_021459XM_354773(SEQ ID NO2)。
發(fā)明詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Islet1(SEQ ID NO2)是轉(zhuǎn)錄因子，是增殖著的心臟干細(xì)胞所特有的一個(gè)標(biāo)志(FIG 2)。它是至今為止唯一已知的特異性表達(dá)在生心干細(xì)胞(cardiogenic stem cells)中，而不表達(dá)在分化的心臟細(xì)胞中的基因。Islet1是生心干細(xì)胞狀態(tài)的主調(diào)節(jié)子(master regulator)。該發(fā)現(xiàn)使得能夠使用islet1表達(dá)作為手段來分離內(nèi)源性生心干細(xì)胞，或產(chǎn)生生心干細(xì)胞。Islet1也在其他祖細(xì)胞或“干細(xì)胞”群中被表達(dá)，包括胰腺、神經(jīng)嵴、主動(dòng)脈-生殖腺-中腎區(qū)域(造血祖細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞)和其他細(xì)胞類型的祖細(xì)胞或“干細(xì)胞”群。該表達(dá)——與本文中描述的關(guān)于生心干細(xì)胞的數(shù)據(jù)相一致，顯示了islet不但能標(biāo)記生心干細(xì)胞，而且也能標(biāo)記其他多能干細(xì)胞。還不知道有其他基因，它們在最早階段特異性地表達(dá)在未分化的生心性前體細(xì)胞(undifferentiated cardiogenic precursors)中。Islet1是這一細(xì)胞群的獨(dú)特鑒定者。Islet1也是這些前體細(xì)胞(precursors)幫助心臟發(fā)育所必需的。在islet1突變體中，通常源自表達(dá)islet1的祖細(xì)胞的生心譜系是不存在的。因此，Islet的獨(dú)特性在于，它在許多胚胎期不同的多能祖細(xì)胞中被表達(dá)。Islet是驅(qū)動(dòng)干細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子。利用islet1作為標(biāo)志，細(xì)胞可以從早期胚胎中被分離得到，與熒光標(biāo)記的islet1抗體雜交，并通過FACS(熒光激活細(xì)胞分選術(shù))對干細(xì)胞進(jìn)行分選。可替代地，基因(例如lacZ、GFP、cre)可以被插入到內(nèi)源性islet1位點(diǎn)，并用作細(xì)胞鑒定或分選的基礎(chǔ)。生心干細(xì)胞系可以通過單獨(dú)表達(dá)islet1而建立，或通過聯(lián)合表達(dá)islet1與Nkx2.5而建立，Nkx2.5是另一種轉(zhuǎn)錄因子，其在心臟祖細(xì)胞中被表達(dá)，也在分化的心臟細(xì)胞中表達(dá)。為了使這些生心性前體進(jìn)行分化，通過遺傳學(xué)手段，或通過應(yīng)用生長因子下調(diào)islet1的表達(dá)。其他干細(xì)胞系能以類似的方式被創(chuàng)作，或者單獨(dú)表達(dá)islet1，或者islet1與對不同的譜系具有特異性的其他因子一起被表達(dá)，來創(chuàng)制多能細(xì)胞，其能分化成多個(gè)譜系，或特殊的譜系，這取決于遺傳或物理環(huán)境。大量的數(shù)據(jù)證實(shí)了這樣的結(jié)論，即islet1是分化之前的生心干細(xì)胞的標(biāo)志。該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致形成這樣的想法，利用islet1作為工具，在胚胎、新生或成體階段，從各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物和從人中，分離生心干細(xì)胞?？梢垣@得islet1抗體，以檢測這些細(xì)胞群；和使用已知的技術(shù)，可以創(chuàng)作在islet1位置插入有GFP的小鼠系。也已經(jīng)確定，islet在主動(dòng)脈-生殖腺-中腎區(qū)域被表達(dá)，該區(qū)域?qū)τ诋a(chǎn)生多能造血前體和內(nèi)皮前體是至關(guān)重要的。由本文中描述的研究，若干利用這些干細(xì)胞的治療用途由然而生。例如，本發(fā)明提供了方法，用于將不同的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化為生心干細(xì)胞，用于治療用途，例如從心臟患者分離皮膚纖維原細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為生心干細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞注射入患者。該方法可以被用于治療心臟病，包括心梗后疾病(post-infarct)、心力衰竭、缺血性心臟病。其他的應(yīng)用包括，刺激在分化心臟內(nèi)的常住生心干細(xì)胞的增殖和/或分化，以修復(fù)心臟或改善心臟功能。分離的生心干細(xì)胞可以用于治療藥物篩選，用于毒理學(xué)研究，和用于組織工程。在所有這些程序中，來自islet陽性干細(xì)胞的其他不同的細(xì)胞譜系也可以被使用，具有對相關(guān)人類疾病的用途。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，兩種生心區(qū)的界線與之前期望的不同。一種祖先群表達(dá)islet1并將產(chǎn)生流出道、右心室、左心室細(xì)胞亞群和大部分的心房細(xì)胞。另一祖先群則不表達(dá)islet1，且將產(chǎn)生左心室的大部分和一些心房細(xì)胞。Islet1在未分化的前體中的特異性表達(dá)，也第一次使得能夠準(zhǔn)確地觀察到islet1表達(dá)祖先群，并給予我們一個(gè)重要的手段，用于分離和表征心臟干細(xì)胞群。Islet1不但定義該干細(xì)胞群，而且也是這些細(xì)胞幫助形成心臟所必須的，這為不同的心臟區(qū)域提供了第一個(gè)的遺傳證據(jù)。Islet1(Isl 1)敲除小鼠已被用來檢測運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和胰腺發(fā)育的缺陷(Ahlgren et al.，1997；Pfaff et al.，1996)。isl 1純合無效的小鼠在大約ED9.5時(shí)，顯示出生長延遲現(xiàn)象，并在大約ED10.5時(shí)死亡。而雜合突變體存活下來，且無明顯的表型。盡管懷疑是血管畸形(Pfaff et al.，1996)，但純合突變體死亡的原因在這之前還未被陳述過。因此，查明了isl1-/-小鼠死亡的原因。當(dāng)對ED9.0至ED9.5之間的純合無效(homozygous null)胚胎進(jìn)行檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重異常的心臟。在總體形態(tài)學(xué)水平上，突變體心臟看上去由單個(gè)的、畸形的、未分裂的腔室組成。組織學(xué)分析確認(rèn)了該印象。作為第一次嘗試去表征突變體心臟內(nèi)的細(xì)胞之腔室同一性，使用心腔室標(biāo)記物來進(jìn)行整體原位雜交分析(whole mount in situhybridization analysis)。心室肌球蛋白輕鏈2(MLC2v)mRNA特異性地標(biāo)記心室細(xì)胞，和A/V連接細(xì)胞(Franco et al.，1999)。在這些階段，心房肌球蛋白輕鏈2(MLC2a)mRNA標(biāo)記所有心肌細(xì)胞(Kubalak et al.，1994)。與針對MLC2v和MLC2a mRNAs的探針進(jìn)行的雜交表明，單個(gè)腔室的前面部分內(nèi)的細(xì)胞具有心室同一性，而單個(gè)腔室的后面部分中的細(xì)胞則不具有心室同一性，并因此可能具有心房同一性。許多轉(zhuǎn)錄因子區(qū)域性地表達(dá)于心臟中，一組這些轉(zhuǎn)錄因子被用于進(jìn)一步研究isl 1突變心臟內(nèi)的細(xì)胞同一性。在所研究的階段中，tbx5特異性地表達(dá)于心臟的后極中，在心房和左心室中(Bruneau et al.，1999)。在islet1突變體中，心臟的心房和心室部分都表達(dá)tbx5，這表示突變心臟的心室部分具有左心室同一性。EHand在左心室中被表達(dá)，但不在右心室中表達(dá)(Cross et al.，1995；Cserjesi et al.，1995；Thomas etal.，1998)。在isl1-/-胚胎中，EHand在整個(gè)心室組織中都被表達(dá)，這表示它具有左心室同一性，不具有右心室同一性，這與用tbx5探針獲得結(jié)果相一致。Tbx20在流出道和A/V通道中被高度表達(dá)(Carson et al.，2000；Kraus et al.，2001)。來自islet 1突變體的心臟在心室和心房的連接處表達(dá)tbx20，在它們的前端不表達(dá)tbx20，這表示無流出道。用msx2的探針獲得了與該結(jié)果一致的結(jié)果，msx2標(biāo)記在ED8.5的心臟流出道。Islet1突變心臟的前部無msx2染色。這些數(shù)據(jù)，同從先前與MLC2a和MLC2v的探針?biāo)M(jìn)行雜交獲得的結(jié)果一起，提示盡管存在左心室、AN通道和心房同一性的細(xì)胞，islet1突變體缺少流出道和右心室。從該分析推斷出，islet1突變體缺失完整的心臟分隔。此外，突變的心臟不能成環(huán)。該結(jié)論得到掃描電子顯微鏡分析的支持。令人感興趣的是，在ED 9.0(12體節(jié)對(somite pairs))時(shí)，isl 1突變體中的心臟原基類似于在ED 8.25(5體節(jié)對)時(shí)、在較早階段野生型胚胎中所見的心臟原基(Kaufman，1999)，這表示出心臟發(fā)育的中斷。在ED 9.5(22體節(jié)對)，野生型同胎仔(littermates)與它們的突變對等物的比較顯示，在突變子中不存在流出道和右心室，這與標(biāo)記物分析一致。isl 1-/-小鼠嚴(yán)重的心臟表型使得人們?nèi)パ芯啃∈笮呐K發(fā)育的早期的isl 1表達(dá)。利用isl 1和MLC2a mRNAs的探針對ED7.25至ED8.75的胚胎進(jìn)行單和雙整體原位雜交。后者是分化的生心性前體最早的標(biāo)志物之一。該整體原位雜交及隨后的切片分析(section analysis)表明，islet1決不與MLC2a共表達(dá)，相反，在緊靠的細(xì)胞群處被表達(dá)。在早期生心新月階段(cardiogenic crescent stages)，islet1表達(dá)細(xì)胞是在MLC2a表達(dá)細(xì)胞的中部和背部。隨著心管形成時(shí)，內(nèi)臟間質(zhì)中的islet1陽性細(xì)胞在它們的整個(gè)延伸范圍內(nèi)，包括前面區(qū)域和后面區(qū)域，與MLC2a陽性細(xì)胞相鄰，其中內(nèi)臟間質(zhì)包括心系膜并靠近前腸內(nèi)胚層。Islet1不但在臟壁中胚層中被表達(dá)，也在腹前腸內(nèi)胚層中被表達(dá)。盡管islet1不在分化的MLC2a陽性心肌前體中被表達(dá)，但是它在最近鑒定的心臟次級或前心區(qū)(secondary or anterior heart field)區(qū)域中，也就是咽區(qū)域的臟壁中胚層細(xì)胞中表達(dá)。最近的證據(jù)指出，小鼠心前區(qū)幫助形成流出道(Kelly and Buckingham，2002)。該發(fā)現(xiàn)——與islet1突變體中的心臟表型相一致——顯示出islet1表達(dá)細(xì)胞可能幫助形成心臟的流出道。為了研究該問題，進(jìn)行isl 1表達(dá)細(xì)胞的譜系分析，這通過將islet-1-cre小鼠(Srinivas et al.，2001)和Rosa26-lacZ指示小鼠(Soriano，1999)雜交來進(jìn)行。在該雜交的子代中，Cre-介導(dǎo)的切除使得lacZ基因處于普遍表達(dá)的Rosa26基因座的控制之下，使得通過針對β-半乳糖苷酶活性的染色方法從而對表達(dá)isl 1的細(xì)胞的命運(yùn)進(jìn)行跟蹤成為可能，既便是從內(nèi)源性isl 1基因座而來的轉(zhuǎn)錄已被抑制。這一分析的結(jié)果是令人吃驚的，并且表明先前表達(dá)islet1的細(xì)胞對胚胎心臟具有實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)，包括位于流出道、右心室和心房中的大部分細(xì)胞，也有助于形成左心室的特殊區(qū)域。β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞也在心內(nèi)膜內(nèi)被觀察到，和在襯里于主動(dòng)脈弓動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞中被觀察到，內(nèi)皮細(xì)胞襯著主動(dòng)脈弓動(dòng)脈(aortic arch arteries)。多數(shù)的β-半乳糖苷酶陰性心肌細(xì)胞在左心室的腹側(cè)面和左心房的前腹區(qū)域被觀察到。觀察到，islet1-表達(dá)細(xì)胞貢獻(xiàn)了發(fā)育成為心臟的大部分細(xì)胞，該觀察結(jié)果與我們先前在isl 1純合突變體小鼠中對心臟表型所作的分析相一致，在該突變體小鼠中，整個(gè)心臟分割都缺失。缺失的結(jié)構(gòu)表明，Islet1可能對于表達(dá)islet1的生心前體的增殖、存活和/或遷移是所必需的。為了致力于解決該問題，人們嘗試去檢測isl 1突變體和同胎幼崽對照中的isl 1表達(dá)細(xì)胞。盡管isl 1基因的靶向結(jié)構(gòu)被刪除了第三外顯子，——第三外顯子包含第二LIM區(qū)域——isl 1 mRNA的5′端依然在突變體中被表達(dá)，這使得可以檢測突變體細(xì)胞中的islet1信使。然而，Islet蛋白是不能被檢測到的(Pfaff et al.，1996)。為了追蹤突變體和野生型胚胎中的isl 1表達(dá)細(xì)胞，用isl 1mRNA的探針，對ED8.5-ED10的胚胎進(jìn)行整體原位雜交分析。這些分析的結(jié)果證明，盡管一些細(xì)胞仍然存在，但是在突變體中islet-表達(dá)細(xì)胞卻日漸減少。結(jié)合isl 1突變體的心臟表型，這些結(jié)果表明，Islet是細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞存活所必需的。這些研究結(jié)果顯示，Islet1是生心前體增殖和存活所必需的細(xì)胞，也顯示，Islet1的下游靶物質(zhì)(downstream targets)調(diào)控該效應(yīng)。兩個(gè)生長因子通道是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和纖維原細(xì)胞生長因子(FGFs)，它們涉及脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育中的生心前體的生長和存活(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)。許多BMPs和FGFs已被描述為表達(dá)在胚胎區(qū)域，其與islet1-表達(dá)細(xì)胞相重疊，和/或臨近islet1-表達(dá)細(xì)胞，包括BMPs 2、4、6和7，和FGFs 4、8和10(Crossley andMartin，1995；Dudley and Robertson，1997；Kelly et al.，2001；Lyons et al.，1995；Niswander and Martin，1992)。為了測定是否這些BMPs和FGFs中的任何一個(gè)是Islet1作用的靶(目標(biāo)，targets)，用這些生長因子基因的探針進(jìn)行整體原位雜交。該分析的結(jié)果表明，在isl無效小鼠中，這些基因中的每一個(gè)的表達(dá)水平下降。在與islet1表達(dá)重疊的區(qū)域，這些生長因子中一些表達(dá)急劇下調(diào)或未被檢測到，包括BMP4、BMP7和FGF10的表達(dá)。這些基因可能是Islet的直接或間接目標(biāo)。其他BMP和FGF基因的表達(dá)依然存在，但是在與islet1表達(dá)重疊的區(qū)域，表達(dá)區(qū)域減少，這與在islet1突變體中對islet1 mRNA的觀察結(jié)果相類似。該減少能反映出表達(dá)這些生長因子的細(xì)胞數(shù)量的減少。本文中描述的數(shù)據(jù)顯示，產(chǎn)生流出道的祖先也產(chǎn)生右心室和心房中的大部分細(xì)胞，和左心室內(nèi)的細(xì)胞亞群。因此，之前描述的二級(secondary)或前心區(qū)是這些祖先群(progenitor population)的亞群，其以islet1表達(dá)為特征。Islet1功能是這些細(xì)胞成為心臟所必需的。在缺乏Islet1時(shí)，其形成的心臟缺失正常情況下由islet1表達(dá)祖先所貢獻(xiàn)的分割(segments)。區(qū)別是，將產(chǎn)生大部分的左心室細(xì)胞和心房細(xì)胞亞群的祖先不表達(dá)islet1，并且能夠產(chǎn)生心臟細(xì)胞，其具有在缺失Islet1功能下的這些標(biāo)識特征。在islet1突變體中心臟的外觀和表征，和islet1表達(dá)的分析和islet1祖先的原基分布作圖，已經(jīng)導(dǎo)致產(chǎn)生新的心臟發(fā)育工作模式。在該模型中，在正中線的生心性中胚層的第一突出分隔(protruding segments)首先分化，不表達(dá)islet1，并將產(chǎn)生左心室和一些相鄰心房內(nèi)的大部分的細(xì)胞。當(dāng)Islet1表達(dá)祖先加入“初級”心臟分割時(shí)，它們遷入進(jìn)來，同時(shí)日益增多地進(jìn)行分化并下調(diào)islet1表達(dá)，以形成右心室、流出道和心房剩余部分的大部分細(xì)胞。應(yīng)該注意到，islet1表達(dá)祖先的很大數(shù)量的子代在左心室內(nèi)、在與右心室的連接區(qū)域、在小梁內(nèi)，和沿著向內(nèi)彎曲的壁處被發(fā)現(xiàn)，微微向下延伸至左心室的背壁。在心臟發(fā)育的最早階段，當(dāng)相鄰的間質(zhì)與正分化的心肌相鄰時(shí)，islet細(xì)胞細(xì)胞遷入貫穿心肌的整個(gè)前部-后部區(qū)域中。在后面的階段中，islet祖先通過兩個(gè)區(qū)域遷移入心臟，這兩個(gè)區(qū)域保持與背體壁(dorsalbody wall)的內(nèi)臟間質(zhì)的連接。在前部，這是主動(dòng)脈囊的區(qū)域；在后部，是心背系膜(dorsal mesocardium)。前面利用分子標(biāo)記對人心臟發(fā)育進(jìn)行解剖學(xué)分析，表明心臟外間質(zhì)——其通過心背系膜遷移進(jìn)來，形成心房和心房-心室分隔(Lamers and Moorman，2002)。對于初級心房七分隔(primary atrialseptem)前沿上的間質(zhì)帽(mesenchymal cap)是否起源于該心臟外中胚層，或是否從墊狀內(nèi)皮(cushion endothelium)衍生而來有爭論。利用islet1譜系分析，該問題現(xiàn)在可以最終解決了。此外，研究islet-衍生心肌細(xì)胞在心臟分隔中的作用將引起人們的注意。有趣的是，注意到islet-表達(dá)祖先的子代明顯分布于與發(fā)育傳導(dǎo)系統(tǒng)的標(biāo)記相符的區(qū)域中，這表明該分布群在傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮主要作用(Rentschler et al，2002；Kondo et al，2003)。本文中描述的數(shù)據(jù)證明，Islet1不存在時(shí)，表達(dá)islet1的生心祖先未充分地幫助形成心臟，并且數(shù)量減少，這證明Islet1是這些祖先增殖和/或存活所必需的。Islet1祖先的大部分子代不存在于isl 1-/-突變體心臟中的觀察現(xiàn)象表明，Islet1也是遷移所必需的。當(dāng)前體分化時(shí)，Islet1表達(dá)被下調(diào)，這表明在生心前體中，Islet的功能可能是維持未分化狀態(tài)所必需的，和/或可能與分化的狀態(tài)不相容。Islet1也是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中細(xì)胞存活中所必需的，但是在分化的細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮作用(Pfaff et al.，1996)。在胰腺發(fā)育中，Islet1的功能在胰腺間質(zhì)中和在分化的islet細(xì)胞中是所必需的(Ahlgren et al.，1997)。肌細(xì)胞分化之后的心臟生長導(dǎo)致人們認(rèn)為，分化的肌細(xì)胞廣泛地增殖，導(dǎo)致心肌生長。表達(dá)islet1的前體遷移入心臟，表明該遷移也能導(dǎo)致心臟的某些生長。然而，在islet1突變體中，非-islet表達(dá)祖先發(fā)生分化，并進(jìn)行擴(kuò)張，這表明分化的前體的遷移和增殖在生心性生長中發(fā)揮作用。islet1突變體的心臟似乎沒有經(jīng)歷成環(huán)形態(tài)形成(Loopingmorphogenesis)，是因?yàn)樾氖夜?jié)段保持在心房節(jié)段之前。該觀察資料表明，islet1表達(dá)祖先遷移入心臟與成環(huán)形成發(fā)生過程密切相關(guān)。環(huán)形成發(fā)生過程(Looping morphogenesis)可能不但是心肌生長、而且是islet1-表達(dá)細(xì)胞遷入到心臟中的結(jié)果。除了在生心中胚層被表達(dá)外，islet1也在咽內(nèi)胚層中表達(dá)，咽內(nèi)胚層是已經(jīng)被證明在心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用的組織(Lough et al，)。這產(chǎn)生這樣的可能性，在生心祖先中對islet的需求可能不是細(xì)胞自主的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)將直指該問題。本文中描述的研究證明，Islet1界定了生心區(qū)(cardiogenic fields)中的一個(gè)，并且是該一個(gè)生心區(qū)所必需的。也引起人們的興趣去了解可能類似地為其他的非islet表達(dá)區(qū)所必需的其他基因。在本文上下文中，應(yīng)該注意到Nkx2.5敲除小鼠具有突變的心臟，該突變心臟具有流出道、右心室細(xì)胞和心房細(xì)胞(Harvey et al，1999；Tanaka et al，1999)。許多左心室同一性標(biāo)記不存在，這表明不具有左心室同一性。這些觀察現(xiàn)象產(chǎn)生這樣的可能性，即Nkx2.5是由非islet表達(dá)祖先形成心臟組織所必需的。倘若islet1和kx2.5無效小鼠的表型形成鮮明對比，盡管Nkx2.5在Islet方式中明顯不是必需的，Nkx2.5也可能在islet-表達(dá)心臟區(qū)中發(fā)揮作用。產(chǎn)生islet1和Nkx2.5雙重突變的小鼠，可以用于評價(jià)這些可能性。已經(jīng)顯示，在Nkx2.5敲除的小鼠中，islet1 mRNA表達(dá)被保留(未公布觀察結(jié)果)。如上所討論，Islet1陽性祖先(Islet1 positive progenitors)可以影響心臟成環(huán)形態(tài)形成(cardiac looping morphogenesis)。心臟成環(huán)作用的發(fā)生以左-右方向?yàn)樘卣鳎鞒龅篮陀倚氖蚁蛴页森h(huán)。左-右軸信息的微擾(Perturbation)導(dǎo)致心臟的內(nèi)臟逆位，流出道和右心室向左成環(huán)。心房異構(gòu)(Atrial isomerism)也可以產(chǎn)生。本文中描述的數(shù)據(jù)證明，流出道、右心室和大部分心房細(xì)胞衍生于islet-表達(dá)祖先細(xì)胞，這表明賦予這些前體的左-右信息將是左右心臟不對稱的關(guān)鍵的決定因素。遺傳標(biāo)記的先前研究已經(jīng)表明最初的左右軸信息保持于心房的排列中，但是在心室中被旋轉(zhuǎn)。也就是，“左”和“右”心室不是嚴(yán)格地與左和右體軸(body axis)相對應(yīng)(Campione et al.，2001；Franco et al.，2000)。我們的發(fā)現(xiàn)，即左和右心室源于不同的生心區(qū)，給予這一個(gè)觀察資料更深層次的理解。有價(jià)值的是，依據(jù)islet祖先細(xì)胞群來重新檢測心臟的左右結(jié)構(gòu)模式，以便研究涉及在細(xì)胞進(jìn)入心臟之前將左右信息賦予這些細(xì)胞的基因，以及它們相對于其原始左-右方向定位、在心臟內(nèi)的隨后定位。類似地，檢測賦予非-islet表達(dá)祖源的左右同一性，和在發(fā)育的心臟內(nèi)的左右分隔的最終定位是有價(jià)值的。同源轉(zhuǎn)換區(qū)轉(zhuǎn)錄因子(homeodomain transcription factor)，pitx2，在左-右通道的下游，在左外側(cè)中胚層中被特異性表達(dá)，并在后期發(fā)育中保持區(qū)域劃分狀態(tài)(Capdevila et al，2000)。最近分析證明，pitx2在生心新月體(cardiogenic crescent)的區(qū)域中被不對稱地表達(dá)，并且隨后在左心房而不是在右心房中被表達(dá)，也表達(dá)在流出道、右和左心室的不同部分中(Campione et al，2001)。非常感興趣的是，去研究pitx2在islet-表達(dá)祖先中的潛在的不對稱表達(dá)，并可能使用pitx2表達(dá)作為標(biāo)志去研究islet1-表達(dá)祖先所采用的遷移途徑。在這點(diǎn)上，在ED9.5，pitx2c不對稱性地表達(dá)在鰓弓和臟壁中胚層中，其與主動(dòng)脈囊相鄰(Liu et al，2002)。Pitx2被敲除的小鼠無法存活下來，并展示出許多心臟表型，盡管心臟依然明顯向右成環(huán)(Capdevila et al，2000)。在islet1范例的上下文中，重新檢測pitx2無效表型，和左右心臟不對稱的其他組織是引人矚目的。缺少Islet導(dǎo)致表達(dá)islet的生心前體細(xì)胞數(shù)量減少，這表明可以擾亂生長因子信號(growth factor signaling)。因?yàn)镕GF和BMP信號是心臟發(fā)生所必需的(Kirby，2002；Yutzey and Kirby，2002)，我們檢測了許多BMP或FGF生長因子的表達(dá)，這些生長因子在表達(dá)islet1的生心祖先中或與表達(dá)islet1的生心祖先相鄰的地方被表達(dá)。本文中描述的數(shù)據(jù)證明，每一檢測的生長因子選擇性地在與表達(dá)islet1的生心前體的相重疊的區(qū)域顯著被下調(diào)或減少。Islet1突變體顯示出，在fgf8表達(dá)區(qū)域中的總體減少，但它們的表型比起具有fgf8亞效等位基因所看到的表型更嚴(yán)重。敲除fgf4或fgf8的小鼠是早期胚胎致死型的。但是fgf8是亞效等位基因的小鼠在出生時(shí)死亡，這是由于心血管缺陷的緣故，包括流出道畸形(Abu-Issa et al.，2002；Feldman et al.，1995；Frank et al.，2002；Sun et al.，1999)。在islet1突變體中，fgf8表達(dá)實(shí)質(zhì)上在islet1-表達(dá)生心前體中是不存在的。敲除fgf8的小鼠在出生時(shí)死亡，這歸因于它們的肺表型(Sekine et al.，1999)。然而，盡管明顯不如islet心臟表型嚴(yán)重，可能有未被描述過的心臟表型。BMP4和BMP7，以高度重疊的方式，被表達(dá)islet的生心前體共表達(dá)。BMP2和BMP6以與BMP4、BMP7不同方式表達(dá)，或以彼此不相同的方式被表達(dá)，但是它們的表達(dá)也與islet1的表達(dá)相重疊。在islet1突變體中，這些生長因子中的每一個(gè)的表達(dá)在與islet表達(dá)相一致的區(qū)域被大大減少或表現(xiàn)缺乏。對這些BMPs中的每個(gè)進(jìn)行了敲除，對BMP6/7進(jìn)行了雙敲除(Kim et al.，2001；Winnier et al.，1995；Zhang andBradley，1996)。這些突變體中的任何突變體都沒有重演islet突變體的心臟表型，這是由于在植入或原腸胚形成中的早期缺陷的緣故，或者，如果它們經(jīng)受得住較早缺陷而存活下來，可能是功能性豐余(functionalredundancy)的緣故。我們的結(jié)果表明，在islet突變體中的心臟表型可能全部或部分是或者FGF或者BMP或兩者信號缺陷的緣故。要將這些可能性辨別開來，將需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，來將islet表達(dá)祖先中的這些信號通路去除。此外，islet突變體中的其他生長因子通路可能受到影響。考慮到許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明脊椎動(dòng)物心臟從咽或腸中胚層演化而來(Haun et al.，1998；Park et al.，1998；Ranganayakulu et al.，1998)，islet1在咽和前腸區(qū)域的臟壁中胚層中的表達(dá)引人矚目。先前的數(shù)據(jù)已經(jīng)證明，islet在小雞生心前體中被表達(dá)(Yuan and Schoenwolf，2000)。對于小鼠islet，存在islet的果蠅同系物，其在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育中具有作用；并且吸引人的是，它在背脈管(dorsal vessel)中被表達(dá)(Thor and Thomas，1997)。非常令人感興趣的是去檢測islet在其他物種心臟發(fā)生中的作用，來獲得對心臟進(jìn)化的更深的認(rèn)識。結(jié)果可以表明，islet-表達(dá)祖先，用進(jìn)化術(shù)語來說，是“初級的”。如果是這樣的話，它可能表明左心室是較晚的進(jìn)化發(fā)育。令人感興趣的是，在斑馬魚中——其具有單個(gè)心室——，Dhand是存在的，Dhand是高等脊椎動(dòng)物中的右心室的標(biāo)志物，然而未發(fā)現(xiàn)它的左心室中的對等物EHand的同源物ngelo，Lohr，Lee，Ticho，Breitbart，Yost，2000)。也許，在我們對islet在心臟發(fā)生中的作用的發(fā)現(xiàn)中，最令人興奮的方面之一是利用Islet1作為生心干細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)志來進(jìn)行預(yù)測。干細(xì)胞可以定義為祖細(xì)胞，其增殖并產(chǎn)生許多不同的譜系。Islet1-表達(dá)細(xì)胞符合該定義，產(chǎn)生許多不同的心臟譜系。Islet1在分化之前的細(xì)胞中表達(dá)的獨(dú)特特性，將使得能依據(jù)islet1表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞分選。此外，Islet1在指令這些細(xì)胞增殖和/或存活中的作用表明，Islet1，與其他因子一起，可以被用于驅(qū)動(dòng)生心干細(xì)胞的狀態(tài)?；谏厦婷枋龅倪@些深思熟慮以及在證據(jù)A(Exhibit A)中所闡述的——其通過參考并入本文，我們成功地鑒定到了小鼠、鼠類和人類非-肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的稀有細(xì)胞群(rare cell population)，其能夠在體外被擴(kuò)增和繁殖。這些細(xì)胞不但分化成中胚層譜系，而且分化成神經(jīng)外胚層。我們能夠顯示，能夠體外分化成至少兩個(gè)胚層的細(xì)胞能夠從嚙齒類動(dòng)物和人心臟選擇出來。Islet-1(isl 1)，是一種LIM-同源轉(zhuǎn)換區(qū)轉(zhuǎn)錄因子，標(biāo)識了這些未分化的祖細(xì)胞，并使該生心前體群在成體心臟中是現(xiàn)顯的。因此，這些細(xì)胞被命名為i-細(xì)胞(i-cells)。未分化的i-細(xì)胞的培養(yǎng)，如在下面實(shí)施例1中闡述的，揭示了生心前體群只能在無分化作用下進(jìn)行培養(yǎng)，并且在種屬-特異性的心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上衰老。類似的滋養(yǎng)細(xì)胞-依賴型(feeder-dependent)培養(yǎng)條件被用于分離小鼠和人ES細(xì)胞，且此類滋養(yǎng)層被證明對于將它們維持在未分化的狀態(tài)下是至關(guān)重要的(Donovanand Gearhart，2001)。對從心臟纖維原細(xì)胞獲得的飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基(conditioned medium)的需求表明它們提供抑制多能祖細(xì)胞的分化或促進(jìn)多能祖細(xì)胞自我更新的因子。具有這些特性的活性稱為i-細(xì)胞的分化-抑制活性(differentiation-inihibiting activity of i-cells)(DIAI)。對于鼠類ES細(xì)胞，白血病抑制因子(LIF)，其為有關(guān)白細(xì)胞介素-6的細(xì)胞因子家族的成員，可以替代對飼養(yǎng)細(xì)胞的需求(Nichols，et al.，1990)。為了抑制LIF受體信號組分的鼠類ES細(xì)胞分化激活作用，糖蛋白130(gp 130)是必要和充分的。然而，人ES細(xì)胞和心臟i-細(xì)胞似乎不需要LIF，以便用于阻斷分化作用和刺激自我更新(Thomson，et al.，1998)。直到現(xiàn)在，還沒有建立起這樣的體外培養(yǎng)條件，其允許多能的成體干細(xì)胞擴(kuò)增和繁殖。成體HSCs或NSCs(dult HSCs or NSCs)，在體內(nèi)定義為長期再生細(xì)胞(long-term repopulating cells)，不能在培養(yǎng)物中被擴(kuò)增，而不失去發(fā)育潛力(Weissman，2000)。但是最近的一個(gè)研究顯示，從骨髓得到的間質(zhì)干細(xì)胞，能夠在特定的條件下，在培養(yǎng)基中無限生長(Jiang，et al.，2002)。本發(fā)明也提供了細(xì)胞的組合物，包括富集的isl 1陽性干細(xì)胞群。相比起其他細(xì)胞類型，該組合物優(yōu)選含有大部分的或至少約90％isl 1陽性干細(xì)胞。isl 1陽性干細(xì)胞由任何心臟組織衍生而來，諸如從大鼠、小鼠或人的心臟組織。因?yàn)槲捶只癄顟B(tài)的表型特征，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)i-細(xì)胞在細(xì)胞核中表達(dá)高水平的isl 1，和在胞質(zhì)中表達(dá)高水平的巢蛋白(nestin)，巢蛋白是標(biāo)志未分化NSCs的中間絲。此外，細(xì)胞顯示出低水平地表達(dá)Nkx2.5和ES細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子oct-4，Nkx2.5是果蠅鐵匠基因(tinman)的同源框脊椎動(dòng)物同系物。因此，這些標(biāo)志物可以被用于鑒定i-細(xì)胞。Isl 1對于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和胰腺發(fā)育是至關(guān)重要的(Pfaff，et al.，1996)。敲除isl 1的純合胚胎在大約ED 10.5死亡，這是由單心室的未分開的心臟-腔室以及流出道血管畸形所造成的(Cai，et al.，2003)。isl 1表達(dá)細(xì)胞的譜系分析揭示這些細(xì)胞在實(shí)質(zhì)上有助于形成(substantiallycontribute)胚胎心臟，包括在流出道中的大部分細(xì)胞、右心室和兩心房(Cai，et al.，2003)。在新生兒和成體心臟中，isl 1表達(dá)的下調(diào)允許在心肌層看到生心前體。免疫組織化學(xué)顯示，在成體心臟中的isl 1表達(dá)細(xì)胞主要位于右心室、隔膜和心房中。在未分化的前體細(xì)胞中，isl 1在核中被高水平的表達(dá)，并在i-細(xì)胞分化期間被下調(diào)。Islet表達(dá)在體外和體內(nèi)成為生心干細(xì)胞群的標(biāo)志，并看上去是這些干細(xì)胞分化和存活所必需的。在未分化狀態(tài)下，Nkx2.5也在i-細(xì)胞中被表達(dá)。該轉(zhuǎn)錄因子是脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育最早的標(biāo)記物之一，并且對于心臟-限制性基因活性的調(diào)節(jié)是重要的。POU-域轉(zhuǎn)錄因子oct-4是多能ES細(xì)胞的分子標(biāo)記物。Oct-4在原腸形成前期胚胎、早期卵裂-期胚胎(early cleavage-stageembryo)、胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)的細(xì)胞、和胚胎癌細(xì)胞中被表達(dá)。在成體動(dòng)物中，oct-4僅在生殖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)(Rosner，et al.，1990)。在本發(fā)明中，新型心臟祖細(xì)胞群(progenitor population)已被發(fā)現(xiàn)、分離和鑒定。Isl 1表達(dá)標(biāo)記這些生心干細(xì)胞，并似乎是這些細(xì)胞分化狀態(tài)和存活所必需的。這些細(xì)胞對研究和理解心臟干細(xì)胞分化和生長的信號通路，為先天性和成體心臟病的未來治療應(yīng)用鋪平了道路。神經(jīng)細(xì)胞或肌細(xì)胞中具有進(jìn)一步分化作用的i-細(xì)胞中的基因靶向(gene targeting)，使得進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究，而避免了與耗費(fèi)時(shí)間的動(dòng)物模型的復(fù)雜性相關(guān)的斗爭。細(xì)胞培養(yǎng)的目標(biāo)是開發(fā)明確的、并容易操作的實(shí)驗(yàn)體系，其賦予克隆均勻性的優(yōu)點(diǎn)和操縱外部環(huán)境的能力。而且，由于倫理上不能接受通過實(shí)驗(yàn)的方式改變?nèi)朔N系，ES細(xì)胞轉(zhuǎn)基因路線對于涉及人基因操作的實(shí)驗(yàn)是不可行的。在人i-細(xì)胞中進(jìn)行基因靶向，使得在嚙齒類動(dòng)物模型系統(tǒng)不能充分重演(recapitulate)人生物學(xué)或疾病過程的領(lǐng)域的重要應(yīng)用成為可能。此外，I-細(xì)胞可以作為心臟和神經(jīng)元細(xì)胞治療的供體組織的來源予以應(yīng)用。早期的胚胎干細(xì)胞對于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療具有不利之處(i)轉(zhuǎn)化的數(shù)量和(ii)獲得特異性分化表型所需要的信號的復(fù)雜性。相反，發(fā)育中的i-細(xì)胞和來源于成體的心臟祖先細(xì)胞的表型分化避開了倫理上和免疫學(xué)上的約束。i-細(xì)胞的交叉-譜系轉(zhuǎn)化(Cross-lineage transformation)，為獲得更為靈活的組織來源提供了一個(gè)新的途徑，特別是從病人本身獲得自體移植物。i-細(xì)胞相比起ES細(xì)胞還有一個(gè)先進(jìn)之處，在于這些前體細(xì)胞，在異種移植物中，比起初級胚胎肌細(xì)胞，具有較少的免疫原性，這就為克服來自非-人供體移植中的主要困難之一開辟了道路。本發(fā)明方法利用分離的單克隆抗體，該抗體特征為特異性地結(jié)合Islet 1多肽并免疫沉淀Islet 1多肽。本領(lǐng)域已知的和本文中描述的任何合適的免疫測定形式，都可以被用于檢測Islet 1-表達(dá)細(xì)胞在不同的細(xì)胞群中的存在和/或?qū)υ诓煌募?xì)胞群中的Islet 1-表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行定量。盡管可以使用任何類型的抗-Islet 1多肽抗體，如本文中描述的，其特異性結(jié)合Islet 1多肽，但是優(yōu)選的是單克隆抗體。本發(fā)明對Islet 1多肽的免疫學(xué)測試，可以通過使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)、以高通量形式被使用，諸如FASC篩選，下面將對其進(jìn)行更加詳細(xì)地描述。適合于結(jié)合到本發(fā)明方法所使用的抗體上的可檢測標(biāo)記物——包括高通量篩選形式方法，包括通過使用各種化學(xué)連接基團(tuán)或雙功能肽接頭連接到抗體上的放射性標(biāo)記物。末端羥基可以用無機(jī)酸進(jìn)行酯化，例如32p磷酸或14C有機(jī)酸，或者以另外方式酯化，以便為標(biāo)記物(label)提供連接基團(tuán)(linking groups)。有意用作可檢測標(biāo)記物的酶將首先是水解酶，特別地是酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素和它的衍生物，若丹明和其衍生物、丹磺酰(dansyl)、傘形酮、和諸如此類物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光劑(Chemiluminescers)包括熒光素和2，3-二羥酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)(例如鄰苯二甲基肼)和類似物?？贵w也可以被附著到固體支持物上，其特別用于Islet 1多肽的免疫測定或免疫沉淀反應(yīng)。此種固體支持物包括，但是不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯，例如蛋白G覆蓋的微量板或珠的孔。針對特異性表位或表位組合的抗體，這樣與Islet 1多肽特異性結(jié)合，將使得能篩選本文中描述的細(xì)胞群。通過使用此類單克隆抗體，可以利用各種篩選技術(shù)，并包括使用抗體-涂覆的磁珠的磁分離，用附著到固體基質(zhì)(即板子)上的抗體“淘洗(panning)”和流式細(xì)胞分析術(shù)(參見例如美國專利5,985,660；和Morrison et al.，Cell，96737-49(1999))。在本發(fā)明方法中有用的抗體可以用任何本領(lǐng)域已知的方法測定其免疫特異性結(jié)合特性?？梢允褂玫拿庖邷y定包括，但不限于競爭性和非-競爭性測定系統(tǒng)，使用技術(shù)諸如蛋白質(zhì)印跡、放射性免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾層”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)(gel diffusion precipitin reactions)、免疫擴(kuò)散測定、凝集測定(agglutination assays)、補(bǔ)體結(jié)合測定(complement-fixation assays)、免疫放射量測定、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定諸如此類。此類測定是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域熟知的(參見例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，其通過參考整體并入本文)。示范性的免疫測定方法在下面被簡要描述(但決不為了限制的目的)。免疫沉淀反應(yīng)的方案一般包括在裂解緩沖液中裂解細(xì)胞群，裂解緩沖液諸如RIPA緩沖液(1％NP-40或Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH 7.2，1％Trasylol)，補(bǔ)充以蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、釩酸鈉)，將感興趣的抗體加入到細(xì)胞裂解物中，在4℃下，溫育一段時(shí)間(例如1-4小時(shí))，將蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)G瓊脂糖珠加入到細(xì)胞裂解物中，在4℃下溫育約1小時(shí)或更多時(shí)間，在裂解緩沖液中洗滌珠子，和將珠子重新懸浮于SDS/樣品緩沖液。例如通過蛋白質(zhì)印跡分析可以測定感興趣的抗體免疫沉淀特定抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，關(guān)于這些參數(shù)可以被修改以增加抗體與抗原的結(jié)合作用和減少背景(例如，用瓊脂糖珠預(yù)先洗滌細(xì)胞裂解物)。對于涉及免疫沉淀反應(yīng)方案的進(jìn)一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York at 10.16.1。蛋白質(zhì)印跡分析一般包括制備蛋白質(zhì)樣品；蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺凝膠中電泳(例如，8％-20％ SDS-PAGE，這取決于抗原的分子量)；將蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，諸如硝酸纖維素、PVDF或尼龍；在封閉溶液(例如，含3％BSA或脫脂奶粉的PBS)中封閉膜；在洗滌緩沖液(PBS-Tween 20)中洗滌膜；用在封閉緩沖液中稀釋的初級抗體(感興趣的抗體)對膜進(jìn)行封閉；在洗滌緩沖液中洗滌膜；用在封閉緩沖液中稀釋的二級抗體(其識別初級抗體，例如抗-人抗體)對膜進(jìn)行封閉，二級抗體偶聯(lián)到酶解基質(zhì)(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)或偶聯(lián)到放射活性分子(例如32P或125I)上；在洗滌緩沖液中洗滌膜；并檢測抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將對這些參數(shù)是可以知曉的，它們被修改以增加被檢測到的信號和減少背景噪音(backgroundnoise)。對于關(guān)于蛋白質(zhì)印跡分析方案的進(jìn)一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley &Sons，Inc.，New York at 10.8.1。ELISAs包括制備抗原，用抗原包被96孔微量板的孔，將偶聯(lián)有可檢測化合物諸如酶促基質(zhì)(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)的感興趣的抗體加入到孔中，并溫育一段時(shí)間，并檢測抗原的存在。在ELISAs中，感興趣的抗體不必結(jié)合到可檢測的化合物上；相反，結(jié)合到可檢測化合物上的二級抗體(其識別感興趣的抗體)可以被加入到孔中。還有，代替用抗原包被孔，抗體可以被用來包被孔。在該情況下，在將感興趣的抗原加入到包被的孔中之后，結(jié)合到可檢測化合物上的二級抗體可以被加入。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，參數(shù)可以被修改以增加被檢測到的信號，以及也知道本領(lǐng)域已知的其他變化。對于關(guān)于ELISAs的進(jìn)一步討論，參見Ausubel et al，eds，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York at 11.2.1。通過競爭性結(jié)合測定方法，可以測定抗體對抗原的結(jié)合親和力，以及抗體-抗原相互作用的解離率(off-rate)。競爭性結(jié)合測定的一個(gè)例子是放射性免疫測定，包括用感興趣的抗體，在增加數(shù)量的未標(biāo)記抗原的存在下，溫育標(biāo)記的抗原(例如，3H或125I)；并檢測結(jié)合到標(biāo)記的抗原上的抗體。由用斯卡查德圖分析獲得的數(shù)據(jù)，能夠測定感興趣的抗體對特異抗原的親和力，和結(jié)合解離率。與二級抗體的競爭也能使用放射性免疫測定來確定。在這種情況下，在增加數(shù)量的未標(biāo)記的二級抗體的存在下，用結(jié)合到標(biāo)記的化合物(例如3H或125I)上的感興趣的抗體溫育抗原。用于本發(fā)明測定中的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體或它們的功能活性片段。針對islet 1多肽的單-或多-克隆抗體在合適的宿主動(dòng)物中產(chǎn)生，這是通過使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)、用免疫源性偶聯(lián)物對動(dòng)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生。單克隆抗體的制備方法已被如Kohler and Milstein，Nature256495-7，1975；和Harlow et al.，inAntibodiesa Laboratory Manual，page726(Cold Spring Harbor Pub.，1988)所公開，這些公開資料通過參考并入本文。簡言之，單克隆抗體可以通過下述方法獲得用包含本發(fā)明免疫原性偶聯(lián)物——上面已公開了它的制備——的組合物注射小鼠或其他小型哺乳動(dòng)物，諸如兔，通過取出血清樣品確認(rèn)抗體產(chǎn)物的存在，取出脾以獲得B淋巴細(xì)胞，將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆該雜交瘤，篩選針對抗原產(chǎn)生抗體的陽性克隆，和從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。通過各種業(yè)已建立的技術(shù)，單克隆抗體可以從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化得到。此種分離技術(shù)包括利用蛋白A-瓊脂糖的親合層析，大小排阻層析和離子交換層析。參見，例如Barnes etal.，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，inMethods in Mol.Biol.，1079-104，1992)。本發(fā)明的抗體也可以來自亞人類靈長類動(dòng)物(subhumanprimate)抗體。在狒狒中產(chǎn)生抗體的通用技術(shù)可以參見例如Goldenberget al.，國際專利公布WO91/11465(1991)和Losman et al.，Int.J.Cancer，46310-314，1990。也能使用抗-獨(dú)特型技術(shù)(anti-idiotype technology)產(chǎn)生單克隆抗體，其模擬一個(gè)表位。例如，為第一單克隆抗體制備的抗-獨(dú)特型單克隆抗體，將在高變區(qū)具有結(jié)合區(qū)域，這是被第一單克隆抗體結(jié)合的該表位的“像(image)”。本發(fā)明中使用的術(shù)語“抗體(antibody)”包括完整的分子以及其功能片段，諸如Fab、F(ab′)2和Fv，它們能夠結(jié)合islet 1多肽，這些功能性抗體片段定義如下(1)Fab，是包含抗體分子的單價(jià)抗原-結(jié)合片段的片段，能夠通過用酶——木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體，產(chǎn)生一個(gè)完整的輕鏈和一個(gè)重鏈的一部分而制備得到；(2)Fab′，是抗體分子的片段，其通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，然后還原，產(chǎn)生完整輕鏈和部分重鏈而制備得到；每個(gè)抗體分子得到兩個(gè)Fab′片段；(3)(Fab′)2，是抗體片段，其通過用酶——胃蛋白酶處理整個(gè)抗體而制備得到，無需隨后的還原作用；F(ab′)2是兩個(gè)Fab′的二聚物，通過兩個(gè)二硫鍵固定在一起；(4)Fv，定義為遺傳工程片段，包含表達(dá)為兩條鏈的輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)；和
(5)單鏈抗體(Single chain antibody，″SCA″)，是遺傳工程分子，包含輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)，通過合適的多肽接頭連接，作為遺傳融合單鏈分子。制備這些片段的方法是本領(lǐng)域已知的。(參見如Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1988，通過參考，并入本文)。如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“表位(epitope)”指抗原上的任何抗原決定簇，抗體的互補(bǔ)位與其結(jié)合?？乖瓫Q定簇通常由分子的化學(xué)活性表面定群(grouping)諸如氨基酸或碳水化合物側(cè)鏈組成，通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異性電荷特征。本發(fā)明的抗體片段可以通過對抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)水解作用制備，或通過在大腸桿菌中表達(dá)編碼該片段的DNA而制備得到?？贵w片段可以通過常規(guī)的方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體而獲得。例如，抗體片段可以通過用木瓜蛋白酶酶切抗體，給出稱為F(ab′)2的5S片段而生產(chǎn)得到。該片段可以進(jìn)一步使用硫醇還原劑進(jìn)行切割，和任選地，使用針對由二硫鍵切割產(chǎn)生的巰基基團(tuán)的任意封閉劑，從而產(chǎn)生3.5S Fab′單價(jià)片段。可選擇地，使用木瓜蛋白酶的酶切，直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab′片段和一個(gè)Fc片段。這些方法例如被Goldenberg，美國專利4,036,945和4,331,647，以及該專利包含的參考文獻(xiàn)所描述，這些專利通過參考整體并入本文。也參見Porter，R.R.，Biochem.J.，73119-126，1959。切割抗體的其他方法，諸如分離重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段，對片段的進(jìn)一步切割，或其他酶促的，化學(xué)的，或遺傳技術(shù)也可以被使用，只要片段能夠結(jié)合被完整抗體所識別的抗原就可以。Fv片段包括VH和VL鏈的締合體。該締合可以是非共價(jià)的，如Inbar et al.，Proc.Nat′l ilcad.Sci.USA692659-62，1972中所述。可選擇地，該可變鏈可以通過分子間二硫鍵連接或通過化學(xué)試劑諸如戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。優(yōu)選地，這些Fv片段含有通過肽接頭連接的VH和VL鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)通過構(gòu)建包括編碼VH和VL區(qū)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因制備而得，其中VH和VL區(qū)域通過寡核苷酸連接起來。結(jié)構(gòu)基因被插入到表達(dá)載體，其隨后被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌。該重組宿主細(xì)胞合成單個(gè)多肽鏈，以連接肽連接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域。產(chǎn)生sFvs的方法，由下述文獻(xiàn)描述，例如Whitlow and Filpula，Methods，297-105，1991；Bird et al.，Science242423-426，1988；Pack etal.，Bio/Technology111271-77，1993；和Ladner等美國專利4,946,778，其通過參考整體并入本文?？贵w片段的另一種形式是編碼單個(gè)互補(bǔ)-決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽(“最小識別單位(minimal recognition units)”)可以通過構(gòu)建編碼感興趣的CDR的基因而獲得。此類基因，例如通過使用聚合酶鏈反應(yīng)，從抗體-產(chǎn)生細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)而制備得到。參見例如Larrickand Fry，Methods，2106-10，1991。本發(fā)明方法使用單克隆抗體，該抗體以特異性結(jié)合islet 1多肽為特征，其中，Islet 1多肽保留功能活性。產(chǎn)生單克隆抗體——其用于本發(fā)明方法來免疫捕捉Islet 1多肽——的雜交瘤細(xì)胞系可以從商業(yè)渠道獲得。下面的實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)程序小鼠突變體產(chǎn)生islet無效突變體的方法已經(jīng)在前面描述(Pfaff et al，1996)。敲除構(gòu)建物剔除了編碼Islet 1第二個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域的外顯子。Islet1-cre小鼠通常由Thomas M.Jessell提供，且在之前已經(jīng)被描述過(Srinivas etal，2001)。IRES-cre盒(cassette)被插入到編碼Islet1第二個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域的外顯子中，破壞islet基因的表達(dá)。
整體RNA原位雜交分析(Whole Mount in situ Hybridization)整體RNA原位雜交分析按照之前描述的方法進(jìn)行(Wilkinson，1999)。有關(guān)所被使用的特異性RNA探針的參考文獻(xiàn)如下MLC2a(Kubalak et al.，1994)；MLC2v(O′Brien et al.，1993)；tbx5(Bruneau et al.，1999)；tbx20(未公開的結(jié)果)；BMP2、BMP6、BMP7、BMP4、BMP5(Kim et al.，2001；Lyons et al.，1995)；FGF4、FGF8和FGF10(Feldman etal.，1995；Sun et al.，1999)；EHand(Cross et al.，1995)；islet1(EST，GenBank編號AA198791)(SEQ ID NO2)；msx2(Liu et al.，1994)。利用異羥洋地黃毒苷配基和熒光素-標(biāo)記探針進(jìn)行雙RNA原位雜交，這些探針偶聯(lián)有堿性磷酸酶(Roche Cat.#1277073，1685619)。染色反應(yīng)采用如下物質(zhì)進(jìn)行采用CIP/鐵氰化物/氰亞鐵酸鹽，依據(jù)萬維網(wǎng)上的Janet Rossant’s實(shí)驗(yàn)室方案網(wǎng)址(mshri.on.ca/rossant/protocols/doubleINsitu)和MagentaPhos-tet Red，依據(jù)萬維網(wǎng)上的Claudio Stem′s實(shí)驗(yàn)室方案網(wǎng)址(sternlab.anat.ucl.ac.uk/INSITU)；或者，采用Fast Red(Roche Cat.No.1496549)和BCIP(堿性磷酸酶的生色底物)；單獨(dú)地。溫育和染色以檢測第一抗體(抗-熒光素-AP，Roche Cat.No.1426338)之后，胚胎在65℃溫育1小時(shí)，以使得堿性磷酸酶活性發(fā)生失活，并在溫育之前洗滌，與第二抗體溫育和染色以檢測第二抗體(抗-異羥洋地黃毒苷配基-AP，Roche Cat.No.1093274)。對于用Fast Red染色的胚胎，其中FastRed可溶于乙醇，制備冷凍切片。對于用BCIP/鐵氰化物/氰亞鐵酸鹽和MagentaPhos-tet Red染色的胚胎，制備石蠟切片，在乙醇中快速洗滌以最小化信號損失。
掃描電子顯微術(shù)可以利用心臟掃描電子顯微術(shù)(SEM)的標(biāo)準(zhǔn)程序(Pexieder，1986)。簡要地，將胚胎進(jìn)行乙醇脫水作用，和由氟利昂113至氟利昂23的臨界點(diǎn)干燥。干燥的標(biāo)本置于SEM管上，用300nm金進(jìn)行離子噴濺，并在掃描電子顯微鏡中檢測。以標(biāo)準(zhǔn)取向(orientations)和放大倍數(shù)，拍攝SEM顯微照片。
實(shí)施例2未分化的I-細(xì)胞的培養(yǎng)要從鼠類心臟分離心臟祖先，所使用的方法類似于那些用于從成年器官分離心肌細(xì)胞的方法。在胰蛋白酶-消化狀態(tài)，i-細(xì)胞和心臟纖維原細(xì)胞具有類似的約35μm的細(xì)胞直徑，和在Percoll梯度上以同樣的組分(fractions)共純化。通過測試多個(gè)條件，開發(fā)得到I-細(xì)胞培養(yǎng)物，包括在纖連蛋白、膠原蛋白-型-IV或?qū)诱尺B蛋白上的培養(yǎng)物。測試的培養(yǎng)基條件包括幾個(gè)濃度的胎牛血清(FCS)、表皮生長因子(EGF)、血小板源生長因子(PDGF-BB)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2+4、胰島素樣生長因子(IGF)1、sonic hedgehoc(Shh)和地塞米松，如下所闡述。種植有10個(gè)isl 1陽性細(xì)胞的96孔板中的約5-10％產(chǎn)生持續(xù)的生長培養(yǎng)物，這就表明100個(gè)i-細(xì)胞中只有約5-10個(gè)能夠引發(fā)i-細(xì)胞培養(yǎng)。幾個(gè)i-細(xì)胞群現(xiàn)在已經(jīng)培養(yǎng)超過12倍的群體倍增。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上或在由從心臟新鮮分離的纖維原細(xì)胞制成的條件培養(yǎng)基中，生心性前體群只能以無分化的或沒有細(xì)胞死亡的狀態(tài)培養(yǎng)。通過對心臟纖維原細(xì)胞去除條件培養(yǎng)基或從滋養(yǎng)層分離I-細(xì)胞，可以誘導(dǎo)I-細(xì)胞分化為肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。經(jīng)過5至10倍以上的群體倍增之后，形態(tài)和表型類似。I-細(xì)胞直徑約35μm，具有巨大的細(xì)胞核，無細(xì)胞質(zhì)，以三維球體形式生長，總是附著到纖維原細(xì)胞滋養(yǎng)層。當(dāng)分離和培養(yǎng)人組織心房的i-細(xì)胞時(shí)，獲得類似的結(jié)果。
實(shí)施例3單個(gè)I-細(xì)胞的體外分化接下來，通過加入細(xì)胞因子，測試從小鼠和大鼠心臟獲得的i-細(xì)胞的體外分化能力，其中，細(xì)胞因子依據(jù)對ES細(xì)胞分化成神經(jīng)外胚層和中胚層已經(jīng)作出的報(bào)道而選擇。分化作用要求，i-細(xì)胞必須被重新鋪板，無滋養(yǎng)層，i-細(xì)胞以約1-2×104細(xì)胞/cm2的濃度，處于不含血清但含有譜系-特異性細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中。神經(jīng)祖先細(xì)胞(Neuroprogenitors)可以用PDGF-BB擴(kuò)增，并通過加入bFGF進(jìn)行誘導(dǎo)分化(Palmer，et al.，1999)。在bFGF處理下，約45％的i-細(xì)胞獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和表型特征，對膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元具有免疫組織化學(xué)陽性，其中神經(jīng)元被染色成對神經(jīng)絲200為陽性(NF-200)。肌細(xì)胞分化作用獲得這樣的細(xì)胞，該細(xì)胞在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中對α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白(sarcomeric actin)和α-輔肌動(dòng)蛋白顯示出陽性信號。
實(shí)施例4從小鼠心臟分離出生后心臟祖細(xì)胞的分離方案將30至50個(gè)1天大的小鼠幼崽的心臟從胸部解剖出來，切成四片，在4℃下，不含Ca2+的HBSS(Hank′s balanced salt)溶液中洗滌3次。將心臟轉(zhuǎn)移入0.5mg/ml胰蛋白酶-HBSS溶液中，并在4℃下，在定軌搖床上預(yù)先消化過夜(～17小時(shí))。將一半的胰蛋白酶溶液從預(yù)先消化的組織去除，剩余部分用溫DMEM/M199細(xì)胞培養(yǎng)基(4∶1比率)以1∶1稀釋，所述培養(yǎng)基含有青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)。將組織在37℃下?lián)u動(dòng)3-4分鐘之后，將稀釋的胰蛋白酶從組織去除，將20ml的24U/mlII型膠原酶的HBSS溶液加入到組織溶液中。在37℃下，振蕩水浴中溫育2分鐘之后，棄去最初的膠原酶II型消化液，因?yàn)樗饕醒t細(xì)胞和死亡的組織細(xì)胞。將該組織重新懸浮于12ml的新鮮II型膠原酶溶液中，并在37℃水浴中振蕩10分鐘。通過加入同樣體積的冷的DMEM/M199培養(yǎng)基，使得上清液失活，該DMEM/M199培養(yǎng)基含有10％的馬血清和5％的胎牛血清，將失活的上清液保存在冰上。組織重新懸浮和上清液失活作用再反復(fù)進(jìn)行3次，直到組織切片完全被消化。將來自消化液的上清液收集在一起，并以800rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。上清液含有大部分的心臟間充質(zhì)細(xì)胞，而沉淀含有大部分的心臟肌細(xì)胞。第二次離心1500rpm，3分鐘之后，繼而將DMEM中的間充質(zhì)細(xì)胞鋪板在塑料上20分鐘，DMEM含有青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分鐘之后，通過用PBS進(jìn)行兩步嚴(yán)格的洗滌步驟，將未-附著的細(xì)胞從平板去除。將附著的心臟間充質(zhì)細(xì)胞在37℃下，用5％CO2培養(yǎng)14-21天。在培養(yǎng)的第二天，當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)，將培養(yǎng)基改換為DMEM/F12，DMEM/F12含有B27補(bǔ)體、2％胎牛血清、10ng/ml EGF。10天后，心臟祖群開始在心臟間充質(zhì)細(xì)胞的滋養(yǎng)層頂部開始擴(kuò)增。
實(shí)施例5從大鼠心臟分離出生后心臟祖細(xì)胞的分離方案將50個(gè)出生1-5天的大鼠幼崽心臟從胸部解剖出來，切成四片，在ADS緩沖液中洗滌2次，ADS緩沖液含有6.8g/l NaCl、4.7g/l HEPES、0.12g/lNaH2PO4、0.14g/lNaH2PO4H2O、1g/l葡萄糖、0.4g/lKCl、0.2g/lMgSO47H2O(pH調(diào)整為7.35)。將心臟切片在37℃下，攪拌瓶(stirflask)中，于ADS緩沖液中溫育15分鐘，ADS緩沖液含有膠原酶II型(115單位/ml)和胰酶(0.8mg/ml)。棄去第一消化物。將18ml的新鮮酶溶液加入到組織中，并37℃攪拌20分鐘。消化20分鐘之后，去除酶溶液，用6ml的新生小牛血清使之失活，將新鮮酶溶液加入到攪拌瓶中的組織切片中，并在37℃下再溫育20分鐘。將由第一個(gè)20分鐘消化得到消化物在1000rpm轉(zhuǎn)速下離心6分鐘，將沉淀重新懸浮于5ml的新生小牛血清，并在37℃下置于10％CO2。上面的步驟，從酶溶液的去除至沉淀重新懸浮，重復(fù)進(jìn)行4次。將每次離心所得到的細(xì)胞懸浮液收集起來，并將收集液在1000rpm離心6分鐘。將沉淀重新懸浮于12ml的ADS緩沖液中。將細(xì)胞懸浮液層鋪在Percoll梯度(每一梯度2ml細(xì)胞)的頂部。每一Percoll梯度由頂部的4ml Percoll(1.06g/ml)和底部的3ml Percoll(1.08g/ml)組成。在緩慢加速和減速下，3000rpm離心30分鐘之后，上部的帶由心臟間充質(zhì)細(xì)胞組成，界面處的中間帶由心臟肌細(xì)胞組成。用巴氏吸管收集間充質(zhì)細(xì)胞。第二次離心(1500rpm，3分鐘)之后，繼而將DMEM中的間充質(zhì)細(xì)胞涂布于塑料上20分鐘，DMEM包含青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100mg/ml)/HEPES(25mM)/谷氨酰胺(2mM)/10％新生小牛血清和5％胎牛血清。20分鐘后，通過用PBS進(jìn)行兩步嚴(yán)格的洗滌步驟，將未-附著細(xì)胞從平板去除。將心臟間充質(zhì)細(xì)胞在37℃下，用5％CO2培養(yǎng)14-21天。在培養(yǎng)的第二天，當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)，將培養(yǎng)基改換為DMEM/F12，DMEM/F12含有B27補(bǔ)體、2％胎牛血清、10ng/mlEGF。10天后，心臟祖群開始在心臟間充質(zhì)細(xì)胞的滋養(yǎng)層頂部開始擴(kuò)增。
實(shí)施例6心臟祖細(xì)胞群表型細(xì)胞標(biāo)記的FACS分析在上述實(shí)施例4和實(shí)施例5中，從出生后的小鼠和大鼠心肌膜分離得到的細(xì)胞的表型細(xì)胞標(biāo)記物，分別用FACS分析鑒定。FACS分析顯示90％的細(xì)胞表達(dá)LIM同源轉(zhuǎn)換區(qū)轉(zhuǎn)錄因子islet1；～90％的細(xì)胞表達(dá)果蠅tinman同源物Nkx2.5；和30-40％的細(xì)胞共表達(dá)中間絲巢蛋白。
實(shí)施例7分化方案對于祖群的分化作用，細(xì)胞被重新鋪板(replated)，無間充質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層，密度大約為2×104細(xì)胞/cm2，位于含有2％的胎牛血清和譜系-特異性分化試劑的培養(yǎng)基中。體外肌細(xì)胞分化用條件培養(yǎng)基實(shí)施，條件培養(yǎng)基富集逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的NIH3T3細(xì)胞系的wntl 1，細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)和分泌wntl 1。在纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿中，用wntl 1條件培養(yǎng)基，隨后用2.5ng/ml濃度的BMP2，以連續(xù)分化實(shí)驗(yàn)方案處理細(xì)胞4.4天。然后，將分化的細(xì)胞在單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行分析，以分析電生理情形下的通道電流(channelcurrents)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變。在層粘連蛋白和多溶素包被的培養(yǎng)皿中，用0.2uM全反式視黃酸(all-trans retinoic acid)和5μM毛喉素實(shí)施神經(jīng)元細(xì)胞類型的體外分化，時(shí)間10-15天。脂肪細(xì)胞的體外分化是在塑料培養(yǎng)皿中，用10％的新生小牛血清和5％的胎牛血清實(shí)施。盡管本發(fā)明參考上述實(shí)施例而進(jìn)行描述，應(yīng)該理解的是，修飾和變化包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅由下述權(quán)利要求的限定。
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測干細(xì)胞的方法，包括測定細(xì)胞中的Isletl核酸或表達(dá)產(chǎn)物的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述測定是免疫組織化學(xué)的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述測定是包括測定IsletlmRNA的存在。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是生心干細(xì)胞。
5.一種用于分離或富集干細(xì)胞的方法，包括將一群細(xì)胞與對Isletl具有反應(yīng)性的試劑相接觸，和將所述反應(yīng)陽性細(xì)胞和反應(yīng)陰性細(xì)胞分離開來，從而分離或富集干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是生心干細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述試劑是被可檢測地標(biāo)記的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述標(biāo)記物是熒光標(biāo)志。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述試劑是抗-islet 1抗體。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述分離或富集是通過熒光激活細(xì)胞分選分析法進(jìn)行的。
11.一種用于產(chǎn)生干細(xì)胞的方法，包括將表達(dá)Islet 1的未分化祖細(xì)胞與試劑接觸，以便激活或增強(qiáng)Islet 1在所述細(xì)胞中的表達(dá)，其中，所述試劑激活或增強(qiáng)Isletl在細(xì)胞中的表達(dá)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，Islet 1表達(dá)的所述激活或增強(qiáng)導(dǎo)致所述細(xì)胞分化為中胚層或神經(jīng)外胚層譜系。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述譜系是中胚層譜系。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述譜系是神經(jīng)外胚層譜系。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述未分化祖細(xì)胞是嚙齒類動(dòng)物的。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是非-肌細(xì)胞的心臟細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述未分化祖細(xì)胞是人的。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述人細(xì)胞是非-肌細(xì)胞的心臟細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述干細(xì)胞是生心干細(xì)胞。
20.一種擴(kuò)增未分化生心祖細(xì)胞的細(xì)胞群、而不發(fā)生分化的體外方法，包括培養(yǎng)分離得到的未分化祖細(xì)胞，所述祖細(xì)胞在祖細(xì)胞足以生長的條件下表達(dá)Isletl，其中所述祖細(xì)胞足以生長的條件包括將該細(xì)胞培養(yǎng)在種-特異性心臟纖維原細(xì)胞的滋養(yǎng)層上或培養(yǎng)在來自心臟的纖維原細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述未分化祖細(xì)胞是非-肌細(xì)胞的細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述非-肌細(xì)胞是大鼠的、小鼠的或人的細(xì)胞。
23.一種組合物，包括Isletl陽性干細(xì)胞的富集群，其包括大于90％的Isletl陽性干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了體外擴(kuò)增和增殖未分化的祖細(xì)胞的方法，更具體地，提供了體外擴(kuò)增和增殖含有Islet1的未分化祖細(xì)胞的方法，Islet1是增殖中的心臟干細(xì)胞顯然特有的一個(gè)標(biāo)志，本發(fā)明描述了用于分離干細(xì)胞群的方法，以及用于刺激未分化的祖細(xì)胞擴(kuò)增和增殖而不發(fā)生分化的方法，例如，以提供心臟修復(fù)或改善心臟功能。
文檔編號C12Q1/68GK1768133SQ200480008937
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者S·M·埃文斯, J·陳, C·蔡, A·莫雷蒂, K·R·近, K-L·勞格維茨 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會