專利名稱：用不能形成芽孢的微生物來(lái)生產(chǎn)泛酸鹽/酯的方法
泛酸鹽/酯是復(fù)合維生素B的一員，而且是哺乳動(dòng)物，包括人類的營(yíng)養(yǎng)必需物，例如，它來(lái)自食物源，作為水可溶性維生素補(bǔ)充劑或作為飼料添加劑。在細(xì)胞中，泛酸鹽/酯主要用于輔酶A和?；d體蛋白質(zhì)的生物合成。這些必需的輔酶在?；糠值拇x中發(fā)揮作用，所述?；糠峙c這些分子的4’-磷酸泛酰巰基乙胺部分的巰基形成硫酯。
由很多化學(xué)物質(zhì)通過(guò)化學(xué)合成已常規(guī)合成了泛酸鹽/酯。但是，化學(xué)合成所需要的底物昂貴，并且外消旋的中間產(chǎn)物必須要光學(xué)分解。因此，已使用細(xì)菌或微生物體系，所述體系能生產(chǎn)用在泛酸鹽/酯生物合成工藝中的酶。具體而言，生物轉(zhuǎn)化工藝已被評(píng)價(jià)是有利于生產(chǎn)泛酸的優(yōu)選異構(gòu)體的方式。此外，直接的微生物合成方法近來(lái)已被分析是方便D-泛酸鹽/酯生產(chǎn)的方式。
專利申請(qǐng)WO 01/21772、WO 02/057474和WO 02/061108描述了一種用B.subtilis 168菌株來(lái)生產(chǎn)泛酸鹽/酯的方法，所述菌株對(duì)在泛酸鹽/酯生產(chǎn)中所涉及的生物合成基因具有更高的表達(dá)水平。這些基因包括panB、panC、panD、panE(ylbQ)、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA和serA。為獲得對(duì)這些基因的更高表達(dá)水平，已使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)遺傳重組方法。這些工程菌株的泛酸鹽/酯的產(chǎn)量在48小時(shí)的補(bǔ)料分批發(fā)酵中在37g/l至85g/l之間。
從環(huán)境和政府調(diào)節(jié)的角度看，重要的是如果經(jīng)遺傳改造的微生物在發(fā)酵工藝過(guò)程中或在生物質(zhì)的處理期間從生產(chǎn)廠逸出，它們不具有在自然環(huán)境中存活的能力。為此，在發(fā)酵工藝中使用B.subtilis的芽孢形成缺陷型菌株(例如，核黃素-US 5837528；生物素-US 6057136)。典型地，spo0A突變用于阻止芽孢形成。spo0A基因?qū)φ{(diào)控芽孢形成的起動(dòng)的蛋白進(jìn)行編碼。spo0A通過(guò)點(diǎn)突變、閱讀框移位突變或缺失突變的失活在最早階段阻止了芽孢形成，從而產(chǎn)生不再能抵抗化學(xué)溶劑、輻射和/或熱的菌株。除spo0A突變以外，WO 97/03185描述了一種生產(chǎn)商業(yè)上重要的酶的方法，其中利用了Bacillus licheniformis spoIIAC的突變，該基因?qū)ρ挎咝纬商禺愋赞D(zhuǎn)錄sigma因子σF進(jìn)行編碼，以獲得不能形成芽孢的Bacillus屬B.subtilis之外的細(xì)菌。
在B.subtilis和其它相關(guān)的Gram陽(yáng)性細(xì)菌中，內(nèi)生芽孢形成(芽孢形成)的過(guò)程由數(shù)個(gè)階段組成。進(jìn)入芽孢形成的階段由磷酸化的Spo0A(Spo0A～P)，一種對(duì)DNA結(jié)合具有基本應(yīng)答的調(diào)節(jié)子控制(Fawcett等，2000)。Spo0A～P起兩個(gè)關(guān)鍵作用(Phillips and Strauch，2002)。在低細(xì)胞內(nèi)濃度時(shí)，Spo0A～P抑制abrB的轉(zhuǎn)錄，從而提高了對(duì)轉(zhuǎn)變狀態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)的AbrB依賴型調(diào)節(jié)。如果接著Spo0A～P濃度達(dá)到較高的臨界水平，它則激活進(jìn)入和參與芽孢形成所需要的基因(sinI、spoIIG、spoIIE、spoIIA等)。因?yàn)镾po0A～P抑制abrB的轉(zhuǎn)錄，并且AbrB抑制sigH的轉(zhuǎn)錄，因此Spo0A～P間接地激活了σH的調(diào)節(jié)子中的基因，σH是另一種控制在芽孢形成的早期階段和穩(wěn)定生長(zhǎng)階段中所涉及的基因(spo0A、spo0F、spoIIA、phrC、phrE等)轉(zhuǎn)錄的sigma因子(Britton等，2002)。增加或降低Spo0A～P和AbrB水平的基因和基因產(chǎn)物包括但不限于abrB、kapB、kbaA、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE、kipA、kipI、obg、phrC、phrE、rapA、rapB、rapE、sigH、spo0A、spo0B、spo0E和spo0F。影響啟動(dòng)子位點(diǎn)的Spo0A～P依賴型結(jié)合以激活基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的例子包括但不限于Spo0JA和Spo0JB。增加或降低Spo0A～P和AbrB水平的信號(hào)的例子包括但不限于營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、代謝信號(hào)、DNA狀態(tài)信號(hào)、細(xì)胞密度信號(hào)(信息素和群體感應(yīng)分子)和細(xì)胞周期信號(hào)。
這些步驟之后，細(xì)胞不對(duì)稱地分裂產(chǎn)生兩個(gè)大小不等、發(fā)育結(jié)果不同的區(qū)室(compartment)(Piggot and Losick，2002)。較小的區(qū)室，即前芽孢發(fā)育成芽孢，而較大的區(qū)室，即母細(xì)胞為芽孢的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)芽孢的形態(tài)形成完成時(shí)，母細(xì)胞裂解，釋放出成熟的芽孢。分化涉及四個(gè)細(xì)胞特異性sigma因子(σF、σE、σG和σK)的作用。σF和σE因子在不對(duì)稱分裂(極性分割，階段II)之后很快被激活，σF引導(dǎo)前芽孢中的基因表達(dá)(Margolis等，1991)，σE引導(dǎo)母細(xì)胞中的基因表達(dá)(Dirks and Losick，1991)。以后，在芽孢形成中，前芽孢中σF被σG所替代，母細(xì)胞中σE被σK所替代(Losick and Stragier，1992；Li and Piggot，2001)。
σE源自被稱為前σE的非活性前蛋白質(zhì)(LaBell等，1987)。前σE的合成開(kāi)始于分割之前(Satola等，1992)，但從前σE到成熟σE的蛋白水解加工發(fā)生在母細(xì)胞不對(duì)稱分裂之后。該反應(yīng)由芽孢形成特異性的蛋白酶SpoIIGA介導(dǎo)，它從前σE氨基末端上切下27個(gè)氨基酸(Stragier等，1988；Jonas等，1988；Peters和Haldenwang，1994)。在加工之前，前芽孢中在σF控制下產(chǎn)生的分泌出的信號(hào)蛋白(SpoIIR)激活SpoIIGA(Londono-Vallejo and Stragier，1995；Hofmeister等，1995；Karow等，1995)。關(guān)于σE和其它sigma因子的激活的其它信息，參見(jiàn)Helmann and Moran(2002)。
將芽孢形成突變與其它突變組合到單種細(xì)菌中，已顯示產(chǎn)生了意想不到的基因激活。例如，編碼γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基因ggt的表達(dá)在不存在Spo0A～P下會(huì)減少，在雙abrB和spo0A-無(wú)效突變體中，ggt的表達(dá)可以比野生型表達(dá)水平增加三至四倍(Xu and Strauch，1996)。此類菌株也不能形成芽孢。但是，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些菌株可以以與對(duì)照細(xì)胞相似或更高的水平來(lái)生產(chǎn)泛酸鹽/酯。具體而言，Xu and Strauch中所述的細(xì)胞不能過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物。
有意思的是，WO 01/21772、WO 02/057474和WO 02/061108中所述的經(jīng)遺傳改造的泛酸鹽/酯生產(chǎn)B.subtilis 168菌株對(duì)于芽孢形成來(lái)說(shuō)都是野生型的。沒(méi)有提供表示在芽孢形成缺陷型菌株中生產(chǎn)泛酸鹽/酯的實(shí)施例。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的芽孢形成缺陷型微生物。本發(fā)明的另一目的是提供制備芽孢形成缺陷型微生物的方法，該方法還適合用于Bacillus subtilis。
已發(fā)現(xiàn)通常使用的spo0A突變導(dǎo)致泛酸鹽/酯產(chǎn)量的顯著降低。但是也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，缺乏SigE活性或同時(shí)缺乏Spo0A和AbrB的Bacillus subtilis細(xì)胞完全沒(méi)有芽孢形成，并顯示出在與對(duì)照細(xì)胞類似或更高水平下的泛酸鹽/酯產(chǎn)量。
因此，本發(fā)明涉及能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的芽孢形成缺陷型微生物。該微生物可以被修飾成使得SigE的活性相比該微生物的未經(jīng)修飾形式有降低。SigE是基因spoIIGB編碼的基因產(chǎn)物。降低的SigE活性可能是由spoIIGB表達(dá)的缺乏、spoIIGA編碼的蛋白酶表達(dá)的降低或缺乏、其它上游調(diào)控基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的降低或缺乏等所導(dǎo)致的。優(yōu)選地，對(duì)該微生物的修飾包括引起SigE活性降低的突變。更優(yōu)選地，該突變影響一種或多種選自由基因spoIIGA、spoIIGB、spoIIR和spoIIAC組成的組的基因。
還已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)增加spo0A基因的表達(dá)，也增加在過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的B.subtilis菌株中的泛酸鹽/酯產(chǎn)量。由于該菌株仍形成芽孢，所以引入sigE突變將導(dǎo)致B.subtilis菌株生產(chǎn)出與spo0A過(guò)量生產(chǎn)親本菌株相似的量的泛酸鹽/酯，并且不形成芽孢。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有降低的SigE活性和較高Spo0A～P水平的微生物因此能夠生產(chǎn)更多的泛酸鹽/酯，而不形成芽孢。
在本發(fā)明的另一方面，該微生物可以被修飾成使得Spo0A和AbrB的活性相比較該微生物的未經(jīng)修飾形式有降低。Spo0A和AbrB是由spo0A和abrB基因分別編碼的基因產(chǎn)物。降低的Spo0A和AbrB活性可能是由基因表達(dá)的缺乏、信號(hào)(營(yíng)養(yǎng)、代謝、DNA狀態(tài)、細(xì)胞密度[信息素和群體感應(yīng)分子]和細(xì)胞周期的信號(hào))的降低或缺乏、其它上游調(diào)控基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的降低或缺乏等所導(dǎo)致的。優(yōu)選地，對(duì)該微生物的修飾包括引起Spo0A/AbrB活性降低的突變。更優(yōu)選地，該突變影響選自由abrB、kapB、kbaA、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE、kipA、kipI、obg、phrC、phrE、rapA、rapB、rapE、scoC、sigH、sinR、sinI、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0JA和spo0JB所組成的組的一種、兩種或更多種基因。
微生物可以是真核的或原核的。優(yōu)選地，微生物是原核的。該原核微生物可以是Gram陽(yáng)性或Gram陰性的。Gram陽(yáng)性微生物包括但不限于屬于Bacillus、Corynebacterium、Lactobacillus、Lactococci和Streptomyces屬其中之一的微生物。優(yōu)選地，微生物屬于Bacillus屬。例子是Bacilluslicheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacilluspuntis、Bacillus halodurans等。最優(yōu)選地，微生物是Bacillus subtilis。本發(fā)明的微生物的對(duì)應(yīng)野生型形式是芽孢形成微生物。
“泛酸鹽/酯化合物”優(yōu)選是泛酸鹽/酯。泛酸鹽/酯化合物還包括泛酸鹽/酯生物合成的生物合成途徑中的中間產(chǎn)物化合物，例如pantoate、α-ketopantoate、α-酮異戊酸酯等。
本發(fā)明包括任何對(duì)微生物基因進(jìn)行的導(dǎo)致sigE基因產(chǎn)物(SigE蛋白質(zhì))功能降低的突變。SigE功能可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的芽孢形成測(cè)定中測(cè)定出。本發(fā)明的微生物可以在其spoIIGB(sigE)基因上具有突變，導(dǎo)致功能性sigE基因產(chǎn)物不表達(dá)或表達(dá)降低。本發(fā)明還包括在已知用于激活spoIIGB(sigE)的基因上的任何突變。這些包括但不限于spoIIGA、spoIIR和spoIIAC(sigF)(Helmann and Moran，2002)。本發(fā)明的微生物可以在其spoIIGA基因上具有突變，導(dǎo)致功能性spoIIGA基因產(chǎn)物不表達(dá)或表達(dá)降低。本發(fā)明的微生物可以在其spoIIR基因上具有突變，導(dǎo)致功能性spoIIR基因產(chǎn)物不表達(dá)或表達(dá)降低。本發(fā)明的微生物可以在其spoIIAC基因上具有突變，導(dǎo)致功能性spoIIAC基因產(chǎn)物不表達(dá)或表達(dá)降低。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或隨后的被轉(zhuǎn)錄序列到氨基酸序列的翻譯。核酸的表達(dá)減少可以通過(guò)將突變引入基因來(lái)獲得，例如通過(guò)使基因缺失；核苷酸的增加或減少，使得通過(guò)閱讀框的移位來(lái)使被編碼的蛋白質(zhì)活性減少或失活，或通過(guò)引入終止密碼子使得翻譯在成熟前終止；修飾調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及本文中所述的其它技術(shù)。
“突變”可以是基因序列中的缺失、取代或增加。突變可以是破壞、閱讀框移位突變或無(wú)義突變。突變可以是影響到基因的整條序列或其一部分的破壞。突變可以影響到基因的編碼或非編碼序列，例如啟動(dòng)子。突變可能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的完全缺乏或翻譯在成熟前終止。同樣，突變可以定位在先前的(或“上游”)基因中，這會(huì)通過(guò)被稱為是極性的方法破壞鄰近(或“下游”)基因的轉(zhuǎn)錄?；蛘撸蛔兛赡芫哂邢率鲂Чg出的蛋白質(zhì)較之野生型蛋白質(zhì)帶有使得該蛋白質(zhì)不具有功能的突變。
向基因中引入合適突變的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法包括但不限于向細(xì)菌染色體引入點(diǎn)突變(Cutting and Vander Horn，1990)；移掉染色體DNA的片斷，用抗生素抗性基因替換該片斷(Perego，1993)；直接插入可轉(zhuǎn)座元件，例如轉(zhuǎn)座子Tn917或mini Tn10(Youngman，1990；Petit et al.，1990)或質(zhì)粒，例如pMUTIN(Vagner et al.，1998)。
優(yōu)選地，其sigE基因產(chǎn)物功能減少的芽孢形成缺陷型微生物能夠過(guò)量表達(dá)spo0A，更優(yōu)選地，它過(guò)量表達(dá)spo0A。對(duì)spo0A的過(guò)量表達(dá)可以如本文所述的來(lái)獲得。
基因的表達(dá)增加或過(guò)量表達(dá)可以以一系列方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。一種獲得過(guò)量表達(dá)一種或多種基因的微生物的方法是改變或修飾與特定基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)控序列或位點(diǎn)，例如通過(guò)加入強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子，或者通過(guò)移除調(diào)控序列，使得表達(dá)成為組成型的。下文描述進(jìn)一步的技術(shù)。
“啟動(dòng)子”是基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的DNA序列，涉及對(duì)RNA聚合酶和/或其它起動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合。通常，啟動(dòng)子確定在什么條件下表達(dá)基因。
“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”導(dǎo)致基因的mRNA合成在特定條件下暫時(shí)啟動(dòng)。(i)啟動(dòng)子可能主要受輔助因子，例如阻遏子或激活子的調(diào)控。阻遏子是抑制啟動(dòng)子活性的序列特異性DNA結(jié)合蛋白。在防止阻遏子與啟動(dòng)子的操縱序列結(jié)合的誘導(dǎo)劑的存在下，轉(zhuǎn)錄可以從該啟動(dòng)子起動(dòng)。來(lái)自Gram陽(yáng)性微生物的此類啟動(dòng)子的例子包括但不限于，gnt(葡糖酸鹽/酯操縱子的啟動(dòng)子)；來(lái)自Bacillus licheniformis的penP；glnA(谷氨酰胺合成酶)；xylAB(木糖操縱子)；araABD(L-阿拉伯糖操縱子)和Pspac啟動(dòng)子，這是可以由誘導(dǎo)劑，例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)控制的SPO1/lac雜交啟動(dòng)子(Yansura and Henner，1984)。激活子也是序列特異性DNA結(jié)合蛋白，但它誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性。來(lái)自Gram陽(yáng)性微生物的此類啟動(dòng)子的例子包括但不限于，雙組分體系(PhoP-PhoR、DegU-DegS、Spo0A-Phosphorelay)、LevR、Mry和GltC。(ii)次級(jí)sigma因子的產(chǎn)生可以主要負(fù)責(zé)來(lái)自特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。來(lái)自Gram陽(yáng)性微生物的例子包括但不限于，由芽孢形成特異性sigma因子(σF、σE、σG和σK以及一般性應(yīng)激sigma因子，σB)激活的啟動(dòng)子。σB介導(dǎo)的應(yīng)答由能量限制和環(huán)境應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)(Hecker and Vlker，1988)。(iii)衰減作用和抗終止作用也會(huì)調(diào)控轉(zhuǎn)錄。來(lái)自Gram陽(yáng)性微生物的例子包括但不限于，trp操縱子和sacB基因。(iv)表達(dá)載體中其它受調(diào)控的啟動(dòng)子基于來(lái)自噬菌體φ105的溫度敏感型免疫阻遏子(Osbourne et al.，1985)和帶來(lái)蔗糖誘導(dǎo)性的sacR調(diào)控體系(Klier and Rapoport，1988)。
“組成型”啟動(dòng)子是允許基因在幾乎所有環(huán)境條件下表達(dá)的啟動(dòng)子，即引導(dǎo)恒定的、非特異性的基因表達(dá)的啟動(dòng)子?！皬?qiáng)組成型啟動(dòng)子”引起mRNA以相對(duì)于天然宿主細(xì)胞的高頻率啟動(dòng)。強(qiáng)組成型啟動(dòng)子是公知的，并且可以根據(jù)宿主細(xì)胞中要控制的特定序列來(lái)選擇合適的啟動(dòng)子。來(lái)自Gram陽(yáng)性微生物的這種強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的例子包括但不限于，SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子)和amyE。來(lái)自Gram陰性微生物的啟動(dòng)子的例子包括但不限于，tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR和λ-PL。
本發(fā)明還包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)基因的任何突變，導(dǎo)致Spo0A和AbrB的功能降低。Spo0A和AbrB的功能可以在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的酶測(cè)定(Xuand Strauch，1996)中并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的微陣列技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。此外，Spo0A功能可以在芽孢形成測(cè)定中進(jìn)行測(cè)定；AbrB功能可以用與AbrB調(diào)控啟動(dòng)子(spo0VG、tycA、abrB等)融合的lacZ報(bào)道基因測(cè)定。微生物可以在其spo0A基因上具有至少一處突變，并且在其abrB基因上具有至少一處突變。突變導(dǎo)致功能性spo0A基因產(chǎn)物的表達(dá)降低或不表達(dá)，以及功能性abrB基因產(chǎn)物的表達(dá)降低或不表達(dá)。
導(dǎo)致Spo0A功能降低的對(duì)一個(gè)或多個(gè)基因的突變包括對(duì)已知能激活spo0A的基因的突變。這些包括但不限于，spo0B、spo0F、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE和sigH。本發(fā)明的微生物可以在其spo0B上具有突變，導(dǎo)致功能性spo0B基因產(chǎn)物的表達(dá)降低或不表達(dá)。本發(fā)明的微生物可以在其spo0F上具有突變，導(dǎo)致功能性spo0F基因產(chǎn)物的表達(dá)降低或不表達(dá)。
在本發(fā)明的一種特定實(shí)施方式中，可以組合導(dǎo)致SigE功能降低的突變和導(dǎo)致Spo0A和AbrB功能降低的突變。因此，本文中所述的各種突變和修飾的優(yōu)選實(shí)施方式可以組合起來(lái)。在進(jìn)行必要的修正后，這適用于下文所述的方法。
本發(fā)明的微生物能夠在合適的條件下過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物”指，相比較所述微生物的野生型形式，本發(fā)明的微生物生產(chǎn)的泛酸鹽/酯化合物顯著增加。優(yōu)選地，泛酸鹽/酯的過(guò)量生產(chǎn)指每升培養(yǎng)基產(chǎn)出至少50mg、100mg、200mg、500mg、1g、3g、5g或10g的泛酸鹽/酯。
在一種實(shí)施方式中，當(dāng)本發(fā)明的微生物群在實(shí)施例II所述的條件下被培養(yǎng)時(shí)，每升培養(yǎng)基中產(chǎn)出至少100mg、優(yōu)選至少125mg、更優(yōu)選至少140mg、更優(yōu)選至少200mg、還更優(yōu)選至少300mg、甚至更優(yōu)選至少400mg、最優(yōu)選至少500mg的泛酸鹽/酯。在該實(shí)施例中，描述了在最少培養(yǎng)基中進(jìn)行的培養(yǎng)?；蛘?，當(dāng)本發(fā)明的微生物群在實(shí)施例IV或V所述的條件下被培養(yǎng)時(shí)，每升培養(yǎng)基中可以產(chǎn)出至少100mg、優(yōu)選至少125mg、更優(yōu)選至少140mg、更優(yōu)選至少200mg、還更優(yōu)選至少300mg、甚至更優(yōu)選至少400mg、最優(yōu)選至少500mg的泛酸鹽/酯。
另一方面，當(dāng)本發(fā)明的微生物群在實(shí)施例III所述的條件下被培養(yǎng)時(shí)，每升培養(yǎng)基中產(chǎn)出至少5g、優(yōu)選至少7.5g、最優(yōu)選至少10g的泛酸鹽/酯。
由本發(fā)明的芽孢形成缺陷型微生物生產(chǎn)泛酸鹽/酯的水平可與對(duì)照細(xì)胞的泛酸鹽/酯生產(chǎn)水平相當(dāng)。因此，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，由本發(fā)明的微生物群生產(chǎn)出的泛酸鹽/酯化合物的量可以比非芽孢形成缺陷型的相應(yīng)微生物群生產(chǎn)的泛酸鹽/酯化合物的量的50％、優(yōu)選75％、更優(yōu)選100％要高。當(dāng)在實(shí)施例II所述的條件下培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選地，由本發(fā)明的微生物群生產(chǎn)出的泛酸鹽/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相應(yīng)微生物群生產(chǎn)的泛酸鹽/酯化合物的量的50％、優(yōu)選75％要高。當(dāng)在如實(shí)施例III所述的條件下培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選地，由本發(fā)明的微生物群生產(chǎn)出的泛酸鹽/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相應(yīng)微生物群生產(chǎn)的泛酸鹽/酯化合物的量的50％、優(yōu)選75％、最優(yōu)選100％要高。當(dāng)在如實(shí)施例IV所述的條件下培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選地，由本發(fā)明的微生物群生產(chǎn)出的泛酸鹽/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相應(yīng)微生物群生產(chǎn)的泛酸鹽/酯化合物的量的50％、優(yōu)選75％、最優(yōu)選100％要高。當(dāng)在如實(shí)施例V所述的條件下培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選地，由本發(fā)明的微生物群生產(chǎn)出的泛酸鹽/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相應(yīng)微生物群生產(chǎn)的泛酸鹽/酯化合物的量的50％、優(yōu)選75％、最優(yōu)選100％要高。
“非芽孢形成缺陷型的相應(yīng)微生物”優(yōu)選是沒(méi)有經(jīng)過(guò)使得SigE功能或Spo0A和ArbB功能降低的修飾的微生物。例如，如果本發(fā)明的微生物在其spoIIGA基因處具有突變，那么非芽孢形成缺陷型的相應(yīng)微生物是與本發(fā)明的微生物幾乎相同的微生物，除了在其spoIIGA基因處不具有突變。這同樣適用于在其它基因處的突變。
泛酸鹽/酯化合物的過(guò)量生產(chǎn)可以通過(guò)一系列方式獲得。制備過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的Bacillus subtilis菌株的方法在例如WO 01/21772、WO02/057474和WO 02/061108中有描述。一種獲得過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的微生物的方法是對(duì)泛酸鹽/酯生物合成途徑中涉及的一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“過(guò)量表達(dá)的”或“過(guò)量表達(dá)”包括基因產(chǎn)物的表達(dá)水平高于對(duì)該微生物進(jìn)行修飾之前表達(dá)的水平，或高于在未經(jīng)修飾的同等微生物中表達(dá)的水平。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的微生物過(guò)量表達(dá)選自panB、panC、panD、panE、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA和sera、ylmA以及甘氨酸切割途徑中所涉及的gcv基因中的一個(gè)或多個(gè)基因。
在微生物中基因的過(guò)量表達(dá)可以根據(jù)本文中所述的任何一套方法來(lái)進(jìn)行，包括但不限于，對(duì)基因進(jìn)行去調(diào)節(jié)和/或?qū)χ辽僖粋€(gè)基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)。在一種實(shí)施方式中，微生物可以被遺傳操縱，例如遺傳工程改造，以使基因產(chǎn)物過(guò)量表達(dá)的水平高于在對(duì)該微生物進(jìn)行修飾之前的表達(dá)水平，或高于在未經(jīng)過(guò)修飾的同等微生物中表達(dá)的水平。遺傳操縱可以包括但不限于改變或修飾與特定基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)控序列或位點(diǎn)，例如通過(guò)加入強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或多種啟動(dòng)子，或者通過(guò)移除調(diào)控序列，使得表達(dá)呈組成型；修飾特定基因的染色體位置；改變與特定基因鄰近的核酸位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子；增加特定基因的拷貝數(shù)；修飾蛋白質(zhì)，例如特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯中涉及到的調(diào)控蛋白質(zhì)、阻遏子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活子等；或者任何其它本領(lǐng)域中常規(guī)的使特定基因表達(dá)去調(diào)節(jié)的傳統(tǒng)方法(包括但不限于，使用反義核酸分子，例如以阻止阻遏子蛋白的表達(dá))。合適的啟動(dòng)子的例子有但不限于，Pveg、P15和P26(Lee et al.，1980，Mol.Gen.Genet.18057-65and Moran et al.，1982，Mol.Gen.Genet.186339-46)。
在另一種實(shí)施方式中，可以對(duì)微生物進(jìn)行物理上或環(huán)境上的操作，使基因產(chǎn)物過(guò)量表達(dá)的水平高于對(duì)該微生物進(jìn)行操作之前表達(dá)的水平，或高于在未經(jīng)過(guò)操作的同等微生物中表達(dá)的水平。例如，可以使用這種試劑處理微生物，或在這種試劑的存在下培養(yǎng)微生物，該試劑已知或被懷疑能增加特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯，使得轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強(qiáng)或增加?；蛘撸梢栽谶x定的溫度下培養(yǎng)微生物，該溫度能增加特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯，使得轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強(qiáng)或增加。
術(shù)語(yǔ)“去調(diào)節(jié)的”或“去調(diào)節(jié)”包括對(duì)微生物中至少一個(gè)基因的修飾加以改變，使得微生物中該基因產(chǎn)物的水平或活性被改變或被修飾。優(yōu)選地，至少一個(gè)基因被改變或被修飾，使得基因產(chǎn)物增強(qiáng)或增加。
本發(fā)明還涉及制備能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的芽孢形成缺陷型微生物的方法。可以對(duì)能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的微生物進(jìn)行修飾，使其調(diào)控SigE功能的基因含有突變，并且可選地，Spo0A的功能增加。根據(jù)該實(shí)施方式，所述方法包括(a)提供能過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的微生物，(b)可選地，在所述微生物中引入導(dǎo)致Spo0A功能增加的DNA序列(例如，啟動(dòng)子)或突變，以及(c)在步驟(a)或(b)的微生物中引入降低SigE功能的突變，從而得到芽孢形成缺陷型微生物。
步驟(b)和(c)的順序可以改變。
或者，所述方法可以包括(a)提供能過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的微生物，(b)在步驟(a)的微生物中引入降低Spo0A功能和降低ArbB功能的突變，從而得到芽孢形成缺陷型微生物。
在另一種實(shí)施方式中，可以在進(jìn)行使得泛酸鹽/酯化合物過(guò)量生產(chǎn)的突變之前，引入對(duì)sigE基因的突變或?qū)po0A基因和arbB基因的突變。根據(jù)該實(shí)施方式，所述方法包括(a)提供不能過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的微生物，(b)向步驟(a)的微生物中引入降低SigE活性的突變或向步驟(a)的微生物中引入降低Spo0A活性和降低ArbB活性的突變，從而得到芽孢形成缺陷型微生物，以及(c)對(duì)步驟(b)中獲得的芽孢形成缺陷型微生物進(jìn)行修飾，使其能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物。
如果在該方法的步驟(b)中引入了導(dǎo)致SigE活性降低的突變，該方法可以包括如下可選的步驟向步驟(a)、(b)或(c)的微生物中引入導(dǎo)致Spo0A功能增加的DNA序列(例如，啟動(dòng)子)或突變。
本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的方法，所述方法包括(a)在生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的條件下，培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微生物；以及(b)可選地，從細(xì)胞培養(yǎng)基中回收泛酸鹽/酯化合物。
本發(fā)明的方法包括在生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的條件下，培養(yǎng)經(jīng)過(guò)修飾的微生物的步驟。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”包括對(duì)本發(fā)明的活的微生物進(jìn)行保持和/或培育。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的微生物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在另一種實(shí)施方式中，微生物在固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中包含有對(duì)所述微生物的保持和/或生長(zhǎng)所必須的或有利的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。此類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括但不限于，碳源或碳底物，例如復(fù)合碳水化合物，例如豆類或谷物粗粉、淀粉、糖、糖醇、烴、油、脂肪、脂肪酸、有機(jī)酸和醇；氮源，例如來(lái)自谷物、豆類和塊莖的植物蛋白質(zhì)、蛋白胨、肽和氨基酸，來(lái)自動(dòng)物來(lái)源，例如肉、奶、動(dòng)物副產(chǎn)物(例如，胨、肉類提取物和酪蛋白水解產(chǎn)物)的蛋白質(zhì)、肽和氨基酸；無(wú)機(jī)氮源，例如尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和磷酸銨；磷源，例如磷酸、其鈉鹽和鉀鹽；痕量元素，例如鎂、鐵、錳、鈣、銅、鋅、硼、鉬和/或鈷鹽；以及生長(zhǎng)因子，例如氨基酸、維生素、生長(zhǎng)促進(jìn)劑等。
優(yōu)選在受控的pH下對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。在一種實(shí)施方式中，在6.0至8.5之間的pH下，更優(yōu)選在pH約為7下培養(yǎng)微生物?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)保持理想的pH。
優(yōu)選地，還在受控的通風(fēng)條件和受控的溫度下對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。在一種實(shí)施方式中，受控溫度包括15至70C之間的溫度，優(yōu)選是20至55℃之間的溫度，更優(yōu)選是30至45℃或30至50℃之間的溫度。
可以通過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，例如靜止培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、通風(fēng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(aeration spinner culture)或發(fā)酵在液體培養(yǎng)基中連續(xù)地或間歇地培養(yǎng)微生物。優(yōu)選地，在發(fā)酵罐中對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵工藝包括分批、補(bǔ)料分批和連續(xù)的發(fā)酵方法。各種此類方法已開(kāi)發(fā)出，并且是本領(lǐng)域公知的。
培養(yǎng)通常持續(xù)的時(shí)間要足以生產(chǎn)出所期望量的泛酸鹽/酯化合物。
在本發(fā)明的另一方面，該方法還包括回收泛酸鹽/酯化合物的步驟。術(shù)語(yǔ)“回收”包括從培養(yǎng)基中離析、提取、收獲、分離或純化所述化合物?；衔锏碾x析可以按照本領(lǐng)域中已知的任何傳統(tǒng)離析或純化的一套方法來(lái)進(jìn)行，這些方法包括但不限于用傳統(tǒng)樹(shù)脂進(jìn)行處理，用傳統(tǒng)吸附劑進(jìn)行處理，改變pH，溶劑提取，透析，過(guò)濾，濃縮，結(jié)晶，重結(jié)晶，pH調(diào)節(jié)，凍干等。例如，從培養(yǎng)基中回收泛酸鹽/酯化合物可以通過(guò)首先將微生物從培養(yǎng)基中移出而進(jìn)行。然后將培養(yǎng)基通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以除去不想要的陽(yáng)離子，然后再通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂，以去除不想要的無(wú)機(jī)陰離子和酸性比目標(biāo)化合物(例如，泛酸鹽/酯)更強(qiáng)的有機(jī)酸。得到的泛酸鹽/酯可以隨后轉(zhuǎn)化為本文所述的鹽。
通常，當(dāng)所得的制劑基本不含其它組分時(shí)，化合物就是“經(jīng)離析的”。在一種實(shí)施方式中，該制劑中目標(biāo)化合物的純度超過(guò)大約80％(按干重計(jì))(例如，全部培養(yǎng)基、組分或發(fā)酵副產(chǎn)物小于大約20％)，更優(yōu)選地超過(guò)大約90％，甚至更優(yōu)選地超過(guò)大約95％，最優(yōu)選地超過(guò)大約98％-99％。
在另一種實(shí)施方式中，并不從微生物或培養(yǎng)基中純化出目標(biāo)化合物。整個(gè)培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液可以用作產(chǎn)物的來(lái)源。在一種特定實(shí)施方式中，培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液未經(jīng)修飾即使用。在另一實(shí)施方式中，對(duì)培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液進(jìn)行濃縮、干燥和/或凍干。
本文中所述的本發(fā)明的各種實(shí)施方式可以交叉組合。
下述非限制性的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例一般方法菌株和質(zhì)粒。本發(fā)明的Bacillus subtilis菌株源自菌株1A747(BacillusGenetic Stock Center，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210USA)，它是B.subtilis 168(trpC2)的原營(yíng)養(yǎng)型衍生菌株。氯霉素抗性基因(cat)盒從質(zhì)粒pC194(GeneBank M19465，Cat# 1E17 Bacillus GeneticStock Center，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210 USA)獲得。B.subtilis細(xì)菌噬菌體SPO1的P15啟動(dòng)子(Lee et al.，1980，Mol.Gen.Genet.18057-65)從質(zhì)粒pX123roDTD-SPO1-15獲得，這是含有來(lái)自RB50∷[pRF69]∷[pRF93](Perkins et al.，1999，J.Ind.Microbiol.Biotech.228-18)的SPO1-15啟動(dòng)子的質(zhì)粒pX12(Hümbelin et al.，1999，J.Ind.Microbiol.Biotech.221-7)的衍生物。芽孢形成基因的突變?cè)醋跃闟WV215[trpC2 pheA1 spo0A∷kan](Xu and Strauch，1996，J.Bacteriol.1784319-4322)、BHI[trpC2 pheA1 spo0HΔHindIII-EcoRI∷cat](BHI是Healy et al.，1991，Mol.Microbiol.5477-487中提到的BH100的衍生物)、650[trpC2 ilvB2 leuB16 spoIIAABC∷cat](Prágai et al.，2004，J.Bacteriol.1861182-1190)、731[trpC2 spoIIIG∷ermC](Partridge and Errington，1993，Mol.Microbiol.8945-955)和901[trpC2 spoIIGA∷aphA-3](Wu andErrington，1994，Science264572-575)。abrB基因的突變?cè)醋跃闟WV119[trpC2 pheA1 abrB∷tet](Xu and Strauch，1996)。對(duì)于spo0A基因的過(guò)量表達(dá)，從菌株AH1763[trpC2 metC3 spo0A∷neoamyE∷Pspacspo0A(cat)]獲得Pspacspo0A融合體(Henriques，A，個(gè)人交流)。
培養(yǎng)基。用于B.subtilis的標(biāo)準(zhǔn)最低限度培養(yǎng)基(MM)含有1XSpizizen鹽、0.04％谷氨酸鈉和0.5％葡萄糖。標(biāo)準(zhǔn)固體完全培養(yǎng)基是Tryptone Blood Agar Broth(胰蛋白胨血瓊脂培養(yǎng)基，TBAB，Difco)。標(biāo)準(zhǔn)液體完全培養(yǎng)基是Veal Infusion-Yeast Extract培養(yǎng)基(VY，小牛肉浸出液-酵母提取物培養(yǎng)基)。上述培養(yǎng)基的組分如下所示TBAB培養(yǎng)基33g Difco Tryptone Blood Agar Base(Catalog #0232)、1L水。高壓滅菌。
VY培養(yǎng)基25g Difco Veal Infusion Broth(Catalog # 0344)、5gDifco Yeast Extract(Catalog #0127)、1L水。高壓滅菌。
最低限度培養(yǎng)基(MM)100ml 10X Spizizen鹽；10ml 50％葡萄糖；1ml 40％谷氨酸鈉，用水定容至1L(qsp 1L water)。
10X Spizizen鹽140g K2HPO4；20g(NH4)2SO4；60g KH2PO4；10g檸檬酸三鈉·2H2O；2g MgSO4·7H2O；用水定容至1L。
P-培養(yǎng)基100ml 10X PAM；100ml 10X Spizizen鹽；10ml 50％葡萄糖；790ml滅菌蒸餾水。
P-瓊脂培養(yǎng)基100ml 10X PAM；100ml 10X Spizizen鹽；10ml 50％葡萄糖；790ml滅菌蒸餾水，其中含有15g瓊脂。
10X泛酸鹽/酯測(cè)定培養(yǎng)基(10X PAM)73g Difco泛酸鹽/酯測(cè)定培養(yǎng)基(Catalog #260410)，1L水。高壓滅菌。
10X VFB最低限度培養(yǎng)基(10X VFB MM)2.5g谷氨酸鈉；15.7gKH2PO4；15.7g K2HPO4；27.4g Na2HPO4·12H2O；40g NH4Cl；1g檸檬酸；68g(NH4)2SO4；用水定容至1L。
痕量元素溶液1.4g MnSO4·H2O；0.4g CoCl2·6H2O；0.15g(NH4)6Mo7O24·4H2O；0.1g AlCl3·6H3O；0.075g CuCl2·2H2O；用水定容至200ml。
Fe溶液0.21g FeSO4·7H2O；用水定容至10ml。
CaCl2溶液15.6g CaCl2·2H2O；用水定容至500ml。
Mg/Zn溶液100g MgSO4·7H2O；0.4g ZnSO4·7H2O；用水定容至200ml。
VFB MM培養(yǎng)基100ml 10X VFB MM；10ml 50％葡萄糖；2ml痕量元素溶液；2ml Fe溶液；2ml CaCl2溶液；2ml Mg/Zn溶液；882ml滅菌蒸餾水。
VFB MMGT培養(yǎng)基100ml 10X VFB MM；100ml 0.5M Tris(pH6.8)；44ml 50％葡萄糖；2ml痕量元素溶液；2ml Fe溶液；2ml CaCl2溶液；2ml Mg/Zn溶液；748ml滅菌蒸餾水。
VF發(fā)酵分批培養(yǎng)基在溶液中就地滅菌的0.75g谷氨酸鈉4.71gKH2PO4；4.71g K2HPO4；8.23g Na2HPO4·12H2O；0.23g NH4Cl；1.41g(NH4)2SO4；11.77g酵母提取物(Merck)；0.2ml Basildon消泡劑；定容至1L。
向發(fā)酵罐中加入作為經(jīng)高壓滅菌的溶液27.3g葡萄糖·H2O；定容至1L。
向發(fā)酵罐中加入作為經(jīng)過(guò)濾滅菌的溶液2ml痕量元素溶液；2mlCaCl2溶液；2ml Mg/Zn溶液；2ml Fe溶液；定容至1L。
VF發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基660g葡萄糖·H2O；定容至1L。高壓滅菌。加入2g MgSO4·7H2O；14.6mg MnSO4·H2O；4mg ZnSO4·H2O；定容至1L(經(jīng)高壓滅菌的)。
泛酸鹽/酯測(cè)定。利用三種生物方法和一種物理方法(HPLC)測(cè)定泛酸鹽/酯生物測(cè)定I-平板生物測(cè)定利用已知方法，使用來(lái)自Salmonellatyphimurium的指示劑，在瓊脂平板上測(cè)定泛酸鹽/酯。菌株DM3(panC355)(D.Downs，University of Wisconsin at Madison，Madison，Wisconsin USA)僅對(duì)泛酸鹽/酯具有應(yīng)答。將10ml含有107個(gè)細(xì)胞/ml S.typhimurium DM3(panC355)指示劑菌株和40μg/ml 2，3，5-三苯基四唑氯(Fluka；Catalog # 93140)的P-瓊脂培養(yǎng)基平鋪到標(biāo)準(zhǔn)帶蓋培養(yǎng)皿中作為底部瓊脂的20ml P-瓊脂培養(yǎng)基上。使用滅菌移液槍頭，將培養(yǎng)于TBAB瓊脂上的單個(gè)菌落的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到生物測(cè)定P-瓊脂平板上。在37℃下經(jīng)整晚的培育后，在產(chǎn)出多于～10mg/l泛酸鹽/酯的B.subtilis菌落周圍形成可觀察到的紫色S.typhimurium DM3環(huán)。環(huán)的大小與B.subtilis菌株的泛酸鹽/酯生產(chǎn)情況相關(guān)。
生物測(cè)定II-試管生物測(cè)定利用試管培養(yǎng)物在液體中測(cè)定泛酸鹽/酯。為測(cè)定B.subtilis培養(yǎng)物，滅菌過(guò)濾出上清液，利用1X泛酸鹽/酯測(cè)定培養(yǎng)基(PAM)在試管中制備稀釋液。稀釋液的總體積為5.0ml。向這些稀釋液試管中加入0.1ml DM3指示劑貯液(在1X PAM中)的200倍稀釋液。然后在滾筒型搖床上在37℃下對(duì)試管進(jìn)行18-24小時(shí)的培養(yǎng)。在600nm處讀取渾濁度讀數(shù)(OD600)，將其與已知量的泛酸鹽/酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。具體而言，通過(guò)如下步驟制得標(biāo)準(zhǔn)曲線將經(jīng)過(guò)認(rèn)定的泛酸鹽/酯稀釋至0.8、4、20、50和100μg/l的水平，向每份稀釋液中加入如上制得的指示劑，在37℃下放置18-24小時(shí)(與未知樣品同樣的培育時(shí)間)后測(cè)量渾濁度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分用來(lái)生成對(duì)數(shù)回歸方程。然后，該方程用來(lái)計(jì)算未知樣品中泛酸鹽/酯的濃度，其中利用經(jīng)稀釋樣品的OD600值。
生物測(cè)定III-96孔微滴定板生物測(cè)定還使用96孔微滴定板形式在液體中測(cè)定泛酸鹽/酯。向96孔微滴定板的每個(gè)孔內(nèi)裝入180μl含有5.5×105個(gè)細(xì)胞/ml S.typhimurium DM3的泛酸鹽/酯測(cè)定培養(yǎng)基(PAM)。為測(cè)定B.subtilis培養(yǎng)物，將60μl經(jīng)過(guò)濾滅菌的培養(yǎng)物上清液加到第1列，第B-H行的孔中?；旌现螅瑢?0μl樣品轉(zhuǎn)移到第2列的鄰近孔中。重復(fù)上述4倍稀釋步驟，直到第12列。在第12列將樣品混合之后，移去60μl樣品，這樣每個(gè)孔都含有180μl樣品。將粘附膜置于平板上以避免蒸發(fā)，并在37℃下以300rpm的振蕩速度對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行17小時(shí)的培養(yǎng)。在600nm處讀取渾濁度讀數(shù)，將其與已知量的泛酸鹽/酯(Pan)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。通過(guò)將60μl Pan標(biāo)準(zhǔn)物(100mg/ml)加入每個(gè)微滴定板的第1列第A行的孔中，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。如上對(duì)未知樣品的那樣，對(duì)Pan標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行稀釋、培養(yǎng)和渾濁度測(cè)量。
HPLC測(cè)定使用裝有恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器和二極管陣列檢測(cè)儀的Agilent1100 HPLC系統(tǒng)，在Phenomenex LUNA C8柱上對(duì)樣品進(jìn)行色譜分析。柱的大小為150×4.6mm，顆粒大小為5微米。柱溫保持恒定為20℃。移動(dòng)相是0.1％乙酸(A)和甲醇(B)的混合物。采用15分鐘的梯度洗脫，從1％B至45％B。流速為1ml/min。利用UV吸收在220nm下監(jiān)測(cè)泛酸鹽/酯，泛酸鹽/酯大約在9.6min時(shí)洗脫出。該方法的校正范圍為1至100mg/l泛酸鹽/酯。
分子和遺傳技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)的遺傳和分子生物技術(shù)通常是本領(lǐng)域已知的，以前已有描述。DNA轉(zhuǎn)化、PBS1普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和其它的標(biāo)準(zhǔn)B.subtilis遺傳技術(shù)也通常是本領(lǐng)域已知的，以前已有描述(Harwood and Cutting，1992)。
芽孢形成測(cè)定。從B.subtilis培養(yǎng)物中取1ml樣品，并在滅菌蒸餾水中制備10倍的稀釋液系列。在80℃下進(jìn)行20分鐘的熱處理后，將稀釋液涂布到TBAB瓊脂上，在37℃下培養(yǎng)20小時(shí)，然后確定1ml原培養(yǎng)物中“耐熱”菌落形成單元(cfu)的數(shù)量。通過(guò)用耐熱芽孢的效價(jià)(cfu/ml)除以熱處理前細(xì)菌細(xì)胞的效價(jià)(cfu/ml)，計(jì)算出芽孢形成頻率。
發(fā)酵。在帶攪拌的罐式發(fā)酵罐中對(duì)生產(chǎn)泛酸鹽/酯的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，例如在最初裝有1.4升含葡萄糖/鹽溶液的VF發(fā)酵分批培養(yǎng)基的BIOFLO3000 New Brunswick 2升容器中進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)NBS Biocommand 32商用軟件(New Brunswick Scientific Co.，Inc.，Edison，NJ，USA)進(jìn)行計(jì)算機(jī)控制；Lucullus軟件(Biospektra AG，Schlieren，Switzerland)用于數(shù)據(jù)采集和控制葡萄糖補(bǔ)料。
為制備用于發(fā)酵的接種體，使用兩步接種(two-seed)培養(yǎng)方案。第一步接種由下述步驟組成用50μl冰凍的細(xì)菌貯備培養(yǎng)物去接種25ml含有10g/l山梨糖醇的VY培養(yǎng)基，并在37℃對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行6小時(shí)的培養(yǎng)。然后用1OD的細(xì)胞來(lái)接種60ml含有10g/l山梨糖醇的VF發(fā)酵分批培養(yǎng)基(無(wú)葡萄糖)，并對(duì)該第二步接種物在37℃下進(jìn)行8-12小時(shí)的培養(yǎng)。然后將第二步接種物用于接種發(fā)酵容器，其用量通常是最初培養(yǎng)基體積的4-5％。冰凍的細(xì)菌貯液通過(guò)如下步驟制得在VY培養(yǎng)基中將細(xì)菌培養(yǎng)至指數(shù)后期(OD600＝0.8-1.0)，加入滅菌甘油至最終濃度為20％，然后在干冰上冷凍1ml樣品，并將冰凍的細(xì)菌貯藏在-80℃下。
發(fā)酵期間，通過(guò)自動(dòng)加入氫氧化銨溶液(28％水溶液)使反應(yīng)器中pH保持恒定為6.8。發(fā)酵溫度為39℃。通過(guò)攪拌器的自動(dòng)級(jí)聯(lián)(400rpm至1000rpm之間)，以及將空氣流手動(dòng)保持在1-2vvm之間，獲得15％的最小溶解氧(pO2)濃度。如果需要的話，手動(dòng)加入消泡劑(Basildon)。
發(fā)酵可以是分批工藝，但是優(yōu)選地是碳水化合物受限的補(bǔ)料分批工藝。因此，在最初的葡萄糖耗盡之后，這通常在6-8小時(shí)的工藝時(shí)間后，向反應(yīng)器中提供給定的VF發(fā)酵補(bǔ)料溶液(見(jiàn)上文)。此時(shí)，以14g/h的速率開(kāi)始恒定加入補(bǔ)料溶液。
實(shí)施例I本實(shí)施例描述了對(duì)過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的B.subtilis菌株的構(gòu)造。
B.subtilis菌株P(guān)A12聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用來(lái)在B.subtilis原營(yíng)養(yǎng)型菌株1A747的panBCD操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域中產(chǎn)生缺失突變，其中birA和panB之間的215bp長(zhǎng)的核苷酸區(qū)域被來(lái)自Staphylococcus aureus的氯霉素抗性(cat)盒(GeneBank M58515)所取代。為此，首先以與panB的轉(zhuǎn)錄方向相反的取向在pBR322質(zhì)粒(GeneBank J01749)的NheI和ClaI位點(diǎn)之間引入cat盒。然后產(chǎn)生兩條PCR片段“臂”將0.2μl 100mM的panB/up2/for/R1和panB/up2/rev/ClaI引物或panB/down2/for/Nhe1和panB/down2/rev/Bam引物(表1)溶液加入到50μl反應(yīng)體積中的0.1μg1A747染色體DNA中，所述50μl反應(yīng)體積中含有1μl 40mM的dNTP’s、5μl 10X緩沖液和0.75μl PCR酶(Taq和Tgo)，如生產(chǎn)商(Expand High fidelity PCR系統(tǒng)-Roche Applied Science)所述的。該P(yáng)CR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，退火溫度為58℃，延伸時(shí)間為60秒。所得片段分別被稱為F1和F2，對(duì)其進(jìn)行純化，隨后將其分別插入到EcoRI和ClaI位點(diǎn)之間(對(duì)F1而言)和NheI和BamHI位點(diǎn)之間(對(duì)F2而言)。將連接的DNA轉(zhuǎn)入到E.coli TOP10細(xì)胞(Invitrogen)中，在100μg/ml的濃度針對(duì)氨芐青霉素抗性進(jìn)行篩選。這得到E.coli質(zhì)粒pPA5。然后通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化，再將ΔpanBp∷cat缺失盒引入到B.subtilis 1A747的染色體上，并利用標(biāo)準(zhǔn)條件，在含有5μg/ml氯霉素(Cm)的TBAB瓊脂平板上針對(duì)氯霉素抗性(Cmr)進(jìn)行篩選。在panB啟動(dòng)子區(qū)域具有缺失的單個(gè)Cmr菌落被離析出，并命名為PA1(ΔpanBp∷cat)。如預(yù)料的，PA1也是泛酸鹽/酯營(yíng)養(yǎng)缺陷型(Pan-)，這要求在最低限度培養(yǎng)基中有泛酸鹽/酯，以用于生長(zhǎng)。利用panB/up2/for/R1和panB/down2/rev/Bam引物(表1)，再使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，通過(guò)診斷性PCR驗(yàn)證缺失突變。
表1.用于產(chǎn)生含有ΔpanBp∷cat缺失突變的B.subtilis菌株的引物
下一步是引入panB基因上游的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。文獻(xiàn)中描述了許多這種啟動(dòng)子，包括從B.subtilis的SP01細(xì)菌噬菌體獲得的那些，P15和P26(Lee et al.，1980)。長(zhǎng)側(cè)翼同源性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LFH-PCR)用來(lái)產(chǎn)生含有panB的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)上游的P15的DNA片段。為此，首先產(chǎn)生兩條PCR片段“臂”將0.2μl 100mM的PlpanBCD和P2panBCD引物或P3panBCD和P4panBCD引物(表2)溶液加到50μl反應(yīng)體積中的0.1μg 1A747染色體DNA中，該50μl反應(yīng)體積含有1μl 40mM dNTP’s、5μl 10X緩沖液和0.75μl PCR酶(Taq和Tgo)，如生產(chǎn)商(Expand High fidelity PCR系統(tǒng)-Roche Applied Science)所述的。該P(yáng)CR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，退火溫度為55.7℃，延伸時(shí)間為45秒。所得片段分別被稱為F3和F4，對(duì)其進(jìn)行純化，并將其作為引物再用于第二輪PCR。將F3和F4片段稀釋50倍，并各取1μl加入到50μl反應(yīng)體積中的0.1μg線性化質(zhì)粒pX123roDTD-SPO1-15(含有P15啟動(dòng)子)中。在最初10個(gè)循環(huán)中，退火溫度為63℃，延伸時(shí)間為6分鐘。在后20個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)后將延伸時(shí)間再延長(zhǎng)20秒。然后將所得產(chǎn)物作為模板用于第三輪PCR。將PCR產(chǎn)物稀釋50倍，并取1μl將其與0.2μl 100mM的P1panBCD和P4panBCD引物溶液混合在50μl上述含有dNTP’s、緩沖液和酶的反應(yīng)體積中。該P(yáng)CR反應(yīng)參數(shù)與第二輪PCR中所用的一致。然后通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化，再將最終的PCR片段轉(zhuǎn)化進(jìn)panB啟動(dòng)子缺失菌株P(guān)A1中，并使用標(biāo)準(zhǔn)條件，在最低限度培養(yǎng)基瓊脂平板上針對(duì)泛酸鹽/酯原營(yíng)養(yǎng)型(Pan+)進(jìn)行篩選。這些Pan+菌落也對(duì)氯霉素敏感(Cms)，這證實(shí)了啟動(dòng)子盒的插入。離析出含有由P15啟動(dòng)子表達(dá)的panBCD操縱子的單個(gè)Pan+Cms菌落，將其命名為PA12(P15panBCD)。使用P15seq和P4panBCD引物(表2)，再使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，通過(guò)診斷性PCR，驗(yàn)證panB基因上游P15啟動(dòng)子的存在。在搖瓶培養(yǎng)物中，PA12在VFB MM培養(yǎng)基中產(chǎn)生大約100mg/l的泛酸鹽/酯，在VFB MMGT培養(yǎng)基中產(chǎn)生大約250mg/l的泛酸鹽/酯(基于HPLC/MS測(cè)定)，而1A747對(duì)照產(chǎn)生的泛酸鹽/酯少于1g/l。使用VF培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件，在標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批發(fā)酵中，PA12在48小時(shí)處生產(chǎn)出約10-14g/l的泛酸鹽/酯。
表2.用于產(chǎn)生含有P15panBCD表達(dá)盒的B.subtilis菌株的引物
B.subtilis菌株P(guān)A49為構(gòu)造還含有panE基因(ylbQ)上游的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的菌株，首先構(gòu)造缺失突變。對(duì)panE基因的檢查表明存在兩個(gè)潛在的起始位點(diǎn)起始位點(diǎn)1(5’-AAATTGGGTG-3’(RBS)-7nt-ATG)，它覆蓋BspHI位點(diǎn)，并在起始位點(diǎn)2(5’-GGAGG-3’(RBS)-5nt-TTG)上游33bp處，起始位點(diǎn)2覆蓋BsaXI位點(diǎn)。因此，使用S.aureus的紅霉素抗性(Emr)基因(GeneBank V01278)，通過(guò)LFH-PCR，構(gòu)造panElylbQ啟動(dòng)子區(qū)域的219bp的缺失。為此，首先產(chǎn)生兩條PCR片段“臂”將0.2μl 100mM的P1panE和P2panE/Er引物或P3panE/Er/2和P4panE引物(表3)溶液加到50μl反應(yīng)體積中的0.1μg 1A747染色體DNA中，該50μl反應(yīng)體積含有1μl 40mM dNTP’s、5μl10X緩沖液和0.75μl PCR酶(Taq和Tgo)，如生產(chǎn)按商(Expand High fidelity PCR系統(tǒng)-Roche Applied Science)所述的。該P(yáng)CR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，退火溫度為55.7℃，延伸時(shí)間為45秒。所得片段分別被稱為F1和F2，對(duì)其進(jìn)行純化，并將其作為引物再用于第二輪PCR。將F1和F2片段稀釋50倍，并各取1μl加到50μl反應(yīng)體積中的0.1μg線性化質(zhì)粒pDG646(含有erm盒Guérout-Fleury et al.，1995)中。在最初10個(gè)循環(huán)中，退火溫度為63℃，延伸時(shí)間為6分鐘。在后20個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)后將延伸時(shí)間再延長(zhǎng)20秒。然后將得到的產(chǎn)物作為模板用于第三輪PCR。將PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取1μl，并將其與0.2μl100mM的P1panE和P4panE引物溶液混合于上述50μl含有dNTP’s、緩沖液和酶的反應(yīng)體積中。PCR反應(yīng)參數(shù)與第二輪PCR中所用的一致。然后將最終的PCR片段轉(zhuǎn)化進(jìn)PA4(Trp+菌落，通過(guò)用1A747染色體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從B.subtilis CU550 trpC2 ilvC4 leu-124獲得)中，得到泛酸鹽/酯營(yíng)養(yǎng)缺陷型Emr菌落。該菌株稱為PA5(ΔpanEp∷erm ilvC leuC)。通過(guò)診斷性PCR來(lái)驗(yàn)證缺失的結(jié)構(gòu)。隨后，通過(guò)轉(zhuǎn)化PA1染色體DNA(非聚集濃度的，non-congressional concentration)，將panB啟動(dòng)子缺失引入PA5，產(chǎn)生PA6(ilvC leuC ΔpanBP∷cat ΔpanEp∷erm)。
表3.用于產(chǎn)生含有ΔpanEp∷erm缺失突變的B.subtilis菌株的引物
下一步要同時(shí)引入panB和panE上游的強(qiáng)組成型P15啟動(dòng)子。再次使用LFH-PCR，以產(chǎn)生含有panB的開(kāi)放閱讀框上游的P15和含有panE的開(kāi)放閱讀框上游的P15的DNA片段。為此，利用用于構(gòu)造PA12的相同PCR方案(見(jiàn)上文)，使用P1panB和P2panB/P15引物(F1)和P3panB/P15和P4panB引物(F2)(表1和2，P15panB的構(gòu)造)，和P1panE和P2panE/P15(F1)和P3panE/P15和P4panE(F2)(表3和4，P15panE的構(gòu)造)，針對(duì)panB和panE構(gòu)造兩條PCR片段“臂”。
表4.用于產(chǎn)生含有P15panE表達(dá)盒的B.subtilis菌株的引物
然后通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化，將最終的P15panB和P15panE PCR片段轉(zhuǎn)化進(jìn)panB和panE啟動(dòng)子缺失菌株P(guān)A6(ilvC leuC ΔpanBp∷cat ΔpanEp∷erm)中，并使用標(biāo)準(zhǔn)條件，在最低限度培養(yǎng)基瓊脂平板上針對(duì)泛酸鹽/酯原營(yíng)養(yǎng)型(Pan+)進(jìn)行篩選?；厥盏降腜an+菌落也是Cms的和對(duì)紅霉素敏感的(Ems)，這證實(shí)了啟動(dòng)子盒的插入。離析出含有從P15啟動(dòng)子表達(dá)的panE基因和panBCD操縱子的單個(gè)Pan+CmsEms菌落，將其命名為PA32。使用P15seq和P4panB引物(表1和2)，再使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，通過(guò)診斷性PCR，驗(yàn)證panB基因上游的P15啟動(dòng)子的存在。用P15seq和P4panE引物(表3和4)，在panE基因上進(jìn)行了同樣的對(duì)照。但是，隨后對(duì)panE前面的P15啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序，表明P15啟動(dòng)子部分缺失。
為了用正確的構(gòu)造來(lái)替換掉部分缺失的P15panE基因，通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化，使用來(lái)自PA5(ΔpanEp∷erm ilvC leuC)的染色體DNA將ΔpanEp∷erm突變重新引入PA32，并針對(duì)紅霉素抗性進(jìn)行篩選。這樣得到菌株P(guān)A41(P15panBCD ΔpanEp∷erm ilvC leuC)。然后將如前文所述的通過(guò)LFH-PCR產(chǎn)生的P15panE DNA片段轉(zhuǎn)化進(jìn)PA41，并針對(duì)Pan+原營(yíng)養(yǎng)型進(jìn)行篩選。這樣得到菌株P(guān)A43(ilvC leuC P15panBCD P15panE)。然后，用標(biāo)準(zhǔn)程序，使用在野生型B.subtilis 1A747上制得的PBS1噬菌體溶解產(chǎn)物，將該Ilv-Leu-營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株再轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)Ilv+Leu+原營(yíng)養(yǎng)型。這樣得到菌株P(guān)A49(P15panBCD P15panE)。
在搖瓶培養(yǎng)物中，PA49在VFB MMGT培養(yǎng)基中產(chǎn)出平均大約為400mg/l的泛酸鹽/酯(基于HPLC/MS測(cè)定)。
實(shí)施例II本實(shí)施例描述了對(duì)含有芽孢形成缺陷型突變spo0A、spo0H、spoIIA(sigF)spoIIG(sigE)和spoIIIG(sigG)的過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的B.subtilis菌株的構(gòu)造和測(cè)試。
對(duì)芽孢形成有缺陷的B.subtilis突變體的構(gòu)造通過(guò)轉(zhuǎn)化分別來(lái)自菌株SWV215(spo0A∷kan)、BHI(spo0HΔHindIII-EcoRI∷cat)、650(spoIIAABC∷cat)、901(spoIIGA∷aphA-3)和731(spoIIIG∷ermC)的染色體DNA，將芽孢形成缺陷型突變引入到1A747(野生型菌株)和過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的菌株P(guān)A12中。按照Bron(1990)，通過(guò)“Groningen”方法提取染色體DNA，對(duì)B.subtilis菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含有0.3μg/ml紅霉素(Em)和25μg/ml林肯霉素(Lm)的TBAB瓊脂培養(yǎng)基上，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行針對(duì)ermC基因的篩選；在含有6μg/ml Cm的TBAB瓊脂培養(yǎng)基上，對(duì)cat基因進(jìn)行篩選；在含有10μg/ml卡那霉素(Km)的TBAB瓊脂培養(yǎng)基上，對(duì)kan和aphA-3基因進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化效率大約為5×104轉(zhuǎn)化子/μg染色體DNA，并由此產(chǎn)生下述菌株(i)來(lái)自SWV215 DNA的卡那霉素抗性(Kmr)轉(zhuǎn)化子，命名為1A747_spo0A和PA12_spo0A；(ii)來(lái)自BHI DNA的Cmr轉(zhuǎn)化子，命名為1A747_sigH和PA12_sigH；(iii)來(lái)自650 DNA的Cmr轉(zhuǎn)化子，命名為1A747_sigF和PA12_sigF；(iv)來(lái)自901 DNA的Kmr轉(zhuǎn)化子，命名為1A747_sigE和PA12_sigE；(v)來(lái)自731 DNA的紅霉素/林肯霉素抗性(Emr/Lmr)轉(zhuǎn)化子，命名為1A747_sigG和PA12_sigG；Spo0A和sigma H(σH)是芽孢形成最初步驟的關(guān)鍵調(diào)控子，除此之外，它們還在空間結(jié)構(gòu)的形成中有著最重要的作用，充當(dāng)在B.subtilis菌落相關(guān)表面上芽孢形成的位點(diǎn)(Branda et al.，2001)。因此，缺乏Spo0A的1A747_spo0A和PA12_spo0A在TBAB瓊脂平板上產(chǎn)生粘液狀的沒(méi)有結(jié)構(gòu)的菌落，而缺乏σH的1A747_sigH和PA12_sigH則顯示出相似但不嚴(yán)重的表型(在瓊脂表面上分布不集中)。相反，缺乏sigma F(σF)、sigmaE(σE)、sigma G(σG)的其它突變體形成的菌落與野生型菌株的菌落外型非常相似。
芽孢形成缺陷型突變對(duì)B.subtilis中泛酸鹽/酯生產(chǎn)和芽孢形成的影響。
從上述每種轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，取25個(gè)獨(dú)立離析出的菌落，利用平板環(huán)狀(plate halo)試驗(yàn)，對(duì)其泛酸鹽/酯生產(chǎn)情況進(jìn)行測(cè)試。對(duì)每個(gè)突變體而言，在搖瓶培養(yǎng)物中分析其環(huán)的尺寸代表了大部分待測(cè)菌落情況的兩個(gè)菌落。用在補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的TBAB平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落去接種在250ml帶隔板Erienmeyer瓶中的20ml VFB MM。在37℃下以250rpm的振蕩速率對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)階段后期(～18小時(shí)培養(yǎng)后)時(shí)，在600nm下測(cè)量細(xì)胞渾濁度(OD600)，并利用芽孢形成測(cè)定來(lái)確定“耐熱性”cfu的數(shù)量。然后經(jīng)0.45μm孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾來(lái)移去細(xì)胞，并利用生物測(cè)定方法和HPLC測(cè)定方法測(cè)定消耗的培養(yǎng)基中泛酸鹽/酯的含量。結(jié)果顯示，突變體1A747_spo0A、PA12_spo0A、1A747_sigH和PA12_sigH的泛酸鹽/酯總產(chǎn)量相比較親本菌株降低了2至3倍(表5)，這表明Spo0A和σH功能的缺乏不利地影響了泛酸鹽/酯的生產(chǎn)。在缺乏σF或σE的突變體中，泛酸鹽/酯的生產(chǎn)與對(duì)照水平在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)近似，這表明在后階段阻止芽孢形成的突變對(duì)泛酸鹽/酯的生產(chǎn)沒(méi)有或只有很小的影響。如通過(guò)培養(yǎng)物的OD600測(cè)量所確定的，所有突變體的細(xì)胞生物質(zhì)與親本對(duì)照都近似。親本菌株1A747和PA12的芽孢形成頻率大約為0.3-1％。在缺少Spo0A、σH和σE的突變體中，沒(méi)有檢測(cè)到芽孢。但是，在1A747_sigF和PA12_sigF的培養(yǎng)物中檢測(cè)到少量的耐熱細(xì)胞(表5)，這表明spoIIAABC基因的突變不會(huì)導(dǎo)致芽孢形成的完全丟失。基于上述結(jié)果，僅有在sigma E基因中含有突變的菌株既能生產(chǎn)對(duì)照水平的泛酸鹽/酯，又是完全不形成芽孢的細(xì)菌。
含有σG突變的菌株產(chǎn)生其它spo突變體沒(méi)有展現(xiàn)過(guò)的獨(dú)特表型。當(dāng)引入到1A747野生型細(xì)胞中時(shí)，得到的突變體產(chǎn)出正常水平的泛酸鹽/酯，而且沒(méi)有芽孢。但是，在經(jīng)工程改造的PA12菌株中，得到的菌株產(chǎn)出非常低水平的泛酸鹽/酯，同時(shí)沒(méi)有芽孢(表5)。上述結(jié)果暗示，通過(guò)erm基因?qū)Ζ褿的破壞，阻礙了泛酸鹽/酯的高水平表達(dá)，這或者通過(guò)防止表達(dá)其蛋白質(zhì)產(chǎn)物在泛酸鹽/酯的生產(chǎn)或排出中所涉及到的Sigma G轉(zhuǎn)錄基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)極性阻止下游基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)spoIIIG下游DNA序列的檢查揭示了單個(gè)基因ylmA的存在，它可隨spoIIIG共轉(zhuǎn)錄。ylmA基因可能編碼未知的ATP結(jié)合蛋白，該蛋白可以作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組分之一發(fā)揮作用。因此，該蛋白質(zhì)單獨(dú)的或與經(jīng)工程改造的pan和/或ilv生物合成基因一起的過(guò)量表達(dá)使得泛酸鹽/酯產(chǎn)量增加。此外，Spo-Pan-表型的阻遏子宿主突變恢復(fù)了泛酸鹽/酯生產(chǎn)，使得菌株生產(chǎn)出更多的泛酸鹽/酯。
表5.芽孢形成缺陷型突變對(duì)B.subtilis中泛酸鹽/酯生產(chǎn)和芽孢形成的影響
實(shí)施例III本實(shí)施例描述了對(duì)含有芽孢形成缺陷型突變spo0A或spoHG(sigE)的過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的B.subtilis菌株進(jìn)行的發(fā)酵。
使用2升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐，在標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批發(fā)酵中對(duì)sigE突變體(PA12_sigE)、spo0A突變體(PA12_spo0A)及其親本PA12進(jìn)行48小時(shí)的培養(yǎng)。在發(fā)酵期間測(cè)量細(xì)菌的泛酸鹽/酯水平和芽孢形成頻率。如表6所示，泛酸鹽/酯產(chǎn)量在sigE突變體和親本中近似，但是spo0A突變體中減少了大約85％。泛酸鹽/酯相對(duì)于葡萄糖的產(chǎn)率在sigE突變體和親本菌株之間也相似。在親本中檢測(cè)到芽孢，但在兩種突變體中沒(méi)有檢測(cè)到。
表6.B.subtilis菌株P(guān)A12、PA12_spo0A和PA12_igE在2升的實(shí)驗(yàn)臺(tái)規(guī)模發(fā)酵中培養(yǎng)48小時(shí)的芽孢形成和泛酸鹽/酯生產(chǎn)情況。
通過(guò)這些僅表現(xiàn)本發(fā)明的特定實(shí)施方式的實(shí)施例，已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了闡述。這不應(yīng)視為是限制本發(fā)明，因?yàn)殚喿x本說(shuō)明書后，許多實(shí)施方式對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
實(shí)施例IV本實(shí)施例描述了對(duì)含有spo0A和abrB中無(wú)效突變的過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的B.subtilis菌株的構(gòu)造和測(cè)試。
通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)自菌株SWV215(spo0A∷kan)和SWV119(abrB∷tet)的染色體DNA，將abrB和spo0A的單突變和雙突變引入到過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的菌株P(guān)A49中。在含有10μg/ml Km的TBAB瓊脂培養(yǎng)基上針對(duì)kan基因進(jìn)行篩選；并且，在含有10μg/ml四環(huán)素(Tc)的培養(yǎng)基上針對(duì)tet基因進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化效率為對(duì)spo0A∷kan而言，2×103轉(zhuǎn)化子/μgDNA；對(duì)abrB∷tet而言，4×102轉(zhuǎn)化子/μg DNA；對(duì)spo0A∷kan和abrB∷tet雙突變體而言，4轉(zhuǎn)化子/μg DNA。得到如下菌株(i)來(lái)自SWV215DNA的Kmr轉(zhuǎn)化子，命名為PA1030；(ii)來(lái)自SWV119 DNA的四環(huán)素抗性(Tcr)轉(zhuǎn)化子，命名為PA1037；(iii)來(lái)自SWV215和SWV119DNA的Kmr和Tcr轉(zhuǎn)化子，命名為PA1051。
對(duì)每種突變體而言，取四個(gè)菌落分析在搖瓶培養(yǎng)物中的泛酸鹽/酯生產(chǎn)和芽孢形成。用在補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的TBAB平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落去接種10ml補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的VY培養(yǎng)基。在37℃下，以250rpm的振蕩速率培養(yǎng)細(xì)菌整晚(～17h)。將過(guò)夜的培養(yǎng)物稀釋(1∶100)于20mlVFB MMGT中，培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600＝0.6-0.8)。用上述培養(yǎng)物對(duì)30ml VFB MMGT進(jìn)行接種，起始渾濁度為OD600＝0.03，并在250ml帶隔板Erlenmeyer瓶中，在37℃下以250rpm的振蕩速率培養(yǎng)細(xì)菌。18小時(shí)培養(yǎng)后，在600nm下測(cè)量細(xì)胞渾濁度(OD600)，并利用芽孢形成測(cè)定來(lái)確定“耐熱性”cfu的數(shù)量。然后經(jīng)過(guò)0.45μm孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾來(lái)移去細(xì)胞，并利用HPLC測(cè)定方法測(cè)定消耗的培養(yǎng)基中泛酸鹽/酯的含量。結(jié)果顯示，如通過(guò)培養(yǎng)物的OD600測(cè)量所確定的，所有突變體的細(xì)胞生物質(zhì)與親本對(duì)照都近似。PA1030(spo0A∷kan)和PA1037(abrB∷tet)的泛酸鹽/酯總產(chǎn)量相比較親本菌株P(guān)A49下降了3至4倍(圖7)，這表明Spo0A(如實(shí)施例II中也顯示的)和AbrB功能的缺乏會(huì)對(duì)泛酸鹽/酯的生產(chǎn)造成負(fù)面影響。但是，雙突變體PA1051(spo0A∷kan abrB∷tet)生產(chǎn)的泛酸鹽/酯比PA49對(duì)照多40％，而且不產(chǎn)生芽孢。基于上述結(jié)果，在雙abrB和spo0A無(wú)效突變體中泛酸鹽/酯的產(chǎn)量可以增加到野生型表達(dá)水平以上。
表7.B.subtilis菌株P(guān)A49、PA1030、PA1037和PA1051在搖瓶培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的芽孢形成和泛酸鹽/酯生產(chǎn)情況。
實(shí)施例V本實(shí)施例描述了對(duì)過(guò)量表達(dá)spo0A并含有芽孢形成缺陷型突變(spoIIGA)的過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的B.subtilis菌株的構(gòu)造和測(cè)試。
對(duì)攜帶Pspac-spo0A和sigE無(wú)效突變的B.subtilis菌株的構(gòu)造。
實(shí)施例II中已顯示Spo0A的缺乏會(huì)使得泛酸鹽/酯產(chǎn)量相比較親本菌株降低2至3倍。為調(diào)查spo0A基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)泛酸鹽/酯生產(chǎn)的影響，通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)自菌株AH1763(amyE∷Pspac-spo0A[cat])的染色體DNA，將IPTG誘導(dǎo)型的Pspac-spo0A融合體引入到PA49的amyE基因中。在含有6μg/ml Cm的TBAB瓊脂培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，并將得到的Cmr菌株命名為PA1025。然后通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)自菌株901(spoIIGA∷aphA-3)的染色體DNA，將spoIIGA中的芽孢形成缺陷型突變引入到PA1025中。在含有6μg/ml Cm的TBAB瓊脂培養(yǎng)基上針對(duì)cat基因?qū)D(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，在含有10μg/ml Km的培養(yǎng)基上針對(duì)aphA-3基因進(jìn)行篩選，得到的Cmr和Kmr菌株命名為PA1064。
spo0A的過(guò)量表達(dá)對(duì)B.subtilis中泛酸鹽/酯生產(chǎn)情況的影響。
用PA49、PA1025和PA1064的單個(gè)菌落去接種10ml補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的VY培養(yǎng)基。在37℃、250rpm的振蕩下，對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)夜(～17h)。將過(guò)夜的培養(yǎng)物稀釋(1∶100)于20ml VFB MMGT中，并培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600＝0.6-0.8)。用上述培養(yǎng)物對(duì)30ml VFB MMGT和30ml含有10mM IPTG的VFB MMGT進(jìn)行接種，起始渾濁度OD600＝0.03，并在250ml帶隔板的Erlenmeyer瓶中，在37℃、250rpm的振蕩下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)。18小時(shí)培養(yǎng)后，在600nm下測(cè)量細(xì)胞渾濁度(OD600)，并用芽孢形成測(cè)定來(lái)確定“耐熱性”cfu的數(shù)量。然后經(jīng)過(guò)0.45μm孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾來(lái)移去細(xì)胞，并用HPLC測(cè)定方法測(cè)定消耗的培養(yǎng)基中泛酸鹽/酯的含量。結(jié)果顯示，如通過(guò)培養(yǎng)物的OD600測(cè)量所確定的，所有突變體的細(xì)胞生物質(zhì)與親本對(duì)照都近似。在不存在IPTG誘導(dǎo)劑的情況下，PA1025(Pspacspo0A)和PA1064(Pspacspo0A spoIIGA∷aphA-3)的泛酸鹽/酯總產(chǎn)量與親本PA49菌株近似(表8)。當(dāng)用10mM IPTG從Pspac啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)spo0A的表達(dá)時(shí)，PA1025產(chǎn)生的泛酸鹽/酯較之親本對(duì)照多70％，芽孢多10倍，而PA1064生產(chǎn)的泛酸鹽/酯也比PA49對(duì)照多70％，并且它是芽孢形成缺陷型的。
表8.B.subtilis菌株P(guān)A49、PA1025和PA1064在搖瓶培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的芽孢形成和泛酸鹽/酯生產(chǎn)情況。
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序列表<110>帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限責(zé)任公司<120>用不能形成芽孢的微生物來(lái)生產(chǎn)泛酸鹽/酯的方法<130>case 21827<150>EP 03013844.0<151>2003-05-18<160>17<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物cat/for/NheI<400>1atgcgctagc cgaaaattgg ataaagtggg 30<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物cat/rev/claI<400>2atgcatcgat aagtacagtc ggcattatct cata34<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物panB/up2/for/R1<400>3atgcgaattc gggtatggca ttctcaagaa gg 32<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>panB/down2/rev/Bam<400>4atgcggatcc gccgtcaagc actgtctgg 29<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物panB/up2/rev/claI<400>5atgcatcgat ggaagtatac caaaatcaac gg 32<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物panB/down2/for/NheI<400>6atgcgctagc atgaaaacaa aactggattt tc 32<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P1panBCD<400>7ccttattgaa ttattttctc aggccg 26<210>8<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P2panBCD<400>8ggactgatct ccaagcgatg gatggaagta taccaaaatc aacggc 46<210>9<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P3panBCD<400>9tcgagaatta aaggagggtt tcatatgaaa acaaaactgg attttct 47<210>10<211>27<212>DNA<213>人T序列<220>
<223>引物P4panBCD<400>10cggatatgct tcaaaatctt cattagg27<210>11<211>25
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P15seq<400>11ctactatttc aacacagcta tctgc 25<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P1panE<400>12ggcagcctgt ggtttcaggt gg 22<210>13<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P2panE/Er<400>13attatgtctt ttgcgcagtc ggccgtctgc ttatcaacta taaaacgc 48<210>14<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P3panE/Er/2<400>14cattcaattt tgagggttgc caggcctatt atttgtcact ttatcacg 48<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P4panE<400>15ccagtctttc gcgccacatg tcc 23<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P2panE/P15<400>16ggactgatct ccaagcgatg ggaatttttt aaataaagcg tttacaatat 50
<210>17<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P3panE/P15<400>17tcgagaatta aaggagggtt tcatatgaaa attggaatta tcggcggag 49
權(quán)利要求
1.一種芽孢形成缺陷型微生物，所述微生物能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物已經(jīng)過(guò)修飾，使得它呈現(xiàn)出降低的SigE活性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物具有至少一處突變，所述突變影響選自由spoIIGA、spoIIGB、spoIIR和spoIIAC所組成的組中的至少一個(gè)基因。
4.如權(quán)利要求l至3中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物過(guò)量表達(dá)spoOA基因。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物已經(jīng)過(guò)修飾，使得它呈現(xiàn)出降低的SpoOA活性和降低的AbrB活性。
6.如權(quán)利要求5所述的微生物，其中所述微生物具有至少一處影響spoOA基因的突變和至少一處影響abrB基因的突變。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物屬于Bacillus屬。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物屬于Bacillus subtilis種。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述泛酸鹽/酯化合物是泛酸鹽/酯。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物的群落在含有最低限度培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中能夠生產(chǎn)至少100mg泛酸鹽/酯每升培養(yǎng)基。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物的群落在補(bǔ)料分批發(fā)酵中能夠生產(chǎn)至少5g泛酸鹽/酯每升培養(yǎng)基。
12.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物生產(chǎn)的泛酸鹽/酯化合物的量比相應(yīng)的非芽孢形成缺陷型微生物生產(chǎn)的所述泛酸鹽/酯化合物的量的50％要高。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物過(guò)量表達(dá)一種或多種選自由panB、panC、panD、panE、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA、serA、ylmA和gcv基因所組成的組中的基因。
14.一種用于生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的方法，所述方法包括(a)在泛酸鹽/酯化合物能被生產(chǎn)出的條件下，對(duì)如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的微生物進(jìn)行培養(yǎng)；以及(b)可選地，從細(xì)胞培養(yǎng)基中回收泛酸鹽/酯化合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中以補(bǔ)料分批發(fā)酵方式來(lái)培養(yǎng)所述微生物的群落。
16.一種制備能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的芽孢形成缺陷型微生物的方法，所述方法包括(a)提供能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的微生物，(b)向步驟(a)的微生物中引入導(dǎo)致SigE活性降低的突變，或者向步驟(a)的微生物中引入導(dǎo)致SpoOA活性降低和AbrB活性降低的突變，從而獲得芽孢形成缺陷型微生物；或者(a)提供不能過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物的微生物，(b)向步驟(a)的微生物中引入降低SigE活性的突變或向步驟(a)的微生物中引入降低SpoOA活性和降低ArbB活性的突變，從而得到芽孢形成缺陷型微生物，以及(c)對(duì)步驟(b)中獲得的芽孢形成缺陷型微生物進(jìn)行修飾，使得它能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯化合物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述導(dǎo)致SigE活性降低的突變影響選自由spoIIGA、spoIIGB、spoIIR和spoIIAC組成的組中的至少一個(gè)基因。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，還包括如下步驟向所述微生物中引入導(dǎo)致spoOA過(guò)量表達(dá)的DNA序列或突變。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述導(dǎo)致SpoOA活性降低和AbrB活性降低的突變影響spoOA基因和abrB基因。
20.如權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物屬于Bacillus屬。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述微生物屬于Bacillus subtilis種。
22.如權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述泛酸鹽/酯化合物是泛酸鹽/酯。
23.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的微生物在制備泛酸鹽/酯化合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的芽孢形成缺陷型微生物。影響SigE功能的基因突變，或者影響Spo0A功能以及AbrB功能的基因突變，使得微生物不能形成芽孢，但卻基本保持它們過(guò)量生產(chǎn)泛酸鹽/酯的能力。本發(fā)明的微生物特別適用于泛酸鹽/酯的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P13/02GK1809631SQ200480017144
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者約翰·伯金斯, 佐爾譚·普里蓋 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司