專利名稱：：含有d－泛酸和/或其鹽的飼料添加劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于含有D-泛酸和/或其鹽的發(fā)酵液的動物飼料添加劑，及制備這種添加劑的方法。泛酸在全世界以每年幾千噸的規(guī)模生產(chǎn)，所產(chǎn)生的泛酸的大部分是用于飼養(yǎng)經(jīng)濟實用動物如禽類和豬。對泛酸的需求持續(xù)增加。泛酸可通過化學(xué)合成制備或經(jīng)在合適的營養(yǎng)溶液中發(fā)酵合適的微生物而經(jīng)生物工程制備。在化學(xué)合成情況下，DL-泛酸內(nèi)酯(DL-pantolactone)是重要的前體，其從甲醛、異丁醛和氰化物經(jīng)多步驟方法制備。在進一步的步驟中，外消旋混合物被分離，并且D-泛酸內(nèi)酯與β-丙氨酸縮合，由此產(chǎn)生D-泛酸。典型的市售形式是D-泛酸的鈣鹽，D，L-泛酸的外消旋混合物的鈣鹽也可以使用。使用微生物的發(fā)酵制備方法的優(yōu)勢是直接形成所需的立體異構(gòu)形式，即D-型，其不含L-泛酸。如EP-A-0493060，EP-A-0590857和WO97/10340所示，各種類型的細(xì)菌如埃希氏大腸桿菌、Arthrobacterureafaciens，Corynebacteriumerythrogenes，產(chǎn)氨短桿菌以及酵母如Debaromycescastellii在合適的發(fā)酵條件下可產(chǎn)生D-泛酸。特別合適的微生物是上述文獻中所述的大腸桿菌IFO3547的衍生物，如菌株FV5069/pFV31和FV5069/pFV202。如EP-A-0493060，EP-A-0590857和WO97/10340所述，在發(fā)酵制備D-泛酸過程中，在合適的營養(yǎng)素中培養(yǎng)能產(chǎn)生D-泛酸的微生物，然后以高成本的方式分離D-泛酸，純化并制備成鈣鹽。合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源如葡萄糖或淀粉水解物或者蔗糖或糖蜜，前體如β-丙氨酸、D，L-泛解酸或D，L-泛酸內(nèi)酯，氮源如硫酸銨，磷源如磷酸鉀或其它鹽，微量元素以及維生素，以及任選的復(fù)合培養(yǎng)基添加劑如酵母提取物。然后將微生物在pH合適的此培養(yǎng)基中保溫，適當(dāng)曝氣和攪拌，這些微生物隨即分泌D-泛酸。根據(jù)由WO96/33283和EP-A-0590857代表的現(xiàn)有技術(shù)，以昂貴的分離和純化方式從含泛酸的發(fā)酵液中獲得D-泛酸的鈣鹽。經(jīng)過濾或離心最初分離生物量后，用活性炭或柱層析純化進行濾液的進一步加工。將以這種方式獲得的溶液與氫氧化鈣反應(yīng)后，所需的鈣鹽結(jié)晶出來。根據(jù)WO96/33283，在第一個柱中經(jīng)活性炭將濾液脫色。用濃鹽酸將pH調(diào)至3.0，然后用填充有活性炭的另外兩個柱連續(xù)純化液體。用甲醇洗脫D-泛酸。在用氫氧化鈣粉末中和步驟后，獲得一種溶液，從中經(jīng)在5℃結(jié)晶回收D-泛酸鈣。在EP-A-0590857所述的方法中，濾液首先用陽離子和陰離子交換柱純化。用鹽酸洗脫。然后用氫氧化鈣中和洗脫的組分，向其中加入活性炭，并過濾混合物。獲得的濾液然后抽提進低分子量醇(甲醇、乙醇、異丙醇)中，經(jīng)結(jié)晶獲得D-泛酸鈣。以上述方式制備的D-泛酸鈣可用作飼料添加劑用于動物營養(yǎng)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，D-泛酸和D，L-泛酸的鹽類通過將經(jīng)化學(xué)合成或發(fā)酵制備的酸與所需的鹽溶液反應(yīng)而制備。本發(fā)明的目的在于提供適合用作飼料添加劑的D-泛酸及其鹽的新的制備形式。另外，本發(fā)明的目的在于提供比已知的方法更經(jīng)濟和更有效的制備方法。本發(fā)明提供了基于發(fā)酵液的動物飼料添加劑，其特征在于其含有a)D-泛酸和/或其鹽，特別是堿金屬或堿土金屬鹽，b)發(fā)酵中形成的0-100％量的生物量，以及c)至少較大部分的發(fā)酵液中的其它溶解成分，以及d)其以固體形式存在，特別是以細(xì)碎或顆粒和自由流動的形式存在。根據(jù)要求，添加劑通常以噴霧干燥或凍干、細(xì)碎、自由流動的粉末形式提供，或以顆粒形式提供，其可含有不同比例的生物量。體積密度約500kg/m3。該添加劑是儲存穩(wěn)定的。如果分離生物量，天然地，其它例如無機固體也被除去。另外，本發(fā)明的添加劑至少含有大部分所產(chǎn)生的其它物質(zhì)或溶解在發(fā)酵液中的任何添加物質(zhì)，只要其未被合適的方法所分離。這些物質(zhì)可包括在發(fā)酵過程中由所用微生物產(chǎn)生和分泌的除D-泛酸之外的有機二級產(chǎn)物。這些物質(zhì)包括選自L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、或L-色氨酸的L-氨基酸，特別是L-纈氨酸。另外也包括含有多至3個羧基的有機酸如乙酸、乳酸、檸檬酸、馬來酸或富馬酸。最后也包括轉(zhuǎn)化力弱的糖如海藻糖。如果這些化合物對添加劑價值有貢獻，則任選地它們是所希望的。另外，這些物質(zhì)可包括所用的可轉(zhuǎn)化糖如葡萄糖或蔗糖的集合。本發(fā)明還提供了用于制備含有D-泛酸和/或其鹽的飼料添加劑的方法，其特征在于a)經(jīng)發(fā)酵制備通常含有鈉、鉀、銨、鎂或鈣鹽的含D-泛酸發(fā)酵液，b)任選地從其中完全或部分分離生物量，c)向如此獲得的溶液或發(fā)酵液中加入堿土金屬或堿金屬的氫氧化物或氧化物，優(yōu)選以針對D-泛酸的化學(xué)計量的量加入，以及d)將如此獲得的混合物干燥、噴霧干燥、噴霧成?；蛄；?。本發(fā)明還提供了從發(fā)酵液中制備含有20-80％(干重)的D-泛酸和/或其鈉、鉀、銨、鎂或鈣鹽的飼料添加劑的方法，其特征在于如下步驟a)優(yōu)選地從發(fā)酵液中除去水(濃縮步驟)，b)任選地，除去0-100％的發(fā)酵中形成的生物量，c)向a)和b)中獲得的發(fā)酵液中加入一或多種所提到的化合物，其中所加入的化合物的重量是使得其在動物飼料添加劑中的總濃度為20-80％(重量)，特別是50-80％(重量)，d)干燥c)中獲得的發(fā)酵液從而以所希望的粉末或顆粒形式獲得動物飼料添加劑。用適合產(chǎn)生D-泛酸的微生物獲得的含有D-泛酸和/或其鹽的發(fā)酵液適用于本發(fā)明方法。微生物可以是真菌或酵母如Debaromycescastellii或革蘭氏陽性細(xì)菌如棒桿菌屬成員或革蘭氏陰性細(xì)菌如腸細(xì)菌科成員。腸細(xì)菌科特別提及的是埃希氏桿菌屬如大腸埃希氏桿菌種。在大腸埃希氏桿菌種中，可提及的是所謂的K-12菌株如菌株MG1655或W3110(Neidhard等大腸埃希氏桿菌和沙門氏菌細(xì)胞和分子生物學(xué)(ASM出版社，華盛頓特區(qū)))或大腸埃希氏桿菌野生型菌株IFO3547(發(fā)酵研究所，日本大阪)及其突變體。同樣，在從IFO3547制備的菌株中，特別提及的是命名為FV5069/pFV31(EP-A-0590857)和FV5069/pFV202(WO97/10340)的菌株。棒桿菌屬特別提及的是谷氨酸棒桿菌種。上述微生物可經(jīng)分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)或重復(fù)補料分批培養(yǎng)方法而連續(xù)或分批培養(yǎng)用于生產(chǎn)D-泛酸。公知的培養(yǎng)方法的綜述見Chmiel的教科書(生物加工技術(shù)I生物方法導(dǎo)論(GustavFischerVerlag，斯圖加特，1991))或者Storhas的教科書(生物反應(yīng)及外圍設(shè)備(ViewwegVerlag，不倫威克/威斯巴登，1994)。所用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足特定微生物的要求。各種微生物的培養(yǎng)基的描述見美國細(xì)菌學(xué)協(xié)會出版的“通用細(xì)菌學(xué)方法手冊”(美國華盛頓特區(qū)，1981)?？捎米魈荚吹奈镔|(zhì)有糖和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪如大豆油、葵花子油、核桃油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇類如甘油和乙醇，有機酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨使用或混和使用。含有機氮的化合物如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、豆粉和尿素以及無機化合物如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨可用作氮源。氮源可以單獨使用或混和使用。磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的鈉鹽可用作磷源。培養(yǎng)基還必須含有金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵，它們是生長所必需的。最后，除上述物質(zhì)外，還加入促進生長所必需的物質(zhì)如氨基酸和維生素。另外，D-泛酸的前體如天冬氨酸、β-丙氨酸、酮異戊酸、酮泛解酸或泛解酸以及任選地它們的鹽可加入到培養(yǎng)基中。所述的原料可以一個批次的形式加入培養(yǎng)物中，或者可以在培養(yǎng)過程中以合適的方式加入培養(yǎng)物中。優(yōu)選使用氨或氨水調(diào)節(jié)pH。任選地其它堿性化合物如氫氧化鈉或氫氧化鉀也是適合的。如果需要酸性化合物，則可以適當(dāng)方式使用磷酸或硫酸。為控制氣泡產(chǎn)生，使用消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯。合適的選擇性作用物質(zhì)如抗生素任選地加入到培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為保持有氧條件，將氧氣或含氧氣體混合物如空氣流經(jīng)培養(yǎng)物。培養(yǎng)溫度通常為20-45℃，優(yōu)選為20-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至產(chǎn)生最大量的D-泛酸。這一目標(biāo)通常在10-160小時內(nèi)達到。以這種方式獲得的發(fā)酵液通常干重為7.5-26％(重量)，所含的D-泛酸濃度為＞0至20％(重量)。在發(fā)酵完成后D-泛酸量為干重的2-20％(重量)的發(fā)酵方法是特別優(yōu)選的。還優(yōu)選的是發(fā)酵方法以至少在發(fā)酵后期限糖方式進行，更有利的是在至少30％發(fā)酵時間內(nèi)限糖。即在此期間內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基中的可轉(zhuǎn)化糖濃度保持在≥0至3g/l或低于此濃度。在一個加入銨離子以制備本發(fā)明的添加劑的變化方法中，任選地在開始時以公知的分離方法如離心、過濾、傾到或其組合方法從含D-泛酸的發(fā)酵液中完全或部分除去生物量。但是，根據(jù)本發(fā)明，也可使全部生物量保留在發(fā)酵液中。最后，通常將針對D-泛酸為0.8-1.2、優(yōu)選地0.95-1.1當(dāng)量的堿金屬或堿土金屬氧化物或氫氧化物特別是NaOH、KOH、Ca(OH)2或MgO加入到發(fā)酵液中。當(dāng)D-泛酸濃度較低時，有利的是使用更大量的氧化物或氫氧化物如1.2-4當(dāng)量。以這種方式獲得的懸液通常在干燥前被濃縮至干重的60％(重量)。還可以先濃縮發(fā)酵液然后加入氧化物或氫氧化物。所獲得的濃縮物然后在常規(guī)的干燥器中或使用降膜蒸發(fā)器或薄層蒸發(fā)器或噴霧干燥器或噴霧成粒機或凍干裝置轉(zhuǎn)化成可傾到的自由流動的細(xì)碎粉末或顆粒。?；部稍诟稍锖筮M行，例如以組合?；问竭M行。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了以快速經(jīng)濟的方式制備含D-泛酸的銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽或鈣鹽的粉末或含有這些粉末的提供形式的新方法。為此，用相應(yīng)的羥基化合物制備含D-泛酸的發(fā)酵液，任選地通過公知的分離方法如離心、過濾、傾到或其組合方法首先完全或部分除去生物量。但是根據(jù)本發(fā)明也可使全部生物量保留在發(fā)酵液中。然后，用公知的方法如用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器或薄層蒸發(fā)器或降膜蒸發(fā)器將任選地預(yù)處理的發(fā)酵液濃縮或干燥。然后用噴霧干燥、噴霧成?；騼龈苫蚱渌椒▽⑷芜x地預(yù)處理的發(fā)酵液加工成可傾到的自由流動的細(xì)碎粉末或顆粒。本發(fā)明的新的動物飼料添加劑通常含有相對于總重量20-80％(重量)、優(yōu)選地30-75％(重量)的D-泛酸和/或其鹽。它們通常還含有2.5-25％(重量)的無機成分以及任選地＞0-30％(重量)的有機二級產(chǎn)物。干生物量的比例為0-35％(重量)。水含量優(yōu)選≤5％(重量)。所需濃度的D-泛酸和/或所述的一或多種鹽任選地通過向發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)物中加入相應(yīng)的化合物而產(chǎn)生。所需化合物優(yōu)選地在干燥或噴霧干燥前、特別是在濃縮混合物后以溶液或干物質(zhì)的形式加入到混合物中并與其混和。以這種方式獲得的產(chǎn)物用作飼料添加劑。D-泛酸的濃度可通過已知方法確定(Velisek；層析科學(xué)60，515-560(1992))。實施例本發(fā)明參照以下實施例更詳細(xì)地描述。為此，用產(chǎn)生D-泛酸的菌株大腸桿菌5069/pFV31進行實驗，該菌株已根據(jù)布達佩斯條約保藏在工業(yè)科學(xué)技術(shù)代理機構(gòu)發(fā)酵研究所(FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustrialScienceandTechnology)(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本)，保藏號為FERM-BP4395。實施例1制備含有D-泛酸的發(fā)酵液1、制備接種物將大腸桿菌FV5069/pFV31樣品涂布在補加50μg/ml氨芐青霉素的LBG瓊脂上，在37℃保溫這一瓊脂板培養(yǎng)物17小時，然后在冰箱中于4℃儲存。然后在LBG液體中進一步培養(yǎng)所選的幾個菌落，LBG液體具有如下組成10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/lNaCl和1g/l葡萄糖。LBG瓊脂還含有12g/l瓊脂?？蓮腉ibco/BRL(Paisley，英國蘇格蘭)購買制備為LB液體基質(zhì)或LB瓊脂的制劑，加入1g/l葡萄糖后，獲得上述培養(yǎng)基。將10毫升培養(yǎng)物置于100毫升錐形瓶中，在37℃以180rpm在購自KuhnerAG(Birsfelden，瑞士)的ESR培養(yǎng)箱中保溫16小時，然后在Beckman(Hannover，德國)的J-6B離心機中將細(xì)胞懸液以4000rpm離心15分鐘。將細(xì)胞沉淀重懸在10毫升補加20％甘油的LBG培養(yǎng)基中，在無菌條件下分成每瓶1毫升的10個等份，在-70℃冷凍。這些培養(yǎng)物用作主細(xì)胞庫。為制備實驗細(xì)胞庫，將含有50μg/ml氨芐青霉素的LBG培養(yǎng)基以10毫升的量加入100毫升錐形瓶中，并用100微升上述主細(xì)胞庫接種。將該混合物在37℃以180rpm在購自KuhnerAG(Birsfelden，瑞士)的ESR培養(yǎng)箱中保溫16小時。保溫后用來自Dr.LangeCo.(德國柏林)的LP2W光度計在660nm測量波長測定培養(yǎng)懸液的光密度(OD)，其是3.5。然后將細(xì)胞懸液在無菌條件下置于來自Greiner公司(Frickenhausen，德國)的無菌30毫升聚乙烯試管中，用Beckman(Hannover，德國)的J-6B離心機在2500rpm離心15分鐘。將分離的生物量重懸于補加20％甘油的10毫升LBG培養(yǎng)基中，然后在無菌條件下將細(xì)胞懸液以500微升比例加入來自Nalgene公司的1毫升無菌(sic)中，在-70℃冷凍。以這種方式制備的保存部分用作實驗細(xì)胞庫。2.制備含有D-泛酸的發(fā)酵液為制備含有D-泛酸的發(fā)酵液，首先在搖瓶培養(yǎng)擴增實驗細(xì)胞庫，并用其接種預(yù)發(fā)酵罐。來自預(yù)發(fā)酵罐的培養(yǎng)物用于接種生產(chǎn)發(fā)酵罐。SKA培養(yǎng)基用于搖瓶培養(yǎng)，如下制備SKA培養(yǎng)基將7.0g(NH4)2SO4、0.5gKH2PO4、1.0gK2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.01gMnSO4·H2O、0.005gFe2(SO4)3和已用25％氨水溶液調(diào)節(jié)pH至6.8的20g玉米漿稱重加入1升玻璃燒杯中，然后加入875毫升蒸餾水。在121℃在高壓滅菌器中將此含玉米漿的鹽溶液滅菌20分鐘。另外，經(jīng)過濾滅菌由125g蒸餾水、28.7g葡萄糖和0.002g鹽酸硫胺素組成的溶液。將10gCaCO3稱重加入100毫升燒瓶中，并在123℃高壓滅菌20分鐘。通過將上述兩種組分與含玉米漿的鹽溶液合并獲得SKA培養(yǎng)基。將此SKA培養(yǎng)基以12.5毫升每份加入100毫升錐形瓶中，然后用0.5ml細(xì)胞懸液接種。用無菌生理鹽水以1∶100稀釋的實驗細(xì)胞培養(yǎng)物保存部分用作細(xì)胞懸液。在購自Infors公司(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK保溫箱中以150rpm在32℃保溫20小時。之后在660nm測定波長的光密度(OD660)測得為12.5。用4.5ml生理鹽水稀釋0.5ml這種搖瓶培養(yǎng)物，用0.7ml稀釋液接種已預(yù)先置于購自BraunDiesselBiotechGmbH(Melsungen，德國)的BiostatMD型2升實驗室發(fā)酵罐中的1300毫升培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基如下制備用25％氨溶液調(diào)整由9.81g(NH4)2SO4、0.7gKH2PO4、1.402gK2HPO4、0.70gMgSO4·7H2O、0.014gMnSO4·H2O、0.014gFe2(SO4)3和28.04g玉米漿于1300毫升自來水中組成的溶液的pH至6.5，并在高壓滅菌器中于121℃滅菌20分鐘。在無菌條件下向此含玉米漿的鹽溶液中加入單獨過濾滅菌的含有40.62g葡萄糖和0.0042g鹽酸硫胺素于100g蒸餾水中的溶液。在37℃發(fā)酵16小時，曝氣速率為1vvm，溶解氧保持在20％，pH保持在6.5。用25％濃度的氨水溶液作為pH調(diào)節(jié)劑。光密度為13.1。用90毫升這一培養(yǎng)物接種1144毫升生長培養(yǎng)基用于在2升實驗室發(fā)酵罐BiostatMD型中進行主發(fā)酵程序。如下制備生長培養(yǎng)基。用25％氨溶液調(diào)整由4.14g(NH4)2SO4、0.744gKH2PO4、1.0gK2HPO4、0.83gMgSO4·7H2O、0.0124gMnSO4·H2O、18.87gβ-丙氨酸、0.74gStruktolJ647和49.72g玉米漿于1144毫升自來水中組成的溶液的pH至6.5，并在高壓滅菌器中于121℃滅菌20分鐘。在無菌條件下向此含玉米漿的鹽溶液中加入單獨過濾滅菌的含有35.92g葡萄糖和0.002g鹽酸硫胺素于100ml蒸餾水中的溶液。在37℃發(fā)酵40小時，在生長期pH為6.5，曝氣速率為1vvm，在生產(chǎn)期pH為6.0，曝氣速率為1.5vvm。在兩種期間溶解氧均保持在低于2％。用25％濃度的氨溶液作為pH調(diào)節(jié)劑。在發(fā)酵過程中，生產(chǎn)培養(yǎng)基1和生產(chǎn)培養(yǎng)基2分步加入。在培養(yǎng)過程中一次加入玉米漿。生產(chǎn)培養(yǎng)基1含有在584毫升自來水中的465.29g葡萄糖和0.0261g鹽酸硫胺素，并已過濾滅菌。生產(chǎn)培養(yǎng)基2含有在140毫升自來水中的37.5gβ-丙氨酸并已在121℃高壓滅菌20分鐘。發(fā)酵7.5小時后并接近培養(yǎng)階段末期時，分步加入生產(chǎn)培養(yǎng)基1。培養(yǎng)10.5小時后，在無菌條件下加入已在121℃高壓滅菌20分鐘的溶解在100毫升自來水中的49.5g玉米漿。發(fā)酵12.5小時后并接近培養(yǎng)階段末期時，以3.5g/h的添加速率加入生產(chǎn)培養(yǎng)基2。培養(yǎng)41小時后，在發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)濃度為6.1％(重量)的泛酸。用購自Knauer(德國柏林)的M321型HPLC(高效液相色譜)裝置，用5μm粒徑的HypersilAPS2氨基相經(jīng)RI(折射指數(shù))檢測法測定D-泛酸的濃度。實施例2在如實施例1相同條件下進行的一個發(fā)酵實驗中，在培養(yǎng)43小時后在發(fā)酵液中檢測到濃度為5.4％(重量)的泛酸。L-纈氨酸濃度為8g/l。實施例3制備D-泛酸鈣首先從根據(jù)實施例1和2所述方法制備的含有約6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸發(fā)酵液中除去生物量。為此，將1升上述發(fā)酵液用實驗室離心機即購自Heraeus(Dusseldorf，德國)的Biofuge-Stratos型離心機在4000rpm離心20分鐘，上清離心液在一購自ICT有限公司(BadHomburg，德國)的UF裝置中用30kD的MRC聚合物膜經(jīng)逆流超濾而進一步純化。然后攪拌下分批加入10.1g固體Ca(OH)2(96％，MERCK，Darmstadt，德國)，隨之pH約為10.3。然后在一購自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德國)的RotavaporRE-120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在真空下于60℃濃縮如此處理的發(fā)酵液至液體含量約50％干重。隨后將如此獲得的濃縮發(fā)酵液噴霧干燥以制備D-泛酸的鈣鹽。為此，使用購自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德國)的Buchi-190實驗室噴霧干燥器，入口溫度107℃、出口溫度85℃、壓差-40mbar、空氣流速600NL/h。以這種方式制備的含有D-泛酸鈣的產(chǎn)物具有68.5％(重量)的泛酸濃度，其是自由流動的，體積密度為460mg/ml。儲存5個月后D-泛酸的濃度為67.6％(重量)。實施例4制備D-泛酸鈉首先從根據(jù)實施例1和2所述方法制備的含有約6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸發(fā)酵液中除去生物量。為此，將1升上述發(fā)酵液以如實施例3相同的方式離心和超濾。然后攪拌下分批加入10.6gNaOH(99％，MERCK)，隨之pH約為10。然后在一購自Buchi-Labortechnik有限公司的RotavaporRE-120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在真空下于50-60℃濃縮如此處理的發(fā)酵液至液體含量約50％干重。隨后將如此獲得的濃縮發(fā)酵液在一購自Leybold(Cologne，德國)的LYOVACGT2冷凍干燥器中冷凍干燥以制備D-泛酸的鈉鹽。以這種方式制備的含有D-泛酸鈉的產(chǎn)物具有63.8％(重量)的D-泛酸濃度，并且是自由流動的。儲存5個月后D-泛酸的濃度為63.0％(重量)。實施例5制備D-泛酸鎂首先從根據(jù)實施例1和2所述方法制備的含有約6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸發(fā)酵液中除去生物量。為此，將1升上述發(fā)酵液以如實施例3相同的方式離心和超濾。然后攪拌下分批加入5.4gMgO(97％，MERCK)，隨之pH約為9-10。然后在一購自Buchi-Labortechnik有限公司的RotavaporRE-120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在真空下于50-60℃濃縮如此處理的發(fā)酵液至液體含量約50％干重。隨后將如此獲得的濃縮發(fā)酵液在一購自Leybold的LYOVACGT2冷凍干燥器中冷凍干燥以制備D-泛酸的鎂鹽。以這種方式制備的含有D-泛酸鎂的產(chǎn)物具有64.7％(重量)的D-泛酸濃度，并且是自由流動的。儲存5個月后D-泛酸的濃度為64.4％(重量)。實施例6制備D-泛酸鉀首先從根據(jù)實施例1和2所述方法制備的含有約6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸發(fā)酵液中除去生物量。為此，將1升上述發(fā)酵液以如實施例3相同的方式離心和超濾。然后攪拌下分批加入17.4gKOH(85％，MERCK)，隨之pH約為10-11。然后在一購自Buchi-Labortechnik有限公司的RotavaporRE-120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在真空下于60℃濃縮如此處理的發(fā)酵液至液體含量約50％干重。隨后將如此獲得的濃縮發(fā)酵液在一購自Leybold的LYOVACGT2冷凍干燥器中冷凍干燥以制備D-泛酸的鉀鹽。以這種方式制備的含有D-泛酸鉀的產(chǎn)物具有63.5％(重量)的D-泛酸濃度，并且是自由流動的。儲存5個月后D-泛酸的濃度為62.9％(重量)。實施例7制備D-泛酸銨首先從根據(jù)實施例1和2所述方法制備的含有約6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸發(fā)酵液中除去生物量。為此，將1升上述發(fā)酵液以如實施例3相同的方式離心和超濾。然后攪拌下分批加入5.4gMgO(97％，MERCK)，隨之pH約為9-10。然后在一購自Buchi-Labortechnik有限公司的RotavaporRE-120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在真空下于50-60℃濃縮如此處理的發(fā)酵液至液體含量約50％干重。隨后將如此獲得的濃縮發(fā)酵液在一購自Leybold的LYOVACGT2冷凍干燥器中冷凍干燥以制備D-泛酸的銨鹽。以這種方式制備的含有D-泛酸銨的產(chǎn)物具有66.8％(重量)的D-泛酸濃度，并且是自由流動的。實施例8從含有生物量的發(fā)酵液中制備D-泛酸鈣首先將根據(jù)實施例1和2所述方法制備的含有約6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸發(fā)酵液在一購自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德國)的RotavaporRE-120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在真空下于60℃濃縮至體積為1.0升，液體含量約30％干重。然后攪拌下分批加入10.1gCa(OH)2(96％，MERCK，Darmstadt，德國)，隨之pH約為10。隨后將如此處理和濃縮的含生物量發(fā)酵液噴霧干燥以制備D-泛酸的鈣鹽。為此，使用購自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德國)的Buchi-190實驗室噴霧干燥器，入口溫度107℃、出口溫度85℃、壓差-40mbar、空氣流速600NL/h。以這種方式制備的含有D-泛酸鈣的產(chǎn)物具有49.8％(重量)的泛酸濃度，其是自由流動的，體積密度為480mg/ml。生物量含量約30％(重量)。實施例9從谷氨酸棒桿菌制備含有D-泛酸鈣和生物量的產(chǎn)物1、制備谷氨酸棒桿菌的產(chǎn)泛酸菌株美國專利5,188,948描述了產(chǎn)L-纈氨酸的乳發(fā)酵短桿菌菌株FERMBP-1763。DE19855313.7公開了含有來自谷氨酸棒桿菌的panB，panC和panD基因的質(zhì)粒pND-DBC2(圖1)，該質(zhì)粒以菌株ATCC13032/pND-DBC2的形式保藏在德意志微生物保藏中心(德國不倫瑞克)，保藏號為DSM12437。通過用質(zhì)粒pND-DBC2轉(zhuǎn)化菌株FERMBP-1763獲得產(chǎn)泛酸的菌株FERMBP-1763/pND-DBC2。2、制備含泛酸的發(fā)酵液將乳發(fā)酵短桿菌FERMBP-1763/pND-DBC2樣品涂布在HHK瓊脂上。HHK瓊脂由MerckKgaA(Darmstadt，德國)出售的腦/心瓊脂補加卡那霉素組成。在37℃培養(yǎng)這一瓊脂平板培養(yǎng)物17小時，然后儲存于+4℃冰箱。然后在同一培養(yǎng)基上進一步繁殖所選的菌落。然后從HHK瓊脂上取下一個克隆的細(xì)胞材料并用接種環(huán)轉(zhuǎn)移進置于總體積為1000毫升的搖瓶中的100毫升HHK液體。HHK液體由MerckKgaA(Darmstadt，德國)出售的腦/心培養(yǎng)基補加葡萄糖和卡那霉素組成。HHK液體的組成見表8b。表8aHHK瓊脂<p>表8bHHK液體</tables>在30℃、150rpm保溫混合物22小時。培養(yǎng)過程完成后，在660nm波長在光度計中測量的光密度為6.1(OD660)。用菌株FERMBP-1763/pND-DBC2的這一培養(yǎng)物接種生產(chǎn)發(fā)酵罐。用表8c給出的培養(yǎng)基SK-71進行發(fā)酵。SK-71培養(yǎng)基中的所有組分根據(jù)工作濃度直接在開始時導(dǎo)入發(fā)酵罐并原地滅菌。表8c培養(yǎng)基SK-71</tables>用來自B.Braun公司(BBI，德國，Melsungen，型號BiostatE/ED)的10升攪拌式反應(yīng)器作為發(fā)酵罐。用在上述HHK液體中的100毫升搖瓶預(yù)培養(yǎng)物接種1950g發(fā)酵培養(yǎng)基SK-71。在整個發(fā)酵時間內(nèi)在30℃培養(yǎng)混合物，根據(jù)氧耗，曝氣體積特異性速率為0.75vvm，攪拌速率為800-1700rpm，pH為7.0，氧氣部分壓力為20％空氣飽和度。在上述條件下培養(yǎng)培養(yǎng)物總計49小時，直至達到OD660為26.2。用氨水溶液(25％w/v)作為修正培養(yǎng)基以調(diào)節(jié)pH。然后用來自Dr.BrunoLange有限公司(德國柏林)的LP1W型數(shù)字式光度計在660nm測定波長測定光密度(OD)，用HPLC(HypersilAPS25μm，250×5mm，RI檢測)測定D-泛酸濃度。49小時后在最終發(fā)酵樣品中測得D-泛酸濃度約為0.2g/l。3、制備含泛酸產(chǎn)物用實施例9.2所述方法制備D-泛酸濃度約為0.02％(重量)的含D-泛酸發(fā)酵液。1.4升體積的這一發(fā)酵液首先在Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德國)制造的RotavaporRE-120型旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中在真空下于60℃蒸發(fā)成干固體含量約為15％的液體。然后攪拌下按比例加入27.1g固體Ca(OH)2(96％；MERCK，Darmstadt，德國)，隨之pH約為10。隨后將37.7gD-泛酸鈣(＞98％，EuroOTCPharma有限公司，Kamen，德國)加入到如此處理和濃縮的含生物量發(fā)酵液中。使用購自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德國)的Buchi-190型實驗室噴霧干燥器，入口溫度107℃、出口溫度85℃、壓差-40mbar、空氣流速600NL/h，進行最終的噴霧干燥程序。以這種方式制備的含有D-泛酸鈣的產(chǎn)物具有約35％(重量)的D-泛酸濃度，其是可傾到的，體積密度為600mg/ml。谷氨酸棒桿菌-生物量的比例約3.5％(重量)。實施例10從啤酒糖酵母制備含D-泛酸鈣和生物量的產(chǎn)物1、制備啤酒糖酵母的產(chǎn)泛酸菌株閱讀框架YHR063c的擴增從啤酒糖酵母閱讀框架YHR063c(登錄號U00061，國立生物技術(shù)中心，Bethesda，MD，USA)的核苷酸序列起始，合成下述PCR引物(MWG-Biotech，Ebersberg，德國)。該閱讀框架的起點和終點以句點(.)表示·oJD539(5’EcoRI-NotISTART)5’-GCGCGAATTCAGATCCGCGGCCGCAAAGAGGAGAAATTAACT.ATGACTGCACCACACAGAAG-3’·oJD540(3’SpeI-PstISTOP)5’-CGCGACTAGTCTGCAG.TCAGTCCTTTCTCCAGTCAC-3’用C.Guthrie和G.R.Fink方法(酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法，194卷，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，CA，1991)分離的啤酒糖酵母菌株JD242的基因組DNA用作模板。這一菌株是基因組已被測序(Goffeau等，科學(xué)274，546頁，1996)的雙倍體菌株SC288C(Winston等，酵母11，53ff.1995)的單倍體分離株。用C.Guthrie和G.R.Fink方法(酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法，194卷，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，CA，1991)進行四分體分析。菌株JD242是亮氨酸(1eu2Δ1等位基因)和尿嘧啶(ura3-52等位基因)營養(yǎng)缺陷型。用Roche公司(Mannheim)的“高可靠性擴增聚合酶”試劑盒在制造商指定的條件下經(jīng)28個PCR循環(huán)擴增約1.2kB的DNA片段。在0.8％濃度的瓊脂糖凝膠中經(jīng)電泳分離確定片段大小。pJD-YHR063c的結(jié)構(gòu)為了在啤酒糖酵母中表達YHR063c閱讀框架，將PCR擴增子摻入大腸桿菌-啤酒糖酵母穿梭載體pJDCEX2(圖2，Dohmen等，1995，生物化學(xué)雜志270，18099-18109)。首先用EcoRI和SpeI(AGS，Heidelberg，德國)酶切PCR產(chǎn)物，然后將其與已用EcoRI和XbaI處理的pJDCEX2-DNA混合，并用T4-DNA連接酶(Roche，Mannheim，德國)連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-blue(Bullock等，1987，生物技術(shù)5，376)，在含有150μg/ml氨芐青霉素(Sigma，Deisenhofen，德國)的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子。經(jīng)堿性細(xì)胞裂解(Sambrook等分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，1989)從氨芐青霉素抗性克隆制備質(zhì)粒DNA。然后用NotI和PstI限制消化，隨后在0.8％瓊脂糖凝膠上分離而測試分離的質(zhì)粒DNA。具有所需結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒命名為pJD-YHR063c(圖3)。制備菌株JD242/pJD-YHR063c用Dohmen等的方法(Dohmen等，酵母7，691，1991)用質(zhì)粒pJD-YHR063c轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母菌株JD242。在使用1.8％瓊脂的無亮氨酸最小培養(yǎng)基SD上選擇轉(zhuǎn)化子(見表9a和9b)。表9a最小培養(yǎng)基SD表9b最小培養(yǎng)基SD2、制備含泛酸發(fā)酵液為制備含D-泛酸發(fā)酵液，首先將啤酒糖酵母JD242/pJD-YHR063c的單個菌落涂布在具有最小培養(yǎng)基SD的瓊脂平板上并在30℃保溫3天。為在搖瓶中制備第一預(yù)培養(yǎng)物，用5ml最小培養(yǎng)基SD洗下細(xì)胞。然后用2.5ml這一細(xì)胞懸液接種含50ml最小培養(yǎng)基SD(表9a和9b)的每個搖瓶(總體積500ml)，并在Infors股份公司(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培養(yǎng)箱中在30℃和130rpm培養(yǎng)6小時，直至在660nm波長處測定的光密度(OD660)為1.9。第二預(yù)培養(yǎng)物是在含150ml最小培養(yǎng)基SD(表9a和9b)的1000mlbaffle-燒瓶中制備，每個燒瓶接種50ml上述預(yù)培養(yǎng)物1。在30℃和80rpm培養(yǎng)20小時，直至在660nm波長處測定的光密度(OD660)為3.8。產(chǎn)生泛酸的主發(fā)酵在總體積6000ml圓底燒瓶中的1500ml最小培養(yǎng)基SD(表9a和9b)中進行。為此，用90ml預(yù)培養(yǎng)物2接種每個圓底燒瓶，然后在30℃和60rpm培養(yǎng)30小時。用來自Dr.BrunoLange有限公司的LP1W型數(shù)字式光度計在660nm測定波長測定光密度(OD)。根據(jù)DIFCO的“DIFCO手冊”中的數(shù)據(jù)(Michigan，USA，10th版，1100-1102(1984))用菌株LactobacillusplantarumATCC確定所獲得的D-泛酸的濃度。光密度(OD660)約為4，D-泛酸濃度約為1mg/l。3、制備含泛酸的產(chǎn)物用實施例10.2中的方法制備D-泛酸濃度約為1mg/l的含泛酸發(fā)酵液。6.0升體積的這一發(fā)酵液首先在Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德國)制造的RotavaporRE-151型旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中在真空下于60℃蒸發(fā)成干固體含量約為16％的液體。然后攪拌下按比例加入15.9g固體Ca(OH)2(96％；MERCK，Darmstadt，德國)，隨之pH約為9.2。隨后將28.4gD-泛酸鈣(＞98％，EuroOTCPharma有限公司，Kamen，德國)加入到如此處理和蒸發(fā)的含生物量發(fā)酵液中。使用購自Leybold公司(Cologne，德國)的LYOVACGT2型冷凍干燥器冷凍干燥。以這種方式制備的含有D-泛酸鈣的產(chǎn)物具有約26.5％(重量)的D-泛酸濃度，其是可傾到的，體積密度為450mg/ml。啤酒糖酵母生物量的比例約6.8％(重量)。附1質(zhì)粒pND-DBC2圖。圖2質(zhì)粒pJDCEX2圖。圖3質(zhì)粒pJD-YHR063c圖。所用縮寫如下圖1rrnBT1T2rrnB基因的轉(zhuǎn)錄終止子Ptactac啟動子panBpanB基因的編碼區(qū)panCpanC基因的編碼區(qū)panDpanD基因的編碼區(qū)rep-C.g.谷氨酸棒桿菌中的用于復(fù)制的DNA區(qū)域oriV-E.c.在大腸桿菌中的營養(yǎng)轉(zhuǎn)移起點kan卡那霉素抗性基因BglII酶BglII的裂解位點ClaI酶ClaI的裂解位點NotI酶NotI的裂解位點NruI酶NruI的裂解位點PvuI酶PvuI的裂解位點SacI酶SacI的裂解位點SalI酶SalI的裂解位點ScaI酶ScaI的裂解位點SphI酶SphI的裂解位點XhoI酶XhoI的裂解位點圖2和圖3LEU2啤酒糖酵母的B-異丙基馬來酸脫氫酶基因2μ啤酒糖酵母的內(nèi)源性2μ質(zhì)粒的序列ApRβ-內(nèi)酰胺酶基因P-CUP1啤酒糖酵母CUP1基因(金屬硫蛋白)的啟動子T-CYC1啤酒糖酵母CYC1基因(細(xì)胞色素C)的終止子SDShineDalgarno序列EcoRI酶EcoRI的裂解位點NotI酶NotI的裂解位點SpeI酶SpeI的裂解位點XbaI酶XbaI的裂解位點權(quán)利要求1.動物飼料添加劑，其含有D-泛酸和/或其鹽并基于發(fā)酵液，其特征在于含有a)D-泛酸和/或其鹽，b)產(chǎn)D-泛酸微生物的發(fā)酵過程中產(chǎn)生的0-100％生物量，c)至少大部分的發(fā)酵液中的其它成分，并且d)其以固體、細(xì)碎或顆粒狀自由流動的形式存在。2.權(quán)利要求1的動物飼料添加劑，其特征在于其含有一或多種選自D-泛酸的鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽或鈣鹽的鹽。3.權(quán)利要求1或2的動物飼料添加劑，其特征在于其含有含量為＞0，特別是20-80重量％(干重)的D-泛酸和/或其一種鹽。4.權(quán)利要求1的動物飼料添加劑，其特征在于其以噴霧干燥或噴霧顆粒形式存在。5.前述一項或多項權(quán)利要求所述的動物飼料添加劑，其特征在于其還含有一或多種選自L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸或L-色氨酸的L-氨基酸。6.一種從發(fā)酵液制備權(quán)利要求1-5的含有D-泛酸和/或其鹽的飼料添加劑的方法，其特征在于a)任選地從含有D-泛酸和/或其鹽的發(fā)酵液中完全或部分除去生物量和/或一些其它成分，b)向如此獲得的溶液或發(fā)酵液中加入堿土金屬或堿金屬的氫氧化物或氧化物，以及c)將如此獲得的混合物干燥、噴霧干燥、噴霧成?；蛄；?.權(quán)利要求6的方法，其特征在于選自鈉、鉀、銨、鎂或鈣化合物的氧化物或氫氧化物以針對D-泛酸為0.8-1.2、優(yōu)選地0.95-1.1的化學(xué)計量比例加入。8.制備含有D-泛酸和/或其鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽或鈣鹽的權(quán)利要求1-5的飼料添加劑的方法，其特征在于a)任選地用所需的羥基化合物從獲得的含D-泛酸鹽的發(fā)酵液中完全或部分除去生物量和/或一些成分，b)優(yōu)選地通過除去水濃縮如此獲得的混合物，以及c)通過干燥、噴霧干燥或噴霧成粒獲得固體形式的含有相應(yīng)的泛酸鹽的飼料添加劑。9.從發(fā)酵液中制備含有濃度為20-80重量％(干重)的D-泛酸和/或其鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽或鈣鹽的動物飼料添加劑的方法，其特征在于如下步驟a)優(yōu)選地從發(fā)酵液中除去水(濃縮步驟)，b)任選地，除去0-100％的在發(fā)酵期間形成的生物量，c)向步驟a)和b)獲得的發(fā)酵液中加入一或多種所述化合物，其中所加入的化合物的重量為其在動物飼料添加劑中的總濃度為約20-80重量％，以及d)干燥步驟c)獲得的發(fā)酵液從而獲得所需粉末或顆粒形式的動物飼料添加劑。10.權(quán)利要求9的方法，其特征在于在優(yōu)選地進行的濃縮步驟之前或之后向發(fā)酵液中加入所述的堿金屬或堿土金屬的氧化物或氫氧化物。11.權(quán)利要求6-9的方法，其特征在于真菌或酵母用于發(fā)酵過程。12.權(quán)利要求9的方法，其特征在于向任選地濃縮的發(fā)酵液中加入一或多種選自L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸或L-色氨酸的L-氨基酸。13.權(quán)利要求6-11的方法，其特征在于來自棒桿菌屬的細(xì)菌用于發(fā)酵過程。14.權(quán)利要求6-11的方法，其特征在于來自腸細(xì)菌科的細(xì)菌用于發(fā)酵過程。全文摘要本發(fā)明提供了基于一種發(fā)酵液的飼料添加劑,所述發(fā)酵液通過發(fā)酵產(chǎn)D－泛酸的微生物獲得并含有選自鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽或鈣鹽的一或多種D－泛酸的鹽,任選地添加一或多種這些化合物。文檔編號A23K1/175GK1276981SQ00106198公開日2000年12月20日申請日期2000年5月8日優(yōu)先權(quán)日1999年5月5日發(fā)明者米夏埃爾·賓德爾,克勞斯－埃里?！醴蚵?伊洛納·瓦爾格,烏爾里?！へ惪藸?瓦爾特·普費弗勒,海因茨·弗里德里希申請人:德古薩－于爾斯股份公司