專利名稱：用于評估神經(jīng)元變性的系統(tǒng)和方法
用于評估神經(jīng)元變性的系統(tǒng)和方法 對相關(guān)申請的交叉引用本申請要求申請日為2003年10月15日的美國臨時申請流水號 60/511， 948的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域本文披露了用于體外評估神經(jīng)變性的系統(tǒng)和方法。更具體地講， 披露了用于評估所選化合物是否能誘導或防止神經(jīng)變性的系統(tǒng)和方 法。所述系統(tǒng)和方法還可用于評估所選培養(yǎng)條件是否能誘導神經(jīng)變性 或神經(jīng)保護性作用。發(fā)明背景對神經(jīng)元細胞死亡，例如，繼發(fā)于興奮性中毒的神經(jīng)元變性機制的體外研究傳統(tǒng)上業(yè)已在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物或者在海馬切片的器官型 的培養(yǎng)物中進行，使用能檢測神經(jīng)元細胞完整性的各個方面的熒光標記(Vor謂J. J. and Coyle J. T. ， R Neurochem. 56: 996-1006 (1991) ; Choi D. W. ， J Neurobiol. ， 23: 1261-1276 ( 1992 ); 和Bruce等，Exp. Neurol. 132: 209-219 ( 1995 ))。這些方法通常 使用能結(jié)合靶分子，如基因或蛋白的標記，或能結(jié)合細胞膜的標記。 這些常規(guī)方法并不測定神經(jīng)元本身活性的改變，而是測定受神經(jīng)元死 亡影響的分子和/或細胞的改變。 一般，這些方法是便于實施的，并且 可用于潛在神經(jīng)保護性化合物的大規(guī)模篩選。不過，它們不能提供導 致細胞死亡的事件的詳細的時間進程，也不能區(qū)分不同神經(jīng)元(或膠 質(zhì)細胞)群體的命運。原則上講，電生理學技術(shù)更適合提供有關(guān)神經(jīng)元變性的信息。不 過，直到最近，可通過商業(yè)渠道獲得的電生理學記錄裝置局限于僅僅
記錄一個或少數(shù)幾個神經(jīng)元的活性。另外，它們只能夠記錄，最多6-10 小時的電生理學活性。目前，業(yè)已開發(fā)出能同時記錄神經(jīng)元培養(yǎng)物(Pine J. ， J Neurosci. Methods, 2: 19-31 ( 1980 )和Gross等，J.Neurosci. Methods, 5: 13—22 ( 1982 ))，器官型培養(yǎng)物(Stoppini等，1 Neurosci. Methods, 72: 23-33 ( 1997 )和Egert等，Brain Res. Protoc. ， 2: 229-242 (1998 )),和快速切片(Novak J. L. and Wheeler B. C. , J. Neurosci. Methods, 23: 149-159 ( 1998 ) ; Oka等，J Neurosci. Methods, 93: 61-67 (1999);和Gholmieh等，Biosens Bioelectron， 16: 491-501 ( 2001 ))中的多個神經(jīng)元活性的平面電極陣列。在以全文形 式收作本文參考的授予Sugihara等的U. S. 6, 297, 025和U. S. 6， 132， 683中披露了通過均勻分布在腦切片中的多達64個電極進行記 錄的裝置。在典型的海馬切片中，這些陣列能夠監(jiān)測所有海馬子域的 神經(jīng)元的電生理學狀態(tài)(Stoppini等，R Neurosci. Methods, 72: 23- 33 ( 1997 )和Oka等，J Neurosci. Methods, 93: 61-67 ( 1999 ))。 不過，上述文獻都沒有披露用于研究化合物或其他實驗操作對受損傷 的或垂死的神經(jīng)元的電活動的慢性影響的方法。神經(jīng)變性業(yè)已與諸如以下疾病的病理生理學相關(guān)亨廷頓氏舞蹈 病、帕金森氏病、阿爾茨海默病、血管性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化、 局部缺血和唐氏綜合征。這些疾病的神經(jīng)元損傷的病因?qū)W已被歸因于 諸如興奮性中毒神經(jīng)元損傷(興奮性中毒)或氧化損傷的病理學機制。 因此，用于評估和預(yù)防神經(jīng)元損傷的系統(tǒng)和方法可以提供顯著的醫(yī)學 效益。發(fā)明概述本發(fā)明總體上提供了用于評估神經(jīng)變性的系統(tǒng)和方法。具體地講， 披露了用于評估候選化合物或培養(yǎng)條件是否能誘導神經(jīng)元損傷，或使 神經(jīng)元免受損傷的系統(tǒng)和方法。在一種變化形式中，用于評估體外所選化合物是否能誘導神經(jīng)變
性的方法包括1 )提供在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本 施加電刺激的基片上具有多個微電極的裝置；2)使所述神經(jīng)元樣本與 所述多個微電極接觸；3)測定所述神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞；4) 使所述神經(jīng)元樣本與第一種候選化合物接觸；5)在所迷神經(jīng)元樣本與 第 一種候選化合物接觸之后的 一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本 所產(chǎn)生的第一個突觸傳遞；和6)比較所產(chǎn)生的第一個突觸傳遞與基 線突觸傳遞。第一和基線突觸傳遞之間突觸傳遞的減弱通常表明了所 述候選化合物在所述神經(jīng)元樣本中誘導神經(jīng)變性。另外，該方法還可用于確定候選化合物是否能防止神經(jīng)元損傷， 通過實施上述步驟1-5，另外使所述神經(jīng)元樣本與第二種候選化合 物接觸；在神經(jīng)元樣本與第二種候選化合物接觸之后的 一個或多個時 間點測定所述神經(jīng)元樣本所產(chǎn)生的第二個突觸傳遞；和比較第二個產(chǎn) 生的突觸傳遞與第一突觸傳遞。第二和第一突觸傳遞之間突觸傳遞的 增強通常表明了第二種候選化合物在神經(jīng)元樣本中提供了防止神經(jīng)變 性的某些保護作用。本文所披露的系統(tǒng)和方法可用于檢測或評估能誘導神經(jīng)元損傷的 培養(yǎng)條件。所述方法可以包括l)提供在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并 且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基片上具有多個微電極的裝置，和供給 第一種培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；2)使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接 觸；3)測定所述神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞；4)改變所述笫一種培 養(yǎng)條件，以產(chǎn)生第二種培養(yǎng)條件；5)在改變所迷第一種培養(yǎng)條件以產(chǎn) 生第二種培養(yǎng)條件之后的 一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本的第 一突觸傳遞；和6)比較第一突觸傳遞與基線突觸傳遞。第一和基線 突觸傳遞之間突觸傳遞的減弱通常表明所述第二種培養(yǎng)條件能夠在所 述神經(jīng)元樣本中誘導神經(jīng)變性。在另 一種變化形式中，導致對神經(jīng)元損傷的至少部分保護作用的 培養(yǎng)條件可以通過實施上述步驟1-5加上以下步驟來評估改變所迷笫二種培養(yǎng)條件；在改變所述第二種培養(yǎng)條件之后的一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本所產(chǎn)生的第二個突觸傳遞；和比較第二個產(chǎn)生
的突觸傳遞與第一突觸傳遞。第二和第一突觸傳遞之間突觸傳遞的增 強通常表明所述改變的第二種培養(yǎng)條件保護神經(jīng)元樣本免于神經(jīng)變 性。附圖的簡要說明

圖1A是在MED探頭上培養(yǎng)的海馬樣本的數(shù)字圖像。 圖1B表示使用成對脈沖刺激方式獲得的電波形。 圖1C表示在候選化合物的篩選測定中取得的電波形幅度測定的 時間線。圖2A表示以各種電流強度刺激后獲得的電波形。 圖2B是輸入-輸出U/0)曲線，表示作為刺激強度函數(shù)的電波形 的峰值幅度。圖2C比較了從快速和長期培養(yǎng)物中的神經(jīng)組織切片獲得的電波形的斜率和衰變時間。圖2D是用實驗對照(快速海馬樣本)獲得的1/0曲線。圖3A是表示在接觸NMDA之后電波形幅度減弱的I/O曲線。圖3B是表示在接觸AMPA之后電波形幅度減弱的I/O曲線。圖3C表示來自圖3A的典型電波形。圖3D表示來自圖3B的典型電波形。圖4A表示提高NMDA濃度對電波形幅度的影響。圖4B表示提高AMPA濃度對電波形幅度的影響。圖5表示在消除NMDA之后不同的時間點突觸反應(yīng)的恢復量。圖6A是表示MK-801對用NMDA培養(yǎng)的神經(jīng)元組織的保護作用的I/O曲線。圖6B是表示二甲金剛胺對用NMDA培養(yǎng)的神經(jīng)元組織的保護作用 的I/O曲線。圖6C表示二甲金剛胺濃度和神經(jīng)保護程度之間的直接相關(guān)性。 圖7A表示MK-801對突觸反應(yīng)的作用。 圖7B表示二甲金剛胺對突觸反應(yīng)的作用。
圖8表示慢性接觸NMDA受體激動劑和/或拮抗劑對突觸反應(yīng)的影響。發(fā)明的詳細說明本文披露的是用于體外評估神經(jīng)元變性的系統(tǒng)和方法。"神經(jīng)元變 性"或"神經(jīng)元損傷"表示神經(jīng)元之間的突觸傳遞的變化，通常是一個或 多個神經(jīng)元的損傷或死亡，導致神經(jīng)元之間的突觸傳遞減弱。所述系 統(tǒng)和方法可以使用下文進一步描述的多電極裝置，用于測定神經(jīng)元樣 本的突觸傳遞活性。在本文中，術(shù)語"神經(jīng)元樣本"在不同的情景中表 示單個神經(jīng)元、神經(jīng)細胞的聚集體、 一層或多層神經(jīng)細胞和神經(jīng)組織 切片。具體地講，在測定某種類型的參數(shù)，例如電波形時，所述"情景 "可以是"神經(jīng)元樣本"呈足以產(chǎn)生可測定的參數(shù)值的大小。多電極裝置 測定突觸傳遞的一種方法是通過測定由神經(jīng)元樣本的特定部分產(chǎn)生的 電波形幅度。例如，電波形幅度的減弱通常表明了突觸傳遞的減弱， 而電波形幅度的增加通常表明了突觸傳遞的增強。用于評估神經(jīng)元變性的多電極裝置本文所披露的系統(tǒng)和方法可以使用包括多個細胞電位測定電極的 裝置，該裝置以前披露在授予Sugihara等的U. S. 6， 132， 683中， 以便獲得并且記錄神經(jīng)元和神經(jīng)元樣本的電活動。Sugihara等的裝置 在它所有的公開變化形式中，通常被稱作MED探頭。適合測定下面所 討論的神經(jīng)元電活動，并且達到所披露系統(tǒng)和方法需要的程度，以便 提供特定形式的電刺激的具有多個電極位點的其他裝置同樣適合實施 本文所披露的系統(tǒng)和方法。在某些場合，當可以選擇其他功能類似的 或者其他合適裝置的情況下我們可以參考MED探頭的使用。簡單地講，MED探頭包括多個物理上隔離的微電極，這些微電極 可能位于絕緣基片上，并且通常具有用于將微電極連接到微電極區(qū)域 以外的某些區(qū)域的導電圖。實際上，所述裝置還可以具有連接在導電 圖末端的電接點、覆蓋所述導電圖的表面的絕緣膜，以及包圍位于所 述絕緣膜表面上包括所述微電極區(qū)域的壁。在MED的某些變型中，將 阻抗低于測量微電極的參考電極放置在由所述壁包圍的區(qū)域中的多個 位置上，并且通常放置在距離所述微電極特定距離的地方。所述電接 點通常還在用于連接每一個參考電極的導電圖和導電圖的末端之間連 接。用于連接參考電極的導電圖的表面通常用絕緣膜覆蓋。另外，MED 探頭的很多變化形式包括光學觀察裝置，例如，倒置顯微鏡，用于對 放置在探頭上的神經(jīng)元樣本進行光學測定或觀察；用于為所述樣本提 供刺激信號并且用于處理來自所述樣本的輸出信號的計算機，以及用 于維持所述樣本周圍的培養(yǎng)環(huán)境的培養(yǎng)室。所述計算機通常是個人計算機(PC )，其中安裝有測量/刺激軟件。 所述計算機和多電極裝置總體上是通過用于測量的1/0板連接的。所 述I/O板通常包括A/D轉(zhuǎn)換器和D/A轉(zhuǎn)換器。A/D轉(zhuǎn)換器通常用于 測量并且轉(zhuǎn)換所得到的電位；D/A轉(zhuǎn)換器用于向樣本發(fā)送刺激信號。 例如，A/D轉(zhuǎn)換器可以具有16位，64通道，而D/A轉(zhuǎn)換器可以具有 16位，8通道。在這種場合下，可以將能夠在該方法中測定突觸傳遞 的隨時間變化的軟件安裝到PC上。用于為所述樣本提供刺激的一種典型的方法是這樣的當刺激信 號從計算機中發(fā)出時，刺激信號通過D/A轉(zhuǎn)換器和隔離器發(fā)送到多電 極裝置。將在每一個微電極和參考電位之間出現(xiàn)的感應(yīng)的、誘發(fā)的或 自發(fā)的電位通過64通道高靈敏度放大器和A/D轉(zhuǎn)換器輸入計算機。 所述放大器的放大系數(shù)可以是，例如，在大約0. 1-10kHz，或0.1-20 kHz的頻帶例如大約80-100 dB，不過，在使用低阻濾波器測定由刺激 信號誘導的電位時，所述頻帶為100 Hz - 10 kHz。自發(fā)電位通常在 100 Hz - 20 Hz范圍內(nèi)。為了進行數(shù)據(jù)分析或加工，可以采用傅立葉函數(shù)變換(FFT )分析、 相干性分析或相關(guān)分析。有用的函數(shù)可以包括使用波形分辨的單尖峰 信號分離函數(shù)，時間分布顯示函數(shù)，拓樸顯示函數(shù)，以及電流源密度 分析函數(shù)。培養(yǎng)室可以是培養(yǎng)系統(tǒng)的一部分，該系統(tǒng)通常包括溫度控制器，
培養(yǎng)液循環(huán)裝置，以及用于輸送，例如，空氣和二氧化碳的混合氣體 的供給裝置。所述培養(yǎng)系統(tǒng)還可以由商業(yè)化微型培養(yǎng)箱，溫度控制器，和二氧化碳桶組成。所述微型培養(yǎng)箱可用于通過使用Peltier元件將 溫度控制在0C-5(TC的范圍內(nèi)，并且適用于3 ml/分鐘或以下的液體 輸送速度和1L/分鐘或以下的氣體流速?；蛘?，可以使用采用了其他 溫度控制器設(shè)計的微型培養(yǎng)箱。評估神經(jīng)元變性的方法通常，用于評估神經(jīng)元變性的方法包括分別在實施例1、 2和3 中所披露的MED探頭和神經(jīng)元樣本制備，和記錄基線電波形。神經(jīng)元 樣本可以從腦或脊髄的任何部位獲取，包括但不局限于，海馬、黑質(zhì)、 小腦、丘腦和下丘腦等。我們以多種方式使用術(shù)語"檢測"和"評估"。本文所披露的方法可 用于"檢測"化合物的缺乏或存在，還可用于"檢測"化合物的相對效力， 以它們導致神經(jīng)元樣本參數(shù)的改變?yōu)楦鶕?jù)，該神經(jīng)元樣本是可通過使 用能夠測量受影響參數(shù)的裝置或方法測量的。術(shù)語"評估"是以相同的 方式使用的。在一種變化形式中，所述方法檢測能夠誘導神經(jīng)元損傷的化合物。 在記錄基線突觸傳遞之后，將候選化合物添加到培養(yǎng)基中，使它接觸 所述樣本。然后在導入候選化合物之后不同的時間點，例如，3小時， l天，2天或3天或更長時間記錄突觸傳遞，這取決于研究者的偏好。 在與基線(對照)突觸功能比較時觀察到的突觸傳遞的減弱通常表明 業(yè)已發(fā)生了神經(jīng)元損傷，正如在實施例4中進一步說明的。能夠誘導神經(jīng)變性的化合物可以包括興奮性毒性分子，如谷氨酸 受體激動劑。谷氨酸受體激動劑的例子包括N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA)和ot-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異喁唑丙酸(AMPA )?；曰衔铩Ｔ诒疚闹?，"氧化損傷"表示由氧化性化合物導致的對神 經(jīng)細胞或組織的損傷。術(shù)語"氧化性化合物"通常表示具有氧化物質(zhì)的
能力的化合物。能夠誘導氧化損傷的氧化性化合物的例子包括，但不局限于活性氧類，如過氧化氫(11202 )，超氧化物自由基，羥基， 一氧化氮，臭氧，含硫自由基，和以碳為中心的自由基(例如，三氯甲基 游離基)。在另一種變化形式中，所述方法檢測能夠保護神經(jīng)元免受損傷的 候選化合物(神經(jīng)保護劑或神經(jīng)保護性化合物)。在記錄基線突觸傳 遞之后，將候選化合物添加到培養(yǎng)基中，使它接觸所述樣本。然后在導入候選化合物之后不同的時間點，例如，3小時、l天、2天或3天 或更長的時間記錄突觸傳遞，這取決于研究者的偏好。在與基線(對 照)突觸功能比較時觀察到的突觸傳遞的增強通常表明業(yè)已發(fā)生了對 神經(jīng)元免遭損傷的保護作用，正如在實施例5-7中進一步說明的。能夠防止神經(jīng)元損傷的候選化合物可以包括谷氨酸受體拮抗劑和 抗氧化劑。谷氨酸受體拮抗劑的例子包括MK-801和二曱金剛胺?？梢?將維生素E、維生素C和谷胱甘肽用作抗氧化劑。在另一種變化形式中，所述方法檢測能誘導神經(jīng)元損傷的培養(yǎng)條 件。通常，用于獲得基線突觸功能的培養(yǎng)條件是通過操縱諸如培養(yǎng)基 的溫度或pH變化，導入神經(jīng)變性-誘導化合物源，使神經(jīng)元樣本接觸 輻射，或剝奪所迷樣本維持樣本存活力所必需的氧或其他因子而改變 的。在另一種變化形式中，所述方法檢測能防止神經(jīng)元損傷的培養(yǎng)條 件。保護性培養(yǎng)條件還可以包括培養(yǎng)基的特定的溫度或pH范圍、神經(jīng) 保護性化合物源的導入，或接觸輻射。在另一種變化形式中，可優(yōu)選使用具有預(yù)先存在的缺陷的神經(jīng)元 樣本以檢測神經(jīng)保護劑。例如，所述缺陷可以是遺傳誘導的，正如在 基因修飾過的動物中所見到的。所述缺陷還可以是機械產(chǎn)生的，從而 在神經(jīng)元樣本中產(chǎn)生物理損傷。
具體實施方式
實施例以下實施例用于更詳細地說明使用本文所披露的發(fā)明的方式。應(yīng)
當理解的是，這些實施例并非要用于限定本發(fā)明的范圍，而是用于說 明目的。實施例1MED探頭的制備在使用之前，將MED探頭(Panasonic, model MED-P530AP,每 一個電極50 x 50jam，極間距離300 ja m)在70%乙醇中浸泡15分 鐘，干燥，然后用UV輻射15分鐘進行消毒。在室溫下用0.1%聚氮 丙啶和pH 8.4的25mM硼酸緩沖液處理探頭表面過夜。然后千燥所述 探頭表面，并且用無菌蒸餾水漂洗3次。最后，用培養(yǎng)基填充所述探 頭，并且在C02培養(yǎng)箱中保存待用(至少保持一小時)。所述培養(yǎng)基 是基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle培養(yǎng)基(Sigma, Catalog No. B9638 )和Earle 平衡的鹽溶液(Sigma, Catalog No. E7510)的2: 1的混合物，補充 了以下化合物(單位為mM) : NaCl (20) ， NaHC03 ( 5 ) ， CaCl2 ( 0. 2 )， MgS04 (1.7)，葡萄糖(48 ) ， HEPES ( 26. 7 ) ; 5%馬血清(GIBCO, Catalog No. 26050 )和10 mi/L青霉素-鏈霉素(GIBCO， Catalog No. 10378 )。將培養(yǎng)基的pH調(diào)整到7.2。實施例2 神經(jīng)元樣本的制備 培養(yǎng)物制備的所有過程都是在無菌工作臺上進行的。首先用70% 的乙醇對十一天大的Sprague-Dawley大鼠進行消毒，在麻醉之后通過 斷頭處死，并且取出完整的腦。將腦馬上浸泡在無菌水鎮(zhèn)的MEM(pH 7.2; GIBCO， Catalog No. 61100)中，其中添加了 HEPES (25 mM), Tris-堿(10 mM)，葡萄糖(10 mM)和MgC" ( 3 mM)。然后通過手 工修剪合適的腦部分，并且將剩余的腦塊放置在冰鎮(zhèn)的振動組織切片 機(Leica, model VT1000S)的工作臺上。將切片的厚度設(shè)定為200 Mm,用吸液管將切片從刀片上輕柔地取下。對每一個切片進行修剪， 放置在按上述方法事先包被的MED探頭的中央，并且定位以覆蓋8x8
的微電極陣列。
在將切片定位到MED探頭上之后，除去切削液，并且將培養(yǎng)基添 加到所述切片達到界面水平(大約250 nl)。將無菌蒸餾水添加在探 頭周圍，以便增加濕度，并且防止MED探頭中的培養(yǎng)基過度干燥。然 后將MED探頭上的切片保存在處于34t:的C02培養(yǎng)箱中。所述培養(yǎng)基 每天更換1/2體積。
圖1A顯示在MED探頭上培養(yǎng)1周的海馬切片，以及電極的位置。 在實驗條件下，在MED探頭上培養(yǎng)的至少2周時間內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)顯著的 形態(tài)學改變。觀察到了細胞輕微至中度遷移出切片，通常是在14-20 天之后開始。在體外培養(yǎng)兩周之后，還出現(xiàn)了切片的某些變平，這不 會干擾誘發(fā)的場興奮性突觸后電位(fEPSP)記錄。
在體外培養(yǎng)的前七天，觀察到了 fEPSP幅度的某些增加；不過， 在7-10天之后，反應(yīng)穩(wěn)定化，并且在隨后的記錄時間內(nèi)保持穩(wěn)定。以 上結(jié)果與Muller等的發(fā)現(xiàn)吻合(Dev. Brain Res. ， 71: 93-100 (1993 ))。結(jié)果，本文所披露的所有實驗都是在MED探頭上培養(yǎng)切 片至少10天之后進行的。
實施例3 基線電生理學記錄
為了進行海馬樣本的基線電生理學記錄，將含有樣本的MED探頭 從培養(yǎng)箱中取出，并且放入溫度為3fC的較小的C02培養(yǎng)箱中，并且 與探頭的刺激/記錄部件連接。用無菌的人工腦脊液(ACSF )取代所述 培養(yǎng)基，所述人工腦脊液具有以下組成(單位為mM) : NaCl U24)， NaHCO3(26)，葡萄糖(I0) ， KC1(3) , NaH2PO(1.25) , CaCl2 ( 2 )， MgS04 (1),和HEPES (10)。
然后用多通道記錄系統(tǒng)(Panasonic, MED64系統(tǒng))以20 kHz的 取樣速率同時記錄所有64個部位的誘發(fā)場電位。將64個可利用的平 面微電極之一用于陰極刺激。然后產(chǎn)生雙極恒定電流脈沖(10-45 in A, 0.1 msec)。為了收集在場CA1中的典型反應(yīng)，選擇Schaffer并行(collateral)纖維中的電極之一作為刺激電極，而選擇輻射層中的 另一個作為記錄電極。以八階刺激強度(10-45 mA， 5mA的梯度)記 錄突觸反應(yīng)。在每一次記錄之后，用培養(yǎng)基更換ACSF，并且將探頭中 的樣本送回到C02培養(yǎng)箱中。使用脈沖間隔時間為50msec的成對脈沖刺激方法以20秒的間隔 記錄fEPSP。參見圖1B，通常觀察到了成對脈沖易化。所述反應(yīng)的斜 率和衰變時間明顯與使用相同的系統(tǒng)在快速制備的切片中記錄到的反 應(yīng)類似(圖2C)。不過，在所述培養(yǎng)條件下在刺激偽跡之后通常觀察 到延遲，這可能是由于在培養(yǎng)的切片中的軸突缺少髓鞘形成所致，正 如以前所報道的(Buchs等，Dev. Brain Res. ， 71: 81-91 ( 1993 ))。 為了更好地評估由測試化合物產(chǎn)生的效果，與包括測試化合物的 實驗平行地進行了對照(基線)實驗。在所有實驗中，將對照樣本的 fEPSP幅度視作由健康組織產(chǎn)生的幅度。將各種刺激電流(10-45 n A 范圍)用于獲得相應(yīng)的fEPSP (圖2A)。將在fEPSP峰值處測定的幅 度作為刺激電流的函數(shù)進行作圖，由此提供了輸入-輸出(I/O)曲線(圖2B)，該曲線同樣與在快速海馬切片中獲得的曲線非常類似(圖 2D)。實施例4 由NMDA和AMPA誘導的神經(jīng)變性 一般，培養(yǎng)慢性接觸NMDA或AMPA的海馬樣本，導致了突觸反應(yīng) 的劑量依賴型減弱。在圖3中示出了在培養(yǎng)之前以及在有NMDA(10ji M )或AMPA( 1 m M )的條件下培養(yǎng)不同時間之后典型的I/O關(guān)系和fEPSP 記錄。在有IO MM NMDA的條件下培養(yǎng)3小時時，突觸反應(yīng)的最大幅度 減弱到對照值的18±4%(n=3)，并且這種減弱在隨后的培養(yǎng)時間內(nèi) 不會顯著改變(圖3A，典型的記錄如圖3C所示)。在將1 AMPA施用三小時后，突觸反應(yīng)的減弱較小，并且，所 迷反應(yīng)在隨后的時間點繼續(xù)減弱，在l天之后穩(wěn)定(圖3B，典型的記
錄如圖3D所示)。通過向組織樣本添加各種濃度的NMDA和AMPA，進一步研究了造 成與這兩種興奮性毒素一起培養(yǎng)產(chǎn)生的突觸反應(yīng)幅度減弱的機制。與 對照實驗相似，將各自的I/O曲線的平臺值用于分析(圖4A和4B)。 用Hill函數(shù)擬合劑量反應(yīng)曲線產(chǎn)生的EC5。值，對于NMDA來說為5.2 ±0. 5pM,而對于AMPA來說為0. 81± 0. l|aM， Hill系數(shù)分別為1.7 ±0. 2和2. 6 ±0.8。為了進行比較，將用pi吸收方法獲得的劑量反 應(yīng)曲線在同一幅附圖中作圖(圖4A和4B，空心的圓環(huán)和虛線)。來 自PI吸收方法的ECs。值對于NMDA來說為21.6土3.4jaM，而對于AMPA 來說為3.87±0. 1jliM，而Hill系數(shù)分別為3.7土1.0和2. O土O. 1。通 過電生理學獲得的劑量反應(yīng)曲線向左側(cè)偏移，并且通常陡度比用PI 方法觀察到的陡度小(至少對于服DA來說)，表明了這兩種方法揭示 了通過NMDA和AMPA激活的不同的細胞機制。為了進一步解決這一問題，研究了在消除激動劑之后突觸反應(yīng)恢 復的時間進程。在有IOjjM nmda的條件下培養(yǎng)40分鐘、3小時、1 天和3天結(jié)束時，突觸反應(yīng)的幅度分別為對照值的48±12%、 22 ±7%、 13±3%和11±3% (n=3)。不過，如圖5所示，洗出NMDA1小時之后， 在相同條件下突觸反應(yīng)分別為最初幅度的109 ±4%、 66 ±5%、 52土2% 和18 ±3%，表明了突觸反應(yīng)實際上是逐漸減弱的，并且僅在用NMDA 持續(xù)處理3天之后才變得不可逆轉(zhuǎn)地減弱。用AMPA獲得了類似結(jié)果， 在有3pMAMPA的條件下培養(yǎng)40分鐘，導致了突觸反應(yīng)幅度大幅減弱 (為對照值的12±5%)，并且在消除AMPA 1小時之后，反應(yīng)恢復到 對照的93±2% (n-3);在有1 jaM AMPA的條件下培養(yǎng)3天，突觸反 應(yīng)幅度降低到46 土 4% (n-3)，并且即使在消除AMPA 24小時之后， 也觀察不到恢復(結(jié)果未顯示)。因此，在我們的實驗中，在較早時間點的突觸反應(yīng)的部分恢復表明了不可能只是由于神經(jīng)元變性造成了突觸傳遞的減弱。由于激動劑誘導的谷氨酸受體通道的開放和隨后的神經(jīng)元去極化，可能發(fā)生其他的突觸傳遞抑制作用。另外，該數(shù)據(jù)是有用的，因為它能夠確定可能
發(fā)生神經(jīng)元再生的窗口。實施例5 檢測神經(jīng)保護劑的方法 用于鑒定神經(jīng)保護劑的測定方法首先涉及通過比較以相同的刺 激強度刺激在實驗開始時測定的以及隨后測定的，例如，在至少3、 24、 48和72小時之后測定的fEPSP幅度來檢測記錄的穩(wěn)定性(圖1 C )。 為了進行數(shù)據(jù)分析，將1/0曲線的最大幅度值(平臺值)用于檢測記 錄的穩(wěn)定性。通常，它相當于用30-40jaA的刺激強度獲得的反應(yīng)(圖 2B)。從23個對照實驗中獲得的記錄表明，在慢性記錄3天之后fEPSP 的相對幅度為對照值的107±4%(n-23)，表明了在測定過程中幅度 的略微增加(體外培養(yǎng)10-13天(DIV)，數(shù)據(jù)未顯示)。對于較長的培養(yǎng)時間(即20天DIV)來說，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)幅度為對照 值的107 ±4% (n=2)。在一種樣本中，甚至在45 DIV之后仍然可以 記錄，不過幅度降低了大約50%。不過，在本研究中，所有結(jié)果是針 對培養(yǎng)時間不超過20天DIV的樣本提供的。實施例6 MK-801的神經(jīng)保護性作用 實施例6證實了 MK-801是神經(jīng)保護劑。選擇麗DA作為興奮性毒 素。根據(jù)上述劑量反應(yīng)分析(圖4A)，選擇IO uM服DA作為激動劑 濃度用于本神經(jīng)保護劑測定。由于我們對評估MK-801對慢性接觸NMDA 的神經(jīng)元樣本的神經(jīng)保護性作用感興趣，我們沒有分析在測定的前3 個小時獲得的結(jié)果(如果有的話)。按上述方法制備神經(jīng)元樣本和MED 探頭。在進行對照測定之后，在含有l(wèi)OiaM醒DA和1 pMMK-801的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)神經(jīng)元樣本不同的時間。在這些條件下，從培養(yǎng)3小時到3天突觸反應(yīng)只有很小的減弱(圖6A),表明了 1 jaM的MK-801幾乎 能完全保護突觸傳遞免受NMDA-介導的神經(jīng)毒性作用，這一結(jié)果與以
前使用不同的突觸損傷標記進行的研究吻合(Peterson等，1989; Pringle等；Kristensen等，2001 )。
在培養(yǎng)3天之后，在相當于 I/O曲線的平臺的刺激強度下測定的突觸反應(yīng)的相對幅度為對照的 91 ±6% (n-3)。另外，在只有1 jaM MK-801的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元樣本，在1天之 后導致了減弱的突觸反應(yīng)。有趣的是，在培養(yǎng)3小時之后，突觸反應(yīng) 不受影響(圖7A)。不過，在培養(yǎng)l、 2和3天之后，反應(yīng)幅度分別 降低到對照的83±6%， 79 ±11%，和76±10%(11=3)。這些幅度的減 弱與由lpMMK-801在有1QiaMNMDA的條件下產(chǎn)生的幅度的減弱沒有 顯著差別(圖6A)。實施例7 二甲金剛胺的神經(jīng)保護性作用 實施例7證實了二甲金剛胺是神經(jīng)保護劑。選擇NMDA作為興奮性 毒素。根據(jù)上述劑量反應(yīng)分析(圖4A)，選擇10jiM NMDA作為激動 劑濃度用于本神經(jīng)保護劑測定。由于我們對評估二甲金剛胺對慢性接 觸服DA的組織樣本的神經(jīng)保護性作用感興趣，我們沒有分析在測定的 前3個小時獲得的結(jié)果(如果有的話)。按上述方法制備神經(jīng)元樣本 和MED探頭。在進行對照測量之后，神經(jīng)元樣本在含有1QjuMNMDA和3G"M 二 甲金剛胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同的時間。參見圖6B，發(fā)現(xiàn)保護形式與 MK-801的保護方式比較相似，突觸反應(yīng)得到顯著保護長達3天培養(yǎng)時 間。不過，保護程度比由MK-801提供的保護程度低得多，在上述條件 下僅保持了原始幅度的78±5% (n-3)。使用IOMMNMDA和各種濃度 的二甲金剛胺研究了二甲金剛胺保護作用的濃度依賴性。用Hill公式 擬合劑量反應(yīng)曲線，并且提供了 6. 9土1.6juM的ICs。值，Hill系數(shù)為 1. 1±3，參見圖6C。與MK-801相反，在僅有二曱金剛胺條件下長時間培養(yǎng)神經(jīng)元樣
本，即使在30inM濃度下，也不會產(chǎn)生突觸傳遞的顯著減弱(圖7B)。實施例8 局部缺血誘導的神經(jīng)變性神經(jīng)元樣本的制備和基線電生理學記錄的測定分別如實施例2和 實施3所述進行。在記錄溶液中洗滌樣本，該溶液含有126niMNaCl、 3mMKCl、 1. 25 mM NaH2P04、 24 mM NaHC03、 1 mM MgS04、 10mMHEPES、 10 mM D-葡萄糖和2 mM CaCh。將pH調(diào)整到大約7. 3。然后將樣本 放入氣密性塑料室中，并且暴露于完全由氬組成的環(huán)境中。切片在該 室中培養(yǎng)大約60-90分鐘。然后按實施例4所述測定突觸傳遞。盡管本實施例使用完全由氬組成的環(huán)境來誘導組織缺血，但還可 以使用其他惰性氣體，如氪、氙和氡，或其他合適的不含氧氣的氣體。實施例9 氧化損傷誘導的神經(jīng)變性神經(jīng)元樣本的制備和基線電生理學記錄的測量是分別按照實施例 2和3所述進行的。然后將1 mM過氧化氫(H202 )添加到培養(yǎng)基中，濃度為大約25 laM-75"M。所述樣本與H202培養(yǎng)大約1小時。然后在24小時之后測 量突觸傳遞，與實施例4所述方案類似。本文所引用的所有文獻，專利和專利申請都以它們的全文形式收 作本文參考用于所有目的，以相同的程度使用，就如同每一份文獻， 專利或?qū)＠暾埍粚ｉT并且單獨地指明被收作本文參考一樣。盡管為 了清楚理解起見業(yè)已通過說明和舉例形式對上述發(fā)明進行了某種詳細 說明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本發(fā)明的教導之后可以方便地理解，在 不超出所附權(quán)利要求書的構(gòu)思或范圍的前提下可對其進行某些改進。
權(quán)利要求
1.一種用于體外檢測誘導神經(jīng)元之間的突觸傳遞改變或誘導神經(jīng)變性的化合物的方法，包括a)在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基片上提供具有多個微電極的裝置；b)使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接觸；c)測定所述神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞；d)使所述神經(jīng)元樣本與能在所述神經(jīng)元樣本中誘導氧化損傷的氧化性化合物接觸；e)在步驟(d)之后的一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本所產(chǎn)生的第一個突觸傳遞；和f)比較所產(chǎn)生的第一個突觸傳遞與基線突觸傳遞，其中，第一和基線突觸傳遞之間突觸傳遞的減弱表明所述氧化性化合物在神經(jīng)元樣本中誘導了神經(jīng)變性。
2. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述氧化性化合物包括過氧化氫。
3. 如權(quán)利要求l的方法，還包括以下步驟g) 使所述神經(jīng)元樣本與候選化合物接觸；h) 在步驟(g)之后的一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本所產(chǎn) 生的第二個突觸傳遞；i) 比較第二個產(chǎn)生的突觸傳遞與第一突觸傳遞，其中，第二和第 一突觸傳遞之間突觸傳遞的增強表明所述候選化合物保護神經(jīng)元樣本 免于神經(jīng)變性。
4. 如權(quán)利要求3的方法，其中，所述候選化合物包括谷氨酸受體 拮抗劑。
5. 如權(quán)利要求4的方法，其中，所述谷氨酸受體拮抗劑包括 MK-801。
6. 如權(quán)利要求4的方法，其中，所述谷氨酸受體拮抗劑包括二甲金剛胺。
7. 如權(quán)利要求3的方法，其中，所述候選化合物包括抗氧化劑。
8. 如權(quán)利要求7的方法，其中，所述抗氧化劑包括維生素E。
9. 如權(quán)利要求3的方法，其中，所迷氧化性化合物和候選化合物 同時接觸神經(jīng)元樣本。
10. 如權(quán)利要求3的方法，其中，所述氧化性化合物和候選化合物 依次接觸神經(jīng)元樣本。
11. 如權(quán)利要求1-10中任意一項的方法，其中， 一個或多個測定 步驟包括測定由神經(jīng)元樣本產(chǎn)生的電波形幅度。
12. —種用于體外檢測誘導神經(jīng)元之間的突觸傳遞改變或誘導神 經(jīng)變性的培養(yǎng)條件的方法，包括a) 在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上提供具有多個微電極的裝置，和提供第一種培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；b) 使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接觸；c) 測定所述神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞；d) 通過使所述神經(jīng)元樣本接觸局部缺血-誘導條件，改變所述第一 種培養(yǎng)條件，以產(chǎn)生第二種培養(yǎng)條件；e) 在步驟(d)之后的一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本的第 一突觸傳遞；和f) 比較第一突觸傳遞與基線突觸傳遞，其中，第一和基線突觸傳 遞之間突觸傳遞的減弱，表明所述第二種培養(yǎng)條件在所述神經(jīng)元樣本中誘導了神經(jīng)變性。
13. 如權(quán)利要求12的方法，其中，改變所述第一種培養(yǎng)條件的步驟包括使所述神經(jīng)元樣本接觸完全由惰性氣體組成的環(huán)境。
14. 如權(quán)利要求12的方法，其中，改變所述第一種培養(yǎng)條件的步驟包括使所述神經(jīng)元樣本接觸完全由氬組成的環(huán)境。
15. 如權(quán)利要求12的方法，還包括以下步驟g) 改變所述第二種培養(yǎng)條件；h) 在步驟(g)之后的一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本所產(chǎn) 生的第二個突觸傳遞； i)比較第二個產(chǎn)生的突觸傳遞與第一突觸傳遞，其中，在所述第 二和第一突觸傳遞之間突觸傳遞的增強，表明所述改變的第二種培養(yǎng)條 件保護神經(jīng)元樣本免于神經(jīng)變性。
16. 如權(quán)利要求12的方法，其中，所述第一和第二種培養(yǎng)條件是 同時改變的。
17. 如權(quán)利要求12的方法，其中，所述第一和第二種培養(yǎng)條件是 依次改變的。
18. 如權(quán)利要求12-17中任意一項的方法，其中， 一個或多個測定 步驟包括測定由神經(jīng)元樣本產(chǎn)生的電波形幅度。
19. 一種用于體外檢測誘導神經(jīng)元之間的突觸傳遞改變或誘導神 經(jīng)變性的培養(yǎng)條件的方法，包括a) 在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上提供具有多個微電極的裝置，和提供第一種培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；b) 使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接觸；c) 測定所述神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞；d) 通過使所述神經(jīng)元樣本接觸輻射，改變所述第一種培養(yǎng)條件， 以產(chǎn)生第二種培養(yǎng)條件；e) 在步驟(d)之后的一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本的第 一突觸傳遞；和f) 比較第一突觸傳遞與基線突觸傳遞，其中，在所述第一和基線 突觸傳遞之間突觸傳遞的減弱，表明所述第二種培養(yǎng)條件在所述神經(jīng)元 樣本中誘導了神經(jīng)變性。
20. —種用于體外檢測誘導神經(jīng)元之間的突觸傳遞改變或誘導神 經(jīng)變性的培養(yǎng)條件的方法，包括a) 在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上提供具有多個微電極的裝置，和提供第一種培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；b) 使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接觸；c) 測定所述神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞；d) 通過使所述神經(jīng)元樣本經(jīng)受溫度變化，改變所述第一種培養(yǎng)條 件，以產(chǎn)生第二種培養(yǎng)條件；e) 在步驟(d)之后的一個或多個時間點測定所述神經(jīng)元樣本的第 一突觸傳遞；和f) 比較所述第一突觸傳遞與基線突觸傳遞，其中，在所述第一和 基線突觸傳遞之間突觸傳遞的減弱，表明所述第二種培養(yǎng)條件在所迷神 經(jīng)元樣本中誘導了神經(jīng)變性。
21. —種用于在神經(jīng)元樣本中體外評估神經(jīng)元之間的突觸傳遞的 改變或神經(jīng)變性改變的系統(tǒng)，包括a) 在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上包括多個微電極的裝置，和提供培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；和b) 氧化性化合物源；其中，所述裝置被設(shè)計成使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接 觸，并且通過比較在所迷神經(jīng)元樣本接觸所述氧化性化合物之后的一個 或多個時間點神經(jīng)元樣本的突觸傳遞，評估突觸傳遞的變化。
22. 如權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中，所述氧化性化合物包括過氧化氫。
23. 如權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中，所述裝置適合在所述神經(jīng)元樣 本接觸氧化性化合物之前測定神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞。
24. —種用于在神經(jīng)元樣本中體外評估神經(jīng)元之間的突觸傳遞的 改變或神經(jīng)變性改變的系統(tǒng)，包括a) 在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上包括多個微電極的裝置；和b) 適合提供局部缺血-誘導培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；其中，所述裝置適合使所迷神經(jīng)元樣本與所迷多個微電極接觸，并 且通過比較在所述神經(jīng)元樣本接觸局部缺血-誘導培養(yǎng)條件之后的一個 或多個時間點神經(jīng)元樣本的突觸傳遞，評估突觸傳遞的變化。
25. 如權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中，所述神經(jīng)元樣本接觸完全由惰 性氣體組成的環(huán)境。
26. 如權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中，所述神經(jīng)元樣本接觸完全由氬 組成的環(huán)境。
27. 如權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中，所述神經(jīng)元樣本接觸無氧氣的 氣體。
28. 如權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中，所述裝置適合在所述神經(jīng)元樣 本接觸局部缺血-誘導培養(yǎng)條件之前測定神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞。
29. —種用于在神經(jīng)元樣本中體外評估神經(jīng)元之間的突觸傳遞的 改變或神經(jīng)變性改變的系統(tǒng)，包括a) 在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上包括多個微電極的裝置，和提供培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；和b) 輻射源；其中，所述裝置適合使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接觸，并 且通過比較在所述神經(jīng)元樣本接觸輻射之后的一個或多個時間點所述 神經(jīng)元樣本的突觸傳遞，評估神經(jīng)元損傷。
30. 如權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其中，所述裝置適合在所迷神經(jīng)元樣 本接觸輻射之前測定神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞。
31. —種用于在神經(jīng)元樣本中體外評估神經(jīng)元之間的突觸傳遞的 改變或神經(jīng)變性改變的系統(tǒng)，包括a) 在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上包括多個微電極的裝置；和b) 培養(yǎng)室，適合通過誘導培養(yǎng)室中的溫度變化改變培養(yǎng)條件； 其中，所述裝置適合使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接觸，并且在所述神經(jīng)元樣本遭受溫度變化之后的一個或多個時間點通過比較 神經(jīng)元樣本的突觸傳遞，評估神經(jīng)元損傷。
32. 如權(quán)利要求31的系統(tǒng)，其中，所述裝置適合在所述神經(jīng)元樣 本遭受溫度變化之前測定神經(jīng)元樣本的基線突觸傳遞。
33. —種用于在神經(jīng)元樣本中體外評估神經(jīng)元之間的突觸傳遞的 改變或神經(jīng)變性改變的系統(tǒng)，包括a)在被設(shè)計成接觸神經(jīng)元樣本并且對神經(jīng)元樣本施加電刺激的基 片上包括多個微電極的裝置，和提供培養(yǎng)條件的培養(yǎng)室；和 b)適合防止對神經(jīng)元樣本的氧化損傷的化合物源；其中，所述裝置適合使所述神經(jīng)元樣本與所述多個微電極接觸，并養(yǎng)條件之后的一個或多個時間點神經(jīng)元樣本的突觸傳遞，評估突觸傳遞 的變化。
34. 如權(quán)利要求33的系統(tǒng)，其中，所述化合物包括抗氧化劑。
35. 如權(quán)利要求33的系統(tǒng)，其中，所述抗氧化劑包括維生素E。
36. 如權(quán)利要求33的系統(tǒng)，其中，所述裝置還適合使所述神經(jīng)元 樣本與氧化性化合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于體外評估神經(jīng)元變性的系統(tǒng)和方法。在有能夠誘導或防止神經(jīng)元損傷的各種化合物和培養(yǎng)條件下，將多電極探頭用于神經(jīng)元樣本的培養(yǎng)和突觸傳遞測定。
文檔編號C12Q1/00GK101128734SQ200480030146
公開日2008年2月20日 申請日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日
發(fā)明者M·克勞斯, V·潘奇恩克, 下野健, 竹谷誠 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社