專利名稱：新型橋石短小芽孢桿菌和使用該微生物作為宿主生產(chǎn)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)。更具體地說，本發(fā)明涉及其胞外和胞內(nèi)蛋白水解活性已極度降低且不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌。本發(fā)明還涉及使用橋石短小芽孢桿菌作為宿主通過基因重組生產(chǎn)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
基因重組使得能夠使用細(xì)菌或動(dòng)物細(xì)胞作為宿主，大量生產(chǎn)迄今為止由于在活體內(nèi)僅以少量存在而非常難以利用并因此難以分離的蛋白，以及具有任何所需氨基酸序列的多肽。各種細(xì)菌都可用作供通過基因重組進(jìn)行的蛋白生產(chǎn)用的宿主，最廣泛使用的是大腸桿菌。但是，在使用大腸桿菌作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)中，由于生產(chǎn)的蛋白積聚在細(xì)胞中，所以細(xì)胞體積是所生產(chǎn)蛋白的最高限度，因此難以大量生產(chǎn)蛋白。而且，存在的其它問題是為了收集積聚在細(xì)胞中的蛋白，必須破碎大腸桿菌細(xì)胞，由破碎的大腸桿菌細(xì)胞所含有的細(xì)胞來源組分、核酸、目標(biāo)蛋白以外的其它蛋白以及細(xì)胞壁來源的內(nèi)毒素中分離和回收目標(biāo)蛋白的操作很繁復(fù)。
為解決大腸桿菌系統(tǒng)的問題，業(yè)已開發(fā)了其中使用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌是能夠分泌和生產(chǎn)蛋白的典型細(xì)菌。在枯草芽孢桿菌用作宿主的生產(chǎn)系統(tǒng)中，所產(chǎn)生的重組蛋白被分泌和生產(chǎn)在培養(yǎng)基中。因此，枯草芽孢桿菌系統(tǒng)具有大腸桿菌系統(tǒng)不具備的某些優(yōu)良特性，即前者不需要為了蛋白回收而破碎細(xì)胞，且前者幾乎不產(chǎn)生內(nèi)毒素。
但是，另一方面，枯草芽孢桿菌具有胞外分泌大量蛋白酶的特性，因此，其存在的嚴(yán)重問題是所分泌和生產(chǎn)的重組蛋白被蛋白酶降解，重組蛋白的產(chǎn)量極低。因此，迄今已進(jìn)行了各種努力來減少枯草芽孢桿菌中蛋白酶的產(chǎn)生。但是，盡管如此，迄今為止已知使用以枯草芽孢桿菌作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白的實(shí)例很少。
另一方面，為解決枯草芽孢桿菌系統(tǒng)的問題，業(yè)已開發(fā)了其中使用能夠胞外分泌和生產(chǎn)重組蛋白但胞外不分泌蛋白酶的細(xì)菌作為宿主的新重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。結(jié)果，成功開發(fā)了使用短芽孢桿菌(Bacillus brevis)如短芽孢桿菌47(專利文獻(xiàn)1)作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述短芽孢桿菌表現(xiàn)出的蛋白分泌生產(chǎn)能力優(yōu)于枯草芽孢桿菌。
目前，基于16SrRNA基因的堿基序列對(duì)短芽孢桿菌進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果將其重新分類為短小芽孢桿菌屬(Brevibacillus)細(xì)菌，包括橋石短小芽孢桿菌、短短小芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)(非專利文獻(xiàn)1)。
但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，短芽孢桿菌47具有弱胞外蛋白水解活性。一般認(rèn)為用短短小芽孢桿菌作為宿主生產(chǎn)重組蛋白所耗費(fèi)的時(shí)間周期較長(一般約3天)。因此，即使短芽孢桿菌細(xì)胞的胞外蛋白水解活性弱，所生產(chǎn)的重組蛋白也可能遭到胞外蛋白水解活性的降解，重組蛋白的產(chǎn)量可能下降。為解決此問題，迄今已進(jìn)行了各種努力，以進(jìn)一步降低短芽孢桿菌的胞外蛋白水解活性。
例如，大范圍篩選短芽孢桿菌菌株，作為具有極低胞外蛋白水解活性并具有優(yōu)良蛋白分泌生產(chǎn)能力的菌株，已分離出橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERM BP-1087)(與FERM BP-6863短芽孢桿菌H102為相同菌株)(專利文獻(xiàn)2)及其突變菌株橋石短小芽孢桿菌HPD31-S5(FERM BP-6623，該菌株以短小芽孢桿菌HPD31-S5的名稱保藏)。這些菌株業(yè)已作為宿主用于生產(chǎn)各種重組蛋白，例如人表皮生長因子(hEGF)。例如，非專利文獻(xiàn)2(其中，橋石短小芽孢桿菌HPD31描述為短芽孢桿菌HPD31)等披露了用橋石短小芽孢桿菌HPD31生產(chǎn)hEGF。
但是，即使是這些橋石短小芽孢桿菌HPD31和HPD31-S5，在以高靈敏蛋白水解活性檢測(cè)法分析時(shí)，也表現(xiàn)出胞外蛋白水解活性。例如，通過檢測(cè)其蛋白水解活性的明膠-PAGE(酶圖)分析橋石短小芽孢桿菌HPD-31的培養(yǎng)物上清液，產(chǎn)生圖2的明膠分解條帶。
另一方面，公開了基本不表現(xiàn)出蛋白酶活性(蛋白水解活性)的短芽孢桿菌31-OK，其被稱為短芽孢桿菌突變株(專利文獻(xiàn)3)。但是，即便是短芽孢桿菌31-OK，在按照明膠PAGE法評(píng)價(jià)其蛋白水解活性的實(shí)驗(yàn)中，也產(chǎn)生了表明其蛋白水解活性的條帶，其并沒有完全失去胞外蛋白水解活性。而且，根本沒有完成該菌株胞外蛋白水解活性的基因水平分析。具體地說，未分離出蛋白酶，更不必說，不僅沒有對(duì)其基因進(jìn)行測(cè)序，而且甚至沒有進(jìn)行其克隆。
因此，即便是對(duì)于使用據(jù)說已降低其胞外蛋白水解活性的菌株的情況，分泌和生產(chǎn)的蛋白被菌株仍具有的胞外蛋白水解活性降解并因此降低蛋白產(chǎn)量的可能性依然存在。
這些橋石短小芽孢桿菌(或短芽孢桿菌)菌株通過篩選或用誘變劑處理而突變或其它方法獲得，而非通過鑒別基因組上的蛋白酶基因接著使基因失活而獲得。因此，迄今無人知曉其蛋白水解活性已通過鑒別基因組上的蛋白酶基因進(jìn)而使基因失活而被降低的橋石短小芽孢桿菌。
前述橋石短小芽孢桿菌蛋白水解活性的降低全部是針對(duì)其胞外蛋白水解活性的降低，尚未關(guān)注菌株胞內(nèi)蛋白水解活性的降低。但是，在使用橋石短小芽孢桿菌作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)中，存在的一種情況是根據(jù)目標(biāo)蛋白的類型，不可能分泌生產(chǎn)，但可胞內(nèi)積聚生產(chǎn)。在這種情況下，由于胞內(nèi)蛋白酶的作用，所生產(chǎn)的蛋白可能被降解，結(jié)果幾乎未獲得重組蛋白。
已知橋石短小芽孢桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可部分地經(jīng)歷溶菌作用，結(jié)果，含胞內(nèi)蛋白酶的胞內(nèi)蛋白可能溶出到培養(yǎng)基中。因此，存在一種可能性即使是胞外分泌和生產(chǎn)的重組蛋白，也可能被溶解的胞內(nèi)蛋白酶降解。
因此，降低胞內(nèi)蛋白水解活性也是要解決的另外一個(gè)問題，以進(jìn)一步增加橋石短小芽孢桿菌作為宿主在基因重組中的實(shí)用性。
迄今為止，已知沒有降低橋石短小芽孢桿菌胞內(nèi)蛋白水解活性的實(shí)例。
另外，根本沒有在基因水平上對(duì)橋石短小芽孢桿菌的胞內(nèi)蛋白水解活性進(jìn)行分析。具體地說，已知沒有分離橋石短小芽孢桿菌胞內(nèi)蛋白酶的實(shí)例。另外，還已知沒有克隆胞內(nèi)蛋白酶基因的實(shí)例和沒有測(cè)定其序列的實(shí)例。
而且，為進(jìn)一步擴(kuò)展橋石短小芽孢桿菌作為宿主在基因重組中的工業(yè)應(yīng)用性，除降低菌株的蛋白水解活性以外，還要解決另一個(gè)問題。
同芽孢桿菌屬細(xì)菌如枯草芽孢桿菌一樣，橋石短小芽孢桿菌可形成孢子。與活細(xì)胞(無孢子細(xì)胞)相比，孢子具有高抗熱性，因此需要極為嚴(yán)格的滅菌條件。因此，在需要培養(yǎng)結(jié)束后保證徹底滅菌并去除生產(chǎn)管路中的含孢子細(xì)胞的重組蛋白藥物生產(chǎn)中，必需難度極大的技術(shù)來使用橋石短小芽孢桿菌作為宿主生產(chǎn)重組蛋白。
因此，為了使在廣泛范圍的工業(yè)應(yīng)用如重組蛋白藥物生產(chǎn)中使用橋石短小芽孢桿菌作為重組宿主成為可能，需要不形成孢子并可在甚至溫和滅菌條件(60℃-100℃)下被完全殺滅的橋石短小芽孢桿菌菌株。
滅菌橋石短小芽孢桿菌孢子所需的條件比滅菌枯草芽孢桿菌孢子所需的條件溫和得多。例如，一般認(rèn)為枯草芽孢桿菌孢子于100℃的D值(在不同的溫度范圍內(nèi)將包括活細(xì)胞(無孢子細(xì)胞)和孢子在內(nèi)的全部細(xì)胞數(shù)減少至1/10所花費(fèi)的時(shí)間)約為11分鐘，但根據(jù)菌株類型有所變化。另一方面，橋石短小芽孢桿菌孢子的D值至多為1分鐘。但是，與滅菌其活細(xì)胞(無孢子細(xì)胞)相比，滅菌橋石短小芽孢桿菌孢子需要極為嚴(yán)格的條件。例如，如下文給出的實(shí)施例所證實(shí)，橋石短小芽孢桿菌活細(xì)胞(無孢子細(xì)胞)于80℃的D值少于1分鐘，但其孢子的D值約為67分鐘。
枯草芽孢桿菌SMS275被披露為枯草芽孢桿菌無孢子菌株(專利文獻(xiàn)4JP-A 4-287686(1992))。但是，迄今為止尚不知曉任何不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌菌株，或換句話說，還不知道任何能夠在溫和滅菌條件下被完全殺滅的橋石短小芽孢桿菌菌株。
專利文獻(xiàn)1JP-A 60-58074(1985)非專利文獻(xiàn)1Int.J.Syst.Bacteriol.，46，939-946(1996)專利文獻(xiàn)2JP-A 63-56277(1988)非專利文獻(xiàn)2Ann.NY Acad.Sci.，782，115-122(1996)專利文獻(xiàn)3JP-A 6-296845(1994)專利文獻(xiàn)4JP-A 4-287686(1992)本發(fā)明所要解決的課題如上所述，橋石短小芽孢桿菌作為基因重組宿主具有極佳的特性，但為了進(jìn)一步增加該菌株作為基因重組宿主的工業(yè)應(yīng)用性，有一些問題有待解決。
一個(gè)課題是獲得其胞外蛋白水解活性比已知菌株顯著降低的橋石短小芽孢桿菌。另一個(gè)課題是獲得其胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株顯著降低的橋石短小芽孢桿菌。再另一個(gè)課題是獲得不形成孢子且可在溫和滅菌條件下被完全殺滅的橋石短小芽孢桿菌。
因此，本發(fā)明提供其胞外蛋白水解活性比已知菌株顯著降低并因此提升了其重組蛋白分泌生產(chǎn)效率的橋石短小芽孢桿菌；其胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株顯著降低并因此提升了其重組蛋白胞內(nèi)積聚生產(chǎn)效率的橋石短小芽孢桿菌；不能形成孢子并因此在溫和滅菌條件下被完全殺滅的橋石短小芽孢桿菌；以及其胞外和胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株顯著降低并因此提升了其重組蛋白生產(chǎn)效率、不能形成孢子并因此在溫和滅菌條件下被完全殺滅的橋石短小芽孢桿菌。本文提到的用語“胞外和胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株顯著降低”意指包括活性完全喪失的情況。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供使用橋石短小芽孢桿菌作為宿主通過基因重組生產(chǎn)蛋白的方法。
解決問題的方法我們，本發(fā)明的發(fā)明人，嘗試通過用誘變劑處理親代菌株橋石短小芽孢桿菌HPD31(此前其作為宿主在重組蛋白生產(chǎn)中產(chǎn)生了一些成效)獲得突變體，以獲得不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌。
首先，在菌落形態(tài)學(xué)改變作為其指標(biāo)的基礎(chǔ)上選擇突變菌株，具體地說，選擇那些就其菌落形態(tài)學(xué)而言形成與普通橋石短小芽孢桿菌不同的無皺菌落的橋石短小芽孢桿菌。再通過顯微鏡觀察由這些菌株中選擇無孢子形成的菌株，作為可能不能形成孢子的菌株。再進(jìn)一步，測(cè)試可能不具備孢子形成能力的菌株的孢子形成的情況，選擇不具備孢子形成能力的菌株。接著，再測(cè)試菌株用作宿主的重組蛋白生產(chǎn)能力，選擇那些重組蛋白生產(chǎn)能力和已知在基因重組中用作宿主的菌株橋石短小芽孢桿菌HPD31水平相同的菌株。按照該方法，我們，本發(fā)明的發(fā)明人，獲得了不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌。
為了獲得其胞外和胞內(nèi)蛋白酶活性比已知菌株大為降低的橋石短小芽孢桿菌菌株，我們，本發(fā)明的發(fā)明人，使用上述不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌作為親代菌株，并失活了胞外和胞內(nèi)主蛋白酶基因。首先，具體地說，為了鑒別所要失活的蛋白酶基因，我們嘗試克隆蛋白酶基因。結(jié)果，我們成功克隆了兩種新蛋白酶的基因，或更確切地說，是胞內(nèi)主蛋白酶IMP和胞外主蛋白酶EMP的基因，并進(jìn)一步構(gòu)建了其中所述基因失活的橋石短小芽孢桿菌。
我們，本發(fā)明的發(fā)明人，按照類似于已知的同源重組的方法對(duì)橋石短小芽孢桿菌基因組上的特定蛋白酶基因進(jìn)行失活，但在該方法中，在每個(gè)基因失活中標(biāo)記基因如藥物抗性基因都保留基因組上，這將在下文提及。因此，為使多個(gè)基因失活，每個(gè)基因失活時(shí)基因組中的標(biāo)記基因如藥物抗性基因必須缺失。為去除標(biāo)記基因，我們利用含F(xiàn)RT序列和酵母源Flp重組酶基因的系統(tǒng)。此外，在該方法中，我們新構(gòu)建了具有Flp重組酶基因并能夠容易地由在不含新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的橋石短小芽孢桿菌細(xì)胞中去除的質(zhì)粒DNA，并使用該質(zhì)粒DNA，如下文給出的實(shí)施例所述。通過去除已導(dǎo)入細(xì)胞中并留在基因組上的標(biāo)記基因，接著在無新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，可容易地去除細(xì)胞中的質(zhì)粒。使用該質(zhì)粒使多個(gè)基因失活成為可能。
此外，我們，本發(fā)明的發(fā)明人，測(cè)試了由此獲得的其胞外和胞內(nèi)主蛋白酶基因已失活的橋石短小芽孢桿菌菌株的孢子形成能力和蛋白水解活性。結(jié)果，我們證實(shí)該菌株不具備孢子形成能力，菌株的胞外和胞內(nèi)蛋白水解活性與已知菌株橋石短小芽孢桿菌HPD31相比顯著降低。
此外，我們?cè)谕ㄟ^同源重組進(jìn)行的蛋白生產(chǎn)中使用該橋石短小芽孢桿菌菌株作為宿主，生產(chǎn)了在任何其它已知橋石短小芽孢桿菌用作宿主的情況下其分泌和生產(chǎn)后被證實(shí)降解的蛋白。結(jié)果，我們證實(shí)，蛋白的積聚量與已知菌株橋石短小芽孢桿菌HPD31用作宿主的情況相比增加，并完成了本發(fā)明。
如上所述，本發(fā)明提供其胞外蛋白水解活性比已知菌株顯著降低并因此提升了其重組蛋白分泌生產(chǎn)效率的橋石短小芽孢桿菌；其胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株顯著降低并因此提升了其重組蛋白胞內(nèi)積聚生產(chǎn)效率的橋石短小芽孢桿菌；以及不能形成孢子并因此在溫和滅菌條件下被完全殺滅的橋石短小芽孢桿菌。本發(fā)明進(jìn)一步提供其胞外和胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株顯著降低并因此提升了其重組蛋白生產(chǎn)效率、不能形成孢子并因此在溫和滅菌條件下被完全殺滅的橋石短小芽孢桿菌。
再進(jìn)一步，本發(fā)明提供使用所述橋石短小芽孢桿菌作為宿主通過基因重組生產(chǎn)蛋白的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1其圖示了通過同源重組失活基因的概述，用于構(gòu)建本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌。
圖2其圖示了通過明膠-PAGE(酶圖)檢測(cè)橋石短小芽孢桿菌HPD31(泳道1)和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3(泳道2)的每種培養(yǎng)上清液組分的蛋白酶活性的結(jié)果。在空白框中顯示了蛋白酶活性分解明膠產(chǎn)生的清晰條帶。
圖3其圖示了在非變性條件下通過明膠-PAGE(酶圖)檢測(cè)橋石短小芽孢桿菌HPD31(泳道1)和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3(泳道2)的每種胞內(nèi)組分的蛋白酶活性的結(jié)果。在空白框中顯示了蛋白酶活性分解明膠產(chǎn)生的清晰條帶。
圖4其圖示了使用橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主通過基因重組分泌和生產(chǎn)的豬IL-1β的CBB染色結(jié)果，并圖示了豬IL-1β的分泌生產(chǎn)和降解。泳道1表示基因重組體橋石短小芽孢桿菌HPD31/pNY301-pIL-1β，泳道2表示基因重組體橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3/pNY301-pIL-1β。
圖5其圖示了用抗豬IL-1β抗體對(duì)使用橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主通過基因重組分泌和生產(chǎn)的豬IL-1β的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，并圖示了豬IL-1β的分泌生產(chǎn)和降解。泳道1表示基因重組體橋石短小芽孢桿菌HPD31/pNY301-pIL-1β，泳道2表示基因重組體橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3/pNY301-pIL-1β。
圖6其圖示了用抗豬IFN-γ抗體對(duì)使用橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主通過基因重組胞內(nèi)積聚和生產(chǎn)的豬IFN-γ的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，并圖示了豬IL-1γ的胞內(nèi)積聚生產(chǎn)和降解。泳道1表示基因重組體橋石短小芽孢桿菌HPD31/pNY301；泳道2表示基因重組體橋石短小芽孢桿菌HPD31/pNY301-pINF-γ；泳道3表示基因重組體橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3/pNY301-pIFN-γ。
圖7其顯示了與孢子形成相關(guān)的基因hos的DNA堿基序列(上行)，以及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(下行)。
圖8其為圖7的延續(xù)。
圖9其顯示了胞外蛋白酶EMP的氨基酸序列(下行)以及編碼其的基因emp的DNA序列(上行)。
圖10其是圖9的延續(xù)。
圖11其是圖10的延續(xù)。
圖12其顯示了胞內(nèi)蛋白酶IMP的氨基酸序列(下行)以及編碼其的基因imp的DNA序列(上行)。
圖13
其是圖12的延續(xù)。
圖14其顯示了引物Hos P1、Hos P2、Hos P3和Hos P4。
圖15其顯示了引物imp P1和imp P2。
圖16其顯示了引物flp P1。
圖17其顯示了引物flp P2。
圖18其顯示了引物flp P3。
圖19其顯示了引物flp P4。
圖20其顯示了引物flp P5。
圖21其顯示了引物flp P6。
圖22其顯示了引物flp P7。
圖23其顯示了引物flp P8。
圖24其顯示了引物emp P1和emp P2的堿基序列和氨基酸序列數(shù)據(jù)。
圖25其顯示了引物emp P3和emp P4，以及接頭引物。
圖26其顯示了實(shí)施例19中的有義引物。
圖27
其顯示了實(shí)施例19中的反義引物。
圖28其顯示了實(shí)施例20中的有義引物。
圖29其顯示了實(shí)施例20中的反義引物。
圖30其顯示了實(shí)施例21中的有義引物。
圖31其顯示了實(shí)施例21中的反義引物。
圖32其顯示了實(shí)施例23中的有義引物。
圖33其顯示了實(shí)施例23中的反義引物。
圖34其顯示了實(shí)施例24中的有義引物。
圖35其顯示了實(shí)施例24中的反義引物。
圖36其顯示了實(shí)施例25中的有義引物。
圖37其顯示了實(shí)施例25中的反義引物。
下文詳述本發(fā)明。
本發(fā)明包括以下的(1)-(16)作為其實(shí)施方案。
(1)不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌。
(2)具有以下菌學(xué)特征且不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌(a)形態(tài)學(xué)細(xì)胞大小
液體培養(yǎng)基0.4-0.6×1.5-4μm，細(xì)胞類型芽孢桿菌有無孢子無(b)生理學(xué)特性硝酸鹽還原-，VP實(shí)驗(yàn)-，檸檬酸利用+，脲酶 -，氧化酶+，過氧化氫酶+，(c)其它特性耐溫性于60℃死亡。
(3)不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌，其特征在于其與孢子形成相關(guān)的基因hos失活。
(4)權(quán)利要求3的橋石短小芽孢桿菌，其中與孢子形成相關(guān)的基因hos具有SEQ ID NO1的堿基序列。
(5)不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌，其胞外和/或胞內(nèi)蛋白酶活性已降低或消失。
(6)具有以下菌學(xué)特性且不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌(a)形態(tài)學(xué)細(xì)胞大小液體培養(yǎng)基0.4-0.6×1.5-4μm，細(xì)胞類型芽孢桿菌有無孢子無(b)生理學(xué)特性硝酸鹽還原-，VP實(shí)驗(yàn)-，檸檬酸利用+，
脲酶-，氧化酶 +，過氧化氫酶 +，(c)其它特性耐溫性于60℃死亡。
胞外蛋白酶活性低或沒有，胞內(nèi)蛋白酶活性低或沒有。
(7)特征在于其胞外主蛋白酶基因emp失活的橋石短小芽孢桿菌。
(8)權(quán)利要求7的橋石短小芽孢桿菌，其中胞外主蛋白酶基因emp具有SEQ ID NO3的堿基序列。
(9)特征在于其胞內(nèi)主蛋白酶基因imp失活的橋石短小芽孢桿菌。
(10)以上(9)的橋石短小芽孢桿菌，其中胞內(nèi)主蛋白酶基因imp具有SEQ ID NO5的堿基序列。
(11)特征在于其胞外主蛋白酶基因emp和胞內(nèi)主蛋白酶基因imp失活的橋石短小芽孢桿菌。
(12)以上(11)的橋石短小芽孢桿菌，其不形成孢子。
(13)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3(FERM BP-08479)。
(14)通過用其中插入蛋白編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化以上(1)-(13)任一項(xiàng)的橋石短小芽孢桿菌而構(gòu)建的橋石短小芽孢桿菌。
(15)一種生產(chǎn)蛋白的方法，其特征在于包括培養(yǎng)以上(14)的橋石短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的步驟。
(16)一種生產(chǎn)重組蛋白的方法，其特征在于在重組蛋白生產(chǎn)中使用以上(1)-(13)任一項(xiàng)的橋石短小芽孢桿菌作為宿主。
通過用誘變劑使親代菌株橋石短小芽孢桿菌突變，接著由突變所獲得的突變體中選擇不具備孢子形成能力的菌株，獲得了本發(fā)明的不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌。在以下給出的實(shí)施例中，使用亞硝基胍作為誘變劑，但亞硝酸或甲磺酸乙酯也可用作誘變劑。另外，也可用UV射線和γ射線。用于獲得本發(fā)明的不具備孢子形成能力的突變體的親代菌株沒有特別限定，只要其是屬于橋石短小芽孢桿菌屬的菌株，但特別優(yōu)選在通過基因重組進(jìn)行的蛋白生產(chǎn)中用作宿主已產(chǎn)生某些成效的橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERMBP-1087)或其突變體橋石短小芽孢桿菌HPD31-S5(FERM BP-6623)?？赏ㄟ^耐熱性實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)突變體的D值，證實(shí)通過突變獲得的突變體有無孢子形成能力。D值指在每個(gè)溫度范圍內(nèi)將包括活細(xì)胞(無孢子細(xì)胞)和孢子在內(nèi)的所有細(xì)胞的數(shù)量降低至1/10所花費(fèi)的時(shí)間，其可用作細(xì)胞死亡率的指標(biāo)。
使用基因組文庫分析本發(fā)明提供的不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌菌株，結(jié)果證實(shí)了該菌株中推定與孢子形成相關(guān)的基因失活。失活的基因命名為hos。作為與孢子形成相關(guān)的基因hos的DNA序列的實(shí)例，橋石短小芽孢桿菌HPD31的DNA堿基序列如SEQID NO1(圖7和圖8中的上行)所示，對(duì)應(yīng)于該DNA堿基序列的氨基酸序列如SEQ ID NO2(圖7和圖8中的下行)所示。
可通過使橋石短小芽孢桿菌基因組上的胞外和胞內(nèi)主蛋白酶基因失活，獲得其胞外和胞內(nèi)蛋白水解活性已顯著降低的本發(fā)明橋石短小芽孢桿菌。為獲得其蛋白水解活性已顯著降低的本發(fā)明橋石短小芽孢桿菌，橋石短小芽孢桿菌基因組上的蛋白酶基因沒有特別限定，但優(yōu)選胞內(nèi)主蛋白酶基因imp和胞外主蛋白酶基因emp中的任一種。
作為胞外主蛋白酶基因emp的DNA序列的實(shí)例，橋石短小芽孢桿菌HPD31的emp基因的DNA堿基序列如SEQ IDNO3(圖9-11中的上行)所示；而對(duì)應(yīng)于該DNA序列的橋石短小芽孢桿菌HPD31胞外主蛋白酶EMP的氨基酸序列如SEQ ID NO4(圖9-11中的下行)所示。
作為胞內(nèi)主蛋白酶基因imp的DNA序列的實(shí)例，橋石短小芽孢桿菌HPD31的imp基因的DNA堿基序列如SEQ ID NO5(圖12-13中的上行)所示；而對(duì)應(yīng)于該DNA序列的橋石短小芽孢桿菌HPD31胞內(nèi)主蛋白酶IMP的氨基酸序列如SEQ ID NO6(圖12-13中的下行)所示。EMP和IMP都是新蛋白，其與任一種已知蛋白的氫基酸序列至少缺少40％的同源性。
通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ ID NO4的氨基酸序列修飾獲得其氨基酸序列的所有蛋白都落入蛋白酶EMP的范圍內(nèi)，只要其具有蛋白水解活性。本文提到的“通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸修飾的氨基酸序列”意指與SEQ IDNO4全長氨基酸序列的同源性至少為60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％的修飾氨基酸序列，盡管根據(jù)氨基酸殘基的類型和氨基酸殘基在蛋白立體結(jié)構(gòu)中的位置而有所變化。
同樣，通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ IDNO6的氨基酸序列修飾獲得其氨基酸序列的所有蛋白都落入蛋白酶IMP的范圍內(nèi)，只要其具有蛋白水解活性。本文提到的“通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸修飾的氨基酸序列”意指與SEQID NO6全長氨基酸序列的同源性至少為50％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％的修飾氨基酸序列，盡管根據(jù)氨基酸殘基的類型和氨基酸殘基在蛋白立體結(jié)構(gòu)中的位置而有所變化。
再同樣，通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ IDNO4的氨基酸序列修飾獲得其氨基酸序列的蛋白的所有編碼基因都落入蛋白酶基因emp(SEQ ID NO3)的范圍內(nèi)，只要其編碼的蛋白具有蛋白水解活性。本文提到的“通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸修飾的氨基酸序列”和上文針對(duì)EMP提及的內(nèi)容具有相同含義。
再同樣，通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ IDNO6的氨基酸序列修飾獲得其氨基酸序列的蛋白的所有編碼基因都落入蛋白酶基因imp(SEQ ID NO5)的范圍內(nèi)，只要其編碼的蛋白具有蛋白水解活性。本文提到的“通過部分置換、缺失、插入或添加某些氨基酸修飾的氫基酸序列”和上文針對(duì)IMP提及的內(nèi)容具有相同含義。迄今為止emp基因和imp基因都沒有分離出來，其DNA序列還沒有確定，兩個(gè)基因都是本領(lǐng)域迄今未知的新基因。
可通過適當(dāng)選擇和組合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和描述于MolecularCloning，2nd Ed.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1989)的標(biāo)準(zhǔn)基因重組技術(shù)，對(duì)橋石短小芽孢桿菌基因組上的胞內(nèi)主蛋白酶基因imp和胞外主蛋白酶基因emp進(jìn)行克隆。例如，制備橋石短小芽孢桿菌的基因組DNA文庫，用基因組DNA文庫，以具有部分待失活基因之編碼DNA序列的DNA片段作為探針進(jìn)行雜交，或用該DNA片段作為引物進(jìn)行PCR。
可按照類似于已知的同源重組的方法對(duì)橋石短小芽孢桿菌基因組上的imp基因或emp基因進(jìn)行失活。例如，可按照下文述及的方法實(shí)施imp基因失活。
首先，用在橋石短小芽孢桿菌中不可復(fù)制的載體，例如用在大腸桿菌中可復(fù)制的載體，克隆含imp基因的DNA片段，籍此用含在其兩側(cè)具有FRT序列(Gene，212，77-86(1998))的藥物抗性基因(例如新霉素抗性基因)的DNA片段置換imp基因的部分區(qū)域，由此切割imp基因。結(jié)果，獲得含失活imp基因的載體，其中imp基因部分地由新霉素抗性基因置換，并因此被失活。此外，將第二個(gè)藥物抗性基因(例如紅霉素抗性基因)插入到載體中，以便選擇上述失活imp基因插入到其基因組DNA中的橋石短小芽孢桿菌，由此構(gòu)建imp基因失活用的載體。
接著，將imp基因失活載體導(dǎo)入到橋石短小芽孢桿菌中，并選擇顯示新霉素抗性的菌株。imp基因失活載體的導(dǎo)入在某些橋石短小芽孢桿菌細(xì)胞中誘導(dǎo)基因組上的imp基因和imp基因失活載體上的失活imp基因之間的同源重組。結(jié)果，新霉素抗性菌株包括僅在新霉素抗性基因-FRT盒上游的imp部分發(fā)生同源重組的菌株；僅在其下游的imp部分發(fā)生同源重組的菌株；以及在其上游和下游兩個(gè)部分發(fā)生同源重組的菌株(雙雜交菌株)。
其中基因組上的imp基因已失活的目標(biāo)菌株是雙雜交菌株，其對(duì)紅霉素敏感。因此，將這些新霉素抗性菌株再在含紅霉素的TM-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇紅霉素敏感菌株。該方法獲得了其中基因組上的imp基因已失活的目標(biāo)橋石短小芽孢桿菌菌株。
在以上獲得的橋石短小芽孢桿菌菌株中的imp基因失活可通過PCR和基因組DNA印跡分析證實(shí)。
此外，從以上獲得的imp基因失活菌株的基因組中去除新霉素抗性基因。導(dǎo)入到imp基因失活菌株中的新霉素抗性基因在其上游區(qū)域和下游區(qū)域都具有FRT序列，因此，使用能特異性識(shí)別FRT序列的Flp重組酶，通過FRT序列重組，有可能從以上獲得的imp基因失活菌株中去除新霉素抗性基因。
具體地說，在無新霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的情況下，首先制備能夠容易地脫離橋石短小芽孢桿菌菌株的質(zhì)粒載體。此外，通過將酵母源Flp重組酶基因(Nature，286，860-864(1980))和博來霉素抗性基因插入到質(zhì)粒載體中，構(gòu)建缺失新霉素抗性基因用的載體。
接著，將新霉素抗性基因缺失載體導(dǎo)入到以上獲得的imp基因失活菌株中，然后在含博來霉素的TM-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株，并由此選擇載體轉(zhuǎn)化的菌株。接著，在無博來霉素的液體TM培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化菌株，然后在TM-瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。
新霉素抗性基因缺失的目標(biāo)imp基因失活菌株，其基因組上的新霉素抗性基因已通過新霉素抗性基因兩側(cè)的FRT序列重組而缺失，并失去了新霉素抗性基因缺失載體。該菌株對(duì)新霉素和博來霉素均敏感。因此，由在TM-瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落的菌株中選擇對(duì)新霉素和博來霉素均敏感的菌株，由此獲得新霉素抗性基因缺失、imp基因失活的目標(biāo)菌株。
該方法產(chǎn)生了imp基因失活的目標(biāo)橋石短小芽孢桿菌菌株。其概述示于圖1。
可使用以上構(gòu)建的imp基因失活的菌株作為親代菌株，并通過失活該菌株基因組上的emp基因，獲得其中蛋白酶基因imp和emp都失活的橋石短小芽孢桿菌菌株?？赏ㄟ^重復(fù)和imp基因失活相同的方法進(jìn)行emp基因失活。
在上述方法中用作標(biāo)記基因的藥物抗性基因的實(shí)例例如為新霉素抗性基因、紅霉素抗性基因和博來霉素抗性基因，用于該方法的標(biāo)記基因的類型沒有特別限定。使用任何所需的多個(gè)標(biāo)記基因，可按照如上所述的方法通過同源重組失活基因。
上述對(duì)橋石短小芽孢桿菌基因組上的胞外和胞內(nèi)主蛋白酶基因失活獲得了其胞外和胞內(nèi)蛋白酶活性比已知菌株大為降低的本發(fā)明橋石短小芽孢桿菌菌株。
可按照明膠-PAGE(酶圖)法或使用偶氮蛋白如偶氮酪蛋白或Azocoll作為底物的方法，測(cè)定橋石短小芽孢桿菌菌株的蛋白水解活性。
按照上述方法獲得的不具備孢子形成能力的本發(fā)明橋石短小芽孢桿菌的實(shí)例是示于實(shí)施例中的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1。其胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株大為降低且不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌的實(shí)例是也示于實(shí)施例中的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP2。其胞外和胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株大為降低且不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌的實(shí)例是也示于實(shí)施例中的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3。
橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3按照布達(dá)佩斯條約于2003年9月11日在國際專利生物保藏單位(1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken)國際保藏，分配的保藏號(hào)為FERM BP-08479。
本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌的特征在于其滿足了以下三種要求中的至少一種(a)其不形成孢子，(b)其胞外主蛋白酶活性低或沒有，(c)其胞內(nèi)主蛋白酶活性低或沒有；就其其它特性而言，其與普通橋石短小芽孢桿菌沒有顯著差異。其菌學(xué)特性如下(a)形態(tài)學(xué)細(xì)胞大小液體培養(yǎng)基0.4-0.6×1.5-4μm，孢子類型芽孢桿菌有無孢子無有無細(xì)胞多態(tài)性無有無運(yùn)動(dòng)性有(外周鞭毛)(b)生理學(xué)特性硝酸鹽還原-，VP實(shí)驗(yàn)(形成3羥基丁酮) -，吲哚形成 -，硫化氫形成(TSI瓊脂培養(yǎng)基) +，檸檬酸利用+，無機(jī)氮源利用硝酸鹽-，銨鹽 +，染料形成(King培養(yǎng)基) -，脲酶 -，氧化酶+，過氧化氫酶+，O-F實(shí)驗(yàn) 未分解，明膠分解 -，由葡萄糖形成酸-，由木糖形成酸 -，由乳糖形成酸 -，由麥芽糖形成酸-，
生長pH6-8.5(c)其它特性耐溫性于60℃死亡，胞外蛋白酶活性低或沒有(注釋1)，胞內(nèi)蛋白酶活性低或沒有(注釋2)。
(注釋1)以以下任一種方法都未在培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到蛋白水解活性(1)通過明膠-PAGE檢測(cè)明膠分解活性的方法。
(2)通過使培養(yǎng)上清液和偶氮酪蛋白反應(yīng)，接著檢測(cè)反應(yīng)液吸光度的變化，來檢測(cè)偶氮酪蛋白分解活性的方法。
(3)通過使培養(yǎng)上清液和Azocoll反應(yīng)，接著檢測(cè)反應(yīng)液吸光度的變化，來檢測(cè)Azocoll分解活性的方法。
(注釋2)即使是通過明膠-PAGE檢測(cè)明膠分解活性，都沒有在胞內(nèi)組分中檢測(cè)到明膠分解活性。
本文提及的用語“胞外蛋白酶活性比已知菌株大為降低”意指當(dāng)按照偶氮酪蛋白法或Azocoll法檢測(cè)時(shí)，培養(yǎng)上清液中的酶活性降低至已知橋石短小芽孢桿菌菌株酶活性的最多1/10，優(yōu)選最多1/30，更優(yōu)選最多1/100。在下文給出的實(shí)施例中，數(shù)據(jù)表明至多1/120和至多1/330。
同樣，用語“胞內(nèi)蛋白酶活性比已知菌株大為降低”意指當(dāng)按照偶氮酪蛋白法檢測(cè)時(shí)，胞內(nèi)組分中的酶活性降低至已知橋石短小芽孢桿菌菌株酶活性的最多1/2，優(yōu)選最多1/5，更優(yōu)選最多1/8至1/10。
這些降低值在按照偶氮酪蛋白法或Azocoll法進(jìn)行的檢測(cè)中獲得，更不必說，以任何其它方法檢測(cè)數(shù)據(jù)時(shí)獲得，然后根據(jù)這些降低值限定每個(gè)方法中的降低值。
此外，本發(fā)明提供使用上述橋石短小芽孢桿菌作為宿主菌株通過基因重組生產(chǎn)蛋白的方法。
在使用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌作為宿主菌株的蛋白生產(chǎn)中使用的表達(dá)載體，可為在橋石短小芽孢桿菌中可復(fù)制的任何載體，沒有特別限定，但優(yōu)選具有短芽孢桿菌47的主胞外蛋白基因(MWP基因)啟動(dòng)子區(qū)或橋石短小芽孢桿菌HPD31的主胞外蛋白基因(HWP基因)啟動(dòng)子區(qū)的表達(dá)載體。一般來說，在使用橋石短小芽孢桿菌作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)中所生產(chǎn)的蛋白并不積聚在宿主細(xì)胞內(nèi)，而是被分泌到細(xì)胞外，因此，理想的是表達(dá)載體在啟動(dòng)子區(qū)編碼DNA序列的3′-末端側(cè)具有編碼分泌信號(hào)肽的DNA序列。編碼分泌信號(hào)肽的DNA序列的優(yōu)選實(shí)例包括編碼橋石短小芽孢桿菌HPD31主胞外蛋白的分泌信號(hào)肽的DNA序列。
具體地說，使用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)中使用的表達(dá)載體的優(yōu)選實(shí)例包括pHT110(JP-A 6-133782(1994))和pNY301(JP-A 10-295378(1998))。
將要插入到本發(fā)明表達(dá)載體中的蛋白的編碼DNA可為在使用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌作為宿主的重組蛋白生產(chǎn)中能使其表達(dá)的任何DNA，沒有特別限定。例如，其可為編碼細(xì)胞因子、趨化因子、酶或激素或任何其它肽的任一種基因的任意DNA片段。通過基因重組產(chǎn)生的蛋白的用途也沒有特別限定。用途可為藥物、生化試劑、工業(yè)用酶等中的任一種。
可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何普通方法，將蛋白編碼DNA插入到表達(dá)載體中。例如，通過用合適的限制性內(nèi)切核酸酶處理編碼目標(biāo)蛋白的純化DNA獲得DNA片段，將該片段插入到表達(dá)載體中合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)，并在該處連接。
再將其中插入蛋白編碼DNA的表達(dá)載體導(dǎo)入本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌中，由此轉(zhuǎn)化橋石短小芽孢桿菌。將表達(dá)載體導(dǎo)入本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌中的方法沒有特別限定，可適當(dāng)?shù)剡x擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法。一個(gè)優(yōu)選方法是通常用于將表達(dá)載體導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌中的電穿孔法。
可通過將轉(zhuǎn)化子接種入合適的培養(yǎng)基中，在其中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)后回收和純化所生產(chǎn)的蛋白，實(shí)現(xiàn)用所獲得的轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)蛋白。
用于本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)條件可為能夠培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子和表達(dá)該重組蛋白基因的任何條件，沒有特別限定。作為一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)例，將轉(zhuǎn)化子在如本說明書給出的實(shí)施例中使用的TM培養(yǎng)基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％，pH 7.0)或2SL培養(yǎng)基(蛋白胨4％、酵母提取物0.5％、葡萄糖2％，pH 7.2)中于30℃培養(yǎng)2-4天。
如果有需要，可將無機(jī)鹽如硫酸鐵、硫酸鎂和硫酸鋅適當(dāng)?shù)靥砑拥脚囵B(yǎng)基中。
當(dāng)分泌和生產(chǎn)重組蛋白時(shí)，則可通過在培養(yǎng)后以離心、過濾等的任何普通方法分離含所分泌和生產(chǎn)的蛋白的培養(yǎng)上清液和培養(yǎng)的橋石短小芽孢桿菌細(xì)胞，回收生產(chǎn)的重組蛋白。
當(dāng)生產(chǎn)的蛋白不是分泌的而是積聚在橋石短小芽孢桿菌細(xì)胞中時(shí)，則可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法回收在細(xì)胞中積聚和生產(chǎn)的蛋白。例如，按照離心、過濾等方法由培養(yǎng)液中收集細(xì)胞，然后按照超聲破碎法或弗氏壓碎器法破碎細(xì)胞，如果有需要，則用加入到其中的表面活性劑溶解破碎的細(xì)胞，由此回收在細(xì)胞中積聚和生產(chǎn)的蛋白。
為純化所生產(chǎn)的蛋白，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法。例如，可適宜地單獨(dú)或組合使用溶劑提取、超濾、硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、疏水層析、電泳、等電點(diǎn)沉淀等。
本發(fā)明的作用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌可在通過基因重組進(jìn)行的蛋白生產(chǎn)中用作宿主。
本發(fā)明提供其胞外蛋白水解活性比已知菌株大為降低的橋石短小芽孢桿菌。當(dāng)該橋石短小芽孢桿菌在分泌和生產(chǎn)的重組蛋白生產(chǎn)中用作宿主時(shí)，則其顯著抑制由于胞外蛋白水解活性引起的重組蛋白降解。因此，橋石短小芽孢桿菌使得能夠比已知橋石短小芽孢桿菌更有效地分泌生產(chǎn)重組蛋白。
本發(fā)明還提供其胞內(nèi)蛋白水解活性比已知菌株大為降低的橋石短小芽孢桿菌。當(dāng)該橋石短小芽孢桿菌在于細(xì)胞內(nèi)積聚和生產(chǎn)的重組蛋白生產(chǎn)中用作宿主時(shí)，則其顯著抑制由于胞內(nèi)蛋白水解活性引起的重組蛋白降解。因此，橋石短小芽孢桿菌能夠比已知橋石短小芽孢桿菌更有效地胞內(nèi)積聚和生產(chǎn)重組蛋白。
另外，本發(fā)明提供不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌。因?yàn)樵摌蚴绦⊙挎邨U菌在溫和滅菌條件下被完全殺滅，所以其在用于大范圍工業(yè)應(yīng)用的重組蛋白生產(chǎn)(如重組蛋白藥物生產(chǎn))中可用作宿主。
因此，本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌在通過基因重組進(jìn)行的蛋白生產(chǎn)中作為宿主非常有用。本發(fā)明的其中一種菌株HPD31-SP3已進(jìn)行了國際保藏(FERM BP-08479)，該菌株是一種新型三重缺陷型菌株，滿足上述全部三種要求。
參照以下實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，但以下的實(shí)施例無意限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1制備不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌突變體用誘變劑亞硝基胍使橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERM BP-1087)(FERM BP-6863)突變，以獲得不具備孢子形成能力的橋石短小芽孢桿菌突變體。
首先，在TM液體培養(yǎng)基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％，pH 7.0)中于30℃過夜培養(yǎng)橋石短小芽孢桿菌HPD31。培養(yǎng)后，通過離心回收細(xì)胞，用無菌水漂洗和稀釋所回收的細(xì)胞，以使OD為0.1。接著，以100mg/L的量向細(xì)胞中加入N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍，由此在振蕩下使細(xì)胞突變，存活率為1-10％。
接著，用無菌水適宜地稀釋突變細(xì)胞，然后涂布在TM平板培養(yǎng)基上，在其上于30℃培養(yǎng)3天，由此在TM平板培養(yǎng)基上形成其菌落。選擇形成與普通橋石短小芽孢桿菌菌落不同的表面無皺菌落的菌株，并從由此選擇的菌株中選擇顯微鏡觀察無孢子的那些菌株作為不具備孢子形成能力的菌株。重復(fù)突變處理和菌落形成的過程，其中獲得5個(gè)可能不形成孢子的突變體。
實(shí)施例2以耐熱性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)突變體的孢子形成能力以耐熱性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)實(shí)施例1獲得的5個(gè)突變體的孢子形成能力。橋石短小芽孢桿菌HPD31用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
分別將橋石短小芽孢桿菌HPD31和5個(gè)突變體(1-5號(hào))涂布在TM-瓊脂培養(yǎng)基上，并以固定培養(yǎng)方式于30℃培養(yǎng)7天。培養(yǎng)期是7天，比普通橋石短小芽孢桿菌孢子形成的時(shí)間長。培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮在含0.8％NaCl的無菌蒸餾水中，以使660nm的吸光度為1.0，將100μl的細(xì)胞懸浮液保持于80℃的溫?zé)釥顟B(tài)10分鐘，然后涂布在TM-瓊脂培養(yǎng)基上。再將其以30℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，由生長菌落數(shù)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
在80℃熱處理前，用無菌蒸餾水分步稀釋細(xì)胞懸浮液，并涂布在TM-瓊脂培養(yǎng)基上，以30℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，由生長菌落數(shù)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。結(jié)果示于表1。
表1

表1表明，當(dāng)80℃加熱10分鐘時(shí)，橋石短小芽孢桿菌HPD31全部活細(xì)胞僅有約1/2死亡，而1-5號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體在相同條件下完全死亡。換句話說，這明顯提示，突變體不形成耐熱性孢子。
實(shí)施例3測(cè)定突變體的D值接著，測(cè)試1-5號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體細(xì)胞，以確定其D值。橋石短小芽孢桿菌HPD31用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
分別將橋石短小芽孢桿菌HPD31和1-5號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體涂布在TM-瓊脂培養(yǎng)基上，并以固定培養(yǎng)方式于30℃培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮在0.8％無菌生理鹽水中，以使660nm的吸光度為1.0。保持細(xì)胞懸浮液于60℃、70℃和80℃的不同溫度的溫?zé)釥顟B(tài)，溫?zé)衢_始后以1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘和60分鐘的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)懸浮液取樣。冷卻每種懸浮液的樣品，然后分別涂布在TM-瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，由生長菌落數(shù)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。根據(jù)由此測(cè)定的細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步獲得D值，其代表將孢子數(shù)降低至1/10所花費(fèi)的時(shí)間。
一般來說，橋石短小芽孢桿菌的活細(xì)胞(無孢子細(xì)胞)在60℃或更高的溫度范圍內(nèi)立即死亡，假定在實(shí)驗(yàn)開始后1分鐘仍保持存活的細(xì)胞全是孢子，并基于此假設(shè)計(jì)算此處的數(shù)據(jù)。結(jié)果示于表2。
表2

ND未檢測(cè)到(少于1分鐘)橋石短小芽孢桿菌HPD31細(xì)胞在不同溫度的D值如表2所示。但是，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)開始后1分鐘內(nèi)1-5號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體細(xì)胞在這些溫度下全部死亡，所以在這些溫度不能測(cè)定其D值。顯然，這些結(jié)果是由于全部1-5號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體的任一種都不形成孢子而產(chǎn)生的。
80℃恒溫10分鐘的實(shí)驗(yàn)和上述檢測(cè)D值的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了1-5號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體都不具備孢子形成能力，當(dāng)于60℃保持1分鐘時(shí)完全死亡。
實(shí)施例4使用1-5號(hào)突變體作為宿主生產(chǎn)重組蛋白(hEGF)測(cè)試1-5號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體在生產(chǎn)重組hEGF時(shí)的重組蛋白生產(chǎn)能力。方法和結(jié)果示于下文。橋石短小芽孢桿菌HPD31用作對(duì)照。
按照電穿孔法將人表皮生長因子(hEGF)表達(dá)質(zhì)粒載體pHT110·EGF(JP-A 6-133782(1994))導(dǎo)入其中，轉(zhuǎn)化橋石短小芽孢桿菌HPD31及其1-5號(hào)突變體。接著，分別將獲得的轉(zhuǎn)化子在3ml 2SL液體培養(yǎng)基(蛋白胨4％、酵母提取物0.5％、葡萄糖2％，pH 7.2)中于30℃振蕩培養(yǎng)60小時(shí)。4-5號(hào)突變體不形成轉(zhuǎn)化子。
培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)液，用蒸餾水稀釋上清液組分10倍，然后進(jìn)行HPLC分析。根據(jù)由此獲得的峰面積計(jì)算在培養(yǎng)液中分泌和生產(chǎn)的重組hEGF的量。結(jié)果示于表3。在表3中，橋石短小芽孢桿菌HPD31生產(chǎn)的hEGF的量為100％，其它宿主的數(shù)據(jù)為其相對(duì)值。
表3

如表3所示，在1號(hào)橋石短小芽孢桿菌突變體用作宿主時(shí)的hEGF產(chǎn)量略高于橋石短小芽孢桿菌HPD31用作宿主的情況。該突變體的生長和轉(zhuǎn)化效率與HPD31水平相同。
1號(hào)突變體命名為橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1。
實(shí)施例5鑒別橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1的突變基因鑒別在橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1基因組上突變的基因。如下鑒別突變基因制備橋石短小芽孢桿菌HPD31的基因組文庫，將基因組文庫的每個(gè)片段導(dǎo)入SP1中，選擇恢復(fù)其孢子形成能力的菌株。
按照以下方法制備橋石短小芽孢桿菌HPD31的基因組文庫。首先，由在TM培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時(shí)的橋石短小芽孢桿菌HPD31制備基因組DNA，然后用限制性內(nèi)切核酸酶Sau3AI部分處理基因組DNA，獲得基因組DNA片段。將獲得的基因組DNA片段與已用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI處理過的質(zhì)粒載體pNY301連接，由此形成基因組文庫質(zhì)粒DNA。再按照電穿孔法將基因組文庫質(zhì)粒DNA導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1中。
接著，在TM液體培養(yǎng)基(不含抗生素)中于30℃培養(yǎng)其中導(dǎo)入了基因組文庫質(zhì)粒DNA的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1轉(zhuǎn)化子1小時(shí)，再在含新霉素的TM液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，將其在80℃加熱10分鐘，然后涂布至TM-瓊脂培養(yǎng)基，在其上于30℃培養(yǎng)3天。通過培養(yǎng)，選擇形成菌落的菌株作為恢復(fù)其孢子形成能力的菌株。
結(jié)果，獲得8個(gè)恢復(fù)孢子形成能力的菌株。接著，由這8個(gè)菌株提取先前導(dǎo)入其中的質(zhì)粒DNA，測(cè)定其DNA序列。結(jié)果證實(shí)這8個(gè)菌株中有3個(gè)具有編碼新基因的共同翻譯讀框。由該結(jié)果推測(cè)，誘變劑處理使突變體橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1中的基因失活，突變體已失去其孢子形成能力。由該共同翻譯讀框編碼的新基因命名為hos。其DNA序列示于SEQ ID NO1(圖7和圖8中的上行)。
接著，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為親代菌株，構(gòu)建hos基因失活菌株，證實(shí)橋石短小芽孢桿菌通過失活hos基因失去其孢子形成能力。
按照類似于已知的同源重組的方法構(gòu)建hos基因失活菌株。其具體過程示于下文。
首先，構(gòu)建hos基因失活用載體。按照PCR，使用引物Hos P1和Hos P2，擴(kuò)增hos基因上游部分的DNA片段(1.5kbp，識(shí)別序列KpnI導(dǎo)入到上游側(cè)，識(shí)別序列BamHI導(dǎo)入到下游側(cè))，然后用限制性內(nèi)切核酸酶KpnI和BamHI處理已通過PCR擴(kuò)增的1.5kbp DNA片段，并回收獲得的DNA片段。另一方面，按照PCR，使用引物HosP3和Hos P4，擴(kuò)增hos基因下游部分的約1.5kbp DNA片段(識(shí)別序列PstI導(dǎo)入到上游側(cè)，識(shí)別序列XbaI導(dǎo)入到下游側(cè))，然后用限制性內(nèi)切核酸酶PstI和XbaI處理約1.5kbp的該DNA片段，并回收獲得的DNA片段。用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和PstI處理具有新霉素抗性基因并在兩側(cè)具有FRT序列(Gene，212，77-86(1998))的DNA片段(1.4kbp)，回收所獲得的DNA片段。
用限制性內(nèi)切核酸酶SacI切出含紅霉素抗性基因的DNA片段，將其插入到在橋石短小芽孢桿菌中不能復(fù)制的載體pBluescripII SK+(Toyobo Co.，Ltd.)中的SacI識(shí)別序列中。接著，將上述三種DNA片段全部同時(shí)導(dǎo)入所述質(zhì)粒DNA的KpnI/XbaI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建hos基因失活用載體。由此構(gòu)建的hos基因失活載體稱為pBlue-hos::Nmr。以上使用的引物Hos P1、Hos P2、Hos P3和Hos P4的堿基序列如SEQ ID NO7、8、9和10所示，這些序列均示于圖14。
接著，按照電穿孔法將hos基因失活載體pBlue-hos::Nmr導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31中，根據(jù)其新霉素抗性作為指標(biāo)選擇產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子。再將新霉素抗性菌株涂布至含紅霉素的TM-瓊脂培養(yǎng)基，并在其上于30℃培養(yǎng)2天，根據(jù)其對(duì)紅霉素的敏感性作為指標(biāo)選擇菌株。通過PCR和基因組DNA分析證實(shí)，如此選擇的菌株中的hos基因失活。再按照下文實(shí)施例7描述的方法，去除hos基因失活菌株中的新霉素抗性基因，由此獲得hos基因失活的橋石短小芽孢桿菌菌株。
接著，按照實(shí)施例2和3的方法測(cè)試hos基因失活菌株的孢子形成能力，證實(shí)了該菌株不具備孢子形成能力。
此外，按照實(shí)施例4的方法測(cè)試hos基因失活菌株的重組蛋白生產(chǎn)能力，證實(shí)了其hEGF生產(chǎn)能力和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1水平相同。
由這些測(cè)試結(jié)果得出結(jié)論在橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1中，通過用誘變劑處理使hos基因突變，并因此使其失活，結(jié)果突變體失去了其孢子形成能力。
構(gòu)建其胞內(nèi)主蛋白酶基因失活的橋石短小芽孢桿菌實(shí)施例6克隆胞內(nèi)主蛋白酶基因imp(6-1)克隆imp為鑒別所要失活的蛋白酶，克隆橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERM BP-1087)的胞內(nèi)主蛋白酶基因。
用已按照實(shí)施例5的方法構(gòu)建的橋石短小芽孢桿菌HPD31的基因組文庫DNA轉(zhuǎn)化橋石短小芽孢桿菌HPD31，將獲得的轉(zhuǎn)化子涂布到含1％脫脂奶和50μg/ml(為終濃度)新霉素的TM-瓊脂培養(yǎng)基上，在其上于30℃培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后，選擇形成暈輪的菌株，暈輪代表脫脂奶分解。
再由以上獲得的菌株中提取出質(zhì)粒DNA，并測(cè)定DNA序列。結(jié)果，約1.4kbp的翻譯讀框(ORF)存在于橋石短小芽孢桿菌HPD31基因組來源的3.6kbp DNA片段中，約0.7kbp的ORF存在于該DNA片段的互補(bǔ)序列中。含約3.6kbp DNA片段的質(zhì)粒命名為pNY-imp。
在3.6kbp DNA片段中含有的兩個(gè)ORF中，構(gòu)建僅含約1.4kbp的ORF的質(zhì)粒和僅含約0.7kbp的ORF的質(zhì)粒，并使用這些質(zhì)粒中的每一種，轉(zhuǎn)化橋石短小芽孢桿菌HPD31。
獲得的轉(zhuǎn)化子再分別在含1％脫脂奶的TM-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，于是，含僅具約1.4kbp ORF的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在TM-瓊脂培養(yǎng)基上形成暈輪。由此明顯看出約1.4kbp的ORF編碼蛋白酶。由約1.4kbp的ORF編碼的蛋白酶命名為胞內(nèi)主蛋白酶，縮寫為IMP。在IMP和其它已知蛋白之間進(jìn)行氨基酸序列同源性檢索，但未發(fā)現(xiàn)與IMP顯著同源的蛋白。
橋石短小芽孢桿菌HPD31菌株來源的胞內(nèi)主蛋白酶基因(intracelluar major protease)imp的DNA堿基序列如SEQ ID NO5所示(圖12和圖13中的上行)；對(duì)應(yīng)于該DNA序列的胞內(nèi)主蛋白酶IMP的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示(圖12和圖13中的下行)。
(6-2)Imp基因的表達(dá)和IMP蛋白的純化接著，為闡明IMP特性的細(xì)節(jié)，進(jìn)行了imp基因的表達(dá)和IMP蛋白的純化。
首先，為利于純化所生產(chǎn)的IMP蛋白，構(gòu)建質(zhì)粒載體pNY-imp-His，其表達(dá)的多肽帶有8個(gè)組氨酸的肽標(biāo)記(組氨酸尾)，該標(biāo)記加入到IMP的C端。按照以下方法構(gòu)建質(zhì)粒載體pNY-imp-His。
首先，使用有義引物imp P1和反義引物imp P2，用pNY-imp質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR。有義引物imp P1是與編碼推定為IMP N端的氨基酸序列的DNA序列同源的引物。反義引物imp P2通過以下方法構(gòu)建加入編碼組氨酸尾的8重重復(fù)gtg的DNA序列，再將終止密碼子和限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI識(shí)別序列導(dǎo)入其中。有義引物imp P1的堿基序列如SEQ ID NO11所示；反義引物imp P2的堿基序列如SEQ ID NO12所示；這些序列都示于圖15。
純化含PCR擴(kuò)增的、組氨酸尾編碼序列和imp基因的DNA片段，然后用限制性內(nèi)切核酸酶XhoI和EcoRI處理，獲得約500bp的DNA片段。接著，將該DNA片段插入質(zhì)粒pNY-imp的XhoI/EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，以獲得質(zhì)粒載體pNY-imp-His。
接著，用以上獲得的質(zhì)粒載體pNY-imp-His轉(zhuǎn)化橋石短小芽孢桿菌HPD31，獲得的轉(zhuǎn)化子在600ml TM液體培養(yǎng)基中于30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，以6000×g離心回收細(xì)胞，并懸浮在30ml清洗緩沖液(20mM磷酸鹽，pH 7.4，2M KCl)中，然后再以6000×g離心回收細(xì)胞。該清洗操作重復(fù)兩次，然后將細(xì)胞懸浮在30mM含0.2mg/ml溶菌酶和10單位DNA酶的裂解緩沖溶液(20mM磷酸鹽，pH 7.4)中，并保持于37℃恒溫20分鐘。接著，超聲破碎細(xì)胞，并以34000×g離心30分鐘，回收上清液作為胞內(nèi)組分。將30ml胞內(nèi)組分通過0.22μm濾器過濾，向其中加入終濃度為0.5M的NaCl和10mM咪唑。然后，將其上1ml鎳螯合柱(Amersham Pharmacia Co.)。以10-50mM咪唑的線性濃度梯度洗脫和收集吸附至鎳螯合柱的IMP蛋白。用蛋白酶檢測(cè)試劑盒QuantiCleave(Pierce Biotechnology，Inc.)測(cè)定分級(jí)分離的洗脫液的蛋白酶活性，由此鑒別IMP活性組分。此外，對(duì)5μl活性組分進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果證實(shí)IMP蛋白在電泳中純化至單一物質(zhì)水平。
(6-3)IMP的特性使用10％丙烯酰胺濃度對(duì)含10μg IMP的純酶制品進(jìn)行SDS-PAGE，用半干蛋白轉(zhuǎn)移裝置將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，其中用含0.01％ CBB(考馬斯亮藍(lán))和40％甲醇的染色溶液檢測(cè)IMP蛋白條帶。接著，用無CBB的40％甲醇溶液對(duì)PVDF膜進(jìn)行脫色，然后干燥膜。接著，切出膜中的IMP蛋白條帶，分析其N端氨基酸序列。這證實(shí)了該蛋白的N端序列是MetAsnHisProAsp。由以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IMP是含453個(gè)氨基酸殘基的胞內(nèi)蛋白酶，估測(cè)分子量為49,811Da。
接著，使用蛋白酶檢測(cè)試劑盒QuantiCleave(PierceBiotechnology，Inc.)詳細(xì)分析純IMP的酶化學(xué)活性。將2mg底物琥珀?；业鞍兹芙庠?5μl的100mM硼酸緩沖溶液(pH 8.0)中，以制備酶底物溶液，向其中加入10μl含1.5μg IMP的純酶制品，將其保持于37℃恒溫20分鐘。接著，向其中加入25μl顯色溶液，并保持于室溫20分鐘。在顯色后，檢測(cè)450nm的液體吸光度，借此測(cè)定IMP蛋白水解活性。在IMP蛋白水解活性測(cè)定中，經(jīng)30℃反應(yīng)60分鐘使450nm吸光度增加0.1的酶量為1單位。使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照Bradford法測(cè)定用于反應(yīng)的酶蛋白的量。
由該結(jié)果可清楚看出，IMP的最適溫度為30℃，其最適pH為8.0，其相對(duì)活性為44.7單位/mg蛋白，至少1mM EDTA抑制IMP活性。
實(shí)施例7構(gòu)建其中胞內(nèi)主蛋白酶基因imp失活的橋石短小芽孢桿菌接著，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1作為親代菌株，構(gòu)建其中imp基因失活的橋石短小芽孢桿菌。為構(gòu)建其中imp基因失活的橋石短小芽孢桿菌，使用類似于通過同源重組失活基因的方法。具體地說，方法如下首先，構(gòu)建imp基因失活用載體。用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRV由imp基因中切出1kbp的DNA片段，其為imp基因的內(nèi)部區(qū)域，將其插入到質(zhì)粒載體pBluescriptII SK+(Toyobo Co.，Ltd.)的SmaI/EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中。接著，對(duì)其用限制性內(nèi)切核酸酶PstI處理，以去除imp基因內(nèi)部的120bp區(qū)域。然后，將含新霉素抗性基因并在兩端具有FRT序列的DNA片段插入到PstI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此切除imp基因。再將已用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI切出的含紅霉素抗性基因的DNA片段插入到該質(zhì)粒的BamHI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建imp基因失活載體。由此構(gòu)建的imp基因失活載體稱為pBlue-imp::Nmr。
接著，按照電穿孔法將1μg imp基因失活載體pBlue-imp::Nmr插入到橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP1中，并基于新霉素抗性作為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化子。將獲得的新霉素抗性菌株涂布在含1μg/ml(為終濃度)紅霉素的TM-瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％、瓊脂1.5％，pH 7.0)上，并在其上于30℃培養(yǎng)2天，基于對(duì)紅霉素的敏感性作為指標(biāo)選擇在imp基因的上游和下游區(qū)域中的兩個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行了同源重組的菌株(雙雜交菌株)。再對(duì)如此選出的菌株進(jìn)行PCR和基因組DNA分析，結(jié)果證實(shí)該菌株中的imp基因失活。
接著，從以上構(gòu)建的imp基因失活菌株基因組去除新霉素抗性基因。為去除imp基因失活菌株的新霉素抗性基因，首先按照下文提及的方法構(gòu)建新霉素抗性基因缺失用的質(zhì)粒載體，其具有酵母源Flp重組酶基因和博來霉素抗性基因。
首先，為了獲得可容易地由橋石短小芽孢桿菌菌株細(xì)胞中去除的質(zhì)粒載體，用化學(xué)品羥胺處理質(zhì)粒載體pNY301(JP-A 10-295378(1998))，產(chǎn)生菌株突變體，然后在無新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株。
具體地說，方法如下通過將350mg羥胺和90mg NaOH溶解在5ml冰冷的無菌蒸餾水中制備溶液，將1.5μg pNY301的質(zhì)粒載體DNA溶解在該溶液(100μl)中，并保持在70℃恒溫120分鐘，然后通過乙醇沉淀濃縮質(zhì)粒DNA，并干燥。接著，將質(zhì)粒DNA溶解在無菌蒸餾水中，用其轉(zhuǎn)化橋石短小芽孢桿菌HPD31。用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA的量是100ng。根據(jù)其新霉素抗性選擇目標(biāo)轉(zhuǎn)化子。對(duì)于由生長緩慢并形成小菌落的轉(zhuǎn)化子獲得的質(zhì)粒DNA，其拷貝/細(xì)胞數(shù)降低至使用原始pNY301質(zhì)粒載體DNA獲得的轉(zhuǎn)化子的幾十分之一；當(dāng)轉(zhuǎn)化子在無新霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，則質(zhì)粒DNA容易由轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中去除。
使用質(zhì)粒DNA作為模板，并使用其中加入EcoRI識(shí)別序列和PstI識(shí)別序列的有義引物flp P1(SEQ ID NO3，圖16)和其中加入BamHI識(shí)別序列的反義引物flp P2(SEQ ID NO14，圖17)進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增含rep基因的約1.6kbp DNA片段。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和BamHI處理約1.6kbp的DNA片段。
使用具有博來霉素抗性基因的質(zhì)粒pNH300(Yasuhiro Shiga等，Applied and Environmental Microbiology，58，525-531(1992))作為模板，使用其中加入BglII識(shí)別序列的有義引物flp P3(SEQ ID NO15，圖18)和其中加入EcoRI識(shí)別序列和XbaI識(shí)別序列的反義引物flp P4(SEQ ID NO16，圖19)進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增同時(shí)含有博來霉素抗性基因和質(zhì)粒Ori的約1.1kbp DNA片段。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI和BalII處理約1.1kbp的DNA片段，連接以上獲得的兩個(gè)約1.6kbp的DNA片段和約1.1kbp的DNA片段，構(gòu)建新質(zhì)粒。該質(zhì)粒稱為pNY-Mut-Ble。
另一方面，使用酵母源質(zhì)粒2-μm作為模板，使用其中加入NcoI識(shí)別序列的有義引物flp P5(SEQ ID NO17，圖20)和其中加入XhoI識(shí)別序列的反義引物flp P6(SEQ ID NO18，圖21)進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增含F(xiàn)lp重組酶基因的區(qū)域。接著，用NcoI和XhoI處理在此PCR中獲得的含F(xiàn)lp重組酶基因的DNA片段，然后將其插入到載體pNY301的NcoI/XhoI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，獲得含F(xiàn)lp重組酶基因的載體。該載體稱為pNY301-Flp。
接著，使用該pNY301-Flp作為模板，使用其中加入XbaI識(shí)別序列的有義引物flp P7(SEQ ID NO19，圖22)和其中加入PstI識(shí)別序列的反義引物flp P8(SEQ ID NO20，圖23)進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增含F(xiàn)1p重組酶基因和pNY301來源的啟動(dòng)子區(qū)域的約1.6kbp DNA片段。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶XbaI和PstI處理該約1.6kbp的DNA片段，然后將其插入到以上獲得的質(zhì)粒pNY-Mut-Ble的XbaI/PstI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建新霉素抗性基因缺失用的載體。該新霉素抗性基因缺失載體稱為pNY-Mut-Ble-Flp。此pNY-Mut-Ble-Flp是表達(dá)Flp重組酶基因的質(zhì)粒載體，當(dāng)其在無新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其容易由橋石短小芽孢桿菌菌株細(xì)胞中去除。
接著，按照電穿孔法將新霉素抗性基因缺失載體pNY-Mut-Ble-Flp導(dǎo)入到imp基因失活菌株中，根據(jù)博來霉素抗性作為指標(biāo)選擇獲得的轉(zhuǎn)化子。接著，在無博來霉素的TM液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，然后在TM-瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。由在TM-瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落的菌株中選擇對(duì)新霉素和博來霉素都敏感的菌株。
按照以上的方法，獲得imp基因失活的目標(biāo)橋石短小芽孢桿菌菌株，該菌株缺失新霉素抗性基因，并去除了新霉素抗性基因缺失載體pNY-Mut-Ble-Flp。其中基因組上的胞內(nèi)主蛋白酶基因imp失活的橋石短小芽孢桿菌菌株命名為橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP2。構(gòu)建其中胞內(nèi)和胞外主蛋白酶基因都失活的橋石短小芽孢桿菌接著，處理以上獲得的imp基因失活的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP2，以失活其中的胞外主蛋白酶基因。其第一步是分離胞外主蛋白酶并克隆其基因。
實(shí)施例8克隆胞外主蛋白酶(extracellular major protease)(縮寫為EMP)基因(8-1)純化胞外主蛋白酶(EMP)在5升TM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERMBP-1087)24小時(shí)。在培養(yǎng)后，通過離心分離培養(yǎng)上清液，向其中加入50mM(終濃度)Tris-HCl(pH 7.5)，然后對(duì)其進(jìn)行DEAE陰離子交換柱層析，用0-0.6M線性濃度梯度的NaCl洗脫EMP。
使含EMP的組分對(duì)50mM Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液透析，然后上肝素柱，用0-0.5M線性濃度梯度的NaCl洗脫，獲得純EMP制品。按照Analytical Biochemistry，102，196-202(1980)中的方法，通過明膠-PAGE測(cè)定每種洗出液組分的酶活性。
(8-2)EMP氨基酸序列分析8-2-1N-端氨基酸序列分析使用10％丙烯酰胺濃度，對(duì)10μg純EMP制品進(jìn)行SDS-PAGE，以半干蛋白轉(zhuǎn)移裝置將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，其中用含0.01％CBB和40％甲醇的染色溶液檢測(cè)EMP蛋白條帶。接著，用無CBB的40％甲醇溶液對(duì)PVDF膜進(jìn)行脫色，然后干燥膜。接著，切下膜上含蛋白條帶的部分，用ABI蛋白測(cè)序儀492型分析其N端氨基酸序列。該氨基酸序列分析證實(shí)該蛋白的N端氨基酸序列含24個(gè)氨基酸殘基AlaSerLysArgValHisThrAspAsnLeuValIleAlaLeuValGluPheAsnAspLeuGluGlyAsnGln。
8-2-2內(nèi)部氨基酸序列分析
使用10％丙烯酰胺濃度，對(duì)50μg純EMP制品進(jìn)行SDS-PAGE，并切出含EMP蛋白條帶的凝膠組分。接著，按照Current Protocols inProtein Science，11.3 Digestion of Proteins in Gel for Sequence Analysis，John Wiley & Sons，1995中的方法，用1μg胰蛋白酶對(duì)EMP進(jìn)行凝膠內(nèi)酶處理，以進(jìn)行凝膠內(nèi)EMP的有限消化。接著，以乙腈溶液回收胰蛋白酶處理的EMP的肽片段，然后用Mightysil Aqua PR18(KantoKagaku Co.)對(duì)其進(jìn)行反相柱層析，其中用含0.05％TFA的0-60％線性濃度梯度的乙腈洗脫和分離EMP肽片段。然后，將由此洗脫和分離的EMP肽片段干燥至固體，用ABI蛋白測(cè)序儀492型對(duì)一個(gè)肽片段進(jìn)行氨基酸序列分析。氨基酸序列分析證實(shí)內(nèi)部部分氨基酸序列含10個(gè)氨基酸殘基IlePheGlnThrGlnProThrGlyPheAsp。
(8-3)克隆和鑒別emp基因接著，根據(jù)以上獲得的EMP的內(nèi)部部分氨基酸序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)和合成兩個(gè)寡核苷酸引物emp P1和emp P2。emp P1的堿基序列如SEQ ID NO21所示；emp P2的堿基序列如SEQ ID NO22所示。emp P1和emp P2的堿基序列和對(duì)應(yīng)于emp P1和emp P2的堿基序列的氨基酸序列都示于圖24。在SEQ ID NO21序列中左數(shù)第6個(gè)“n”和SEQ ID NO22序列中左數(shù)第6個(gè)“n”是肌苷。
使用這些引物emp P1和emp P2，用橋石短小芽孢桿菌HPD31的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增約700bp的DNA片段。接著，在載體pUC118(Toyobo Co.，Ltd.)的HincII識(shí)別序列中亞克隆該約700bp的DNA片段，用于其DNA序列分析，結(jié)果證實(shí)該約700bp的DNA片段含部分emp基因。
接著，為了克隆在約700bp的DNA片段上游區(qū)域的DNA片段和在其下游區(qū)域的DNA片段，根據(jù)以上獲得的約700bp的DNA片段的DNA序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)和合成下文提及的兩個(gè)特異性引物，一個(gè)是用于擴(kuò)增上游區(qū)域的反義引物emp P3，一個(gè)是用于擴(kuò)增下游區(qū)域的有義引物emp P4。
用限制性內(nèi)切核酸酶如EcoRV使橋石短小芽孢桿菌HPD31的基因組DNA片段化，并將接頭DNA加入到DNA片段末端，以制備橋石短小芽孢桿菌HPD31的接頭基因組DNA文庫。
反義引物emp P3、有義引物emp P4和接頭DNA的堿基序列分別如SEQ ID NO23、24和25所示。它們?nèi)渴居趫D25。
接著，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31基因組的接頭DNA文庫作為模板進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增含全長emp基因的DNA片段。再通過對(duì)所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)定emp基因的DNA序列。
來源于橋石短小芽孢桿菌HPD31菌株的胞外主蛋白酶基因emp的DNA序列如SEQ ID NO3(圖9-11中的上行)所示。對(duì)應(yīng)于該DNA序列的胞外主蛋白酶EMP的氨基酸序列如SEQ ID NO4(圖9-11中的下行)所示。
(8-4)EMP的特性胞外主蛋白酶EMP是酸性蛋白，含754個(gè)氨基酸殘基作為前原結(jié)構(gòu)，分子量約84kDa，推測(cè)其胞外分泌時(shí)其N端的124個(gè)氨基酸可能被切除，其成熟為含630個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)，分子量約71kDa。在成熟蛋白N端的207位上存在HEXXH序列，該序列可能參與鋅金屬蛋白酶的鋅離子的配位。因此，推測(cè)EMP為鋅金屬蛋白酶。
EMP與丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的金屬蛋白酶在氨基酸水平上具有37％的同源性。
實(shí)施例9構(gòu)建其中imp基因和emp基因失活的橋石短小芽孢桿菌菌株接著，失活在實(shí)施例7中獲得的作為親代菌株的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP2中的emp基因，由此產(chǎn)生其中兩個(gè)蛋白酶基因imp和emp失活的橋石短小芽孢桿菌菌株。為產(chǎn)生其中emp基因失活的橋石短小芽孢桿菌菌株，使用類似于通過同源重組進(jìn)行的基因失活萬法的方法。
首先，構(gòu)建emp基因失活用的載體。使用實(shí)施例8-3中描述的empP4引物(SEQ ID NO24)和接頭引物(SEQ ID NO24)，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31的接頭基因組DNA文庫作為模板進(jìn)行PCR，由此擴(kuò)增含部分emp基因的約2.2kbp DNA片段。
接著，將通過PCR擴(kuò)增的約2.2kbp DNA片段插入到pUC118的HincII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中。接著，將已用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI切出的含紅霉素抗性基因的DNA片段插入到所插入DNA片段附近的BamHI識(shí)別序列中。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII和PstI去除emp基因內(nèi)部的220bp部分，然后將含新霉素抗性基因并在兩側(cè)具有FRT序列的DNA片段插入到質(zhì)粒的HindIII/PstI限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建emp基因失活用的載體。emp基因失活載體稱為pBlue-emp::Nmr。
接著，使用emp基因失活載體pBlue-emp::Nmr，失活橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP2的emp基因。按照和實(shí)施例7中的imp基因失活菌株構(gòu)建相同的方法，實(shí)現(xiàn)用pBlue-emp::Nmr失活emp基因，以及由emp基因失活菌株基因組中去除新霉素抗性基因。
以上獲得的其中imp基因和emp基因失活的橋石短小芽孢桿菌菌株命名為橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3，其以FERM BP-08479進(jìn)行了國際保藏。
證實(shí)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3沒有孢子形成能力實(shí)施例10耐熱性測(cè)試為證實(shí)以上獲得的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3不具備孢子形成能力的事實(shí)，以和實(shí)施例2相同的方式測(cè)試菌株的耐熱性。橋石短小芽孢桿菌HPD31用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。結(jié)果示于表4。
表4

當(dāng)于80℃加熱10分鐘時(shí)，橋石短小芽孢桿菌HPD31全部活細(xì)胞約有3/4死亡，而在相同條件下橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的所有活細(xì)胞完全死亡。換句話說，這表明后者不形成耐熱性孢子。
實(shí)施例11測(cè)定D值接著，為分析橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的孢子形成能力，以和實(shí)施例3相同的方式測(cè)定菌株的D值。橋石短小芽孢桿菌HPD31用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。結(jié)果示于表5。
表5

ND未檢測(cè)到(小于1分鐘)橋石短小芽孢桿菌HPD31細(xì)胞在不同溫度時(shí)的D值如表5所示。但是，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)開始后的1分鐘內(nèi)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的所有細(xì)胞在這些溫度下都死亡，所以在這些溫度不能測(cè)定其D值。顯然，這些結(jié)果是由于橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3不形成孢子而產(chǎn)生的。
上述80℃恒溫10分鐘的實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)D值的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3不具備孢子形成能力。
評(píng)價(jià)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性評(píng)價(jià)了橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性。
首先證實(shí)了以下事實(shí)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3不分解乳酪蛋白和BSA，它們也不能被橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERM BP-1087)(短芽孢桿菌H102)(JP-1 63-56277(1988))分解。
實(shí)施例12以乳酪蛋白分解實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性將橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3細(xì)胞接種在含5％、2％或1％脫脂奶的TM-瓊脂平板培養(yǎng)基上，然后在其上于37℃培養(yǎng)3天，以觀察在菌落周圍是否由于乳酪蛋白分解而形成暈輪。結(jié)果，在任一種含5％、2％或1％脫脂奶的TM-瓊脂培養(yǎng)基上都根本沒有形成暈輪。
此結(jié)果證實(shí)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3不具有分解乳酪蛋白的能力。
實(shí)施例13以BSA分解實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性將橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3細(xì)胞接種在10ml TM液體培養(yǎng)基上，向其中加入通過過濾除菌獲得的3.2mg/ml(為終濃度)BSA(Sigma A4503)溶液，并在其中于37℃以200rpm振蕩培養(yǎng)。
在培養(yǎng)開始后24、48和72小時(shí)，對(duì)培養(yǎng)物濾液取樣，每個(gè)培養(yǎng)物樣品以10000rpm離心5分鐘。接著，將125μl的0.5M Tris-HCl(pH 6.8)、200μl 10％SDS和50μl β-巰基乙醇加入到通過離心獲得的625μl培養(yǎng)上清液組分中，然后攪拌，在沸水中加熱3分鐘。在所述加熱后，接著向其中加入0.1ml含0.05％ BPB和70％甘油的0.0625MTris-HCl(pH 6.8)，并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。以10％的丙烯酰胺濃度進(jìn)行SDS-PAGE。通過用CBB(考馬斯亮藍(lán))染色完成蛋白檢測(cè)。結(jié)果，在培養(yǎng)開始后的24、48和72小時(shí)的任一時(shí)間，都未發(fā)現(xiàn)代表BSA分解的條帶。
結(jié)果證實(shí)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3不具有BSA分解能力。
再按照明膠-PAGE法和使用偶氮酪蛋白或Azocoll的方法評(píng)價(jià)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性。橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERM BP-1087)用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
實(shí)施例14以明膠-PAGE評(píng)價(jià)HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性在TM液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)橋石短小芽孢桿菌HPD31細(xì)胞和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3細(xì)胞48小時(shí)，對(duì)10μl培養(yǎng)上清液組分進(jìn)行明膠-PAGE。按照Analytical Biochemistry 102，196-202(1980)中的方法進(jìn)行明膠-PAGE。將電泳后的凝膠放入含10mM CaCl2的50mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5)中，37℃恒溫16小時(shí)，由此分解凝膠中的明膠。在所述恒溫放置后，用含0.1％酰胺黑、30％甲醇和10％乙酸的染色溶液對(duì)其染色30分鐘，然后用不含酰胺黑的相同溶液脫色。結(jié)果如圖2所示。
如圖2所示，橋石短小芽孢桿菌HPD31的培養(yǎng)上清液組分由于其蛋白水解活性而產(chǎn)生代表明膠分解的約40kDa遷移率的清晰條帶，但橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的培養(yǎng)上清液組分未產(chǎn)生代表明膠分解的清晰條帶。
實(shí)施例15使用偶氮酪蛋白測(cè)定HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性在T2培養(yǎng)基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％)中于30℃分別振蕩培養(yǎng)橋石短小芽孢桿菌HPD31細(xì)胞和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3細(xì)胞6天。培養(yǎng)物以10,000rpm離心10分鐘，獲得的上清液用作活性測(cè)定的樣品。將5g偶氮酪蛋白溶解在1L 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)中，以制備底物溶液。接著，向0.1ml底物溶液中加入相同量的樣品，二者于37℃反應(yīng)5小時(shí)。然后，通過向其中加入0.2ml 10％三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。接著，將其靜止保持于室溫20分鐘，然后以15,000rpm離心10分鐘，以收集上清液組分。向其中加入0.4ml 0.5N NaOH，檢測(cè)其440nm的吸光度。檢測(cè)結(jié)果示于表6。在表6中，在5小時(shí)的反應(yīng)中使吸光度改變10的酶活性定義為1單位。
表6

ND未檢測(cè)到(至多0.001)。
如以上表6所示，在使用偶氮酪蛋白試劑的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到蛋白酶活性。橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的培養(yǎng)上清液組分的蛋白酶活性至多是橋石短小芽孢桿菌HPD31的培養(yǎng)上清液組分的1/120。
實(shí)施例16使用Azocoll測(cè)定HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性在TM液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)橋石短小芽孢桿菌HPD31細(xì)胞和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3細(xì)胞48小時(shí)。培養(yǎng)后，離心并分離培養(yǎng)液，用Centricon plus-20(Biomax-5)將每種培養(yǎng)上清液組分濃縮10倍。接著，將300μl濃縮的上清液與相同量的含10mM CaCl2和1％Azocoll的100mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5)混合，并于37℃恒溫?cái)嚢?小時(shí)。在反應(yīng)后，立即離心反應(yīng)溶液，檢測(cè)培養(yǎng)上清液520nm的吸光度，由此測(cè)定酶活性。結(jié)果示于表7。在37℃、1小時(shí)的反應(yīng)中使520nm吸光度增加0.01的酶活性定義為1單位。
表7

ND未檢測(cè)到(至多0.1)。
如以上表7所示，在使用Azocoll試劑的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到蛋白酶活性。橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的培養(yǎng)上清液組分的蛋白酶活性至多是橋石短小芽孢桿菌HPD31的培養(yǎng)上清液組分的1/330。
以上的實(shí)施例14至實(shí)施例16表明，與已知菌株橋石短小芽孢桿菌HPD31相比，本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性顯著降低。
評(píng)價(jià)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞內(nèi)蛋白酶活性接著，按照明膠-PAGE法和使用偶氮酪蛋白的方法評(píng)價(jià)本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞內(nèi)蛋白酶活性。橋石短小芽孢桿菌HPD31用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
實(shí)施例17在非變性條件下以明膠-PAGE評(píng)價(jià)橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞內(nèi)蛋白酶活性在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)橋石短小芽孢桿菌HPD31細(xì)胞和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3細(xì)胞48小時(shí)。培養(yǎng)后，通過離心收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞，然后通過超聲破碎，再離心獲得胞內(nèi)組分。在非變性條件下對(duì)胞內(nèi)組分進(jìn)行電泳。非變性條件下的電泳如下進(jìn)行向10μl胞內(nèi)組分中加入50mM(為終濃度)Tris-HCl(pH 6.8)和10％甘油，然后加至含0.1％明膠的10％丙烯酰胺凝膠，用無SDS的Tris-甘氨酸緩沖溶液于4℃以10mA恒定電流進(jìn)行10小時(shí)電泳。
在電泳后，將丙烯酰胺凝膠在含10mM CaCl2的50mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5)中于37℃恒溫放置24小時(shí)，然后用含0.1％酰胺黑、30％甲醇和10％乙酸的染色溶液染色30分鐘，用不含酰胺黑的相同溶液脫色。結(jié)果如圖3所示。
如圖3所示，橋石短小芽孢桿菌HPD31的胞內(nèi)組分由于其蛋白水解活性而產(chǎn)生代表明膠分解的清晰條帶，但橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞內(nèi)組分未產(chǎn)生代表明膠分解的清晰條帶。
實(shí)施例18使用偶氮酪蛋白測(cè)定橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞內(nèi)蛋白酶活性將200μl以和實(shí)施例17相同的方式制備的橋石短小芽孢桿菌HPD31胞內(nèi)組分或橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3胞內(nèi)組分與400μl酶反應(yīng)溶液(100mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.2％偶氮酪蛋白、10mM CaCl2)混合，并放置于37℃恒溫1.5小時(shí)，然后通過向其中加入2.5％(為終濃度)TCA終止反應(yīng)。接著，離心反應(yīng)溶液，并檢測(cè)上清液440nm的吸光度。使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照Bradford法定量測(cè)定用于反應(yīng)的粗酶溶液中的蛋白總量。結(jié)果示于表8。在37℃、1小時(shí)的反應(yīng)中使440nm吸光度增加0.01的酶活性定義為1單位。
表8

如以上表8所示，橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞內(nèi)蛋白酶活性降低至橋石短小芽孢桿菌HPD31的約1/8。
以上的實(shí)施例17和實(shí)施例18表明，與橋石短小芽孢桿菌HPD31相比，本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3的胞內(nèi)蛋白酶活性顯著降低。
用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3分泌和生產(chǎn)重組蛋白接著，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)使用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的重組蛋白的生產(chǎn)和降解。首先，測(cè)試用該菌株分泌生產(chǎn)重組蛋白的情況。
所進(jìn)行的測(cè)試涉及對(duì)應(yīng)地在使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主分泌生產(chǎn)的情況下已被部分降解的重組蛋白。
所述在使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主分泌生產(chǎn)時(shí)被部分降解的蛋白是豬源IL-1β成熟形式(EMBL登錄號(hào)X74568)；大腸桿菌K12菌株來源的麥芽糖結(jié)合蛋白成熟形式(EMBL登錄號(hào)AAB59056)；牛源巨噬細(xì)胞集落刺激因子成熟形式(GenBANK登錄號(hào)NM_174026.1)；具有豬丹毒抗原性的豬丹毒抗原蛋白的一部分EN2(JP-A 2000-279179)；以及作為具有親密素抗原性的大腸桿菌O157:H7菌株來源的親密素(SWISS-PROT登錄號(hào)P43261)的一部分的多肽(Intimin(339-575))。橋石短小芽孢桿菌HPD31用作對(duì)照。
實(shí)施例19使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3分泌生產(chǎn)豬IL-1β蛋白使用有義引物(SEQ ID NO26，圖26，其中NcoI識(shí)別序列和編碼部分信號(hào)肽的序列加入到編碼豬源IL-1β成熟形式(EMBL登錄號(hào)X74568)(下文稱為豬IL-1β)的N端氨基酸殘基的DNA序列中)和反義引物(SEQ ID NO27，圖27，其中HindIII識(shí)別序列加入到編碼其C端氨基酸殘基的DNA序列中)，使用豬源IL-1βcDNA作為模板進(jìn)行PCR。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶NcoI和HindIII處理通過PCR擴(kuò)增的DNA片段，并將其插入到pNY301載體的NcoI/HindIII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建豬IL-1β分泌生產(chǎn)載體。豬IL-1β分泌生產(chǎn)載體稱為pNY301-pIL-1β。
接著，按照電穿孔法將pNY301-pIL-1β導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3中，由此構(gòu)建其轉(zhuǎn)化子。接著，在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子90小時(shí)。培養(yǎng)后，離心和分離培養(yǎng)液，獲得的培養(yǎng)上清液進(jìn)行10-25％濃度梯度丙烯酰胺凝膠電泳。在電泳后，使用半干蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。接著，按照普通方法，使用抗豬IL-1β抗體對(duì)轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，由此檢測(cè)豬IL-1β。
結(jié)果，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的樣品產(chǎn)生清晰條帶，表明豬IL-1β降解，但使用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的樣品不產(chǎn)生表明豬IL-1β降解的條帶，如圖5所示。
在電泳后，用CBB染色凝膠，以檢測(cè)蛋白條帶，并通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于豬IL-1β的條帶的光密度，測(cè)定培養(yǎng)液中積聚的豬IL-1β的量。
表9

如表9所示，與使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-S5作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中的情況相比，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中的豬IL-1β的量增至至少約2.5倍。
實(shí)施例20使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3分泌生產(chǎn)大腸桿菌MBP使用有義引物(SEQ ID NO28，圖28，其中PstI識(shí)別序列加入到編碼大腸桿菌K12菌株來源的麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)成熟形式(EMBL登錄號(hào)AAB59056)(下文稱為大腸桿菌MBP)的N端氨基酸殘基的DNA序列中)和反義引物(SEQ ID NO29，圖29，其中HindIII識(shí)別序列加入到編碼其C端氨基酸殘基的DNA序列中)，使用大腸桿菌K12菌株基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶PstI和HindIII處理通過PCR擴(kuò)增的DNA片段，并將其插入到pNY301載體的PstI/HindIII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建大腸桿菌MBP分泌生產(chǎn)載體。大腸桿菌MBP分泌生產(chǎn)載體稱為pNY301-MBP。
接著，按照電穿孔法將pNY301-MBP導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3中，由此構(gòu)建其轉(zhuǎn)化子。接著，在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子72小時(shí)。培養(yǎng)后，離心和分離培養(yǎng)液，獲得的培養(yǎng)上清液以和實(shí)施例19相同的方式進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的樣品產(chǎn)生清晰條帶，表明大腸桿菌MBP降解，但使用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的樣品不產(chǎn)生表明大腸桿菌MBP降解的條帶。
在電泳后，用CBB染色凝膠，以檢測(cè)蛋白條帶，并通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于大腸桿菌MBP的條帶的光密度，測(cè)定培養(yǎng)液中積聚的大腸桿菌MBP的量。結(jié)果示于表10。
表10

如表10所示，與使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中的情況相比，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中的大腸桿菌MBP的量增至約2倍。
實(shí)施例21使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3分泌生產(chǎn)牛M-CSF使用有義引物(SEQ ID NO30，圖30，其中BamHI識(shí)別序列加入到編碼牛源巨噬細(xì)胞集落刺激因子成熟形式(GenBANK登錄號(hào)NM_174026.1)(下文稱為牛M-CSF)的N端氨基酸殘基的DNA序列中)和反義引物(SEQ ID NO31，圖31，其中HindIII識(shí)別序列加入到編碼其C端氨基酸殘基的DNA序列中)，使用牛M-CSF cDNA作為模板進(jìn)行PCR。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和HindIII處理通過PCR擴(kuò)增的DNA片段，并將其插入到pNY301載體的BamHI/HindIII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建牛M-CSF分泌生產(chǎn)載體。牛M-CSF分泌生產(chǎn)載體稱為pNY301-M-CSF。
接著，按照電穿孔法將pNY301-M-CSF導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3中，由此構(gòu)建其轉(zhuǎn)化子。接著，在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子72小時(shí)。培養(yǎng)后，離心和分離培養(yǎng)液，獲得的培養(yǎng)上清液組分以和實(shí)施例19相同的方式進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的樣品產(chǎn)生清晰條帶，表明牛M-CSF降解，但使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的樣品不產(chǎn)生表明牛M-CSF降解的條帶。
在電泳后，用CBB染色凝膠，以檢測(cè)蛋白條帶，并通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于牛M-CSF的條帶的光密度，測(cè)定培養(yǎng)液中積聚的蛋白量。結(jié)果示于表11。
表11

如表11所示，與使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中的情況相比，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中積聚的牛M-CSF的量增加至約3倍。
實(shí)施例22使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3分泌生產(chǎn)EN2
按照電穿孔法將表達(dá)豬丹毒抗原蛋白的一部分-EN2(JP-A2000-279179)的質(zhì)粒載體pNH300 en2導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3中，由此構(gòu)建其轉(zhuǎn)化子，在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子90小時(shí)。
培養(yǎng)后，離心和分離培養(yǎng)液，獲得的培養(yǎng)上清液組分以和實(shí)施例19相同的方式進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的樣品產(chǎn)生清晰條帶，表明EN2降解，但使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的樣品不產(chǎn)生表明EN2降解的條帶。
在電泳后，用CBB染色凝膠，以檢測(cè)蛋白條帶，并通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于EN2的條帶的光密度，測(cè)定培養(yǎng)液中積聚的蛋白量。結(jié)果示于表12。
表12

如表12所示，與使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中的情況相比，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中積聚的EN2的量增加至約2倍。
實(shí)施例23使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3生產(chǎn)親密素(339-575)使用有義引物(SEQ ID NO32，圖32，其中BamHI識(shí)別序列加入到對(duì)應(yīng)于成熟親密素的第339個(gè)氨基酸序列的DNA序列中)和反義引物(SEQ ID NO33，圖33，其中HindIII識(shí)別序列加入到對(duì)應(yīng)于其第575個(gè)氨基酸附近的氨基酸序列的DNA序列中)，使用親密素基因作為模板進(jìn)行PCR。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII和BamHI處理通過PCR擴(kuò)增的DNA片段，并將其插入到pNY301的BamHI/HindIII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建表達(dá)多肽部分的質(zhì)粒載體，該多肽部分對(duì)應(yīng)于大腸桿菌O157:H7菌株來源的親密素的第339-575位氨基酸殘基的氨基酸序列(SWISS-PORT登錄號(hào)P43261)(下文稱為親密素(339-575))。親密素(339-575)分泌生產(chǎn)載體稱為pNY301-Intimin。
接著，按照電穿孔法將pNY301-Intimin導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3中，由此構(gòu)建其轉(zhuǎn)化子。接著，在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子90小時(shí)。培養(yǎng)后，離心和分離培養(yǎng)液，獲得的培養(yǎng)上清液組分以和實(shí)施例19相同的方式進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的樣品產(chǎn)生清晰條帶，表明親密素(339-575)降解，但使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的樣品不產(chǎn)生表明親密素(339-575)降解的條帶。
在電泳后，用CBB染色凝膠，以檢測(cè)蛋白條帶，并通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于親密素(339-575)的條帶的光密度，測(cè)定培養(yǎng)液中積聚的親密素(339-575)的量。結(jié)果示于表13。
表13

如表13所示，與使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中的情況相比，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主生產(chǎn)的培養(yǎng)液中積聚的親密素(339-575)的量增加至約2倍。
實(shí)施例19至實(shí)施例23表明當(dāng)橋石短小芽孢桿菌HPD31用作宿主時(shí)，分泌和生產(chǎn)的部分重組蛋白降解。但是，當(dāng)使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主時(shí)，蛋白的積聚量比使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的情況增加。
顯然，這些結(jié)果是由于橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3用作宿主而產(chǎn)生的，所分泌和生產(chǎn)的蛋白的降解被顯著抑制。
橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3胞內(nèi)積聚和生產(chǎn)重組蛋白接著，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)并非在分泌生產(chǎn)中、而是在胞內(nèi)積聚生產(chǎn)中使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主時(shí)重組蛋白的生產(chǎn)和降解。豬源干擾素-γ(PIR登錄號(hào)S10513)和犬源干擾素-β(GenBANK登錄號(hào)E11229)用作所述重組蛋白。當(dāng)將這些蛋白中的每一種用于使用橋石短小芽孢桿菌HPD31進(jìn)行胞內(nèi)積聚生產(chǎn)時(shí)，所生產(chǎn)的蛋白在細(xì)胞中被部分降解。
橋石短小芽孢桿菌HPD31用作對(duì)照。
實(shí)施例24使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3胞內(nèi)積聚生產(chǎn)重組豬源干擾素γ使用有義引物(SEQ ID NO34，圖34，其中含NcoI識(shí)別序列的ccatggct序列和編碼MetAla的序列加入到編碼豬源干擾素-γ成熟形式(PIR登錄號(hào)S10513)(下文稱為豬IFN-γ)的N端氨基酸殘基的DNA序列中)和反義引物(SEQ ID NO35，圖35，其中HindIII識(shí)別序列加入到編碼其C端氨基酸殘基的DNA序列中)，使用豬源干擾素-γcDNA作為模板進(jìn)行PCR。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶NcoI和HindIII處理通過PCR擴(kuò)增的DNA片段，并將其插入到在pNY301載體的翻譯起始甲硫氨酸上存在的BspHI/HindIII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建豬IFN-γ表達(dá)載體。豬IFN-γ表達(dá)載體稱為pNY301-pIFN-γ。因?yàn)榇藀NY301-pIFN-γ不具有編碼分泌信號(hào)肽的DNA序列，所以所生產(chǎn)的豬IFN-γ在胞內(nèi)積聚。
接著，按照電穿孔法將pNY301-pIFN-γ導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3中，由此構(gòu)建其轉(zhuǎn)化子。作為對(duì)照，構(gòu)建其中導(dǎo)入未插入豬IFN-γ基因的pNY301的橋石短小芽孢桿菌HPD31/pNY301。
接著，在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子和橋石短小芽孢桿菌HPD31/pNY301 72小時(shí)。培養(yǎng)后，通過離心由培養(yǎng)液中回收細(xì)胞，并超聲破碎，通過離心收集胞內(nèi)組分。接著，以和實(shí)施例19相同的方式對(duì)胞內(nèi)組分進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。
結(jié)果，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的樣品產(chǎn)生清晰條帶，表明豬IFN-γ降解，但使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的樣品不產(chǎn)生表明豬IFN-γ降解的條帶，如圖6所示。
在電泳后，用CBB染色凝膠，以檢測(cè)蛋白條帶，并通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于豬IFN-γ的條帶的光密度，測(cè)定細(xì)胞中積聚的蛋白的量。結(jié)果示于表14。
表14

如表14所示，與使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主生產(chǎn)的細(xì)胞中的情況相比，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主生產(chǎn)的豬IFN-γ的胞內(nèi)積聚量增加至約2倍。
實(shí)施例25使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3胞內(nèi)積聚生產(chǎn)犬源干擾素-β使用有義引物(SEQ ID NO36，圖36，其中BspHI識(shí)別序列加入到編碼犬源干擾素-β成熟形式(GenBANK登錄號(hào)E11229)(下文稱為犬IFN-β)的N端氨基酸殘基的DNA序列中)和反義引物(SEQ IDNO37，圖37，其中HindIII識(shí)別序列加入到編碼其C端氨基酸殘基的DNA序列中)，使用犬源干擾素-βcDNA作為模板進(jìn)行PCR。接著，用限制性內(nèi)切核酸酶BspHI和HindIII處理通過PCR擴(kuò)增的DNA片段，并將其插入到在pNY301載體的翻譯起始甲硫氨酸上存在的BspHI/HindIII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)中，由此構(gòu)建犬IFN-β表達(dá)載體。犬IFN-β表達(dá)載體稱為pNY301-cIFN-β。因?yàn)榇藀NY301-cIFN-β不具有編碼分泌信號(hào)肽的DNA序列，所以所生產(chǎn)的犬IFN-β在胞內(nèi)積聚。
接著，按照電穿孔法將pNY301-cIFN-β導(dǎo)入橋石短小芽孢桿菌HPD31和橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3中，由此構(gòu)建其轉(zhuǎn)化子。接著，在TM液體培養(yǎng)基中于30℃分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子72小時(shí)。培養(yǎng)后，通過離心由培養(yǎng)液中回收細(xì)胞，并超聲破碎，通過離心收集胞內(nèi)組分。接著，以和實(shí)施例21相同的方式對(duì)胞內(nèi)組分進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的樣品產(chǎn)生清晰條帶，表明犬IFN-β降解，但使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主的樣品不產(chǎn)生表明犬IFN-β降解的條帶。
在電泳后，用CBB染色凝膠，以檢測(cè)蛋白條帶，并通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于犬IFN-β的條帶的光密度，測(cè)定細(xì)胞中積聚的蛋白量。結(jié)果示于表15。
表15

如表15所示，與使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主生產(chǎn)的細(xì)胞中的情況相比，使用橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主生產(chǎn)的犬IFN-β的胞內(nèi)積聚量增加至約1.6倍。
實(shí)施例24和實(shí)施例25表明當(dāng)在重組蛋白生產(chǎn)中使用本發(fā)明的橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3作為宿主時(shí)，則蛋白的積聚量比使用橋石短小芽孢桿菌HPD31作為宿主的情況增加。顯然，這些結(jié)果是由于胞內(nèi)蛋白酶基因imp基因失活而使胞內(nèi)積聚的重組蛋白受到顯著抑制而產(chǎn)生的。
保藏號(hào)FERM BP-08497保藏名稱橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3保藏單位名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心保藏單位地址日本茨城縣筑波市東1丁1番1中央第6，郵編305-8566保藏日2003年9月11日保藏號(hào)FERM BP-6863保藏名稱橋石短小芽孢桿菌HPD31(FERM BP-1087)保藏單位名稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所保藏單位地址日本茨城縣筑波市東1丁1番3號(hào)，郵編305-8566保藏日1999年8月31日保藏號(hào)FERM BP-6623保藏名稱短芽孢桿菌HPD31-S5保藏單位名稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所保藏單位地址日本茨城縣筑波市東1丁1番3號(hào)，郵編305-8566保藏日1999年1月19日序列表<110>日下田醬油股份有限公司<120>新型橋石短小芽孢桿菌和使用該微生物作為宿主生產(chǎn)蛋白的方法<130>6826<141>2004-11-08<160>37<210>1<211>756<212>DNA<213>橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)<400>1atgggtgccg atatcaaaaa tgcgagtcaa ccatttctga ccaatgacca agtgaaagat60ttgatagcca agagccaagc tggcgatacg gatgcacgtg agcttctcgt gaatagcaat120atcagactgg tctggtccgt cgtccagcgc tttatcaacc gcgggtatga agcggatgat180ttgtttcaga tcggttgcat tggcttgctc aaggccgttg acaagttcga tctttcgtac240gatgtgagat tttcgaccta tgcggtgcca atgatcatcg gagaaattca acgctttttg300cgcgatgacg gtacggtlaa ggtcagtcga tcgttaaaag aaacagcgaa taaggtgcgg360cgatcaaagg atgaattgta caagcaattc ggccgtgccc ccacgatcgc agaagtggca420gaagcagtgg gaatcacgcc ggaggaagta gtctttgcgc aagaggcaag cagagcgcct480tcctccatcc atgagaccgt ttttgaaaat gacggcgatc ccatcacact gatcgatcag540atagcggatg aaggtgtgaa caagtggttt gagaaaattg ccttgaagga cgccatcagc600aggctgagcg agcgtgagca gctcatcgtc tacctgcgct attacaagga tcagacacag660tctgaggtag cagagcgtct agggatttcg caggtccagg tctcgcgtct ggaaaagcgt720atcctgctaa cgatcaagga gcaaattgaa cattag 756<210>2<211>251<212>PRT<213>橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)<400>2Met Gly Ala Asp Ile Lys Asn Ala Ser Gln Pro Phe Leu Thr Asn Asp5 10 15Gln Val Lys Asp Leu Ile Ala Lys Ser Gln Ala Gly Asp Thr Asp Ala20 25 30Arg Glu Leu Leu Val Asn Ser Asn Ile Arg Leu Val Trp Ser Val Val35 40 45
Gln Arg Phe Ile Asn Arg Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Leu Phe Gln Ile50 55 60Gly Cys Ile Gly Leu Leu Lys Ala Val Asp Lys Phe Asp Leu Ser Tyr65 70 75 80Asp Val Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Val Pro Met Ile Ile Gly Glu Ile85 90 95Gln Arg Phe Leu Arg Asp Asp Gly Thr Val Lys Val Ser Arg Ser Leu100 105 110Lys Glu Thr Ala Asn Lys Val Arg Arg Ser Lys Asp Glu Leu Tyr Lys115 120 125Gln Phe Gly Arg Ala Pro Thr Ile Ala Glu Val Ala Glu Ala Val Gly130 135 140Ile Thr Pro Glu Glu Val Val Phe Ala Gln Glu Ala Ser Arg Ala Pro145 150 155 160Ser Ser Ile His Glu Thr Val Phe Glu Asn Asp Gly Asp Pro Ile Thr165 170 175Leu Ile Asp Gln Ile Ala Asp Glu Gly Val Asn Lys Trp Phe Glu Lys180 185 190Ile Ala Leu Lys Asp Ala Ile Ser Arg Leu Ser Glu Arg Glu Gln Leu195 200 205Ile Val Tyr Leu Arg Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gln Ser Glu Val Ala210 215 220Glu Arg Leu Gly Ile Ser Gln Val Gln Val Ser Arg Leu Glu Lys Arg225 230 235 240Ile Leu Leu Thr Ile Lys Glu Gln Ile Glu His245 250<210>3<211>2265<212>DNA<213>橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)<400>3gtgaacgcag tgaagaaagg caagaagcta ttatccatcc tattttcttc ctcactggtc60ctgagcggca ttgcggcggt tccagcgaca gggatggcca agtcaaagga caagccgccg120cttgaagtgg atttgtccac agtgaacatg gatcgtttgg ttaaagcctt gatcgaccaa180ggtgaaatcg acgaggacgc cgaccaggaa gagatcaaca aagctgtgga gaagtttttg240agagacaaga aagttcccca cggcattgat gactccagct ccttcgggaa aaaagcaagc300aaaacccagc tttcggcagt atcaaaggca gcaagcaaag tatccaagct caaagatgac360
aagcaagtgc gcgcttccaa gcgggtacat acggataatc tggtgattgc cctggtcgag420ttcaatgatc tggagcacaa ccaggtgcca aaacaaagcg attccttgtg gacggcagac480ttcgaccaaa agcactacga ggaaatgctg ttcgatcgta aaggctatac gactcctgaa540gggataagca tgaccacgat ggccaagtac tactacgagc aatcgggtga gacatggacc600gtggatgggg ttgtcactcc gtggttgact gccgaaaaag ataagaaatt ctacggtgga660aacgatgaaa acggcaacga tgccaaccca cgcgatctgg tcgtcgagac actggaatct720gtaggggatg ccatcaaggg tcatgaagaa gaatacgacc aacgcgaccc gtatgacttg780gatggagaca gcgatctgat ggagccggat ggcatgctgg acaacctgat gctggttcac840tccggtattg gtgaagagac tggggaagat gcggatgcga tctggtctca ccgctggact900ctgaaaaagc cgacagaaat tccaggcacc agcctgaaag cttacgacta catgattcag960cctgaagatg gcgcacccgg cgtattcgca catgaatacg gacacaacct gggactgcca1020gatctgtatg acacgacaag actgggacat gattcgccgg ttggcgcatg gtcgctgatg1080tcttccggaa gccatacagg taagatcttc caaacccaac caaccggatt tgatccttgg1140tccaaaatga tgctgcagga aatgtatggg ggcaagtgga ttgagccgca agtcatcaat1200tacgaagacc tgaaaaaacg gaaaaagcag gcttcgctct acgatggcag cagcctcgat1260gaagatggca aagtcatcaa gctgaatatg ccgcaagtag agaagacacc gccggttcaa1320ccgaaagacg gcgattattc ttacttctcc gatgagggcg acaatctgaa cacgaagatg1380acttcggaag tgatcgacct gacaggcgcc agctccgcat cgatgagctt cgactcctgg1440agagcgatcg agaccgggta cgactacctg tacgtgaacg tgattgatgt cgactcaggt1500gagagcacaa cagtaaaaga gtacgatgac gaaaccaaag gctgggataa ggaagaaatc1560agcctgaacg atttcgctgg caaaaagatt caagtcgagt tcaactacgt gacggatggc1620ggcttggcga tgtccggctt ctatctggat aattttgcag tcacagcaga cggcgaagta1680gtcttctcgg atgatgcaga aggcgaccag aagtttgatc tggatggatt catccatttc1740gacggcgaag gcaaaatgta cgacgcgtac tacctggtag agctgcgctc ccatgaaggc1800gtggacgagg gtctgaaata cttccgccgc aatgacacat tcttcacgta tgatccaggt1860ctggtgatct ggtactacga tggacgcttt ggcaaaacgc aagacaacaa caccagcaac1920catccaggct acggcatgct gggcgtagtc gatgcgcatc aggaagttcg ttactggaat1980aacgatgagg gcaacgagga ggccattgcc gactcccgtt accaagtgaa cgatgcggca2040ttcagcccga acaaaacctc cggcatggat ctcgactaca ttctcggcac gatggattac2100gagccgctga aaggcattac cgtattcaaa gacagtgatg attacacgat gccggaagtt2160ccggaaatcg gaaaaatcct gccgaagatc ggtctgcaaa tcaaattaat tcgtgtgtcc2220aagaaattca cgaacgcaca ggtcgagttc tccatcaaaa aataa2265<210>4<211>754<212>PRT<213>橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)<400>4
Val Asn Ala Val Lys Lys Gly Lys Lys Leu Leu Ser Ile Leu Phe Ser5 10 15Ser Ser Leu Val Leu Ser Gly Ile Ala Ala Val Pro Ala Thr Gly Met20 25 30Ala Lys Ser Lys Asp Lys Pro Pro Leu Glu Val Asp Leu Ser Thr Val35 40 45Asn Met Asp Arg Leu Val Lys Ala Leu Ile Asp Gln Gly Glu Ile Asp50 55 60Glu Asp Ala Asp Gln Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Glu Lys Phe Leu65 70 75 80Arg Asp Lys Lys Val Pro His Gly Ile Asp Asp Ser Ser Ser Phe Gly85 90 95Lys Lys Ala Ser Lys Thr Gln Leu Ser Ala Val Ser Lys Ala Ala Ser100 105 110Lys Val Ser Lys Leu Lys Asp Asp Lys Gln Val Arg Ala Ser Lys Arg115 120 125Val His Thr Asp Asn Leu Val Ile Ala Leu Val Glu Phe Asn Asp Leu130 135 140Glu His Asn Gln Val Pro Lys Gln Ser Asp Ser Leu Trp Thr Ala Asp145 150 155 160Phe Asp Gln Lys His Tyr Glu Glu Met Leu Phe Asp Arg Lys Gly Tyr165 170 175Thr Thr Pro Glu Gly Ile Ser Met Thr Thr Met Ala Lys Tyr Tyr Tyr180 185 190Glu Gln Ser Gly Glu Thr Trp Thr Val Asp Gly Val Val Thr Pro Trp195 200 205Leu Thr Ala Glu Lys Asp Lys Lys Phe Tyr Gly Gly Asn Asp Glu Asn210 215 220Gly Asn Asp Ala Asn Pro Arg Asp Leu Val Val Glu Thr Leu Glu Ser225 230 235 240Val Gly Asp Ala Ile Lys Gly His Glu Glu Glu Tyr Asp Gln Arg Asp245 250 255Pro Tyr Asp Leu Asp Gly Asp Ser Asp Leu Met Glu Pro Asp Gly Met260 265 270Leu Asp Asn Leu Met Leu Val His Ser Gly Ile Gly Glu Glu Thr Gly275 280 285Glu Asp Ala Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Trp Thr Leu Lys Lys Pro
290 295 300Thr Glu Ile Pro Gly Thr Ser Leu Lys Ala Tyr Asp Tyr Met Ile Gln305 310 315 320Pro Glu Asp Gly Ala Pro Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asn325 330 335Leu Gly Leu Pro Asp Leu Tyr Asp Thr Thr Arg Leu Gly His Asp Ser340 345 350Pro Val Gly Ala Trp Ser Leu Met Ser Ser Gly Ser His Thr Gly Lys355 360 365Ile Phe Gln Thr Gln Pro Thr Gly Phe Asp Pro Trp Ser Lys Met Met370 375 380Leu Gln Glu Met Tyr Gly Gly Lys Trp Ile Glu Pro Gln Val Ile Asn385 390 395 400Tyr Glu Asp Leu Lys Lys Arg Lys Lys Gln Ala Ser Leu Tyr Asp Gly405 410 415Ser Ser Leu Asp Glu Asp Gly Lys Val Ile Lys Leu Asn Met Pro Gln420 425 430Val Glu Lys Thr Pro Pro Val Gln Pro Lys Asp Gly Asp Tyr Ser Tyr435 440 445Phe Ser Asp Glu Gly Asp Asn Leu Asn Thr Lys Met Thr Ser Glu Val450 455 460Ile Asp Leu Thr Gly Ala Ser Ser Ala Ser Met Ser Phe Asp Ser Trp465 470 475 480Arg Ala Ile Glu Thr Gly Tyr Asp Tyr Leu Tyr Val Asn Val Ile Asp485 490 495Val Asp Ser Gly Glu Ser Thr Thr Val Lys Glu Tyr Asp Asp Glu Thr500 505 510Lys Gly Trp Asp Lys Glu Glu Ile Ser Leu Asn Asp Phe Ala Gly Lys515 520 525Lys Ile Gln Val Glu Phe Asn Tyr Val Thr Asp Gly Gly Leu Ala Met530 535 540Ser Gly Phe Tyr Leu Asp Asn Phe Ala Val Thr Ala Asp Gly Glu Val545 550 555 560Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly Asp Gln Lys Phe Asp Leu Asp Gly565 570 575Phe Ile His Phe Asp Gly Glu Gly Lys Met Tyr Asp Ala Tyr Tyr Leu580 585 590
Val Glu Leu Arg Ser His Glu Gly Val Asp Glu Gly Leu Lys Tyr Phe595 600 605Arg Arg Asn Asp Thr Phe Phe Thr Tyr Asp Pro Gly Leu Val Ile Trp610 615 620Tyr Tyr Asp Gly Arg Phe Gly Lys Thr Gln Asp Asn Asn Thr Ser Asn625 630 635 640His Pro Gly Tyr Gly Met Leu Gly Val Val Asp Ala His Gln Glu Val645 650 655Arg Tyr Trp Asn Ash Asp Glu Gly Asn Glu Glu Ala Ile Ala Asp Ser660 665 670Arg Tyr Gln Val Asn Asp Ala Ala Phe Ser Pro Asn Lys Thr Ser Gly675 680 685Met Asp Leu Asp Tyr Ile Leu Gly Thr Met Asp Tyr Glu Pro Leu Lys690 695 700Gly Ile Thr Val Phe Lys Asp Ser Asp Asp Tyr Thr Met Pro Glu Val705 710 715 720Pro Glu Ile Gly Lys Ile Leu Pro Lys Ile Gly Leu Gln Ile Lys Leu725 730 735Ile Arg Val Ser Lys Lys Phe Thr Asn Ala Gln Val Glu Phe Ser Ile740 745 750Lys Lys754<210>5<211>1362<212>DNA<213>橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)<400>5atgaaccatc ctgattttcg cgatctaccc gcctgcatgg aagacgtaac cctcgctgcc60ctggacgagt acactggtcc accagatccg accgaatacc aatcattgta tggacgcttg120caagaggttg ccgaaactct ccctccgctc tatcgggagc atgtgtatca cccttttctt180caagcgatgg acaagttgtc tgagtcagga tttgcgcaga tgctccgtcg agatcctcaa240aaagagcgag aagccggtct gttttgcgat atcgcacagg ccattctgca aaacggcgaa300gcgtatgaac gcgatgccac ggatgccttt caggaagtag tcagcgattt gtacgacggt360tttttaagcg aggaagacag gagtggcatc aaaccgcctg atgaaagctt gattgctcct420ctggtcaaat ggggacgccc gcaattcgga ccttatacgt ggacagctga agccgctgcc480cattttggca tcaagacggg cattgtcaat ttgcccccgg caaacgcccg cctgggtctg540ctcgcgtggt ctgcattagg tcacgaaacg gctggacacg acattctcca cgccgacacc600
ggtttgcttg gagaactgca gcaaaccgtc tatgacgctt tgtttgatga gcttcacaat660cggacgctgg cggactactg gtcgctccga atcgacgaga ctgcctccga cgttttggga720atcctgaaca ccggccccgc tgcagggatt ggactgattg gatatttccg cggccttaat780aaggcgtaca ccggacaagc aacactgcgg aatacagggc cacagaatga cccacatcca840gcagacatct tgcgcggtta tcttgctgct gagactgctc gtctgctgca ttttgacaac900gcatccgact gggcacaggc acttctcgag gaaaccaggc gtgatcttaa aggcatcaca960ataggcagag cctctttgga tgcagaaacc gctcaaaaat ctgctgccat tgtcgctcgc1020acaattatgg aagcacgcct gctcagtctg gaaggtcatg ccctcgggca aattcaaaac1080tggcacaacg aggatgaacg aatcgttcag gaaattcgct cccattttac aggttccctg1140accgtgcaag acggcattgt ttcgggtatg tatgctgcgc atgtcgtggc agcagccgtc1200caagcagccg tttcaggaga gatggatacc tccgctgcct tcacagggat gaaaaccttg1260ctgaagagca tgcacgacgc caatccttcc tggggacctc tctatgtacg atatcgcggt1320gatctcactc cgcatcgcat ttactcccgt tctgcgagct ag 1362<210>6<211>453<212>PRT<213>橋石短小芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)<400>6Met Asn His Pro Asp Phe Arg Asp Leu Pro Ala Cys Met Glu Asp Val5 10 15Thr Leu Ala Ala Leu Asp Glu Tyr Thr Gly Pro Pro Asp Pro Thr Glu20 25 30Tyr Gln Ser Leu Tyr Gly Arg Leu Gln Glu Val Ala Glu Thr Leu Pro35 40 45Pro Leu Tyr Arg Glu His Val Tyr His Pro Phe Leu Gln Ala Met Asp50 55 60Lys Leu Ser Glu Ser Gly Phe Ala Gln Met Leu Arg Arg Asp Pro Gln65 70 75 80Lys Glu Arg Glu Ala Gly Leu Phe Cys Asp Ile Ala Gln Ala Ile Leu85 90 95Gln Asn Gly Glu Ala Tyr Glu Arg Asp Ala Thr Asp Ala Phe Gln Glu100 105 110Val Val Ser Asp Leu Tyr Asp Gly Phe Leu Ser Glu Glu Asp Arg Ser115 120 125Gly Ile Lys Pro Pro Asp Glu Ser Leu Ile Ala Pro Leu Val Lys Trp130 135 140Gly Arg Pro Gln Phe Gly Pro Tyr Thr Trp Thr Ala Glu Ala Ala Ala
145 150 155 160His Phe Gly Ile Lys Thr Gly Ile Val Asn Leu Pro Pro Ala Asn Ala165 170 175Arg Leu Gly Leu Leu Ala Trp Ser Ala Leu Gly His Glu Thr Ala Gly180 185 190His Asp Ile Leu His Ala Asp Thr Gly Leu Leu Gly Glu Leu Gln Gln195 200 205Thr Val Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Glu Leu His Asn Arg Thr Leu Ala210 215 220Asp Tyr Trp Ser Leu Arg Ile Asp Glu Thr Ala Ser Asp Val Leu Gly225 230 235 240Ile Leu Asn Thr Gly Pro Ala Ala Gly Ile Gly Leu Ile Gly Tyr Phe245 250 255Arg Gly Leu Asn Lys Ala Tyr Thr Gly Gln Ala Thr Leu Arg Asn Thr260 265 270Gly Pro Gln Asn Asp Pro His Pro Ala Asp Ile Leu Arg Gly Tyr Leu275 280 285Ala Ala Glu Thr Ala Arg Leu Leu His Phe Asp Asn Ala Ser Asp Trp290 295 300Ala Gln Ala Leu Leu Glu Glu Thr Arg Arg Asp Leu Lys Gly Ile Thr305 310 315 320Ile Gly Arg Ala Ser Leu Asp Ala Glu Thr Ala Gln Lys Ser Ala Ala325 330 335Ile Val Ala Arg Thr Ile Met Glu Ala Arg Leu Leu Ser Leu Glu Gly340 345 350His Ala Leu Gly Gln Ile Gln Asn Trp His Asn Glu Asp Glu Arg Ile355 360 365Val Gln Glu Ile Arg Ser His Phe Thr Gly Ser Leu Thr Val Gln Asp370 375 380Gly Ile Val Ser Gly Met Tyr Ala Ala His Val Val Ala Ala Ala Val385 390 395 400Gln Ala Ala Val Ser Gly Glu Met Asp Thr Ser Ala Ala Phe Thr Gly405 410 415Met Lys Thr Leu Leu Lys Ser Met His Asp Ala Asn Pro Ser Trp Gly420 425 430Pro Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Gly Asp Leu Thr Pro His Arg Ile Tyr435 440 445
Ser Arg Ser Ala Ser450 452<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>7gggggtacct cactctgtca gcatgctg 28<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>8gggggatccc ggcgtgattc ccactgc 27<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9gggctgcaga tagcggatga aggtgtg 27<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>10gggtctagac ctgcttatac atctgtttcg 30<210>11<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>11gagagaccat ggaccatcct gattttcgcg atctacccg 39<210>12<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>12
agaattcagt ggtggtggtg gtggtggtgg tggctcgcag aacgggagta aatgcgatgc 60<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>13aaaagaattc tttctgcaga acaggatgcg ggggagccgc cgct 44<210>14<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>14aaaaaggatc cttatagcat ctaatcttca acaaact 37<210>15<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>15aaaaaaagat cttgaacgat gacctctaat aattgttaa 39<210>16<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>16aaaagaattc aaatctagaa agtgtgtgct ctgcgaggct gtc43<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>17tccatggcac aatttggtat attatgtaaa 30<210>18<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>18actcgagtta tatgcgtcta tttatgtagg at32
<210>19<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>19ttttttctag actttatgaa tataaagtat agtgtgt 37<210>20<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>20gggggctgca gttatatgcg tctatttatg taggatg 37<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>21aarcgngtnc ayacngayaa yct 23<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>22aanccngtng gytgngtytg gaa 23<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>23cctcgtagtg cttttggtcg aag 23<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>24accaataccg gagtgaacca gca 23<210>25
<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>25actatagggc acgcgtggt 19<210>26<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>26ctcccatggc tttcgctacc cccgtgcagt ccgtggactg c 41<210>27<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>27atataagctt ttagggagag aggacttcca tggt 34<210>28<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>28tttctgcagg taaaatcgaa gaaggtaaac tggta 35<210>29<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>29aaaaagcttt tacttggtga tacgagtctg cgcg 34<210>30<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>30ttttggatcc gaggaggtgt cggagaactg tagccac 37<210>31<211>34
<212>DNA<213>人工序列<400>31aaaaagcttc tacactggca gctcctcctg tctg 34<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>32aaggatcccc gtcatatccg gca 23<210>33<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>33aaaagcttta ggcgttatcc gctttagc 28<210>34<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>34tatatccatg gcttcttact gccaggcgcc cttttttaa 39<210>35<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>35atataagctt ttattttgat gctctctggc cttggaa 37<210>36<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>36atattcatga gcaacgactt gcttcgatcc ca32<210>37<211>36<212>DNA
<213>人工序列<400>37atataagctt tcagttctgg agataatctg taagta3權(quán)利要求
1.橋石短小芽孢桿菌，其不形成孢子。
2.橋石短小芽孢桿菌，其具有以下菌學(xué)特征且不形成孢子(a)形態(tài)學(xué)細(xì)胞大小液體培養(yǎng)基0.4-0.6×1.5-4μm，細(xì)胞類型芽孢桿菌有無孢子無(b)生理學(xué)特性硝酸鹽還原 -，VP實(shí)驗(yàn) -，檸檬酸利用 +，脲酶 -，氧化酶 +，過氧化氫酶 +，(c)其它特性耐溫性于60℃死亡。
3.不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌，其特征在于其與孢子形成相關(guān)的基因hos失活。
4.權(quán)利要求3要求保護(hù)的橋石短小芽孢桿菌，其中所述與孢子形成相關(guān)的基因hos具有SEQ ID NO1的堿基序列。
5.不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌，其胞外和/或胞內(nèi)蛋白酶活性已降低或消失。
6.具有以下菌學(xué)特性且不形成孢子的橋石短小芽孢桿菌(a)形態(tài)學(xué)細(xì)胞大小液體培養(yǎng)基0.4-0.6×1.5-4μm，細(xì)胞類型芽孢桿菌有無孢子無(b)生理學(xué)特性硝酸鹽還原 -，VP實(shí)驗(yàn) -，檸檬酸利用 +，脲酶 -，氧化酶 +，過氧化氫酶 +，(c)其它特性耐溫性于60℃死亡，胞外蛋白酶活性低或沒有，胞內(nèi)蛋白酶活性低或沒有。
7.橋石短小芽孢桿菌，其特征在于其胞外主蛋白酶基因emp失活。
8.權(quán)利要求7要求保護(hù)的橋石短小芽孢桿菌，其中胞外主蛋白酶基因emp具有SEQ ID NO3的堿基序列。
9.橋石短小芽孢桿菌，其特征在于其胞內(nèi)主蛋白酶基因imp失活。
10.權(quán)利要求9要求保護(hù)的橋石短小芽孢桿菌，其中胞內(nèi)主蛋白酶基因imp具有SEQ ID NO5的堿基序列。
11.橋石短小芽孢桿菌，其特征在于其胞外主蛋白酶基因emp和其胞內(nèi)主蛋白酶基因imp失活。
12.權(quán)利要求11要求保護(hù)的橋石短小芽孢桿菌，其不形成孢子。
13.橋石短小芽孢桿菌HPD31-SP3(FERM BP-08479)。
14.橋石短小芽孢桿菌，其通過用其中插入蛋白編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)要求保護(hù)的橋石短小芽孢桿菌構(gòu)建。
15.一種生產(chǎn)蛋白的方法，其特征在于包括培養(yǎng)權(quán)利要求14的橋石短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的步驟。
16.一種生產(chǎn)重組蛋白的方法，其特征在于在重組蛋白生產(chǎn)中，使用權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)要求保護(hù)的橋石短小芽孢桿菌作為宿主。
全文摘要
橋石短小芽孢桿菌表現(xiàn)出其胞外蛋白水解活性極低且其蛋白分泌生產(chǎn)能力極好，但希望不僅菌株的胞外蛋白水解活性進(jìn)一步降低，而且其胞內(nèi)蛋白水解活性也降低。另一方面，當(dāng)橋石短小芽孢桿菌用作蛋白藥物等的宿主時(shí)，還希望其不形成孢子而易于滅菌。通過失活其與孢子形成相關(guān)的基因，并通過克隆和失活其胞外和胞內(nèi)蛋白酶基因，解決了以上問題。
文檔編號(hào)C12N15/01GK1878859SQ20048003274
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月11日
發(fā)明者花方寬, 西條孝幸 申請(qǐng)人:日下田醬油股份有限公司