專利名稱：可用作治療劑的單價(jià)抗體片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和抗體治療學(xué)領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明涉及具有用作治療劑的獨(dú)特特征的新型單價(jià)抗體片段以及所述抗體片段的用途。
背景技術(shù)：
近年來發(fā)現(xiàn)，在多種紊亂和疾病中使用抗體作為診斷和治療劑的前途越來越大。大體上，已經(jīng)做出了大量努力，研究在天然抗體中發(fā)現(xiàn)的抗體序列和結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行修飾以獲取期望特征，這反映了抗體對(duì)于診斷、研究和治療目的的重要性。
普遍的觀點(diǎn)是，理想的治療性抗體應(yīng)具有某些最低限度特征，包括施用于受試患者后的靶特異性、生物穩(wěn)定性和生物利用度，以及足以將治療效果最大化的靶結(jié)合親和力。不幸的是，生成具有所有這些最低限度特征或甚至其中大多數(shù)所述最低限度特性的抗體治療劑的努力所獲得的成就是有限的。例如，全長(zhǎng)抗體諸如IgG展示期望的藥動(dòng)學(xué)(如實(shí)質(zhì)性體內(nèi)半衰期)和優(yōu)良的靶結(jié)合親和力，這是由于一個(gè)抗體分子中存在兩個(gè)抗原結(jié)合臂而衍生的親合效果(avidity effect)。但是，這些全長(zhǎng)抗體由于其分子尺寸較大而遭遇生物利用度的問題。另外，全長(zhǎng)抗體在有些情況中可能在與靶抗原結(jié)合后展示激動(dòng)劑效果(agonistic effects)(這是不想要的)，即使作為Fab片段時(shí)它是拮抗性抗體。參閱如美國(guó)專利號(hào)6,468,529。在期望的治療作用是拮抗效果(antagonistic effect)時(shí)，這種現(xiàn)象是不適宜的。在有些情況中，這種現(xiàn)象可能是由于在與細(xì)胞表面受體結(jié)合后促進(jìn)受體二聚化從而導(dǎo)致受體活化的二價(jià)抗體的“交聯(lián)”效果(“cross-linking”effect)。
盡管認(rèn)為單價(jià)抗體不會(huì)具有“交聯(lián)”效果，然而由于其結(jié)構(gòu)/構(gòu)造的某些內(nèi)在限制，至今未曾希望單價(jià)抗體作為治療劑。例如，F(xiàn)ab形式的單價(jià)抗體在用作治療劑方面具有低劣的藥效學(xué)(如在體內(nèi)不穩(wěn)定且在施用后迅速清除)。另外，與它們的多價(jià)對(duì)應(yīng)物相比，單價(jià)抗體由于缺乏親合結(jié)合效應(yīng)通常具有較低的表觀結(jié)合親和力。
一般而言，用作治療劑的抗體形式的選擇是在接受了每種形式都具有不利限制這一事實(shí)的前提下做出決定的。盡管如此，顯然全長(zhǎng)抗體形式是近幾年所選擇的形式，這很可能是(至少部分)由于其體內(nèi)生物穩(wěn)定性。在生物穩(wěn)定性不像生物利用度那般作為治療功效的關(guān)鍵因素時(shí)，權(quán)衡之后，單價(jià)抗體可能是可接受的。例如，部分由于與全長(zhǎng)抗體相比更好的組織穿透性，單價(jià)Fab抗體可能是將異源分子諸如毒素投遞至靶細(xì)胞或組織使得異源分子在其中發(fā)揮治療作用的較好載體。參閱如美國(guó)專利號(hào)5,169,939。開發(fā)單價(jià)抗體作為治療劑的嘗試的其它實(shí)例包括其中單價(jià)對(duì)于獲得治療效果是至關(guān)重要的背景，如在擔(dān)心抗體的二價(jià)性可能誘導(dǎo)靶細(xì)胞進(jìn)行抗原調(diào)節(jié)從而可能為靶細(xì)胞提供逃避細(xì)胞毒劑、效應(yīng)物和補(bǔ)體的手段時(shí)。下列文獻(xiàn)描述了這些抗體的實(shí)例Cobbold和Waldmann，1984，Nature，308460-462；EP 0 131 424；Glennie和Stevenson，1982，Nature，295712-714；Nielsen和Routledge，2002，Blood，1004067-4073；Stevenson等人，1989，Anticancer Drug Des.，3(4)219-230；Routledge等人，1995，Transplantation，60847-853；Clark等人，1989，Eur.J.Immunol.，19381-388；Bolt等人，1993，Eur.J.Immunol.，23403-411；Routledge等人，1991，Eur.J.Immunol.，212717-2725；Staerz等人，1985，Nature，314628-631；及美國(guó)專利號(hào)5,968,509。值得注意的是，這些單價(jià)抗體片段含有功能性Fc序列，這是因?yàn)橹委熥饔眯枰鼈兊男?yīng)物功能(諸如補(bǔ)體介導(dǎo)的T細(xì)胞裂解)。除了上述情況以外，本領(lǐng)域似乎尚未認(rèn)識(shí)到在作為治療劑使用和/或開發(fā)的單價(jià)抗體中包含F(xiàn)c區(qū)的需要或效用。獲得這些抗體的實(shí)際困難加重了在Fc區(qū)不是治療作用所必需時(shí)在單價(jià)抗體中包含F(xiàn)c區(qū)的不情愿?，F(xiàn)有的抗體生產(chǎn)技術(shù)不能提供有效的方法以較大數(shù)量且以充分純化形式獲得包含單個(gè)抗原結(jié)合構(gòu)件(即單價(jià))和Fc區(qū)的異二聚體。
值得注意的是，為了提高抗體片段的體內(nèi)穩(wěn)定性已經(jīng)做出了一些努力并獲得了不同程度的成功。例如，可以將Fab片段附著到穩(wěn)定性部分諸如聚乙二醇或其它穩(wěn)定化分子諸如異源肽上。參閱如Dennis等人，2002，J.Biol.Chem.，27735035-35043；PCT發(fā)布號(hào)WO 01/45746。
綜上所述，仍然非常需要改良的抗體形式以及生產(chǎn)和使用這些抗體的方法，例如用作治療劑或預(yù)防劑。本文描述的發(fā)明致力于解決這種需要并提供了其它好處。
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發(fā)明公開本發(fā)明提供了在其治療效用、功能性和生產(chǎn)方法方面提供多種優(yōu)勢(shì)的抗體形式。一方面，本發(fā)明的抗體提供了對(duì)于某些非基于免疫應(yīng)答的治療方案至關(guān)重要的單價(jià)特征。例如，在需要拮抗作用的病理?xiàng)l件中和在抗體的二價(jià)性導(dǎo)致不利激動(dòng)作用時(shí)，本發(fā)明抗體的單價(jià)特性導(dǎo)致和/或確保在抗體與靶分子結(jié)合后的拮抗作用。另外，與具有相似/基本上相同的抗原結(jié)合特征的Fab形式相比，本發(fā)明抗體的特征有上佳的藥動(dòng)學(xué)屬性(諸如半衰期延長(zhǎng)和/或體內(nèi)清除率減慢)，由此克服了使用常規(guī)單價(jià)Fab抗體的主要缺點(diǎn)。一方面，本發(fā)明的抗體具有少許免疫效應(yīng)物功能至完全沒有免疫效應(yīng)物功能，這種特性在治療免疫效應(yīng)物應(yīng)答是有害的病理狀況中特別有用。另一方面，本發(fā)明抗體的特征有大大提高產(chǎn)量的改變。另外，與用于生產(chǎn)單價(jià)抗體片段的某些常規(guī)方法(如酶促消化，在有些情況中繼以化學(xué)偶聯(lián))相反，本發(fā)明生產(chǎn)方法的重組本質(zhì)使之有可能獲得具有足夠高度的同質(zhì)性和/或純度的可作為治療劑開發(fā)和/或商品化的抗體群。
因此，一方面，本發(fā)明提供了包含單個(gè)靶分子結(jié)合臂和Fc區(qū)(即Fc多肽的復(fù)合體)的單價(jià)抗體片段，其中所述單價(jià)抗體片段在體內(nèi)比缺乏所述Fc區(qū)的對(duì)應(yīng)抗體片段更加穩(wěn)定。一方面，本發(fā)明提供了包含單個(gè)抗原結(jié)合臂和Fc區(qū)的抗體片段，與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比，所述Fc區(qū)提高抗體片段的穩(wěn)定性(即更加穩(wěn)定，例如展示更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期)，且所述Fc區(qū)包含第一和第二Fc多肽的復(fù)合體，其中只有所述一種Fc多肽而不是二種Fc多肽是N端截短的重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，N端截短的重鏈由或基本上由鉸鏈序列組成，它與重鏈CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的至少一部分連續(xù)相連，足以與第一Fc多肽形成復(fù)合物，并賦予所述提高的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，N端截短的重鏈由或基本上由鉸鏈序列組成，它與能夠與第一Fc多肽形成復(fù)合物的重鏈CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域連續(xù)相連，并賦予所述提高的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，N端截短的重鏈的N端序列是部分或整個(gè)鉸鏈序列(即截短的重鏈所包含的N端包含部分或整個(gè)鉸鏈序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，N端截短的重鏈?zhǔn)荌gG重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)能夠結(jié)合FcRn。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)不具有FcRn結(jié)合以外的免疫效應(yīng)物功能。通常且優(yōu)選的是，N端截短的重鏈不特異結(jié)合抗原。
正如本文所述，本發(fā)明抗體片段的特征是與其Fab片段對(duì)應(yīng)物相比穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段展示的體內(nèi)半衰期是其Fab對(duì)應(yīng)物的至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約350倍、至少約400倍、至少約450倍、至少約500倍。可以通過本領(lǐng)域知道的多種方法來測(cè)量體內(nèi)半衰期，本文描述了其中一些。在一個(gè)實(shí)施方案中，體內(nèi)半衰期是通過對(duì)合適哺乳動(dòng)物(諸如小鼠)施用一定量的抗體并測(cè)量哺乳動(dòng)物中所施用抗體數(shù)量的降低速率而測(cè)量的。
免疫效應(yīng)物功能在某些臨床背景中是不必要的或甚至有害的。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是未糖基化的。這些抗體不展示依賴Fc區(qū)糖基化的實(shí)質(zhì)性免疫效應(yīng)物功能。通常且優(yōu)選的是，本發(fā)明的未糖基化抗體不展示實(shí)質(zhì)性免疫效應(yīng)物功能，除了結(jié)合FcRn。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段不具有實(shí)質(zhì)性效應(yīng)物功能或完全缺乏FcRn結(jié)合以外的效應(yīng)物功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物功能指補(bǔ)體裂解。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)物功能指抗體依賴性細(xì)胞毒性作用(ADCC)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段結(jié)合FcRn。可以通過本領(lǐng)域知道的多種方法生產(chǎn)未糖基化抗體。方便的方法包括在原核宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌中表達(dá)抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段是糖基化的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域知道的方法來完成糖基化，如通過在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞諸如中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中生成抗體。
在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段不靶向免疫應(yīng)答的成分，因此其治療作用的機(jī)制不包括免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)和/或參與。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段具有少許免疫抑制特性至沒有免疫抑制特性。例如，所述免疫抑制特性可以包括直接或間接招致T細(xì)胞耗損的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體片段不特異結(jié)合T細(xì)胞表面抗原，它在有些實(shí)施方案中指CD3或CD4。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞表面抗原指CD3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段不特異結(jié)合免疫球蛋白多肽，例如它不特異結(jié)合表面免疫球蛋白λ鏈上的恒定決定簇或表面免疫球蛋白上的獨(dú)特型決定簇。
本發(fā)明的抗體片段能夠特異結(jié)合目的靶分子。例如，在有些實(shí)施方案中，抗體片段特異結(jié)合腫瘤抗原。在有些實(shí)施方案中，抗體片段特異結(jié)合在受體多聚化(如二聚化)后活化的細(xì)胞表面受體。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體與靶分子的結(jié)合抑制另一種分子(諸如配體，在靶分子是受體時(shí))與所述靶分子的結(jié)合。由此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體片段在與靶分子結(jié)合后抑制相關(guān)結(jié)合配偶體結(jié)合靶分子。相關(guān)結(jié)合配偶體可以是配體或是異二聚體或同二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段在與靶分子結(jié)合后抑制靶分子多聚化。例如，在本發(fā)明抗體片段是拮抗物的有些實(shí)施方案中，抗體片段與細(xì)胞表面受體的結(jié)合可能抑制受體與受體另一單位的二聚化，由此抑制受體的活化(至少部分由于缺乏受體二聚化)。本領(lǐng)域知道許多受體分子能夠和/或需要二聚化(或是同二聚化或是異二聚化)來實(shí)現(xiàn)其正常功能。這些受體包括酪氨酸激酶受體諸如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和HGF受體c-met。其它蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用包括受體-配體相互作用，諸如與flt、flk等結(jié)合的VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)和與c-met結(jié)合的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段能夠與HGF競(jìng)爭(zhēng)與c-met的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段能夠與VEGF競(jìng)爭(zhēng)與VEGF受體的結(jié)合。
一方面，本發(fā)明提供了單臂形式(正如本文所定義的)的拮抗劑但以雙臂形式(即其中兩個(gè)臂具有相同的抗原結(jié)合能力)作為激動(dòng)劑或具有激動(dòng)劑活性的抗體片段。
一方面，本發(fā)明提供了包含下列各項(xiàng)的抗體片段(i)包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(且在有些實(shí)施方案中還包含輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域)的第一多肽；(ii)包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域、第一Fc多肽序列(且在有些實(shí)施方案中還包含非Fc重鏈恒定結(jié)構(gòu)域序列)的第二多肽；和(iii)包含第二Fc多肽序列的第三多肽。通常，所述第二多肽是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域、重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(如整個(gè)或部分CH1)、和第一Fc多肽的單鏈多肽。例如，通常通過肽鍵(即不是非肽鍵)將第一Fc多肽序列與重鏈恒定結(jié)構(gòu)域相連。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一多肽包含與人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合的非人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二多肽包含與人重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合的非人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三多肽包含N端截短的重鏈，它在其N端包含至少部分鉸鏈序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三多肽包含N端截短的重鏈，它在其N端不包含功能性或野生型鉸鏈序列。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段的兩種Fc多肽共價(jià)連接。例如，兩種Fc多肽可以經(jīng)由分子間二硫鍵例如經(jīng)由鉸鏈區(qū)半胱氨酸殘基之間的分子間二硫鍵連接。
一方面，本發(fā)明提供了包含免疫球蛋白群的組合物，其中至少(或至少約)50％、75％、85％、90％、95％的免疫球蛋白是本發(fā)明的抗體片段。包含所述免疫球蛋白群的組合物可以是多種形式，包括但不限于宿主細(xì)胞裂解物、細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)液、宿主細(xì)胞漿、或其半純化或純化形式。純化方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，本文描述了其中一些。
一方面，本發(fā)明提供了具有至少一項(xiàng)特征的抗體片段，即在將抗體片段內(nèi)的Fc序列的同二聚化降至最低的同時(shí)促進(jìn)異二聚化。這些特征改善了可通過本文所述本發(fā)明方法獲得的免疫球蛋白群的產(chǎn)量和/或純度和/或同質(zhì)性。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面處相遇/相互作用。在第一和第二Fc多肽在界面處相遇的有些實(shí)施方案中，第二Fc多肽(序列)的界面包含的突起(protuberance)可位于第一Fc多肽(序列)的界面的腔(cavity)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼腔或第二Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼突起或者二者兼之。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼腔且第二Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼突起。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二Fc多肽的界面包含的突起可位于第一Fc多肽的界面的腔中，其中所述腔或突起或二者已經(jīng)分別導(dǎo)入第一和第二Fc多肽的界面。在第一和第二Fc多肽在界面處相互作用的有些實(shí)施方案中，第一Fc多肽(序列)的界面包含的突起可位于第二Fc多肽(序列)的界面的腔中。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼腔或第一Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼突起，或者二者兼之。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼腔且第一Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼突起。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一Fc多肽的界面包含的突起可位于第二Fc多肽的界面的腔中，其中所述突起或腔或二者已經(jīng)分別導(dǎo)入第一種和第二Fc多肽的界面。
在一個(gè)實(shí)施方案中，突起和腔各自包含天然存在的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含突起的Fc多肽是通過用具有比原始?xì)埢髠?cè)鏈體積的輸入殘基替代來自模板/原始多肽界面的原始?xì)埢傻摹Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方案中，包含突起的Fc多肽是通過包括如下步驟的方法生成的，其中用編碼具有比原始?xì)埢髠?cè)鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始?xì)埢暮怂?。在一個(gè)實(shí)施方案中，原始?xì)埢翘K氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，原始?xì)埢荰366。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是精氨酸(R)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是酪氨酸(Y)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是色氨酸(W)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是R、F、Y或W。在一個(gè)實(shí)施方案中，突起是通過替代模板/原始多肽中的兩個(gè)或多個(gè)殘基而生成的。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含突起的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含色氨酸替代，氨基酸編號(hào)依照Katat等人(《Sequences of proteins of immunological interest》第5版，第1卷，第688-696頁，1991，NIH，Bethesda，MD)的EU編號(hào)方案。
在有些實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽是通過用具有比原始?xì)埢?cè)鏈體積的輸入殘基替代模板/原始多肽界面中的原始?xì)埢傻摹＠纾梢酝ㄟ^包括如下步驟的方法來生成包含腔的Fc多肽，其中用編碼具有比原始?xì)埢?cè)鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始?xì)埢暮怂?。在一個(gè)實(shí)施方案中，原始?xì)埢翘K氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，原始?xì)埢橇涟彼帷Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方案中，原始?xì)埢抢野彼?。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基不是半胱氨酸(C)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是丙氨酸(A)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是絲氨酸(S)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是蘇氨酸(T)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸入殘基是纈氨酸(V)?？梢酝ㄟ^替代模板/原始多肽的一個(gè)或多個(gè)原始?xì)埢鶃砩汕?。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的原始氨基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的輸入殘基丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。在有些實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的原始氨基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中所述原始氨基酸用選自下組的輸入殘基替代丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。在有些實(shí)施方案中，替代的原始氨基酸是T366、L368和/或Y407。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含絲氨酸替代，氨基酸編號(hào)依照Katat等人(見上文)的EU編號(hào)方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽在第368位亮氨酸處包含丙氨酸替代，氨基酸編號(hào)依照Katat等人(見上文)的EU編號(hào)方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽在第407位酪氨酸處包含纈氨酸替代，氨基酸編號(hào)依照Katat等人(見上文)的EU編號(hào)方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的替代T366S、L368A和Y407V，氨基酸編號(hào)依照Katat等人(見上文)的EU編號(hào)方案。在這些抗體片段的有些實(shí)施方案中，包含突起的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含色氨酸替代，氨基酸編號(hào)依照Katat等人(見上文)的EU編號(hào)方案。
一方面，本發(fā)明的抗體片段包含F(xiàn)c區(qū)，其存在是相對(duì)于包含相同抗原結(jié)合臂(序列)的Fab片段提高抗體片段的穩(wěn)定性所要求的。所述Fc區(qū)是經(jīng)由不同F(xiàn)c多肽序列的復(fù)合(多聚化)而形成的。所述不同F(xiàn)c多肽序列可以包含或不含相同序列和/或結(jié)構(gòu)域，倘若它們能夠二聚化而形成Fc區(qū)(正如本文所定義的)的話。第一Fc多肽通常以一條多肽鏈的形式與免疫球蛋白重鏈一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域連續(xù)相連，例如與鉸鏈、恒定和/或可變結(jié)構(gòu)域序列相連。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一Fc多肽包含至少部分鉸鏈序列、至少部分CH2結(jié)構(gòu)域和/或至少部分CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一Fc多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二Fc多肽(即作為N端截短的重鏈的一部分的Fc多肽)包含至少部分鉸鏈序列、至少部分CH2結(jié)構(gòu)域和/或至少部分CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二Fc多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段包含第一和第二Fc多肽，它們各自包含至少一個(gè)抗體恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體恒定結(jié)構(gòu)域指CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明抗體片段包含恒定結(jié)構(gòu)域的任何實(shí)施方案中，抗體恒定結(jié)構(gòu)域可以來自任何免疫球蛋白類型，例如IgG。免疫球蛋白來源可以是任何合適的物種起源(如IgG可以是人IgG1)或是合成形式。
本發(fā)明的抗體包含單個(gè)抗原結(jié)合臂。與一種抗原的結(jié)合可能牽涉與一種或多種結(jié)合靶(如決定簇/表位)的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是單特異性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是免疫粘附素，它在一個(gè)實(shí)施方案中是單特異性的。
本發(fā)明的抗體片段可以與異源部分綴合。任何異源部分都將是合適的，只要它與抗體的綴合不會(huì)實(shí)質(zhì)性的降低抗體的期望功能和/或特征。例如，在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含的異源部分是細(xì)胞毒劑。在有些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒劑選自下組放射性同位素、化療劑和毒素。在有些實(shí)施方案中，所述毒素選自下組加利車霉素(calicheamicin，calichemicin)、美登素(maytansine)和單端孢菌素(trichothecene，trichothene)。在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含的異源部分是可檢測(cè)標(biāo)記物。在有些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)標(biāo)記物選自下組放射性同位素、配體-受體對(duì)的一個(gè)成員、酶-底物對(duì)的一個(gè)成員和熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)的一個(gè)成員。
在多種背景中，非常希望獲得包含高度同質(zhì)的本發(fā)明抗體片段群的組合物。這可以通過本領(lǐng)域知道的多種方法來完成。例如，通常重組表達(dá)構(gòu)成本發(fā)明抗體片段的多肽(與例如酶促消化全長(zhǎng)免疫球蛋白不同)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含就結(jié)合臂的N端和/或Fc區(qū)的C端而言基本上同質(zhì)的抗體片段。若組合物中所含有的至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％的本發(fā)明抗體片段在結(jié)合臂的N端和/或Fc區(qū)的C端具有相同氨基酸殘基，則說它是“本質(zhì)上同質(zhì)的”。所述組合物可以是最初生成抗體片段的來源組合物的未純化、半純化或純化形式。
一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗體片段和載體的組合物，所述載體在一個(gè)實(shí)施方案中是制藥學(xué)可接受載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段與異源部分綴合。
另一方面，本發(fā)明提供了包括容器及其中所含有的組合物的產(chǎn)品，其中組合物包含本發(fā)明的抗體片段。在有些實(shí)施方案中，這些產(chǎn)品還包括使用所述組合物的指示。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是以治療有效量提供的。
又一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體片段的多核苷酸?？梢杂蓡蝹€(gè)多核苷酸或分開的(多種)多核苷酸編碼本發(fā)明抗體片段的構(gòu)件。在一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)多核苷酸編碼(a)抗原結(jié)合臂的輕鏈和重鏈構(gòu)件，和(b)N端截短的重鏈多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)多核苷酸編碼抗原結(jié)合臂的輕鏈和重鏈構(gòu)件，且另一種多核苷酸編碼N端截短的重鏈多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，分開的多核苷酸分別編碼抗原結(jié)合臂的輕鏈構(gòu)件、抗原結(jié)合臂的重鏈構(gòu)件和N端截短的重鏈多肽。
一方面，本發(fā)明提供了用于表達(dá)本發(fā)明抗體的重組載體。
一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸或重組載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
一方面，本發(fā)明提供了生成本發(fā)明抗體片段的方法，所述方法包括在容許二聚化從而導(dǎo)致抗體片段形成的條件下在合適宿主細(xì)胞(如大腸桿菌或CHO)中表達(dá)編碼抗體片段的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中所生成的至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的免疫球蛋白多肽是本發(fā)明的抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法生成的抗體片段在一種Fc多肽中包含突起且在另一種Fc多肽中包含腔，正如本文所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)三種多核苷酸的方法，其中第一種多核苷酸編碼抗原結(jié)合臂的第一種構(gòu)件(如重鏈CDR序列或可變結(jié)構(gòu)域(且在有些實(shí)施例中還包含非Fc重鏈恒定結(jié)構(gòu)域序列))和第一Fc多肽，第二種多核苷酸編碼抗原結(jié)合臂的第二種構(gòu)件(如輕鏈CDR序列或可變結(jié)構(gòu)域(且在有些實(shí)施例中還包含輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域))，且第三種多核苷酸編碼包含第二Fc多肽的N端截短的重鏈，其中通過這些多肽的異多聚化形成本發(fā)明的抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將所述多核苷酸導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括由細(xì)胞培養(yǎng)物(如由細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物的培養(yǎng)液)回收本發(fā)明的抗體片段。
一方面，本發(fā)明提供了包括在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼本發(fā)明抗體片段構(gòu)件的核酸的方法，其中編碼一種構(gòu)件的每個(gè)順反子包含與編碼所述構(gòu)件的核酸序列可操作連接的翻譯起始區(qū)(TIR)，且其中調(diào)節(jié)每個(gè)TIR的強(qiáng)度以獲得合適的構(gòu)件表達(dá)水平比率，由此生成期望量的所述抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，TIR具有近似相等的強(qiáng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)TIR強(qiáng)度是1，例如依照Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634及Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147。在有些實(shí)施方案中，TIR包含原核分泌信號(hào)序列或其變體。在有些實(shí)施方案中，原核分泌信號(hào)序列選自下組STII、OmpA、PhoE、LamB、MBP和PhoA分泌信號(hào)序列。
本發(fā)明的抗體可在多種背景中找到多種用途。例如，本發(fā)明的抗體通常是治療性抗體。本發(fā)明的抗體可以通過多種機(jī)制來發(fā)揮其治療效果。例如，本發(fā)明的抗體可以是激動(dòng)性抗體(agonist antibody)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體可以是拮抗性抗體(antagonistic antibody)。在還有一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體可以是阻斷性抗體(blocking antibody)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體可以是中和性抗體(neutralizing antibody)。
一方面，本發(fā)明提供了治療或延遲疾病發(fā)展的方法，包括對(duì)患病的受試者施用有效量的有效治療或延遲疾病發(fā)展的本發(fā)明抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病指腫瘤或癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病指免疫學(xué)紊亂，如自身免疫病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病(牛皮癬)、Sjogren氏綜合癥、胰島素依賴性糖尿病等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疾病與異常血管化(諸如血管發(fā)生)有關(guān)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，疾病與生長(zhǎng)因子-受體信號(hào)調(diào)節(jié)異常有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述生長(zhǎng)因子-受體信號(hào)與酪氨酸激酶有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述生長(zhǎng)因子-受體信號(hào)與HGF-c-met軸有關(guān)。
本發(fā)明的抗體適用于治療或預(yù)防由多種細(xì)胞、遺傳和/或生物化學(xué)異常引起的多種病理學(xué)狀況。例如，本發(fā)明的抗體特別適用于治療和/或預(yù)防與HGF/c-met信號(hào)途徑內(nèi)的異常有關(guān)的病理學(xué)狀況。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是c-met拮抗物。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是嵌合抗體，例如包含嫁接到異源非人、人、或人源化序列(如框架和/或恒定結(jié)構(gòu)域序列)中的來自非人供體的抗原結(jié)合序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，非人供體是小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列是合成的，如通過誘變(如噬菌體展示篩選等)獲得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體具有鼠源V區(qū)和人源C區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼠源輕鏈V區(qū)與人源κ輕鏈融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼠源重鏈V區(qū)與人源IgG1 C區(qū)融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列包含輕鏈和/或重鏈的至少一種、至少兩種或所有三種CDR。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列包含重鏈CDR3。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列包含由下述雜交瘤細(xì)胞系生成的單克隆抗體的部分或所有CDR和/或可變結(jié)構(gòu)域序列，即以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)編號(hào)ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列至少包含由雜交瘤細(xì)胞系1A3.3.13或5D5.11.6生成的單克隆抗體的重鏈CDR3。本發(fā)明的人源化抗體包括在FR中具有氨基酸替代的抗體和在嫁接的CDR中有變化的親和力成熟變體。CDR和FR中替代的氨基酸不限于供體或受體抗體中存在的氨基酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體還在Fc區(qū)的氨基酸殘基中包含變化，導(dǎo)致效應(yīng)物功能改善，包括CDC和/或ADCC功能和B細(xì)胞殺傷增強(qiáng)。本發(fā)明的其它抗體包括具有改善穩(wěn)定性的特殊變化的抗體。本發(fā)明的抗體還包括在體內(nèi)具有改善的ADCC功能的巖藻糖缺失變體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段包含的抗原結(jié)合臂所包含的重鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列SYWLH(SEQ IDNO1)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO2)和YGSYVSPLDY(SEQID NO3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合臂包含的重鏈CDR-H1具有氨基酸序列SYWLH。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合臂包含的重鏈CDR-H2具有氨基酸序列MIDPSNSDTRFNPNFKD。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合臂包含的重鏈CDR-H3具有氨基酸序列YGSYVSPLDY。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段包含的抗原結(jié)合臂所包含的輕鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO4)、WASTRES(SEQ ID NO5)和QQYYAYPWT(SEQ ID NO6)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合臂包含的輕鏈CDR-L1具有氨基酸序列KSSQSLLYTSSQKNYLA。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合臂包含的輕鏈CDR-L2具有氨基酸序列WASTRES。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合臂包含的輕鏈CDR-L3具有氨基酸序列QQYYAYPWT。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段包含的抗原結(jié)合臂所包含的重鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列SYWLH(SEQ ID NO1)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO2)和YGSYVSPLDY(SEQ ID NO3)且輕鏈包含至少一種、至少兩種或所有三種選自下組的CDR序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO4)、WASTRES(SEQ ID NO5)和QQYYAYPWT(SEQ ID NO6)。
本發(fā)明提供了結(jié)合人c-met的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體在體內(nèi)有效抑制HGF/c-met活性，且在重鏈可變區(qū)(VH)中至少包含由以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的單克隆抗體的CDR3序列和基本上人共有序列(如基本上人重鏈亞組III(VHIII)的人共有框架(FR)殘基)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體還包含由以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的單克隆抗體的重鏈CDR1序列和/或CDR2序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，前述抗體包含由以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成的單克隆抗體的輕鏈CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列和基本上人輕鏈κ亞組I(VκI)的人共有框架(FR)殘基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段包含抗原結(jié)合臂，該抗原結(jié)合臂包含具有如下序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO7)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體片段包含抗原結(jié)合臂，該抗原結(jié)合臂所包含具有如下序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO8)。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明抗體片段(例如本發(fā)明的c-met拮抗性抗體片段)在制備用于諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂等疾病的治療和/或預(yù)防的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明核酸(例如編碼本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段的核酸)在制備用于諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂等疾病的治療和/或預(yù)防的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明表達(dá)載體(例如編碼本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段的載體)在制備用于諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂等疾病的治療和/或預(yù)防的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明宿主細(xì)胞(例如包含編碼本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段的載體的宿主細(xì)胞)在制備用于諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂等疾病的治療和/或預(yù)防的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明制品(例如包含本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段和/或編碼本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段的核酸的制品)在制備用于諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂等疾病的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明試劑盒(例如包含本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段和/或編碼本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段的核酸的試劑盒)在制備用于諸如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關(guān)紊亂等疾病的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了抑制c-met活化的細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使細(xì)胞或組織接觸有效量的本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段，由此抑制與c-met活化有關(guān)的細(xì)胞增殖。
一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中與c-met活化調(diào)節(jié)異常有關(guān)的病理學(xué)狀況的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段，由此治療所述病癥。
一方面，本發(fā)明提供了抑制表達(dá)c-met或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或二者的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸本發(fā)明的c-met拮抗性抗體片段，由此引起所述細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，使所述細(xì)胞接觸由不同細(xì)胞表達(dá)的HGF(如經(jīng)由旁分泌效應(yīng))。
一方面，本發(fā)明提供了治療性處理具有癌性腫瘤的哺乳動(dòng)物的方法，其中腫瘤包含表達(dá)c-met或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或二者的細(xì)胞，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段，由此有效治療所述哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使腫瘤接觸由不同細(xì)胞表達(dá)的HGF(如經(jīng)由旁分泌效應(yīng))。
一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防與c-met或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或二者表達(dá)升高或活性升高有關(guān)的細(xì)胞增殖性紊亂的方法，所述方法包括對(duì)需要這種治療的受試者施用有效量的本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段，由此有效治療或預(yù)防所述細(xì)胞增殖性紊亂。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述增殖性紊亂是癌癥。
一方面，本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其中所述細(xì)胞的生長(zhǎng)至少部分依賴于c-met或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或二者的生長(zhǎng)加強(qiáng)效應(yīng)(growthpotentiating effect)，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸有效量的本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段，由此抑制所述細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使細(xì)胞接觸由不同細(xì)胞表達(dá)的HGF(如經(jīng)由旁分泌效應(yīng))。
一方面，本發(fā)明提供了治療性處理哺乳動(dòng)物中的腫瘤的方法，其中所述腫瘤的生長(zhǎng)至少部分依賴于c-met或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或二者的生長(zhǎng)加強(qiáng)效應(yīng)，所述方法包括使所述腫瘤接觸有效量的本發(fā)明c-met拮抗性抗體片段，由此抑制所述腫瘤的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使腫瘤接觸由不同細(xì)胞表達(dá)的HGF(如經(jīng)由旁分泌效應(yīng))。
本發(fā)明的方法可用于影響任何合適的病理學(xué)狀態(tài)，例如與HGF/c-met信號(hào)途經(jīng)調(diào)節(jié)異常有關(guān)的細(xì)胞和/或組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所靶向的細(xì)胞是癌細(xì)胞。例如，癌細(xì)胞可以是選自下組的細(xì)胞乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳頭狀癌細(xì)胞(如甲狀腺的)、結(jié)腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、頭和頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞(如多發(fā)性骨髓瘤)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤/成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(如多形性星形細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性少突星形細(xì)胞瘤)和白血病細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所靶向的細(xì)胞是過度增殖和/或增生細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所靶向的細(xì)胞是發(fā)育異常細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所靶向的細(xì)胞是轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
本發(fā)明的方法還可以包括額外的治療步驟。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括使所靶向的細(xì)胞和/或組織(如癌細(xì)胞)暴露于放療或化療劑的步驟。
c-met的活化是重要的生物學(xué)過程，其調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致多種病理學(xué)狀況。因此，在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所靶向的細(xì)胞(如癌細(xì)胞)是其中c-met的活化與相同組織起源的正常細(xì)胞相比增強(qiáng)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法引起所靶向細(xì)胞的死亡。例如，與本發(fā)明拮抗性抗體片段的接觸可能導(dǎo)致細(xì)胞不能經(jīng)由c-met途經(jīng)發(fā)信號(hào)，繼而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
c-met活性(及由此的信號(hào))的調(diào)節(jié)異?？赡苁怯啥喾N細(xì)胞變化引起的，包括例如HGF(c-met相關(guān)配體)和/或c-met自身的過度表達(dá)。因此，在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括靶向這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞(如癌細(xì)胞)中c-met或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或二者的表達(dá)與相同組織起源的正常細(xì)胞相比更加豐富。表達(dá)c-met的細(xì)胞可以受到來自多種來源的HGF的調(diào)節(jié)，即自分泌或旁分泌方式。例如，在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，使所靶向的細(xì)胞接觸/結(jié)合由不同細(xì)胞表達(dá)的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(如經(jīng)由旁分泌效應(yīng))。所述不同細(xì)胞可以是相同或不同的組織起源。在一個(gè)實(shí)施方案中，使所靶向的細(xì)胞接觸/結(jié)合由所靶向細(xì)胞自身表達(dá)的HGF(如經(jīng)由自分泌效應(yīng)/環(huán))。在一個(gè)實(shí)施方案中，所靶向細(xì)胞中的c-met活性(或活化)依賴于配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，c-met活性(或活化)不依賴配體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)表達(dá)的抗Fab Western印跡結(jié)果。
圖2顯示了抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)表達(dá)的抗Fc Western印跡結(jié)果。
圖3顯示了在Fc區(qū)中包含突起和腔的抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)的表達(dá)的抗Fab Western印跡結(jié)果。
圖4顯示了在Fc區(qū)中包含突起和腔的抗c-met Fab/c抗體(單臂抗體)的表達(dá)的抗Fc Western印跡結(jié)果。
圖5顯示了競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法的結(jié)果，其中單臂抗c-met抗體阻斷HGF結(jié)合c-met。
圖6顯示了在使用或未用HGF和/或抗c-met 5D5單臂抗體處理的U87細(xì)胞中進(jìn)行的KIRA測(cè)定法的結(jié)果。
圖7顯示了BaF3-hMet細(xì)胞在存在不同數(shù)量的抗c-met 5D5抗體時(shí)的細(xì)胞增殖。
圖8顯示了細(xì)胞遷移測(cè)定法，其中單臂抗c-met抗體阻斷HGF功能。
圖9A-B顯示了單臂抗c-met抗體的藥物動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果。
圖10A-B顯示了用單臂抗c-met抗體治療腫瘤的結(jié)果。在圖10B中，“OA”指示單臂。
執(zhí)行本發(fā)明的模式本發(fā)明提供了使用具有獨(dú)特特征的單價(jià)抗體片段的方法、組合物、試劑盒和產(chǎn)品，所述特征使得所述單價(jià)抗體片段特別有利于用于治療某些病理狀況。此外，可以容易的以實(shí)用產(chǎn)量和期望純度制備所述抗體片段。與現(xiàn)有的單價(jià)抗體相比，本發(fā)明抗體片段的特征有上佳的物理化學(xué)和/或治療性能。一般而言，本發(fā)明的單價(jià)片段片段包含單個(gè)抗原結(jié)合臂和Fc區(qū)，其中與包含所述抗原結(jié)合臂但缺乏所述Fc區(qū)的Fab抗體片段相比，所述抗體片段展示增強(qiáng)的體內(nèi)穩(wěn)定性。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段在每種Fc序列的一個(gè)或多個(gè)殘基處包含改變，所述Fc序列在構(gòu)成Fc區(qū)的Fc多肽間形成多聚化介面。本發(fā)明提供了生產(chǎn)和使用本發(fā)明抗體片段的方法。本發(fā)明使得本發(fā)明新型抗體片段的高效且商業(yè)可行性生產(chǎn)成為可能。所述抗體片段可用于治療非常希望和/或需要使用本質(zhì)是單價(jià)且高度穩(wěn)定的治療性抗體的病理狀況。本文提供了本發(fā)明方法、組合物、試劑盒和產(chǎn)品的詳細(xì)情況。
通用技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。文獻(xiàn)中充分闡明了這些技術(shù)，諸如《Molecular CloningALaboratory Manual》第2版(Sambrook等人，1989)；《Oligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait編著，1984)；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney編著，1987)；《Methods in Enzymology》(Academic Press Inc.)；《Current Protocols inMolecular Biology》(F.M.Ausubel等人編著，1987，以及定期更新)；《PCRThe Polymerase Chain Reaction》(Mullis等人編著，1994)；《A Practical Guideto Molecular Cloning》(Perbal Bernard V.，1988)。
定義術(shù)語“載體”在用于本文時(shí)意圖指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！?，指其中可以連接額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可以將額外DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因的表達(dá)。這些載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱“重組載體”)。一般而言，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。
“多核苷酸”和“核酸”在本申請(qǐng)中可以交互使用，是指任一長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者可以通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)引入聚合物的任一取代物。多核苷酸可以包括經(jīng)過修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在所述聚合物裝配之前或之后加入。所述核苷酸序列可以被非一核苷酸組分阻斷。多核苷酸還可以在合成后修飾，例如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其他類型的修飾包括，例如，″帽子″，將一個(gè)或多個(gè)天然生成核苷酸用類似物取代，核苷酸之間修飾例如，含不帶電連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidates)，氨基甲酸酯，等)和含帶電連接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)的修飾，含有附加基元，例如，蛋白質(zhì)(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、ply-L-賴氨酸，等)的修飾，帶有嵌入劑(例如，吖啶，補(bǔ)骨脂素，等)的修飾，含有螯合劑(例如，金屬，放射性金屬，硼，氧化的金屬等)的修飾，含有烷化劑(alkylators)的修飾，帶有經(jīng)修飾連接(例如，α端基異構(gòu)核酸(anomeric nucleic acid)，等)的修飾，以及未經(jīng)修飾形式的多核苷酸。另外，通常出現(xiàn)于糖類的任一羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)取代，用常見保護(hù)基保護(hù)，或者經(jīng)過活化制備與其他核苷酸間的其他連接，或者可以偶聯(lián)至固相或半固相支持物。5′和3′末端的OH可以用長(zhǎng)度為1-20個(gè)碳原子的胺或有機(jī)封端基團(tuán)(organic capping group)磷酸化或取代。另外還可以將其他羥基衍生至常規(guī)的保護(hù)基。多核苷酸還可以含有本領(lǐng)域普遍已知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式，包括，例如，2′-氧-甲基，2′-氧-烯丙基，2′-烯丙基-，2′-氟-或2′-疊氮基核糖，碳環(huán)形的糖類似物，α-端基異構(gòu)糖，差向立體異構(gòu)糖例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，非環(huán)形的類似物以及脫堿基的核苷類似物例如甲基核糖核苷?？梢杂闷渌B接基團(tuán)替代一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵。這些其他的連接基團(tuán)包括但不限于這樣的實(shí)例，其中磷酸酯基被P(O)S(″硫代酸酯基(thioate)″)，P(S)S(″二硫代酸酯基(dithioate)″)，″(O)NR2(″酰胺基團(tuán)(amidate)″)，P(O)R，P(O)OR′，COCH2(″formacetal″)替代，其中R或R′各自獨(dú)立地為H或者取代或未被取代的烷基(1-20個(gè)C)，任選含有醚(-O-)鍵、芳香基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。上述描述適用于所有本申請(qǐng)所述多核苷酸，包括RNA及DNA。
“寡核苷酸”在用于本文時(shí)一般指短多核苷酸，通常是單鏈，通常是合成的，長(zhǎng)度通常但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核苷酸。
除非另有明確說明或上下文相關(guān)的說明，術(shù)語“肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子”或“HGF”在用于本文時(shí)指能夠在容許HGF/c-met信號(hào)途經(jīng)發(fā)生的條件下激活所述過程的任何天然或變異的(或是天然存在的或是合成的)HGF多肽。術(shù)語“野生型HGF”通常指包含天然存在HGF蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“野生型HGF序列”通常指在天然存在HGF中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。
術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在廣義上可互換使用，且包括單克隆抗體(如全長(zhǎng)或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價(jià)抗體、多價(jià)抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體，只要它們展示期望的生物學(xué)活性)和本文描述的抗體片段。抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。
“抗體片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時(shí)通常相關(guān)的至少一種、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能。
短語“抗原結(jié)合臂”在用于本文時(shí)指有能力與目的分子特異結(jié)合的本發(fā)明抗體片段的組成部分。一般且優(yōu)選的是，抗原結(jié)合臂是免疫球蛋白多肽序列的復(fù)合體，例如免疫球蛋白輕鏈和重鏈的CDR和/或可變結(jié)構(gòu)域序列。
短語“N端截短的重鏈”在用于本文時(shí)指包含部分但非整個(gè)全長(zhǎng)免疫球蛋白重鏈的多肽，其中缺失的部分通常位于重鏈的N端區(qū)域。缺失部分可以包括但不限于可變結(jié)構(gòu)域、CH1、和部分或整個(gè)鉸鏈序列。通常，如果不存在野生型鉸鏈序列，那么N端截短的重鏈中的剩余恒定結(jié)構(gòu)域?qū)軌蜻B接另一種Fc序列(即本文所述“第一”Fc多肽)的構(gòu)件。例如，所述構(gòu)件可以是經(jīng)修飾的殘基或能夠形成二硫鍵的外加半胱氨酸殘基。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指由本質(zhì)上同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體，即組成該抗體群的單個(gè)抗體是相同的，只是可能以最小數(shù)量存在可能的天然存在突變。單克隆抗體是高度特異的，即針對(duì)一種抗原。此外，與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，而該鏈的剩余部分與衍生自另一種物種或?qū)儆诹硪环N抗體類型或亞型的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，以及這些抗體的片段，只要它們展示期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；及Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。
非人抗體(如鼠源)的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體高變區(qū)的殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)的殘基替換。在有些情況中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可以包含沒有在受體抗體中或在供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改善抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一種且通常兩種基本上整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)非人免疫球蛋白中的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗體還任選包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。更多詳情參閱Jones等人，1986，Nature，321522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332323-329；及Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596。還可參閱下列綜述性論文及其引用的參考文獻(xiàn)Vaswani和Hamilton，1998，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.，1105-115；Harris，1995，Biochem.Soc.Transactions，231035-1038；Hurle和Gross，1994，Curr.Op.Biotech.，5428-433。
“人抗體”指具有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于制備人抗體的任何技術(shù)制備的抗體。人抗體的這種定義明確排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
“親和力成熟”的抗體指在一種或多種CDR中具有一處或多處改變從而導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的針對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知流程生成。Marks等人，1992，Bio/Technology，10779-783描述了經(jīng)由VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。下列文獻(xiàn)描述了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，913809-3813；Schier等人，1995，Gene，169147-155；Yelton等人，1995，J.Immunol.，1551994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.，154(7)3310-9；及Hawkins等人，1992，J.Mol.Biol.，226889-896。
在用于本文時(shí)，術(shù)語“免疫粘附素”指將異源蛋白(“粘附素”，如受體、配體或酶)的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)物構(gòu)件(effectorcomponent)結(jié)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包含具有不同于抗體的(即是“異源的”)抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(抗原結(jié)合位點(diǎn))的期望結(jié)合特異性的粘附素氨基酸序列和免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的融合體。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以由任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。
“異多聚體”、“異多聚復(fù)合體”、或“異多聚多肽”指至少包含第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽的氨基酸序列因至少一個(gè)氨基酸殘基而與第一多肽不同。異多聚體可以包括由第一和第二多肽形成的“異二聚體”，或者可以形成更高等級(jí)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其中存在第一種和第二多肽以外的多肽。
在用于本文時(shí)，“多肽”通常指具有超過約10個(gè)氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。
短語“免疫抑制特性”或其變體在用于本文時(shí)指抗體直接或間接導(dǎo)致對(duì)一種或多種牽涉免疫系統(tǒng)的正?；钚院?或功能(包括但不限于體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)的抑制的特性。
術(shù)語“Fc區(qū)”在用于本文時(shí)通常指包含免疫球蛋白重鏈C端多肽序列的二聚復(fù)合體，其中C端多肽序列可通過木瓜蛋白酶消化完整抗體得到。Fc區(qū)可以包含天然或變異的Fc序列。雖然免疫球蛋白重鏈Fc序列的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc序列通常限定為由Cys226附近位置或Pro230附近位置的氨基酸殘基至Fc序列羧基末端的區(qū)段。免疫球蛋白的Fc序列通常包含兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，且任選包含CH4結(jié)構(gòu)域?！癋c多肽”在本文中指構(gòu)成Fc區(qū)的多肽之一。Fc多肽可以由任何合適免疫球蛋白獲得，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。在有些實(shí)施方案中，F(xiàn)c多肽包含部分或整個(gè)野生型鉸鏈序列(通常位于其N端)。在有些實(shí)施方案中，F(xiàn)c多肽不含功能性或野生型鉸鏈序列。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞裂解。
術(shù)語“Fc受體”和“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。例如，F(xiàn)cR可以是天然序列人FcR。通常，F(xiàn)cR與IgG抗體結(jié)合(γ受體)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞型的受體，包括這些受體的等位基因變體和可選剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，且主要在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中有所不同。其它同種型的免疫球蛋白也可以由某些FcR結(jié)合(參閱如Janeway等人，《Immuno Biologythe immune system in health and disease》，Elsevier ScienceLtd.，NY，第4版，1999)。激活受體FcγRIIA在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(綜述見Daron，1997，Annu.Rev.Immunol.，15203-234)。FcR的綜述見Ravetch和Kinet，1991，Annu.Rev.Immunol.，9457-92；Capel等人，1994，Immunomethods，425-34；及de Haas等人，1995，J.Lab.Clin.Med.，126330-41。術(shù)語“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括將來鑒定的FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體FcRn，它負(fù)責(zé)將母親的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等人，1976，J.Immunol.，117587；及Kim等人，1994，J.Immunol.，24249)。
“鉸鏈區(qū)”、“鉸鏈序列”及其變體在用于本文時(shí)包含本領(lǐng)域知道的含義，下列文獻(xiàn)中有圖解例如Janeway等人，《Immuno Biologythe immune systemin health and disease》，Elsevier Science Ltd.，NY，第4版，1999；Bloom等人，1997，Protein Science，6407-415；Humphreys等人，1997，J.Immunol.Methods，209193-202。
術(shù)語“順反子”在用于本文時(shí)意圖指與翻譯單元粗略相當(dāng)?shù)倪z傳元件，包含編碼多肽鏈的核苷酸序列和鄰近的控制區(qū)?！班徑目刂茀^(qū)”包括例如翻譯起始區(qū)(TIR；如下文定義)和終止區(qū)。
“翻譯起始區(qū)”或TIR在用于本文時(shí)指為目的基因提供翻譯起始功效的核酸區(qū)。通常，特定順反子內(nèi)的TIR涵蓋核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)及RBS的5’和3’序列。RBS限定為最低限度含有Shine-Dalgamo區(qū)和起始密碼子(AUG)。因此，TIR還包括至少部分待翻譯核酸序列。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的TIR在順反子內(nèi)在編碼輕鏈或重鏈的序列的前面包含編碼信號(hào)肽的分泌信號(hào)序列。TIR變體在TIR區(qū)內(nèi)含有改變TIR特性(諸如其翻譯強(qiáng)度，如下文定義)的序列變異(特別是替代)。優(yōu)選的是，本發(fā)明的TIR變體在分泌信號(hào)序列的前2至約14個(gè)、優(yōu)選約4至12個(gè)、更優(yōu)選約6個(gè)密碼子內(nèi)含有序列替代，所述分泌信號(hào)序列位于順反子內(nèi)位于編碼輕鏈或重鏈的序列的前面。
術(shù)語“翻譯強(qiáng)度”在用于本文時(shí)指分泌多肽在對(duì)照系統(tǒng)中的度量，其中將一種或多種TIR變體用于指導(dǎo)多肽的分泌，并將結(jié)果與相同培養(yǎng)和測(cè)定條件下的野生型TIR或某些其它對(duì)照進(jìn)行比較。不限于任何一種理論，“翻譯強(qiáng)度”在用于本文時(shí)包括例如mRNA穩(wěn)定性、核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的效率、和穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)模式的度量。
“分泌信號(hào)序列”或“信號(hào)序列”指編碼可用于指導(dǎo)新合成的目的蛋白穿過細(xì)胞膜(例如原核生物的內(nèi)膜或內(nèi)外膜二者)的短信號(hào)肽的核酸序列。因此，目的蛋白(諸如免疫球蛋白輕鏈或重鏈多肽)可以分泌到原核宿主細(xì)胞的周質(zhì)或進(jìn)入培養(yǎng)基。由分泌信號(hào)序列編碼的信號(hào)肽對(duì)于宿主細(xì)胞可以是內(nèi)源的，或者它們可以是外源的，包括對(duì)于待表達(dá)多肽是天然的信號(hào)肽。分泌信號(hào)序列通常位于待表達(dá)多肽的氨基末端，且通常在多肽的生物合成與由細(xì)胞質(zhì)分泌之間酶促切除。由此，成熟的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中通常不存在信號(hào)肽。
“封閉性抗體”或“拮抗性(antagonist)”抗體指抑制或降低它所結(jié)合的抗原(如c-met和VEGF受體)的生物學(xué)活性的抗體。
“激動(dòng)性抗體(agonist antibody)”在用于本文時(shí)指模擬目的多肽(如HGF和VEGF)的至少一種功能性活性的抗體。
“腫瘤抗原”在用于本文時(shí)包括本領(lǐng)域知道的含義，包括與正常細(xì)胞相比在腫瘤細(xì)胞上差異表達(dá)的任何分子。在有些實(shí)施方案中，所述分子在腫瘤細(xì)胞中以可檢測(cè)的或者顯著高于或低于正常細(xì)胞的水平表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，所述分子在腫瘤細(xì)胞中展示可檢測(cè)的或者顯著高于或低于正常細(xì)胞的水平的生物學(xué)活性。在有些實(shí)施方案中，已知或認(rèn)為所述分子有助于腫瘤細(xì)胞的致瘤特征。本領(lǐng)域已知許多腫瘤抗原。還可以依照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)和試驗(yàn)來確定某種分子是否是腫瘤抗原，諸如例如產(chǎn)克隆試驗(yàn)(clonogenic assays)、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、體外或體內(nèi)腫瘤形成試驗(yàn)、凝膠遷移試驗(yàn)、基因敲除分析等。
“紊亂”指將受益于本發(fā)明抗體或方法的治療的任何狀況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易患所討論紊亂的病理狀況。本文中待治療紊亂的非限制性實(shí)例包括惡性和良性腫瘤；非白血病性和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體的、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔病癥；及炎性、免疫學(xué)和其它血管發(fā)生相關(guān)紊亂。
術(shù)語“癌癥”和“癌癥的”指的是或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)/增殖的生理狀況。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。這些癌癥的更具體實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、腹膜癌癥、骨髓瘤(如多發(fā)性骨髓瘤)、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤/神經(jīng)膠質(zhì)瘤(如多形性星形細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性少突星形細(xì)胞瘤)、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝的癌(hepatic carcinoma)及各種類型的頭和頸癌。
“自身免疫病”在本文中指源于且針對(duì)個(gè)體自身組織的非惡性疾病或紊亂。自身免疫病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或紊亂，尤其排除B細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、多毛細(xì)胞白血病和慢性成髓細(xì)胞白血病。自身免疫疾病或紊亂的實(shí)例包括但不限于炎性應(yīng)答，諸如炎性皮膚病，包括銀屑病(牛皮癬)和皮炎(如特應(yīng)性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥；與炎性腸病有關(guān)的應(yīng)答(諸如Crohn氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合癥(包括成人呼吸窘迫綜合癥；ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過敏狀況，諸如濕疹和哮喘及牽涉T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎性應(yīng)答的其它狀況；動(dòng)脈硬化；白細(xì)胞粘著缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(如I型糖尿病和胰島素依賴性糖尿病)；多發(fā)性硬化癥；Reynaud氏綜合癥；自身免疫性甲狀腺炎；特應(yīng)性腦脊髓炎；Sjorgen氏綜合癥；幼發(fā)型糖尿病；通常在肺結(jié)核、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎中發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)有關(guān)的免疫應(yīng)答；惡性貧血(Addison氏病)；牽涉白細(xì)胞滲出的疾?。恢袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性紊亂；多種器官損傷綜合癥；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥(cryoglobinemia)或Coombs氏反應(yīng)陽性貧血(Coombs positive anemia))；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基膜??；抗磷脂綜合癥；過敏性神經(jīng)炎；Graves氏病；Lambert-Eaton肌無力綜合癥；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內(nèi)分泌腺?。籖eiter氏?。唤w綜合癥(stiff-man syndrome)；Behcet氏??；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎??；IgM多神經(jīng)??；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。
在用于本文時(shí)，“治療”指試圖改變受治療個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括防止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、防止轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或紊亂的發(fā)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和方法實(shí)現(xiàn)了腫瘤消退。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤/癌生長(zhǎng)的抑制。
“有效量”指在必需的劑量和時(shí)間上有效達(dá)到期望的治療或預(yù)防效果的數(shù)量。本發(fā)明抗體的“治療有效量”可以根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及抗體在個(gè)體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指抗體的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果?！邦A(yù)防有效量”指在必需的劑量和時(shí)間上有效達(dá)到期望的預(yù)防效果的數(shù)量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量。
在用于本文時(shí)，短語“不具有實(shí)質(zhì)性的效應(yīng)物功能”就本發(fā)明的抗體片段而言指對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明抗體片段的可檢測(cè)效應(yīng)物功能活性的數(shù)量與所述抗體的野生型糖基化對(duì)應(yīng)物所展示的活性數(shù)量之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的，其中本發(fā)明抗體片段的活性數(shù)量低于野生型對(duì)應(yīng)物所展示的活性數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體片段不展示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的超過背景水平的效應(yīng)物功能活性水平(除了FcRn結(jié)合以外)。在用于本文時(shí)，短語“具有少許免疫抑制特性至沒有免疫抑制特性”就本發(fā)明的抗體片段而言指抗體在施用于受試者后不引發(fā)生物學(xué)有意義的數(shù)量的免疫抑制。正如本領(lǐng)域所理解的，可以定量或定性的測(cè)定活性的數(shù)量，只要能夠在本發(fā)明的抗體與參照對(duì)應(yīng)物之間進(jìn)行比較?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域知道的任何試驗(yàn)或技術(shù)來測(cè)量或檢測(cè)活性，包括如本文所述?？梢云叫械鼗蚍謩e地測(cè)定本發(fā)明抗體及其參照對(duì)應(yīng)物的活性的數(shù)量。
短語“基本上(本質(zhì)上)相似的”、“基本上(本質(zhì)上)同一的”、“基本上(本質(zhì)上)相同的”及其變化的相應(yīng)描述在用于本文時(shí)指兩個(gè)數(shù)值(通常一個(gè)與本發(fā)明的抗體有關(guān)而另一個(gè)與其參照對(duì)應(yīng)物有關(guān))之間足夠高度的相似性，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為兩個(gè)數(shù)值之間的差異在由所述數(shù)值測(cè)量的生物學(xué)、物質(zhì)或數(shù)量特征的語境內(nèi)沒有或具有極少生物學(xué)意義。所述兩個(gè)數(shù)值之間的差異優(yōu)選小于約50％、優(yōu)選小于約40％、優(yōu)選小于約30％、優(yōu)選小于約20％、優(yōu)選小于約10％，上述百分比為參照對(duì)應(yīng)物數(shù)值的函數(shù)。
本發(fā)明的抗體片段比另一種抗體形式(諸如Fab片段對(duì)應(yīng)物)“更加穩(wěn)定”或具有“提高的穩(wěn)定性”及其變體在用于本文時(shí)指與參照抗體(諸如Fab片段對(duì)應(yīng)物)相比本發(fā)明的抗體片段展示可檢測(cè)的/可測(cè)量的體內(nèi)穩(wěn)定性升高。穩(wěn)定性可以以半衰期、清除速率和/或本領(lǐng)域看作在將本發(fā)明的抗體片段施用于受試者后的特定時(shí)間點(diǎn)有多少抗體片段保留在受試者體內(nèi)的指標(biāo)的任何其它參數(shù)為基礎(chǔ)。測(cè)定穩(wěn)定性參數(shù)諸如半衰期和/或清除速率的方法在本領(lǐng)域眾所周知，本文描述了其中一些。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”和“CDC”指存在補(bǔ)體時(shí)目標(biāo)的裂解。補(bǔ)體激活途經(jīng)是由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一種構(gòu)件(C1q)結(jié)合與相關(guān)抗原復(fù)合的分子(如抗體)而發(fā)起的。
“結(jié)合親和力”通常指分子(如抗體)的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配對(duì)物(如抗原或FcRn受體)之間非共價(jià)相互作用的總和強(qiáng)度。分子X對(duì)其配對(duì)物Y的親和力通?？梢员硎鰹榻怆x常數(shù)(Kd)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域知道的通用方法來測(cè)量親和力，包括本文所述。低親和力抗體微弱地結(jié)合抗原(或FcRn受體)，且傾向易于解離；而高親和力抗體更加緊密的結(jié)合抗原(或FcRn受體)，且更久的保持結(jié)合。
術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞毀滅的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的小分子毒素或有酶活性的毒素，包括其片段和/或變體。
“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑膶?shí)例包括烷化劑，諸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫化磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenin(番荔枝內(nèi)酯)類(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚類(曲大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素類(colchicine)；白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物拓?fù)涮婵?topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東茛菪素(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；鬼臼噻吩苷(teniposide)；隱藻素(cryptophycin)類(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合適類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、磷雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、三芥環(huán)磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲類(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(參閱如Agnew，1994，Chem.Intl.Ed.Engl.，33183-186))；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素類(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素類(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素類(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、嗎啉阿霉素、氰嗎啉阿霉素、2-吡咯啉阿霉素、鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射液(DOXIL)和脫氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycin)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素類(olivomycin)、培來霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine，GEMZAR)、喃氟啶(tegafur，UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine，XELODA)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、曲麥克特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、氮雜胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、羥甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinic acid，frolinic acid)；醋葡內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；蒽尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；醋酸羥嗶咔唑(elliptinium acetate)；環(huán)氧甘醚(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine，lonidainine)；美登木素生物堿類(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)和美坦西醇類(ansamitocin)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹達(dá)謀(mopidamol，mopidanmol)；nitraerine；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；甲基芐肼(procarbazine)；PSK多糖復(fù)合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；丙亞胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西作非蘭(裂裥多糖，sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細(xì)格孢氮雜酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidin，anguidine))；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；硫替哌；類紫杉醇類(taxoid)，如紫杉醇(paclitaxel，TAXOL)、紫杉醇的清蛋白改造納米顆粒劑型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel，TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil，chloranbucil)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿(vinblastine，VELBAN)；鉑；鬼臼乙叉苷(etoposide，VP-16)；異磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長(zhǎng)春新堿(vincristine，ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；亞葉酸(leucovorin，leucovovin)；長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine，NAVELBINE)；米托蒽醌(novantrone)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃醇類，諸如視黃酸；任何上述試劑的制藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或多種的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和亞葉酸(leucovovin)的治療方案的縮寫)。
該定義還包括起調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制能夠促進(jìn)癌生長(zhǎng)的激素發(fā)揮作用的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可能是激素。實(shí)例包括抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene，EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲奧昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那斯酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene，F(xiàn)ARESTON)；抗孕酮；雌激素受體下調(diào)劑(ERD)；雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant，F(xiàn)ASLODEX)；作用于抑制或關(guān)閉卵巢的試劑，例如促黃體生成素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate，LUPRON和ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(醋酸性瑞林，goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin，tripterelin)；其它抗雄激素，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate，MEGASE)、依西美坦(exemestane，AROMASIN)、福美司坦(formestane，formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole，RIVISOR)、來曲唑(letrozole，F(xiàn)EMARA)和阿納托唑(anastrozole，ARIMIDEX)。另外，化療劑的這些定義包括二膦酸鹽，諸如氯屈膦酸二鈉(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鈉(etidronate，DIDROCAL)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鈉(zoledronic acid/zoledronate，ZOMETA)、阿倫膦酸鈉(alendronate，F(xiàn)OSAMAX)、帕米膦酸鈉(pamidronate，AREDIA)、替魯膦酸鈉(tiludronate，SKELID)或利塞膦酸鈉(risedronate，ACTONEL)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘著細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑(如LURTOTECAN)；rmRH(如ABARELIX)；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016)；COX-2抑制劑，諸如塞來昔布(celecoxib，CELEBREX；4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述試劑的制藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。
除非文中另有說明，術(shù)語“第一種(第一)”多肽和“第二種(第二)”多肽及其變體只是一般稱謂，并非指定具體多肽或本發(fā)明的抗體構(gòu)件。
“突起”指例如由第一多肽的界面突出并因此可位于鄰近界面(即第二多肽的界面)的補(bǔ)償腔中從而穩(wěn)定異多聚體且由此對(duì)同多聚體形成而言有助于形成異多聚體的至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈。突起可以存在于原始界面中，或者可以人為導(dǎo)入(如通過改變編碼界面的核酸)。通常，改變編碼第一多肽的界面的核酸以編碼突起。為此，將編碼第一多肽的界面中的至少一個(gè)“原始”氨基酸殘基的核酸用編碼至少一個(gè)比原始氨基酸殘基具有更大側(cè)鏈體積的“輸入”氨基酸殘基的核酸替代?？梢岳斫?，可以存在超過一個(gè)原始?xì)埢拖鄳?yīng)的輸入殘基。所替代原始?xì)埢臄?shù)目上限是第一多肽的界面中的殘基總數(shù)。下表顯示了各種氨基酸殘基的側(cè)鏈體積。
表1氨基酸殘基的特性

a氨基酸的分子量減去了水的分子量。數(shù)值來自《Handbook of Chemistryand Physics》，第43版，Cleveland，Chemical Rubber Publishing Co.，1961。
b數(shù)值來自A.A.Zamyatnin，1972，Prog.Biophys.Mol.Biol.，24107-123。
c數(shù)值來自C.Chothia，1975，J.Mol.Biol.，1051-14。可及表面積如該參考文獻(xiàn)的圖6-20定義。
為了形成突起而優(yōu)選的輸入殘基通常是天然存在氨基酸殘基，且優(yōu)選選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最優(yōu)選的是色氨酸和酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于形成突起的原始?xì)埢哂休^小側(cè)鏈體積，諸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。
“腔”指至少一個(gè)氨基酸側(cè)鏈陷入第二多肽的界面并因此可容納第一多肽鄰近界面上的相應(yīng)突起。腔可以存在于天然界面中，或者可以人為導(dǎo)入(如通過改變編碼界面的核酸)。通常，改變編碼第二多肽的界面的核酸以編碼腔。為此，將編碼第二多肽的界面中的至少一個(gè)“原始”氨基酸殘基的核酸用編碼至少一個(gè)比原始氨基酸殘基具有更小側(cè)鏈體積的“輸入”氨基酸殘基的DNA替代?？梢岳斫?，可以存在超過一個(gè)原始?xì)埢拖鄳?yīng)的輸入殘基。所替代原始?xì)埢臄?shù)目上限是第二多肽的界面中的殘基總數(shù)。上文表1顯示了各種氨基酸殘基的側(cè)鏈體積。為了形成腔而優(yōu)選的輸入殘基通常是天然存在氨基酸殘基，且優(yōu)選選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和纈氨酸(V)。最優(yōu)選的是絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于形成腔的原始?xì)埢哂休^大側(cè)鏈體積，諸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
“原始”氨基酸殘基指用比原始?xì)埢哂懈』蚋髠?cè)鏈體積的“輸入”殘基所替代的氨基酸殘基。輸入氨基酸殘基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基，但優(yōu)選前者。“天然存在的”氨基酸殘基指由遺傳密碼編碼的殘基，正如上文表1所列?！胺翘烊淮嬖诘摹卑被釟埢覆皇怯蛇z傳密碼編碼的殘基，但是它們能夠與多肽鏈中的鄰近氨基酸殘基共價(jià)連接。非天然存在氨基酸殘基的實(shí)例有正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，諸如例如Ellman等人，1991，Meth.Enzym.，202301-336中所述。為了生成這些非天然存在氨基酸殘基，可以使用Noren等人，1989，Science，244182和Ellman等人，見上文的流程。簡(jiǎn)而言之，這牽涉用非天然存在氨基酸殘基化學(xué)活化抑制型tRNA，然后體外轉(zhuǎn)錄并翻譯RNA。本發(fā)明的方法牽涉替代至少一個(gè)原始氨基酸殘基，但可以替代超過一個(gè)原始?xì)埢?。通常，所替代的原始氨基酸殘基不超過第一或第二多肽的界面中的全部殘基。通常，所替代的原始?xì)埢恰把诼竦摹薄！把诼竦摹敝溉軇┗旧线_(dá)不到該殘基。通常，輸入殘基不是半胱氨酸以防止可能的氧化或二硫鍵錯(cuò)配。
突起“可位于”腔中指第一多肽和第二多肽各自界面上的突起和腔的空間位置及突起和腔的大小容許突起可以位于腔中且不會(huì)顯著干擾第一與第二多肽在界面處的正常結(jié)合。由于突起(諸如Tyr、Phe和Trp)通常不會(huì)由界面的軸垂直伸出且具有優(yōu)選的構(gòu)象，因此突起與對(duì)應(yīng)腔的排列取決于以三維結(jié)構(gòu)(諸如通過X射線結(jié)晶學(xué)或核磁共振(NMR)得到的)為基礎(chǔ)的突起/腔對(duì)的建模。這可以使用本領(lǐng)域廣泛接受的技術(shù)來完成。
“原始或模板核酸”指編碼目的多肽的核酸，它可以“改變”(即遺傳工程改造或突變)以編碼突起或腔。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含進(jìn)行了上述改變的核酸(如人源化抗體片段)。“改變”核酸指原始核酸通過插入、刪除或替代至少一個(gè)編碼目的氨基酸殘基的密碼子而進(jìn)行了突變。通常，將編碼原始?xì)埢拿艽a子用編碼輸入殘基的密碼子替代。用于以這種方式遺傳修飾DNA的技術(shù)的綜述見《Mutagenesisa PracticalApproach》，M.J.McPherson編，IRL Press，Oxford，UK，1991，且包括例如定點(diǎn)誘變、盒式誘變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)誘變。通過突變?cè)?模板核酸，由此就相應(yīng)改變了由原始/模板核酸編碼的原始/模板多肽。
可以通過合成手段將突起或腔“導(dǎo)入”第一或第二多肽的界面，如通過重組技術(shù)、體外肽合成、先前所述用于導(dǎo)入非天然存在氨基酸殘基的那些技術(shù)、通過肽的酶促或化學(xué)偶聯(lián)或這些技術(shù)的一些組合。因此，“導(dǎo)入”的突起或腔是“非天然存在的”或“非天然的”，這意味著它不存在于天然或原始多肽中(如人源化單克隆抗體)。
通常，用于形成突起的輸入氨基酸殘基具有相對(duì)較小數(shù)目的“旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體”(如約3-6種)?！靶D(zhuǎn)異構(gòu)體”指氨基酸側(cè)鏈的熱力學(xué)有利構(gòu)象。各種氨基酸殘基的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù)目的綜述見Ponders和Richards，1987，J.Mol.Biol.，193775-791。
“分離的”異多聚體指已經(jīng)由其天然細(xì)胞培養(yǎng)物環(huán)境的成分鑒定且分開和/或回收的異多聚體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾異多聚體的診斷性或治療性用途的物質(zhì)，可以包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在有些實(shí)施方案中，異多聚體純化(1)超過95％(以重量計(jì))的蛋白質(zhì)(通過Lowry法測(cè)定)，或超過99％(以重量計(jì))，(2)達(dá)到足以獲得至少15個(gè)殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列(使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀)的程度，或(3)根據(jù)SDS-PAGE(使用還原或非還原條件，使用考馬斯藍(lán)或銀染)達(dá)到同質(zhì)。
本發(fā)明的異多聚體通常純化至本質(zhì)上同質(zhì)。短語“基本上(本質(zhì)上)同質(zhì)的”、“基本上(本質(zhì)上)同質(zhì)的形式”和“基本上(本質(zhì)上)同質(zhì)”用于指產(chǎn)物本質(zhì)上不含源自非期望多肽組合體(如同多聚體)的副產(chǎn)物。就表述成純度而言，基本上(本質(zhì)上)同質(zhì)意味著副產(chǎn)物的數(shù)量不超過10％、或低于5％、或低于1％、或低于0.5％，其中百分?jǐn)?shù)指重量。
表述“控制序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、可能還有目前了解不多的序列。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、和增強(qiáng)子。
當(dāng)一種核酸與另一種核酸序列處于功能性相互關(guān)系中時(shí)，則它們是“可操作連接的”。例如，若前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白，則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。通常，“可操作連接”指DNA序列鄰近相連，且在分泌前導(dǎo)序列的情況中指鄰近且以讀碼狀態(tài)相連。然而，增強(qiáng)子不必鄰近。連接可以通過在方便的限制性位點(diǎn)處的連接反應(yīng)來完成。如果沒有這些位點(diǎn)，那么使用與常規(guī)實(shí)踐一致的合成寡核苷酸銜接頭或接頭。
載體、宿主細(xì)胞和重組方法為了重組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，分離編碼它的核酸，并將其插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)?？梢允褂贸Ｒ?guī)流程容易的分離編碼抗體的DNA并測(cè)序(如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。可以獲得許多載體。載體的選擇部分取決于將要使用的宿主細(xì)胞。通常，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核或真核(通常是哺乳動(dòng)物)起源。
使用原核宿主細(xì)胞生成抗體載體構(gòu)建可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)獲得編碼本發(fā)明抗體多肽構(gòu)件的多核苷酸序列。可以由抗體生成細(xì)胞(諸如雜交瘤細(xì)胞)分離期望的多核苷酸序列并測(cè)序?；蛘撸梢允褂煤塑账岷铣蓛x或PCR技術(shù)合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復(fù)制并表達(dá)異源多核苷酸的重組載體。為了本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域知道的且可獲得的許多載體。合適載體的選擇主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。根據(jù)其功能(擴(kuò)增或表達(dá)異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細(xì)胞的相容性，每種載體都含有多種構(gòu)件。載體構(gòu)件通常包括但不限于復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、信號(hào)序列、異源核酸插入片段、和轉(zhuǎn)錄終止序列。
一般而言，與宿主細(xì)胞一起使用的質(zhì)粒載體含有源自與所述宿主相容物種的復(fù)制子和控制序列。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322含有編碼氨芐青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，由此提供輕松鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物質(zhì)?；蚴删w也可以含有或在修飾后含有能夠被微生物生物體用于表達(dá)內(nèi)源蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。Carter等人，美國(guó)專利號(hào)5,648,237中詳細(xì)描述了用于表達(dá)特定抗體的pBR322衍生物的實(shí)例。
另外，可以將含有與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿主的轉(zhuǎn)化載體。例如，可以使用噬菌體諸如λGEM.TM.-11來構(gòu)建可用于轉(zhuǎn)化敏感宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌LE392的重組載體。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以包含兩種或多種啟動(dòng)子-順反子對(duì)，編碼每一種多肽構(gòu)件。啟動(dòng)子是位于順反子上游(5′)的非翻譯調(diào)控序列，它調(diào)控順反子的表達(dá)。原核啟動(dòng)子通常分成兩類，誘導(dǎo)型和組成性。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子指應(yīng)答培養(yǎng)條件的變化(如營(yíng)養(yǎng)物的存在與否或溫度變化)而啟動(dòng)受其控制的順反子的升高水平轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
眾所周知受到多種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的大量啟動(dòng)子。通過限制酶消化清除源DNA中的啟動(dòng)子并將分離的啟動(dòng)子序列插入本發(fā)明的載體，由此可以將選擇的啟動(dòng)子與編碼輕鏈或重鏈的順反子DNA可操作連接。天然啟動(dòng)子序列和許多異源啟動(dòng)子都可以用于指導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，采用異源啟動(dòng)子，因?yàn)榕c天然靶多肽啟動(dòng)子相比，它們通常容許所表達(dá)靶基因的更高轉(zhuǎn)錄和更高產(chǎn)量。
適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括PhoA啟動(dòng)子、β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子諸如tac或trc啟動(dòng)子。然而，在細(xì)菌中有功能的其它啟動(dòng)子(諸如其它已知的細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)表，因此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點(diǎn)的接頭或銜接頭將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作連接(Siebenlist等人，1980，Cell，20269)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，重組載體內(nèi)的每個(gè)順反子都包含指導(dǎo)所表達(dá)多肽穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌信號(hào)序列構(gòu)件。一般而言，信號(hào)序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是插入載體的靶多肽DNA的一部分。為了本發(fā)明而選擇的信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切除)的信號(hào)序列。對(duì)于不識(shí)別并加工異源多肽的天然信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，將信號(hào)序列用選自例如下組的原核信號(hào)序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II(STII)前導(dǎo)序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)順反子中都使用的信號(hào)序列是STII信號(hào)序列或其變體。
在另一個(gè)方面，依照本發(fā)明的免疫球蛋白的生成可以發(fā)生在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，因此不需要在每個(gè)順反子內(nèi)存在分泌信號(hào)序列。在那點(diǎn)上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)、折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大腸桿菌trxB-菌株)提供有利于二硫鍵形成的細(xì)胞質(zhì)條件，從而容許所表達(dá)蛋白質(zhì)亞基的正確折疊和裝配(Proba和Pluckthun，1995，Gene，159203)。
本發(fā)明提供了可以調(diào)控所表達(dá)多肽構(gòu)件的數(shù)量比率的表達(dá)系統(tǒng)，從而將分泌且正確裝配的本發(fā)明抗體的產(chǎn)量最大化。這種調(diào)控是至少部分通過同時(shí)調(diào)控多肽構(gòu)件的翻譯強(qiáng)度而完成的。
Simmons等人，美國(guó)專利號(hào)5,840,523中公開了用于調(diào)控翻譯強(qiáng)度的一種技術(shù)。它在順反子內(nèi)采用翻譯起始區(qū)(TIR)的變體。對(duì)于指定TIR，可以創(chuàng)建具有一定范圍翻譯強(qiáng)度的一系列氨基酸或核苷酸序列變體，由此提供針對(duì)特定鏈的期望表達(dá)水平調(diào)節(jié)此因素的方便手段。可以通過常規(guī)誘變技術(shù)導(dǎo)致能夠改變氨基酸序列的密碼子變化(盡管優(yōu)選核苷酸序列中的沉默變化)從而生成TIR變體。TIR中的改變可以包括例如Shine-Dalgarno序列的數(shù)目或間距的改變，以及信號(hào)序列的改變。用于生成突變型信號(hào)序列的一種方法是在編碼序列的開端生成不改變信號(hào)序列氨基酸序列的“密碼子庫”(即變化是沉默的)。這可以通過改變每個(gè)密碼子的第三個(gè)位置核苷酸來完成；另外，有些氨基酸，諸如亮氨酸、絲氨酸、和精氨酸，具有多種第一個(gè)和第二個(gè)位置核苷酸，這能夠?yàn)榻◣煸黾訌?fù)雜性。Yansura等人，1992，METHODSA Companion to Methods in Enzymol.，4151-158中詳細(xì)描述了這種誘變方法。
優(yōu)選的是，對(duì)于載體中的每個(gè)順反子，生成具有一定范圍TIR強(qiáng)度的一組載體。這個(gè)有限集合提供了每條鏈的表達(dá)水平以及期望抗體產(chǎn)物的產(chǎn)量在各種TIR強(qiáng)度組合下的比較?？梢酝ㄟ^量化報(bào)道基因的表達(dá)水平來測(cè)定TIR強(qiáng)度，Simmons等人，美國(guó)專利號(hào)5,840,523中有詳細(xì)描述。根據(jù)翻譯強(qiáng)度的比較，選擇期望的個(gè)別TIR在本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建物中進(jìn)行組合。
適于表達(dá)本發(fā)明抗體的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌(Archaebacteria)和真細(xì)菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏菌(Escherichia)(如大腸埃希氏菌E.coli)、芽孢桿菌(Bacilli)(如枯草芽孢桿菌B.subtilis)、腸桿菌(Enterobacteria)、假單胞菌(Pseudomonas)物種(如銅綠假單胞菌P.aeruginosa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形菌(Proteus)、志賀氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)、或副球菌(Paracoccus)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用大腸桿菌細(xì)胞作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌株的實(shí)例包括菌株W3110(Bachmann，《Cellular and MolecularBiology》，第2卷，Washington，D.C.，美國(guó)微生物學(xué)學(xué)會(huì)，1987，第1190-1219頁；ATCC保藏號(hào)27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美國(guó)專利號(hào)5,639,635)。其它菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌RV308(ATCC 31,608)也是合適的。這些實(shí)例只是例示而非限制。本領(lǐng)域知道用于構(gòu)建具有指定基因型的任何上述細(xì)菌衍生物的方法，見例如Bass等人，1990，Proteins，8309-314。通常必需考慮復(fù)制子在細(xì)菌細(xì)胞中的可復(fù)制性來選擇適當(dāng)?shù)募?xì)菌。例如，在使用眾所周知的質(zhì)粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供復(fù)制子時(shí)，大腸桿菌、沙雷氏菌、或沙門氏菌物種可能適于用作宿主。通常，宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細(xì)胞培養(yǎng)中摻入額外的蛋白酶抑制劑。
抗體生產(chǎn)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)化即將DNA導(dǎo)入原核宿主，使得DNA能夠或是作為染色體外元件或是通過染色體成分而復(fù)制。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適合這些細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用氯化鈣的鈣處理通常用于具有堅(jiān)固細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。另一種轉(zhuǎn)化方法采用聚乙二醇/DMSO。采用的還有一種技術(shù)是電穿孔。
在本領(lǐng)域知道的且適于培養(yǎng)選定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞。合適培養(yǎng)基的實(shí)例包括添加了必需營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物的LB培養(yǎng)基。在有些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還含有根據(jù)表達(dá)載體的構(gòu)建而選擇的、選擇性容許攜帶表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇劑。例如，向用于培養(yǎng)表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素。
除了碳、氮、和無機(jī)磷酸鹽來源以外，還可以含有適當(dāng)濃度的任何必需補(bǔ)充物，或是單獨(dú)加入或是作為與另一種補(bǔ)充物或培養(yǎng)基的混合物，諸如復(fù)合氮源。任選的是，培養(yǎng)基可以含有一種或多種選自下組的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。
在合適的溫度培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞。例如，對(duì)于培養(yǎng)大腸桿菌而言，優(yōu)選的溫度范圍是約20℃至約39℃，更優(yōu)選約25℃至約37℃，甚至更優(yōu)選約30℃。主要根據(jù)宿主生物體，培養(yǎng)基的pH可以是范圍為約5至約9的任何pH。對(duì)于大腸桿菌而言，pH優(yōu)選約6.8至約7.4，更優(yōu)選約7.0。
如果本發(fā)明的表達(dá)載體中所使用的是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么在適于激活啟動(dòng)子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用PhoA啟動(dòng)子來控制多肽的轉(zhuǎn)錄。因此，在用于誘導(dǎo)的磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。優(yōu)選的是，磷酸鹽限制培養(yǎng)基是C.R.A.P培養(yǎng)基(參閱如Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可以采用多種其它誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域所知道的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所表達(dá)的本發(fā)明多肽分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)且由此回收。蛋白質(zhì)回收通常牽涉破壞微生物，通常通過諸如滲壓震擾、超聲處理或裂解等手段。一旦細(xì)胞破裂，可以通過離心或過濾清除細(xì)胞碎片或整個(gè)細(xì)胞?？梢酝ㄟ^例如親和樹脂層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。或者，蛋白質(zhì)可能轉(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)液中且由此分離。可以由培養(yǎng)液清除細(xì)胞，并將培養(yǎng)液過濾和濃縮，用于進(jìn)一步純化所生成蛋白質(zhì)?？梢允褂闷毡橹赖姆椒ㄖT如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡分析進(jìn)一步分離和鑒定所表達(dá)蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過發(fā)酵過程大量進(jìn)行抗體生產(chǎn)。多種大規(guī)模補(bǔ)料-分批發(fā)酵流程可用于生產(chǎn)重組蛋白。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1,000至100,000升的容量。這些發(fā)酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養(yǎng)分，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳源/能源)。小規(guī)模發(fā)酵通常指在體積容量不超過約100升的發(fā)酵罐中進(jìn)行的發(fā)酵，范圍可以是約1升至約100升。
在發(fā)酵過程中，通常在細(xì)胞在合適條件下生長(zhǎng)至期望密度(如OD550約180-220，在此階段細(xì)胞處于早期穩(wěn)定期)后啟動(dòng)蛋白質(zhì)表的誘導(dǎo)。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可以使用多種誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域知道的且上文所述的?？梢栽谡T導(dǎo)前將細(xì)胞培養(yǎng)更短的時(shí)間。通常將細(xì)胞誘導(dǎo)約12-50小時(shí)，但是可以使用更長(zhǎng)或更短的誘導(dǎo)時(shí)間。
為了改善本發(fā)明多肽的產(chǎn)量和質(zhì)量，可以修改多個(gè)發(fā)酵條件。例如，為了改善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊，可以使用過度表達(dá)伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侶活性的一種肽基脯氨酰-順式，反式-異構(gòu)酶)的額外載體共轉(zhuǎn)化宿主原核細(xì)胞。已經(jīng)證明伴侶蛋白促進(jìn)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中生成的異源蛋白的正確折疊和溶解性(Chen等人，1999，J.Biol.Chem.，27419601-19605；Georgiou等人，美國(guó)專利號(hào)6,083,715；Georgiou等人，美國(guó)專利號(hào)6,027,888；Bothmann和Pluckthun，2000，J.Biol.Chem.，27517100-17105；Ramm和Pluckthun，2000，J.Biol.Chem.，27517106-17113；Arie等人，2001，Mol.Microbiol.，39199-210)。
為了將所表達(dá)異源蛋白(尤其是對(duì)蛋白水解敏感的蛋白質(zhì))的蛋白水解降至最低，可以將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本發(fā)明。例如，可以修飾宿主細(xì)胞菌株，在編碼已知細(xì)菌蛋白酶的基因中進(jìn)行遺傳突變，諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合?？梢垣@得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株，參閱例如Joly等人，1998，見上文；Georgiou等人，美國(guó)專利號(hào)5,264,365；Georgiou等人，美國(guó)專利號(hào)5,508,192；Hara等人，1996，Microbial Drug Resistance，263-72。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中使用蛋白水解酶缺陷且經(jīng)過度表達(dá)一種或多種伴侶蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株作為宿主細(xì)胞。
抗體純化在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步純化此處生成的抗體蛋白以獲得基本上(本質(zhì)上)同質(zhì)的制劑，用于進(jìn)一步的測(cè)定和使用?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。下面的流程是合適純化流程的例示在免疫親和或離子交換柱上分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅土或陽離子交換樹脂諸如DEAE上層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝膠過濾。
在一個(gè)方面，將固定在固相上的蛋白A用于本發(fā)明全長(zhǎng)抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，它以高親和力結(jié)合抗體Fc區(qū)(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Meth.，621-13)。蛋白A固定其上的固相優(yōu)選具有玻璃或石英表面的柱子，更優(yōu)選可控孔徑玻璃柱或硅酸柱。在有些應(yīng)用中，柱子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止污染物的非特異粘附。
作為純化的第一步，將衍生自如上所述細(xì)胞培養(yǎng)物的制備物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗體特異結(jié)合蛋白A。然后清洗固相以清除與固相非特異結(jié)合的污染物。最后通過洗脫由固相回收目的抗體。
使用真核宿主細(xì)胞生成抗體載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
(i)信號(hào)序列構(gòu)件用于真核宿主細(xì)胞的載體還可以在目的成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端含有信號(hào)序列或具有特異切割位點(diǎn)的其它多肽。優(yōu)選受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即受到信號(hào)肽酶切割)的異源信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)例如單純皰疹病毒gD信號(hào)。
將這些前體區(qū)的DNA連接到編碼抗體的DNA的讀碼框中。
(ii)復(fù)制起點(diǎn)通常，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件。例如，SV40起點(diǎn)通常可能只因含有早期啟動(dòng)子才使用。
(iii)選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可以含有選擇基因，也稱為選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予抗生素或其它毒素抗性，如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。
選擇方案的一個(gè)實(shí)例利用藥物來阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選擇方案。這些顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記的另一個(gè)實(shí)例是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)記，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
例如，首先通過將所有轉(zhuǎn)化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一種競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(如ATCC CRL-9096)。
或者，可以通過在含有針對(duì)選擇標(biāo)記的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來選擇經(jīng)編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標(biāo)記諸如氨基糖苷3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是含有內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參閱美國(guó)專利號(hào)4,965,199。
(iv)啟動(dòng)子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體通常含有受到宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，且與抗體多肽核酸可操作連接。已知真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信號(hào)。所有這些序列合適的插入真核表達(dá)載體中。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄抗體多肽受到例如由病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細(xì)胞巨化病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因組獲得的、來自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子)的、來自熱休克啟動(dòng)子的啟動(dòng)子的控制，倘若這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。
方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，該片段還含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便地以HindIII E限制性片段的形式獲得人細(xì)胞巨化病毒的立即早期啟動(dòng)子。美國(guó)專利號(hào)4,419,446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利號(hào)4,601,978中描述了該系統(tǒng)的一種修改。關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下表達(dá)人β-干擾素cDNA還可參閱Reyes等人，1982，Nature，297598-601?；蛘?，可以使用勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。
(v)增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過在載體中插入增強(qiáng)子序列來提高高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明抗體多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。已知來自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子(bp 100-270)、細(xì)胞巨化病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件還可參閱Yaniv，1982，Nature，29717-18。增強(qiáng)子可以剪接到載體中，位于抗體多肽編碼序列的5′或3′位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5′位點(diǎn)。
(vi)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體通常還含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這些序列通?？梢杂烧婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5′端和偶爾的3′端獲得。這些區(qū)域含有在編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參閱WO94/11026及其中公開的表達(dá)載體。
(vii)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括本文描述的高等真核細(xì)胞，包括脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞。脊椎動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例有經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚腎系(293細(xì)胞或?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Graham等人，1977，J.Gen.virol.，3659)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216)、小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.，23243-251)、猴腎細(xì)胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)、人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI細(xì)胞(Mather等人，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68)、MRC 5細(xì)胞、FS4細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤系(Hep G2)。
為了生產(chǎn)抗體，用上文所述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
(viii)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中描述的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham等人，1979，Meth.Enz.，5844；Barnes等人，1980，Anal.Biochem.，102255；美國(guó)專利號(hào)4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國(guó)專利再審號(hào)(U.S.Patent Re.)30,985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適當(dāng)濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件諸如溫度、pH等即為表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞先前所用的，這對(duì)于普通技術(shù)人員而言是顯然的。
(ix)抗體的純化在使用重組技術(shù)時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么首先需要通過例如離心或超濾清除宿主細(xì)胞或裂解片段的微粒碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自這些表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來污染物的生長(zhǎng)。
可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析)來純化由細(xì)胞制備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2、或γ4重鏈的抗體(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Meth.，621-13)。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人γ3(Guss等人，1986，EMBO J.，51567-1575)。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時(shí)間。對(duì)于包含CH3結(jié)構(gòu)域的抗體而言，可使用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何初步純化步驟之后，可以將包含目的抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，使用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(如約0-0.25M鹽)進(jìn)行。
活性測(cè)定法可以通過本領(lǐng)域知道的多種測(cè)定法對(duì)本發(fā)明的抗體鑒定它們的物理/化學(xué)特性和生物學(xué)功能。
可以通過一系列測(cè)定法進(jìn)一步鑒定純化的免疫球蛋白，包括但不限于N端測(cè)序、氨基酸分析、非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC)、質(zhì)譜、離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，對(duì)本文生產(chǎn)的免疫球蛋白分析它們的生物學(xué)活性。在有些實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的免疫球蛋白測(cè)試它們的抗原結(jié)合活性。本領(lǐng)域知道的且可用于本文的抗原結(jié)合測(cè)定法包括但不限于使用諸如Western印跡、放射免疫測(cè)定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、“三明治”免疫測(cè)定法、免疫沉淀測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法和蛋白A免疫測(cè)定法等技術(shù)的任何直接或競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。下文在實(shí)施例部分中提供了例示性的抗原結(jié)合測(cè)定法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋具有一些但非所有效應(yīng)物功能的改良抗體，這使得它在抗體體內(nèi)半衰期是重要的但某些效應(yīng)物功能(諸如補(bǔ)體和ADCC)是不必要的或有害的許多應(yīng)用中成為期望的候選物。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量所生產(chǎn)免疫球蛋白的Fc活性以確保只保留了期望的特性?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)定法來確認(rèn)CDC和/或ADCC活性的降低/耗損。例如，可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測(cè)定法來確?？贵w缺乏FcγR結(jié)合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞NK細(xì)胞只表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，1991，Annu.Rev.Immunol.，9457-92第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。美國(guó)專利號(hào)5,500,362或5,821,337中描述了用于評(píng)估目的分子的ADCC活性的體外測(cè)定法的實(shí)例。這些測(cè)定法的有用效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。或者/另外，可以在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes等人，199g，PNAS(USA)，95652-656中所公開的。還可以進(jìn)行C1q結(jié)合測(cè)定法來確認(rèn)抗體不能結(jié)合C1q且因此缺乏CDC活性。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以如Gazzano-Santoro等人，1996，J.Immunol.Methods，202163中所述進(jìn)行CDC測(cè)定法。還可以使用本領(lǐng)域知道的方法進(jìn)行FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測(cè)定，如實(shí)施例部分中所描述的。
人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領(lǐng)域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可以具有一個(gè)或多個(gè)由非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為“輸入”殘基，它們通常來自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。基本上可以遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行人源化(Jones等人，1986，Nature，321522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332323-327；Verhoeyen等人，1988，Science，2391534-1536)，即用非人高變區(qū)序列替代人抗體的對(duì)應(yīng)序列。因此，這些“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，其中完整人可變結(jié)構(gòu)域的很少一部分用非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中有些高變區(qū)殘基和可能的有些FR殘基用來自嚙齒類抗體的類似位點(diǎn)的殘基替代。
用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的選擇對(duì)于降低抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列對(duì)已知人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(Sims等人，1993，J.Immunol.，1512296；Chothia等人，1987，J.Mol.Biol.，196901)。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285；Presta等人，1993，J.Immunol.，1512623)。
更重要的是，抗體在人源化后保留對(duì)抗原的高親合力和其它有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到此目的，根據(jù)一種方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化抗體。通常可獲得免疫球蛋白三維模型，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還可以獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過這種方法，可以由受體和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的牽涉對(duì)抗原結(jié)合的影響。
抗體變體一方面，本發(fā)明提供了在構(gòu)成Fc區(qū)的Fc多肽界面中包含修飾的抗體片段，其中該修飾推動(dòng)和/促進(jìn)異多聚化。這些修飾包括將突起導(dǎo)入第一Fc多肽和將腔導(dǎo)入第二Fc多肽，其中突起可位于腔中，從而促進(jìn)第一和第二Fc多肽的復(fù)合。本領(lǐng)域知道生成含有這些修飾的抗體的方法，如美國(guó)專利號(hào)5,731,168中所述。
在有些實(shí)施方案中，涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過將合適的核苷酸變化導(dǎo)入抗體核酸或通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。這些修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。進(jìn)行任何刪除、插入和替代組合以達(dá)到最終的構(gòu)建物，倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征?？梢栽谥苽湫蛄袝r(shí)將氨基酸改變導(dǎo)入抗體氨基酸序列。
可用于鑒定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的特定殘基或區(qū)域的方法有Cunningham和Wells，1989，Science，2441081-1085描述的所謂“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個(gè)殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，從而影響抗原內(nèi)氨基酸的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c(diǎn)導(dǎo)入更多或其它變體，推敲對(duì)替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，盡管用于導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，然而突變本身的本質(zhì)不必預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點(diǎn)處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對(duì)所表達(dá)的免疫球蛋白篩選預(yù)期的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合(長(zhǎng)度范圍由一個(gè)殘基至含有100個(gè)或更多殘基的多肽)，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實(shí)例包括具有N端甲硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括將抗體的N或C端與酶(如ADEPT)或延長(zhǎng)抗體血清半衰期的多肽融合。
另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用不同殘基替代。最有興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但是也涵蓋FR改變。表2中“優(yōu)選替代”欄顯示了保守替代。如果這些替代導(dǎo)致生物學(xué)活性變化，那么可以導(dǎo)入表2中稱為“例示替代”的較實(shí)質(zhì)性變化，或下文參照氨基酸分類進(jìn)一步所述，并篩選產(chǎn)物。
表2


對(duì)抗體的生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾可通過選擇在維持(a)替代區(qū)域多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如(折疊)片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積這幾方面的效果中有顯著差異的替代來完成。天然存在的殘基可根據(jù)共有的側(cè)鏈特性分組(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性的cys、ser、thr；(3)酸性的asp、glu；(4)堿性的asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈取向的殘基gly、pro；和(6)芳香族的trp、tyr、phe。
非保守替代將限定為用上述某一類的成員替代另一類。
一類替代變體牽涉替代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于其來源的親本抗體將具有改善的生物學(xué)特性。生成這些替代變體的方便方法牽涉使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)單的說，將高變區(qū)的數(shù)個(gè)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，從而在每一個(gè)位點(diǎn)生成所有可能的氨基酸替代。將由此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后對(duì)噬菌體展示變體篩選它們的生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)，正如本文所公開的。為了鑒定候選高變區(qū)修飾位點(diǎn)，可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變來鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定抗體與抗原之間的接觸點(diǎn)可能也是有利的。這些接觸殘基及鄰近殘基是根據(jù)本文詳述技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦生成這些變體，如本文所述對(duì)這組變體進(jìn)行篩選，可以選擇在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有上佳特性的抗體用于進(jìn)一步開發(fā)。
通過本領(lǐng)域知道的多種方法制備編碼抗體氨基酸序列變體的核酸。這些方法包括但不限于由天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或是由較早制備的抗體的變體或非變體形式通過寡核苷酸誘導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變、和盒式誘變制備。
可能希望在本發(fā)明免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，由此生成Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可以包括在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含氨基酸修飾(如替代)的人Fc區(qū)序列(如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區(qū))。
依照此描述和本領(lǐng)域的教導(dǎo)，預(yù)料在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所用的抗體與野生型對(duì)應(yīng)抗體相比可以在如Fc區(qū)中包含一處或多處改變。與它們的野生型對(duì)應(yīng)物相比，這些抗體仍將基本上(本質(zhì)上)保留治療功效所需要的相同特征。例如，認(rèn)為可以在Fc區(qū)中進(jìn)行導(dǎo)致Clq結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)改變(即或是增強(qiáng)或是削弱)的某些改變，例如WO99/51642中所述。還可參閱關(guān)注Fc區(qū)變體其它實(shí)施例的Duncan和Winter，1988，Nature，322738-40；美國(guó)專利號(hào)5,648,260；美國(guó)專利號(hào)5,624,821；及WO94/29351。
免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還關(guān)于包含與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)的抗體的免疫偶聯(lián)物或抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)，細(xì)胞毒劑諸如化療劑、藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶聯(lián)物)。
抗體-藥物偶聯(lián)物在癌癥治療中用于局部投遞毒害細(xì)胞或抑制細(xì)胞試劑(即用于殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物)的用途(Syrigos和Epenetos，1999，Anticancer Research，19605-614；Niculescu-Duvaz和Springer，1997，Adv.Drg.Del.Rev.，26151-172；美國(guó)專利號(hào)4,975,278)理論上容許藥物部分靶向投遞至腫瘤，并在那兒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)積累，而系統(tǒng)施用這些未綴合的藥物試劑在試圖消除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)可能導(dǎo)致不可接受的對(duì)正常細(xì)胞的毒性水平(Baldwin等人，1986年5月15日，Lancet，603-05；Thorpe，1985，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，在《MonoclonalAntibodies′84Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人編，第475-506頁)。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體二者都有報(bào)道可用于這些策略(Rowland等人，1986，Cancer Immunol.Immunother.，21183-87)。這些方法中所用的藥物包括道諾霉素、阿霉素、甲氨蝶呤和長(zhǎng)春地辛(Rowland等人，1986，見上文)?？贵w-毒素偶聯(lián)物中所用的毒素包括細(xì)菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒素、小分子毒素諸如格爾德霉素(geldanamycin)(Mandler等人，2000，Jour.of the Nat.CancerInst.，92(19)1573-1581；Mandler等人，2000，Bioorganic & Med.Chem.Letters，101025-1028；Mandler等人，2002，Bioconjugate Chem.，13786-791)、美登木素生物堿類(EP 1391213；Liu等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938618-8623)、和加利車霉素(Lode等人，1998，Cancer Res.，582928；Hinman等人，1993，Cancer Res.，533336-3342)。毒素可以通過包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制在內(nèi)的機(jī)制發(fā)揮其毒害細(xì)胞和抑制細(xì)胞的效果。有些細(xì)胞毒劑在與大的抗體或蛋白質(zhì)受體配體綴合時(shí)趨于失活或活性降低。
ZEVALIN(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由針對(duì)在正常和惡性B淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的鼠IgG1 κ單克隆抗體與由硫脲接頭-螯合劑結(jié)合的111In或90Y放射性同位素構(gòu)成的抗體-放射性同位素偶聯(lián)物(Wiseman等人，2000，Eur.Jour.Nucl.Med.，27(7)766-77；Wiseman等人，2002，Blood，99(12)4336-42；Witzig等人，2002，J.Clin.Oncol.，20(10)2453-63；Witzig等人，2002，J.Clin.Oncol.，20(15)3262-69)。盡管ZEVALIN具有針對(duì)B細(xì)胞非Hodgkin氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施藥在大多數(shù)患者中導(dǎo)致嚴(yán)重且長(zhǎng)時(shí)間的血球減少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗體與加利車霉素連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，在2000年批準(zhǔn)用于經(jīng)注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future，2000，25(7)686；美國(guó)專利號(hào)4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumabmertansine(Immunogen公司)，即由huC242抗體經(jīng)二硫化物接頭SPP與美登木素生物堿藥物部分DM1連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于治療表達(dá)CanAg的癌癥諸如結(jié)腸、胰腺、胃和其它癌的II期試驗(yàn)。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特異膜抗原(PSMA)單克隆抗體與美登木素生物堿藥物部分DM1連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于前列腺癌潛在治療的開發(fā)。將多拉司他汀(auristatin)的合成類似物多拉司他肽、多拉司他E(AE)和單甲基多拉司他(MMAE)與嵌合單克隆抗體cBR96(對(duì)癌上的Lewis Y特異)和cAC10(對(duì)惡性血液腫瘤上的CD30特異)綴合(Doronina等人，2003，NatureBiotechnology，21(7)778-784)，且正在進(jìn)行治療性開發(fā)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成這些免疫偶聯(lián)物的化療劑?？梢允褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈(abrin A chain)、蒴蓮根毒素A鏈(modeccin A chain)、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)蛋白質(zhì)、香石竹毒(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(zhì)(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(tricothecenes)。還可參閱如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多種放射性核素可用于生成放射性綴合抗體。實(shí)例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re?？贵w和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來制備，雙功能蛋白偶聯(lián)劑諸如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺酯)、活性酯類(諸如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，1987，Science，2381098中所述制備蓖麻毒素免疫毒素。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參閱WO94/11026。
本文還涵蓋抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)、美登木素生物堿類(maytansinoids)、單端孢霉素和CC1065及這些毒素具有毒素活性的片段的偶聯(lián)物。
美登素和美登木素生物堿類在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(全長(zhǎng)或片段)與一個(gè)或多個(gè)美登木素生物堿分子綴合。
美登木素生物堿是通過抑制微管蛋白多聚化來發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初由東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離得到(美國(guó)專利號(hào)3,896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登木醇和C-3美登木醇酯(美國(guó)專利號(hào)4,151,042)。例如下列專利公開了合成美登木醇及其衍生物和類似物美國(guó)專利號(hào)4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，其公開內(nèi)容收入本文作為參考。
美登木素生物堿-抗體偶聯(lián)物在改進(jìn)其治療指數(shù)的嘗試中，已經(jīng)將美登素和美登木素生物堿類與特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的抗體綴合。例如下列專利公開了含有美登木素生物堿類的免疫偶聯(lián)物及其用途美國(guó)專利號(hào)5,208,020、5,416,064及歐洲專利EP 0425 235 B1，將其內(nèi)容收入本文作為參考。Liu等人，2996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938618-8623描述了包含與針對(duì)人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DM1的美登木素生物堿的免疫偶聯(lián)物。發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物具有針對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞的高度細(xì)胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定法中顯示抗腫瘤活性。Chari等人，1992，Cancer Research，52127-131描述了美登木素生物堿經(jīng)二硫化物接頭與結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞系上抗原的鼠抗體A7或結(jié)合HER-2/neu癌基因的另一種鼠單克隆抗體TA.1綴合的免疫偶聯(lián)物。在體外在人乳癌細(xì)胞系SK-BR-3上測(cè)試了TA.1-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性，該細(xì)胞系每個(gè)細(xì)胞表達(dá)3×105個(gè)HER-2表面抗原。藥物偶聯(lián)物達(dá)到了與游離美登木素生物堿藥物相似的一定程度的細(xì)胞毒性，這可以通過增加每個(gè)抗體分子綴合的美登木素生物堿分子數(shù)目來提高。A7-美登木素生物堿偶聯(lián)物在小鼠中顯示低的系統(tǒng)性細(xì)胞毒性。
抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物(免疫偶聯(lián)物)抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物是通過將抗體與美登木素生物堿分子化學(xué)連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿分子的生物學(xué)活性而制備的。每個(gè)抗體分子綴合平均3-4個(gè)美登木素生物堿分子在增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性中顯示功效，且對(duì)抗體的功能或溶解度沒有負(fù)面影響，盡管預(yù)計(jì)甚至一個(gè)毒素分子/抗體也將相對(duì)于裸露抗體的使用增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登木素生物堿類在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可以通過已知技術(shù)合成或由天然來源分離。例如美國(guó)專利號(hào)5,208,020和上文提及的其它專利及非專利發(fā)表物中描述了合適的美登木素生物堿類。優(yōu)選的美登木素生物堿類是美登木醇和美登木醇分子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過修飾的美登木醇類似物，諸如各種美登木醇酯。
本領(lǐng)域知道許多連接基團(tuán)可用于制備抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，包括例如美國(guó)專利號(hào)5,208,020或歐洲專利0 425 235 B1及Chari等人，1992，Cancer Research，52127-131中所公開的。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)、或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，正如上文所述專利中所公開的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團(tuán)。
可以使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑諸如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺酯)、活性酯類(諸如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，1978，Biochem.J.，173723-737)和N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫鍵。
可以將接頭附著在美登木素生物堿分子上，根據(jù)連接的類型可以在多個(gè)位置處。例如，可以使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基的反應(yīng)來形成酯鍵。反應(yīng)可以發(fā)生在具有羥基的C-3位置、經(jīng)羥甲基修飾的C-14位置、經(jīng)羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登木醇或美登木醇類似物的C-3位置形成鍵。
加利車霉素另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包含與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子綴合的抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關(guān)于加利車霉素家族偶聯(lián)物的制備參閱美國(guó)專利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(都授予美國(guó)Cyanamid公司)?？梢允褂玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等人，1993，Cancer Research，533336-3342；Lode等人，1998，Cancer Research，582925-2928；及上述授予美國(guó)Cyanamid公司的美國(guó)專利)?？梢耘c抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA二者都具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，且不易穿過質(zhì)膜。因此，這些試劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細(xì)胞攝取大大增強(qiáng)了它們的毒害細(xì)胞效果。
其它細(xì)胞毒性劑可以與本發(fā)明抗體綴合的其它抗腫瘤試劑包括BCNU、鏈脲菌素(streptozoicin)、長(zhǎng)春新堿、5-氟尿嘧啶、美國(guó)專利5,053,394、5,770,710中描述的統(tǒng)稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物的試劑家族、及埃斯波霉素類(esperamicins)(美國(guó)專利5,877,296)。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲霉素、油桐蛋白質(zhì)、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白質(zhì)(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、白樹毒蛋白、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌素。參閱例如1993年10月28日公布的WO93/21232。
本發(fā)明還涵蓋抗體和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。
為了選擇性破壞腫瘤，抗體可以包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射性綴合抗體。實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在將偶聯(lián)物用于檢測(cè)時(shí)，可以包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋標(biāo)記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以以已知方式將放射性或其它標(biāo)記物摻入偶聯(lián)物。例如，可以生物合成肽，或是通過化學(xué)氨基酸合成法合成肽，其中使用牽涉例如氟-19取代氫的合適氨基酸前體?？梢越?jīng)肽中的半胱氨酸殘基來附著標(biāo)記物，諸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111?？梢越?jīng)賴氨酸殘基來附著釔-90。IODOGEN法(Fraker等人，1978，Biochem.Biophys.Res.Commun.，8049-57)可用于摻入碘-123?！禡onoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRCPress，1989)詳細(xì)描述了其它方法。
可以使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)還己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺酯)、活性酯類(諸如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，1987，Science，2381098中所述制備蓖麻毒素免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參閱WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放毒害細(xì)胞藥物的“可切割接頭”。例如，可以使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等人，1992，Cancer Research，52127-131；美國(guó)專利號(hào)5,208,020)。
本發(fā)明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯(lián)試劑制備的ADC商品化(如購自Pierce Biotechnology公司，Rockford，IL，美國(guó))的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。見2003-2004年度應(yīng)用手冊(cè)和產(chǎn)品目錄(ApplicationsHandbook and Catalog)第467-498頁。
抗體-藥物偶聯(lián)物的制備在本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)中，將抗體(Ab)經(jīng)接頭(L)與一個(gè)或多個(gè)藥物基元(moity)(D)綴合，如每個(gè)抗體約1個(gè)至約20個(gè)藥物基元?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑通過數(shù)種路徑制備通式I的ADC，包括(1)抗體的親核基團(tuán)經(jīng)共價(jià)鍵與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成Ab-L，隨后與藥物基元D反應(yīng)；和(2)藥物基元的親和基團(tuán)經(jīng)共價(jià)鍵與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成D-L，隨后與抗體的親和基團(tuán)反應(yīng)。
Ab-(L-D)pI抗體的親核基團(tuán)包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)側(cè)鏈氨基，如賴氨酸；(iii)側(cè)鏈巰基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。氨基、巰基、和羥基是親核的，能夠與接頭分子上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii)烷基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來酰亞胺基團(tuán)。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋?？梢酝ㄟ^還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應(yīng)活性。由此，每個(gè)半胱氨酸橋理論上將形成兩個(gè)反應(yīng)活性硫醇親核體?？梢越?jīng)由賴氨酸與2-亞氨基硫烷(Traut氏試劑)的反應(yīng)，導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼迹瑥亩鴮㈩~外親核基團(tuán)導(dǎo)入抗體。
還可以通過修飾抗體來生成本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物，即導(dǎo)入能夠與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應(yīng)的親電子部分?？梢杂美绺叩馑猁}氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可以與接頭試劑或藥物基元的胺基反應(yīng)的醛或酮基。由此生成的亞胺Schiff堿基可以形成穩(wěn)定的鍵，或者可以被例如硼氫化物試劑還原而形成穩(wěn)定的胺鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可以在蛋白質(zhì)中生成羰(醛和酮)基，它能夠與藥物上的合適基團(tuán)反應(yīng)(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)能夠與偏高碘酸鈉反應(yīng)，導(dǎo)致在第一個(gè)氨基酸處生成醛(Geoghegan和Stroh，1992，Bioconjugate Chem.，3138-146；US 5362852)。這些醛能夠與藥物基元或接頭親核體反應(yīng)。
同樣，藥物基元上的親核基團(tuán)包括但不限于胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基團(tuán)，它們能夠與接頭分子上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii)烷基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來酰亞胺基團(tuán)。
或者，可以通過例如重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。DNA的長(zhǎng)度可以包含編碼偶聯(lián)物兩個(gè)部分的各自區(qū)域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區(qū)域分開，該接頭肽不破壞偶聯(lián)物的期望特性。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以將抗體與“受體”(諸如鏈霉親和素)綴合從而用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對(duì)患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(如放射性核苷酸)綴合的“配體”(如生物素)。
抗體衍生物可以進(jìn)一步修飾本發(fā)明的抗體以包含本領(lǐng)域知道的且易于獲得的額外非蛋白質(zhì)性質(zhì)成分。具體而言，適于抗體衍生的成分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實(shí)例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)、右旋糖苷(重復(fù))、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在生產(chǎn)中可能具有優(yōu)勢(shì)。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數(shù)目可以變化，而且如果附著了超過一個(gè)聚合物，那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根據(jù)如下考慮來確定用于衍生的聚合物的數(shù)目和/或類型，包括但不限于待改進(jìn)抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用于指定條件下的治療等。
抗體特異性本發(fā)明適用于具有任何合適抗原結(jié)合特異性的抗體。優(yōu)選的是，本發(fā)明方法中所使用的抗體對(duì)這樣的抗原特異，即生物學(xué)重要的多肽。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體可用于哺乳動(dòng)物中疾病或紊亂的治療或診斷。本發(fā)明的抗體包括但不限于阻斷性抗體、激動(dòng)性抗體、中和性抗體、或抗體偶聯(lián)物。治療性抗體的非限制性實(shí)例包括抗c-met、抗VEGF、抗IgE、抗CD11、抗CD18、抗CD40、抗組織因子(TF)、抗HER2和抗TrkC抗體。還涵蓋針對(duì)非多肽抗原(諸如腫瘤相關(guān)糖脂抗原)的抗體。
當(dāng)抗原是多肽時(shí)，它可以是跨膜分子(如受體)或配體諸如生長(zhǎng)因子。例示性抗原包括諸如以下分子腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；卵泡刺激激素；降鈣素；黃體生成素；高血糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)、和von Willebrand因子；抗凝血因子，諸如蛋白C；心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(由正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的、在激活時(shí)受調(diào)節(jié)的因子，regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)(microbial protein)，諸如β-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，諸如骨衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF-β；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，諸如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD40；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如例如HIV包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原，諸如HER2、HER3或HER4受體；以及任何上文所列多肽的片段。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案所涵蓋的抗體的抗原包括CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、和CD46；ErbB受體家族成員，諸如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細(xì)胞粘附分子，諸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整聯(lián)蛋白、和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(如抗CD11a、抗CD18、或抗CD11b抗體)；生長(zhǎng)因子，諸如VEGF；組織因子(TF)；TGF-β；α-干擾素(α-IFN)；白介素，諸如IL-8；IgE；血型抗原Apo2，死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白C等。在有些實(shí)施方案中，此處的靶是VEGF、TF、CD19、CD20、CD40、TGF-β、CD11a、CD18、Apo2和C24。
在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與腫瘤抗原特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與腫瘤抗原特異結(jié)合，其中該腫瘤抗原不是簇分化因子(cluster differentiation factor)(即CD蛋白)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CD蛋白特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CD3或CD4以外的CD蛋白特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CD19或CD20以外的CD蛋白特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CD40以外的CD蛋白特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CD19或CD20特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CD40特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CD11特異結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合在免疫細(xì)胞中不表達(dá)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合在T細(xì)胞中不表達(dá)的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合在B細(xì)胞中不表達(dá)的抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與牽涉細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的分子特異結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與牽涉組織發(fā)育或細(xì)胞分化的分子特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與細(xì)胞表面分子特異結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合不是細(xì)胞表面受體多肽的腫瘤抗原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與淋巴因子特異結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與細(xì)胞因子特異結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與牽涉脈管發(fā)生(vasculogenesis)的分子特異結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與牽涉血管形成(angiogenesis)的分子特異結(jié)合。
可溶性抗原或其片段，任選與其它分子綴合的，可以作為免疫原用于生成抗體。對(duì)于跨膜分子，諸如受體，這些分子的片段(如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可以用作免疫原?；蛘撸磉_(dá)跨膜分子的細(xì)胞可以用作免疫原。這些細(xì)胞可以衍生自天然來源(如癌細(xì)胞系)，或者可以是經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞?？捎糜谥苽淇贵w的其它抗原及其形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
藥物制劑可以通過將具有期望純度的抗體與任選的生理學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備包含本發(fā)明抗體的治療用配劑，其形式是水溶液、凍干或其它干燥配劑(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第16版，Osol，A.編，1980)?？山邮茌d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)受者沒有毒性，而且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨；苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、巖藻糖、或山梨醇；成鹽反離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(如鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
此處的配劑還可以含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的那些。合適的是，這些分子以對(duì)于預(yù)定目的有效的量組合存在。
例如在膠態(tài)藥物投遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)中或在粗滴乳狀液中，活性成分還可以包裹在通過例如凝聚技術(shù)或界面聚合而制備的微膠囊中，分別是羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)公開于《Remington′s PharmaceuticalSciences》第16版，Osol，A.編，1980。
用于體內(nèi)施用的配劑必需是無菌的。這可以通過使用無菌濾膜過濾而容易實(shí)現(xiàn)。
可以制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適實(shí)例包括含有本發(fā)明免疫球蛋白的固體疏水聚合物半透基質(zhì)，該基質(zhì)采取定型產(chǎn)品的形式，如膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)、以及聚D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠持續(xù)釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠囊化抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露在37℃的潮濕環(huán)境中而變性或聚集，導(dǎo)致生物活性損失且免疫原性可能改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可以通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用合適添加劑和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。
用途本發(fā)明的免疫球蛋白可用于例如體外、離體和體內(nèi)治療方法。本發(fā)明提供了以使用與常規(guī)單價(jià)抗體相比具有上佳特性的單價(jià)抗體片段為基礎(chǔ)的多種方法。在某些病理學(xué)狀況中，必須和/或希望利用單價(jià)抗體。同樣，在有些情況中，治療性抗體可以實(shí)現(xiàn)其治療作用但不牽涉免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的活性，諸如效應(yīng)物功能ADCC、吞噬和CDC。在這些情況中，希望生成這些活性實(shí)質(zhì)性降低或消除的抗體形式。如果抗體是能夠高效制備且具有高產(chǎn)量的形式，那么這也是有利的。本發(fā)明提供了這些抗體，它們可用于多種目的，例如治療劑、預(yù)防劑和診斷劑。例如，本發(fā)明提供了治療疾病的方法，所述方法包括對(duì)需要治療的受試者施用高度穩(wěn)定的包含單個(gè)抗原結(jié)合臂的抗體片段，由此治療疾病。本文描述的任何本發(fā)明抗體片段可用于本文描述的治療(或預(yù)防或診斷)方法。
本發(fā)明的抗體可用作拮抗劑，從而在體外、離體和/或體內(nèi)部分或完全阻斷特異抗原活性。此外，至少有些本發(fā)明抗體能夠中和來自其它物種的抗原活性。因此，本發(fā)明的抗體可用于抑制特異抗原活性，例如在含有抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物中、在人受試者中或在具有本發(fā)明抗體與之交叉反應(yīng)的抗原的哺乳動(dòng)物受試者(如黑猩猩、狒狒、狨猴、獼猴和恒河猴、豬或小鼠)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于抑制抗原活性，即通過使抗體接觸抗原從而抑制抗原活性。優(yōu)選的是，抗原是人蛋白質(zhì)分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于在患有某種紊亂的受試者中抑制抗原的方法，在所述紊亂中抗原活性是有害的，包括對(duì)受試者施用本發(fā)明的抗體，從而抑制受試者中的抗原活性。優(yōu)選的是，抗原是人蛋白質(zhì)分子且受試者是人受試者?；蛘撸茉囌呖梢允潜磉_(dá)本發(fā)明抗體所結(jié)合的抗原的哺乳動(dòng)物。又或者，受試者可以是其中導(dǎo)入了抗原(如通過施用抗原或通過表達(dá)抗原轉(zhuǎn)基因)的哺乳動(dòng)物?？梢猿鲇谥委熌康膶⒈景l(fā)明的抗體施用于人受試者。此外，可以出于獸醫(yī)目的將本發(fā)明的抗體施用于表達(dá)免疫球蛋白與之交叉反應(yīng)的抗原的非人哺乳動(dòng)物(如靈長(zhǎng)類、豬或小鼠)，或是人疾病的動(dòng)物模型。關(guān)于后者，這些動(dòng)物模型可用于評(píng)估本發(fā)明抗體的治療功效(如測(cè)試施藥的劑量和療程)。在治療上有用的本發(fā)明阻斷性抗體包括但不限于例如抗c-met、抗VEGF、抗IgE、抗CD11、抗干擾素和抗組織因子抗體。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制、延遲其發(fā)展、預(yù)防/延遲其復(fù)發(fā)、改善、或預(yù)防與一種或多種抗原分子的異常表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病、紊亂或狀況，包括但不限于惡性和良性腫瘤；非白血病淋巴惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和囊胚的疾?。患把仔?、血管發(fā)生性和免疫紊亂。
一方面，本發(fā)明的阻斷性抗體對(duì)配體抗原特異，而且通過阻斷或干擾牽涉配體抗原的配體-受體相互作用來抑制抗原活性，由此抑制相應(yīng)的信號(hào)途經(jīng)和其它分子或細(xì)胞事件。本發(fā)明的特色還有受體特異抗體，它們不必阻止配體結(jié)合但干擾受體活化，由此抑制通常由配體結(jié)合啟動(dòng)的任何應(yīng)答。本發(fā)明還涵蓋優(yōu)選或?qū)ｉT結(jié)合配體-受體復(fù)合物的抗體。本發(fā)明的抗體還可擔(dān)當(dāng)特定抗原受體的激動(dòng)劑，由此加強(qiáng)、增強(qiáng)或激活配體介導(dǎo)的受體活化的全部或部分活性。
在某些實(shí)施方案中，將包含與細(xì)胞毒劑綴合的抗體的免疫偶聯(lián)物施用于患者。在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物和/或它所結(jié)合的抗原由細(xì)胞內(nèi)化，導(dǎo)致免疫偶聯(lián)物殺傷它所結(jié)合的靶細(xì)胞的治療功效提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒劑靶向或干擾靶細(xì)胞中的核酸。這些細(xì)胞毒劑的實(shí)例包括本文所述任何化療劑(諸如美登木素生物堿或加利車霉素)、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶。
在治療中，本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)使用，或是聯(lián)合其它組合物使用。例如，本發(fā)明的抗體可以與另一種抗體、化療劑(包括化療劑的雞尾酒樣混合物)、其它細(xì)胞毒劑、抗血管發(fā)生劑、細(xì)胞因子、和/或生長(zhǎng)抑制劑聯(lián)合施用。當(dāng)本發(fā)明的抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)時(shí)，可能特別希望將其聯(lián)合一種或多種同樣抑制腫瘤生長(zhǎng)的其它治療劑。例如，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療中可以將阻斷VEGF活性的抗VEGF抗體聯(lián)合抗ErbB抗體(HERCEPTIN抗HER2抗體)。或者/另外，患者可以接受聯(lián)合放射療法(如外部射束照射或使用放射性標(biāo)記試劑諸如抗體的療法)。上文所述這些聯(lián)合療法包括聯(lián)合施藥(當(dāng)相同或不同劑型中包含兩種或多種試劑時(shí))和分開施藥，在后一種情況中，本發(fā)明抗體的施用可以發(fā)生在附屬療法的施用之前和/或之后。
可以通過任何合適手段來施用本發(fā)明的抗體(和附屬治療劑)，包括腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，以及損傷內(nèi)(如果希望局部治療的話)。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施藥。另外，脈沖輸注抗體也是合適的，特別是抗體劑量衰減時(shí)?？梢酝ㄟ^任何合適路徑服藥，例如通過注射，諸如靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于施藥是短期的還是長(zhǎng)期的。
可以以與優(yōu)良醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式配制、服用和施用本發(fā)明的抗體組合物。在此內(nèi)容中考慮的因素包括所治療的具體病癥、所治療的具體哺乳動(dòng)物、患者個(gè)體的臨床狀況、病癥的起因、投遞試劑的部位、施藥的方法、施藥的日程安排、和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。不是必需而是任選將抗體與目前用于預(yù)防或治療所討論病癥的一種或多種試劑一起配制。這些其它試劑的有效量取決于配制劑中存在的本發(fā)明抗體的數(shù)量、病癥或治療的類型、和上文討論的其它因素。這些通常是以與上文所述相同劑量和施用路徑使用，或是所述采用劑量的大約1至99％。
對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，本發(fā)明抗體的合適劑量(在單獨(dú)使用或聯(lián)合其它試劑諸如化療劑時(shí))將取決于所治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴(yán)重程度和發(fā)展階段、施用抗體是出于預(yù)防或治療目的、先前的療法、患者的臨床病史和對(duì)抗體的應(yīng)答、及主治醫(yī)師的判斷。合適的是，一次性或通過一系列治療將抗體施用于患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，施用于患者的初始候選劑量是約1μg/kg至15mg/kg(如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體，例如或是通過一次或多次分開施藥或是通過連續(xù)輸注。根據(jù)上文所述因素，典型日劑量的范圍可以是約1μg/kg至100mg/kg或更多。對(duì)于持續(xù)數(shù)天或更長(zhǎng)的重復(fù)施藥，根據(jù)狀況，持續(xù)治療直至疾病癥狀發(fā)生期望的抑制?？贵w的例示劑量的范圍可以是約0.05mg/kg至約10mg/kg。由此，可以對(duì)患者施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一個(gè)或多個(gè)劑量。這些劑量可以間歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受由約2個(gè)至約20個(gè)例如約6個(gè)劑量的抗體)。可以施用初始較高加載劑量，后續(xù)一個(gè)或多個(gè)較低劑量。例示性服藥方案包括施用約4mg/kg抗體的初始加載劑量，后續(xù)每周約2mg/kg的維持劑量。但是，其它劑量方案也可能是有用的。這種療法的進(jìn)程易于通過常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法來監(jiān)測(cè)。
產(chǎn)品在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有可用于上文所述病癥的治療、預(yù)防和/或診斷的物質(zhì)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包含容器和與容器有關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料構(gòu)成，諸如玻璃或塑料。容器中裝有其自身或在聯(lián)合另外的組合物時(shí)有效治療、預(yù)防和/或診斷病癥的組合物，而且可以具有無菌進(jìn)入端口(例如容器可以是具有能夠被皮下注射針頭刺穿的阻塞物的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性試劑是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝插頁指示組合物用于治療選擇的病癥，諸如癌癥。此外，該產(chǎn)品可以包含(a)其中裝有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的抗體；和其中裝有組合物的第二容器，其中所述組合物包含其它細(xì)胞毒制劑。本發(fā)明這個(gè)實(shí)施方案中的產(chǎn)品還可以包含指示第一和第二抗體組合物可用于治療特定病癥如癌癥的包裝插頁。或者/另外，該產(chǎn)品還可以包含裝有制藥學(xué)可接受緩沖液的第二(或第三)容器，諸如無菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer氏液和右旋糖溶液。它還可以包含商業(yè)和用戶立場(chǎng)希望的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
下面是本發(fā)明方法和組合物的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上文提供的一般描述，可以實(shí)行多種其它實(shí)施方案。
實(shí)施例實(shí)施例1本發(fā)明抗體的生成和鑒定(下文也稱為“單臂抗體”或“Fab/c抗體”)表達(dá)載體的構(gòu)建用于表達(dá)全長(zhǎng)或Fab/c抗-c-met抗體的所有質(zhì)粒都是基于分開的順反子系統(tǒng)(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)，它們依賴分開的phoA啟動(dòng)子(AP)(Kikuchi等人，1981，Nucleic Acids Res.，95671-5678)來轉(zhuǎn)錄重鏈和輕鏈和Fc片段，后繼trp Shine-Dalgarno序列來啟動(dòng)翻譯(Yanofsky等人，1981，Nucleic Acids Res.，96647-6668；及Chang等人，1987，Gene，55189-196)。另外，將熱穩(wěn)定腸毒素II信號(hào)序列(STII)(Picken等人，1983，Infect.Immun.，42269-275；及Lee等人，1983，Infect.Immun.，42264-268)用于重鏈和輕鏈和Fc片段的周質(zhì)分泌。對(duì)兩條鏈和Fc片段的精細(xì)翻譯控制是用先前所述具有實(shí)測(cè)的相對(duì)翻譯力度的STII信號(hào)序列變體而達(dá)到的，它們?cè)诜g起始區(qū)(TIR)中含有沉默密碼子改變(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634；及Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)。最后，將λt0轉(zhuǎn)錄終止子(Schlosstissek和Grosse，1987，Nucleic Acids Res.，153185)置于兩條鏈和Fc片段編碼序列的下游。所有質(zhì)粒都采用基于pBR322的載體系統(tǒng)的讀碼框(Sutcliffe，1978，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90)。抗c-met抗體源是美國(guó)專利號(hào)5,686,292、5,646,036、6,207,152、6,214,344和6,468,529中描述的5D5抗體。SDS源抗體的雜交瘤細(xì)胞系先前保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，12301 ParklawnDrive，Rockville，Md.，USA)，ATCC編號(hào)HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)(保藏日期1995年5月23日)。
質(zhì)粒pxcM11C生成編碼嵌合5D5抗c-met抗體的期望質(zhì)粒pxcM11C需要兩種中間質(zhì)粒。首先，為了表達(dá)每條鏈，將5D5重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域分開轉(zhuǎn)移到基于pBR322的質(zhì)粒上。下文描述了這些中間質(zhì)粒pxcMLC和pxcMHC的制備，接著是pxcM11C的構(gòu)建。
pxcMLC為了將5D5抗體的鼠源輕鏈可變結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到與生成全長(zhǎng)抗體相容的人源輕鏈框架中而構(gòu)建該質(zhì)粒。該質(zhì)粒的構(gòu)建牽涉三種DNA片段的連接。第一個(gè)是消除了MluI-BamHI小片段的pPho51載體(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634，變體1)。連接的第二個(gè)部分是來自pST7LC的約516個(gè)堿基對(duì)的AlwNI-BamHI片段，編碼輕鏈最后15個(gè)氨基酸、λt0終止子和tet基因開端。質(zhì)粒pST7LC是變體6(見上文參考文獻(xiàn))的衍生物，在STII信號(hào)序列下游具有人κ輕鏈。連接的第三個(gè)部分是使用如下引物由含有5D5 Fab序列(下文實(shí)施例2中“5D5 Fab的克隆和重組表達(dá)”中所述)的質(zhì)粒生成的約623個(gè)堿基對(duì)的MluI-AlwNIPCR片段5’-TAAATTTAACGCGTACGCTGACATTATGATGTCCCAGTCTCCATCC(SEQ ID NO9)5’-GGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGC(SEQ ID NO10)pxcMHC為了將5D5抗體的鼠源重鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)肱c生成全長(zhǎng)抗體相容的人源重鏈框架而構(gòu)建該質(zhì)粒。PxcMHC的構(gòu)建牽涉兩種DNA片段的連接。第一個(gè)是消除了MluI-BstEII小片段的pST2HC載體。質(zhì)粒pST2HC是變體3(見上文參考文獻(xiàn))的衍生物，其中人源IgG1重鏈融合在STII信號(hào)序列的下游。連接的第二個(gè)部分是使用如下引物由含有5D5Fab序列(下文實(shí)施例2中“5D5 Fab的克隆和重組表達(dá)”中所述)的質(zhì)粒生成的約346個(gè)堿基對(duì)的MluI-BstEII PCR片段5’-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG(SEQ ID NO11)5’-AAGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACC(SEQ ID NO12)pxcM11C為了表達(dá)全長(zhǎng)5D5嵌合抗體而構(gòu)建質(zhì)粒pxcM11C。該質(zhì)粒的構(gòu)建牽涉四種DNA片段的連接。第一個(gè)是消除了MluI-BstEII小片段的paTF20載體(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147，paTF20是具有1-輕鏈和1-重鏈TIR的多順反子載體)。連接的第二個(gè)部分是來自pxcMLC的約623個(gè)堿基對(duì)的MluI-AlwNI片段。第三個(gè)部分是來自paTF50(見上文參考文獻(xiàn)；paTF50是具有1-輕鏈和1-重鏈TIR的分開順反子載體)的約547個(gè)堿基對(duì)的AlwNI-BsiWI片段。連接的最后一個(gè)部分是來自pxcMHC的約349個(gè)堿基對(duì)的BsiWI-BstEII片段。
質(zhì)粒pxcM11C-Fc為了構(gòu)建pxcM11C-Fc，將編碼Fc片段表達(dá)的盒以及所有上文所述控制元件(包括AP啟動(dòng)子、STII信號(hào)序列和λt0轉(zhuǎn)錄終止子)加入質(zhì)粒pxcM11C。首先需要描述通向pxcM11c-Fc構(gòu)建的兩種質(zhì)粒，pBR322.VNERK.HC和pBR322.Fc。
pBR322.VNERK.HC質(zhì)粒pBR322.VNERK.HC是變體1(Simmons和Yansura，1996，NatureBiotechnol.，14629-634)的衍生物，在STII信號(hào)序列下游具有人源重鏈。該質(zhì)粒是通過將兩種DNA片段連接起來而構(gòu)建的。第一個(gè)是清除了EcoRI-ClaI小片段的載體pBR322。連接的第二個(gè)部分是使用如下引物由pVG11.VNERK生成的約1885個(gè)堿基對(duì)的EcoRI-ClaI PCR片段，編碼AP啟動(dòng)子、STII信號(hào)序列、重鏈、λt0終止子和tet基因的開端5’-TTTCCCTTTGAATTCTTGGTTGTTAACGTTGCCGACGCGCATC(SEQ ID NO13)5’-TTTCCCTTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGTAAACAATAAAAAACGCCC(SEQ ID NO14)質(zhì)粒pVG11.VNERK是具有1-輕鏈和1-重鏈TIR的分開順反子載體的衍生物(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods 263133-147)，其中輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域變成抗VEGF抗體(VNERK)。
pBR322.Fc質(zhì)粒pBR322.Fc是質(zhì)粒pBR322.VNERK.HC的衍生物，它編碼Fc片段的表達(dá)以及上文所述所有控制元件。
質(zhì)粒pBR322.Fc是通過將兩種DNA片段連接起來而構(gòu)建的。第一個(gè)是清除了MluI-NsiI小片段的載體pBR322.VNERK.HC。連接的第二個(gè)部分是來自pJAL226的約1319個(gè)堿基對(duì)的MluI-NsiI片段，編碼氨基酸SGTT，繼以人IgG1的氨基酸221至429。pJAL226是變體3(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14629-634)的衍生物，在STII信號(hào)序列下游具有人Fc片段。
pxcM11C-FcpxcM11C-Fc是通過將兩種DNA片段連接起來而構(gòu)建的。第一個(gè)是清除了HpaI-ClaI小片段的載體pxcM11C。連接的第二個(gè)部分是來自pBR322.Fc的約1198個(gè)堿基對(duì)的HpaI-ClaI片段。該連接導(dǎo)致命名為pxcM11C-Fc的期望質(zhì)粒。
質(zhì)粒pxcM11C.H-Fc.K質(zhì)粒pxcM11C.H-Fc.K是pxcM11C-Fc的衍生物，其中pxcM11C重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域用具有“穴(hole)”(本文也稱為“腔”)突變(T366S、L368A、Y407V)的CH3結(jié)構(gòu)域置換(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16677-681)。另外，F(xiàn)c片段的CH3結(jié)構(gòu)域用具有“隆起(knob)”(本文也稱為“突起”)突變(T366W)的CH3結(jié)構(gòu)域置換(見上文參考文獻(xiàn))。
pxcM11C.H該質(zhì)粒以兩個(gè)步驟構(gòu)建。第一步，通過將兩種DNA片段連接起來而導(dǎo)入“穴”突變。第一個(gè)是清除了SacII-NsiI小片段的載體pxcM11C。連接的第二個(gè)部分是來自pBR322.VNERK.HC.H的約411個(gè)堿基對(duì)的SacII-NsiI片段。pBR322.VNERK.HC.H是質(zhì)粒pBR322.VNERK.HC(見上文)的衍生物其中導(dǎo)入了“穴”突變(T366S、L368A、Y407V)(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16677-681)。將該中間質(zhì)粒命名為pxcM11C.H。
pxcM11C.H-Fc.K第二步，將“隆起”突變導(dǎo)入Fc片段，且牽涉兩種DNA片段的連接。第一個(gè)是清除了ClaI-HpaI小片段的載體pxcM11C.H。連接的第二個(gè)部分是來自pBR322.Fc.K的約1198個(gè)堿基對(duì)的ClaI-HpaI片段，編碼具有“隆起”突變的Fc片段的表達(dá)盒。pBR322.Fc.K是質(zhì)粒pBR322.Fc(見上文)的衍生物，它編碼具有“隆起”突變(T366W)的Fc片段的表達(dá)(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16677-681)以及上文所述所有控制元件。該連接導(dǎo)致命名為pxcM11C.H-Fc.K的期望質(zhì)粒。
抗c-Met單臂Fab/c抗體的表達(dá)和鑒定使用親本構(gòu)建物(5D5抗c-Met的pxcM11C)和單臂Fab/c抗體構(gòu)建物(pxcM11C-Fc)進(jìn)行抗體的小規(guī)模誘導(dǎo)。對(duì)于每種構(gòu)建物的小規(guī)模表達(dá)，使用大腸桿菌菌株33D3(W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR)作為宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，用所選轉(zhuǎn)化子挑取物接種5ml補(bǔ)充羧芐青霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani培養(yǎng)基，并于30℃在培養(yǎng)輪上培養(yǎng)過夜。然后在C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263133-147)中稀釋(1∶100)每份培養(yǎng)物。然后以50μg/ml濃度向誘導(dǎo)培養(yǎng)物中添加羧芐青霉素，并將培養(yǎng)物于30℃在培養(yǎng)輪上培養(yǎng)約24小時(shí)。除非另有注釋，所有搖瓶誘導(dǎo)以5ml體積進(jìn)行。
如下所述由誘導(dǎo)培養(yǎng)物制備非還原的全細(xì)胞裂解物(1)將1ml OD600誘導(dǎo)樣品在微量離心管中離心；(2)將每份沉淀重懸于90μl TE(10mM TrispH 7.6，1mM EDTA)；(3)向每份樣品中添加10μl 100mM碘乙酸(SigmaI-2512)以封閉任何游離半胱氨酸和預(yù)防二硫鍵改組；(4)向每份樣品中添加20μl 10％ SDS。將樣品旋渦震蕩，加熱至約90℃達(dá)3分鐘，然后再次旋渦震蕩。在樣品冷卻至室溫后，加入750μl丙酮來沉淀蛋白質(zhì)。將樣品旋渦震蕩，并于室溫放置約15分鐘。在微量離心機(jī)中離心5分鐘后，吸走每份樣品的上清液，并將每份蛋白質(zhì)沉淀重懸于50μl dH2O+50μl 2X NOVEXSDS樣品緩沖液。然后將樣品加熱至約90℃達(dá)4分鐘，充分旋渦震蕩，并使之冷卻至室溫。然后進(jìn)行最后的5分鐘離心，并將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中。
如下所述由誘導(dǎo)培養(yǎng)物制備還原的全細(xì)胞裂解物(1)將1ml OD600誘導(dǎo)樣品在微量離心管中離心；(2)將每份沉淀重懸于90μl TE(10mM Tris pH7.6，1mM EDTA)；(3)向每份樣品中添加10μl 1M二硫蘇糖醇(SigmaD-5545)以還原二硫鍵；(4)向每份樣品中添加20μl 10％ SDS。將樣品旋渦震蕩，加熱至約90℃達(dá)3分鐘，然后再次旋渦震蕩。在樣品冷卻至室溫后，加入750μl丙酮來沉淀蛋白質(zhì)。將樣品旋渦震蕩，并于室溫放置約15分鐘。在微量離心機(jī)中離心5分鐘后，吸走每份樣品的上清液，并將每份蛋白質(zhì)沉淀重懸于10μl 1M二硫蘇糖醇+40μl dH2O+50μl 2X NOVEX SDS樣品緩沖液。然后將樣品加熱至約90℃達(dá)4分鐘，充分旋渦震蕩，并使之冷卻至室溫。然后進(jìn)行最后的5分鐘離心，并將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中。
制備后，將5-8μl每份樣品加載到NOVEX制造的10孔1.0mm 12％ Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，并以～120伏特電泳1.5-2小時(shí)。然后將由此得到的凝膠用考馬斯藍(lán)染色或用于Western印跡分析。
對(duì)于Western印跡分析，在10mM CAPS緩沖液pH 11+3％甲醇中將SDS-PAGE凝膠電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NOVEX)上。然后將膜用溶液1XNET(150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris pH 7.4，0.05％ Triton X-100)+0.5％明膠封閉約30分鐘至1小時(shí)，于室溫?fù)u動(dòng)。封閉步驟后，為了抗FabWestern印跡分析，將膜置于溶液1X NET+0.5％明膠+抗Fab抗體(過氧化物酶綴合的針對(duì)人IgG Fab的山羊IgG餾分；CAPPEL #55223)中。根據(jù)抗體的批次，抗Fab抗體的稀釋范圍由1∶50,000至1∶1,000,000?；蛘?，為了抗FcWestern印跡分析，將膜置于溶液1X NET+0.5％明膠+抗Fc抗體(過氧化物酶綴合的針對(duì)人Fc片段的山羊IgG餾分；BETHYL#A80-104P-41)中。根據(jù)抗體的批次，抗Fc抗體的稀釋范圍由1∶50,000至1∶250,000。在每種情況中，將膜置于抗體溶液中過夜，于室溫?fù)u動(dòng)。第二天上午，將膜用1X NET+0.5％明膠清洗3×10分鐘，接著用TBS(20mM TrispH 7.5，500mM NaCl)清洗1×15分鐘。使用Amersham Pharmacia Biotech ECL檢測(cè)并將膜暴露于X射線膠片來顯現(xiàn)抗Fab抗體和抗Fc抗體所結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶。
圖1顯示了抗c-Met Fab/c抗體表達(dá)的抗Fab Western印跡結(jié)果。它們揭示了完全折疊和裝配的全長(zhǎng)抗體(泳道1)和單臂Fab/c抗體(泳道2)的表達(dá)。注意，抗Fab抗體不能結(jié)合Fc片段，因此沒有檢出。對(duì)于非還原樣品，F(xiàn)c片段與全長(zhǎng)抗c-Met抗體的共表達(dá)導(dǎo)致完全折疊和裝配的全長(zhǎng)抗體實(shí)質(zhì)性轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆郫B和裝配的單臂Fab/c抗體。對(duì)于還原樣品，對(duì)全長(zhǎng)抗c-Met抗體和單臂抗c-Met Fab/c抗體檢出的重鏈和輕鏈數(shù)量是相似的。單臂抗c-Met Fab/c構(gòu)建物的輕鏈前體的數(shù)量略有增加，可能是由于分泌途經(jīng)的輕微倒退(back up)。
類似的，圖2顯示了抗Fc Western印跡結(jié)果，它們也揭示了完全折疊和裝配的單臂Fab/c抗體的表達(dá)(泳道2)?？笷c抗體不能結(jié)合輕鏈，因此沒有檢出。對(duì)于非還原樣品，F(xiàn)c區(qū)與全長(zhǎng)抗c-Met抗體的共表達(dá)顯示完全折疊和裝配的全長(zhǎng)抗體轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆郫B和裝配的單臂Fab/c抗體。另外，在抗FcWestern印跡上還檢出Fc多肽的單體和二聚體。對(duì)于還原樣品，對(duì)全長(zhǎng)抗c-Met抗體和單臂抗c-Met Fab/c抗體表達(dá)檢出的重鏈數(shù)量是相似的。單臂Fab/c抗體構(gòu)建物也有少量的Fc片段前體，可能是由于分泌途經(jīng)的一些倒退。
根據(jù)上述資料顯而易見的是，有可能生成其中主要抗體種類是期望的單臂Fab/c抗體的免疫球蛋白群體。然而，通過抗Fab和抗Fc兩種Western印跡分析仍能檢出完整形式的抗體(即完全折疊和裝配的抗c-Met全長(zhǎng)抗體)。由于完整形式的抗c-met 5D5抗體是c-met受體的激動(dòng)劑，它在需要拮抗作用的治療方案中是不合需要的，因此通常希望將生成的完整形式抗體的數(shù)量降至最低。
包含突起和腔(下文也稱為“隆起嵌入穴”)的單臂Fab/c抗c-Me抗體的表達(dá)和鑒定為了進(jìn)一步將抗c-Met Fab/c抗體制備中全長(zhǎng)抗c-Met抗體的形成降至最低，基本上如Merchant等人(1998，Nature Biotechnology，16677-681)所述，在Fc的CH3結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行“隆起嵌入穴”突變。制備單臂Fab/c抗c-Met抗體的構(gòu)建物(pxcM11C.H-Fc.K)，即將“穴”突變(T366S、L368A、Y407V)導(dǎo)入全長(zhǎng)重鏈，并將“隆起”突變(T366W)導(dǎo)入Fc片段。
然后如上所述以相同方式表達(dá)全長(zhǎng)抗c-Met抗體(pxcM11C)、單臂Fab/c抗c-Met抗體(pxcM11C-Fc)、和單臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗體(pxcM11C.H.Fc.K)構(gòu)建物。制備全細(xì)胞裂解物，通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，并用先前所述山羊抗人Fab綴合抗體和山羊抗人Fc綴合抗體檢測(cè)。
圖3顯示了抗Fab Western印跡結(jié)果，它們顯示了單臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗體的折疊和裝配有顯著改善。另外，抗Fab Western印跡結(jié)果顯示了全長(zhǎng)抗c-Met抗體降至不能檢出的水平。再次，重要的是要注意，抗Fab抗體不能結(jié)合Fc片段。對(duì)于非還原樣品，單臂“隆起嵌入穴”抗c-Met抗體的表達(dá)導(dǎo)致完全折疊和裝配的全長(zhǎng)抗體實(shí)質(zhì)性轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆郫B和裝配的單臂Fab/c抗體。由野生型Fc移至“隆起嵌入穴”Fc，單臂Fab/c抗體的折疊和裝配也有顯著改善。對(duì)于還原樣品，對(duì)全長(zhǎng)、單臂Fab/c、和單臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗體檢出的重鏈的數(shù)量是相似的。單臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met構(gòu)建物似乎也是加工后的輕鏈數(shù)量增加和輕鏈前體數(shù)量減少。
類似的，圖4中的抗Fc Western印跡結(jié)果顯示了單臂Fab/c“隆起嵌入穴”比野生型單臂Fab/c抗c-Met抗體的折疊和裝配有顯著改善。再次，抗Fc Western印跡結(jié)果顯示了全長(zhǎng)抗c-Met抗體降至不能檢出的水平。抗Fc抗體不能結(jié)合輕鏈，因此沒有檢出。對(duì)于還原樣品，對(duì)全長(zhǎng)、野生型單臂Fab/c、和單臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗體檢出的重鏈數(shù)量是相似的。
實(shí)施例2本發(fā)明抗體的藥物動(dòng)力學(xué)特征和治療功效材料和方法材料HGF和c-Met-IgG在Genentech生產(chǎn)，正如先前所述。Maxisorb微量滴定板購自NUNC(Rosklide，丹麥)。抗hFc購自Jackson Immunochemical(WestGrove，PA)。HRP-鏈霉親和素購自Zymed(South San Francisco，CA)。3H-胸苷購自Amersham Inc.(Arlington Heights，IL)。MDA-MB-435細(xì)胞由ATCC(Rockville，MD)獲得。焦谷氨酸氨肽酶購自Takara Biochemicals(Berkeley，CA)。NHS-X-生物素購自Research Organics(Cleveland，OH)。Immobilon-PSQPVDF購自Millipore(Marlborough，MA)。Superscript II RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶購自Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)。Taq聚合物購自Perkin Elmer-Cetus(Foster City，CA)，Bakerbond ABX(40μ粒度)來自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)，而SP-Sepharose高效樹脂來自Pharmacia Biotech Inc.(Piscataway，NJ)。生物素-抗P-tyr來自Upstate Biotech(Lake Placid，NY)，TMB過氧化物酶底物購自KPL(Gaithersburg，MD)。
抗體和Fab片段的生成抗c-Met單克隆抗體的生成抗c-met單克隆抗體，包括5D5抗體的生成，已有描述。參閱如美國(guó)專利5,686,292；5,646,036；6,207,152；6,214,344；和6,468,529。第0、7、14、21、28、266、273、和279天將BALB/c小鼠每只后足墊免疫2.5μg懸浮在MPL/TDM佐劑中的可溶性c-Met-IgG(Mark等人，1982，J.Biol.Chem.，26726166-26171)。最后一次免疫后4天，收獲淋巴結(jié)細(xì)胞，并如(Laskov等人，1980，Cell.Immunol.，55251)所述使用35％聚乙二醇與P3/X63-Ag8U1骨髓瘤細(xì)胞融合(Yelton等人，1978，Curr.Top.Microbio.Immunol.，811)。首先通過捕捉ELISA選擇分泌對(duì)c-Met特異的抗體的雜交瘤細(xì)胞系，然后使用表達(dá)c-Met的BAF3轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行后續(xù)篩選。如下文所述，對(duì)選擇的雜交瘤進(jìn)一步測(cè)試它們抑制生物素-HGF結(jié)合c-Met-IgG的能力。通過有限稀釋將雜交瘤克隆兩次，然后進(jìn)一步鑒定它們的拮抗和激動(dòng)能力。在balb/c小鼠中生成腹水，并使用蛋白G親和柱純化單克隆抗體。采用消光系數(shù)1.4，通過280nm吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
天然Fab的生成和純化將抗體5D5在20mM磷酸鹽，10mM EDTA緩沖液中透析過夜，然后在Centricon 30中濃縮至7mg/ml。將0.5ml固定化木瓜蛋白酶(Pierce，Rockford，Il)用消化緩沖液清洗，然后加入10mg 5D5并于37℃溫育過夜，以200rpm搖動(dòng)。向混合液中加入1.5ml結(jié)合緩沖液，然后將上清液與珠子分開并流過事先用結(jié)合緩沖液平衡的蛋白A柱。使額外的結(jié)合緩沖液流過柱子，并以1ml餾分收集洗脫液。讀取每個(gè)餾分的280nm吸光度，合并含有Fab片段的洗脫液。將蛋白質(zhì)在PBS中透析過夜，并通過280nm吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，采用消光系數(shù)1.53。通過凝膠過濾進(jìn)一步純化Fab片段以清除殘余的F(ab’)2。
5D5 Fab的N端測(cè)序?qū)⒁恍》?D5 Fab在4-20％梯度SDS凝膠上解析，并在BioRadTrans-Blot轉(zhuǎn)移槽(Matsudaira，1987，J.Biol.Chem.，26210035-10038)中以250mA恒流1小時(shí)電轉(zhuǎn)印到PVDF(Immobilon-PSQ)膜上。將膜用溶于50％甲醇的0.1％考馬斯藍(lán)R-250染色0.5分鐘，并用溶于50％甲醇的10％乙酸脫色2-3分鐘。將膜用水徹底清洗，并使之干燥，然后使用Blott柱體(Applied Biosystem)在473A型自動(dòng)化蛋白質(zhì)測(cè)序儀上測(cè)序。用JusticeInnovation軟件使用Nelson Analytical 760界面整合峰。在DECα(Henzel等人，1996，J.Chromatog.，40441-52)上進(jìn)行序列解讀。
獲得5D5重鏈的序列需要如下進(jìn)行去封閉。將Fab片段用7mM DTT于45℃還原1小時(shí)，并用180mM異丙基乙酰胺于25℃烷化20分鐘(Krutzsch和Inman，1993，Anal.Biochem.，209109-116)。然后將烷化Fab片段在Microcon-10中與含10mM DTT的0.1M磷酸鈉(消化緩沖液)交換3次，并在20μl消化緩沖液中用1mU焦谷氨酸氨肽酶于45℃消化3小時(shí)。然后如上所述將去封閉Fab轉(zhuǎn)移至PVDF并測(cè)序。
5D5 Fab的克隆和重組表達(dá)根據(jù)N端序列資料設(shè)計(jì)對(duì)輕鏈和重鏈可變區(qū)5’端特異的PCR引物，而3’引物設(shè)計(jì)成與每條鏈的共有框架4退火(Kabat等人，1991，《Sequences ofproteins of immunological interest》，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)。引物的設(shè)計(jì)中還添加用于克隆的限制性位點(diǎn)。將用Stratagene RNA分離試劑盒由108個(gè)雜交瘤5D5細(xì)胞提取的總RNA用作RT-PCR的底物。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用框架4特異引物和Superscript II RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(Kawasaki，Amplification of RNA，在《PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications》中，第21-27頁，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky、和T.J.White編，Academic Press Inc.，San Diego，1990)。如(Kawasaki，Amplification of RNA，在《PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications》中，第21-27頁，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky、和T.J.White編，Academic Press Inc.，San Diego，1990)所述，PCR擴(kuò)增采用Taq聚合酶，只是反應(yīng)混合液中含有2％ DMSO。用限制酶SfiI和RsrII(輕鏈)或Mlu I和Apa I(重鏈)消化擴(kuò)增得到的DNA片段，凝膠純化，并克隆到表達(dá)質(zhì)粒pAK19(Carter等人，1992，Bio/Technol.，10163-167)的衍生物中。此載體pXCA730經(jīng)過定點(diǎn)誘變的修飾(Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488)后在ST II信號(hào)序列與可變結(jié)構(gòu)域之間和在每條鏈的可變與恒定結(jié)構(gòu)域接合處含有獨(dú)特限制性位點(diǎn)。將輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域cDNA插入人Cκ和CH1結(jié)構(gòu)域的上游且同一讀碼框中。消除pAK19中重鏈C末端半胱氨酸，它能夠形成二硫鍵而生成F(ab’)2分子，從而能夠只表達(dá)抗體的Fab形式。
如(Carter等人，1992，Bio/Technol.，10163-167)所述，在大腸桿菌K12菌株33B6(W3110 tonA phoA E15 deoC KanR ilvGR degPD)argF-lac)169)(Rodriques等人，1995，Cancer Res.，5563-70)中表達(dá)重組5D5 Fab。通過連續(xù)補(bǔ)料離心由10升發(fā)酵液收獲細(xì)胞沉淀，冷凍并保存于-70℃。將一部分沉淀懸浮于提取緩沖液(120mM MES pH 6，5mM EDTA)中(5ml/g細(xì)胞沉淀)。于4℃使用ultraturrax(Janke and Kunkel)約15分鐘，將懸浮液徹底混勻。然后兩次通過安裝了冷卻旋管的細(xì)胞勻漿器(Microfluidizer，Microfluidics Corporation，Newton，MA)，破壞完整細(xì)胞。然后用調(diào)至pH 6的5％(v/v)儲(chǔ)存液將懸浮液調(diào)至0.1％(v/v)聚乙烯亞胺。通過25,400xg離心30分鐘，將完整細(xì)胞和PEI絮凝碎片與可溶餾分分開。通過添加純化的水將上清液的電導(dǎo)率調(diào)至低于4mS，并加載到Bakerbond ABX柱(1×10cm，40μ粒度)上。柱子已經(jīng)用50mM MES，5mM EDTA pH 6平衡。所有步驟都以線性流速100cm/h進(jìn)行。加載條件上清液后，用平衡緩沖液清洗柱子，直至流出液的吸光度等于基線。使用16個(gè)柱體積、由0至100mM線性梯度的溶于平衡緩沖液的硫酸銨進(jìn)行洗脫。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析餾分，并合并含有Fab的餾分。將來自ABX柱的合并液的電導(dǎo)率降至低于4mS，并加載到經(jīng)過25mM MOPS緩沖液pH 6.9平衡的SP-Sepharose高效樹脂柱(1×10cm)上。所有步驟都以線性流速100cm/h進(jìn)行。加樣后，用一個(gè)柱體積的平衡緩沖液清洗柱子。然后使用16個(gè)柱體積、0至200mM線性梯度的溶于平衡緩沖液的乙酸鈉由柱上洗脫5D5 Fab。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析餾分，并合并含有Fab的餾分。
單臂5D5小規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)將表達(dá)質(zhì)粒pxcM11C.H-Fc.K(如上所述)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株33D3(W3110 kanR ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lacIq lacL8 ompTΔ(nmpc-fepE)degP)，然后將轉(zhuǎn)化子于30℃在添加羧芐青霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將LB培養(yǎng)液在含有羧芐青霉素(50μg/ml)的C.R.A.P.培養(yǎng)基中稀釋100倍，并于30℃搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。取出等量小份樣品通過SDS-PAGE和Western分析使用抗Fab抗體(過氧化物酶綴合的針對(duì)人IgG Fab的山羊IgG餾分；CAPPEL #55223)或抗Fc抗體(過氧化物酶綴合的針對(duì)人Fc片段的山羊IgG餾分；Bethyl #A08-104P-41)檢驗(yàn)抗體表達(dá)。然后將剩余培養(yǎng)物離心，并將細(xì)胞團(tuán)冷凍于-70℃，直至開始抗體純化步驟。
單臂5D5的純化將冷凍細(xì)胞團(tuán)融化，并懸浮于10倍體積(w/v)的裂解緩沖液(25mMtris-HCl，5mM EDTA pH7.5)中，然后離心。使用Polytron勻漿器(KinematicaA.G，瑞士)將不溶沉淀重懸于裂解緩沖液中，并通過兩次流過Microfluidizer(Microfluidics，Newton，Mass)來破壞細(xì)胞。向裂解物中添加聚乙烯亞胺(Sigma)0.1％(v/v)，隨后于4℃攪動(dòng)1小時(shí)，然后以15,000xg離心。將由此得到的上清液與蛋白A親和樹脂混合并于4℃攪動(dòng)過夜。讓樹脂沉降，倒出上清液，并將樹脂倒入連接液相層析系統(tǒng)(Varian Inc，Palo Alto，CA)的柱子。先用10mM tris-HCl，1mM EDTA緩沖液pH 7.5后用溶于相同緩沖液的0.5M NaCl清洗柱子，然后用50mM檸檬酸鈉，0.1M NaCl緩沖液的pH6至pH2梯度洗脫。將洗脫餾分立即調(diào)至終濃度2M尿素和pH 5.4，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。合并含有單臂抗cMet的餾分，并在用25mM MES，2M尿素pH 5.4平衡的SP Sepharose柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)上進(jìn)行陽離子交換層析。用溶于25mM MES pH5.4的0至1M NaCl梯度洗脫柱子。SDS-PAGE分析后，將合并的洗脫液調(diào)至0.4M硫酸鈉pH6，并加載到用0.4M硫酸鈉，25mM MES pH6平衡的Hi-Propyl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)柱上。用溶于25mM MES pH6的0.4M至0M硫酸鈉梯度洗脫柱子。SDS-PAGE分析后，使用CentriPrep 10(Millipore Corp，Bedford，MA)濃縮由此得到的洗脫液，然后再用10mM琥珀酸鈉，0.15M NaCl pH 5.0平衡的Superdex 200柱(Amersham Biosciences)上進(jìn)行大小排阻層析。
通過定量氨基酸分析測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過LAL測(cè)定法測(cè)定內(nèi)毒素水平。這些抗體制備物可用于后續(xù)分析。
測(cè)定法細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％ FBS的MEM中培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞。在補(bǔ)充了10％ FCS、5％ WEHI-231的細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基(含有IL-3)、2mM谷氨酸鹽、4μl/Lβ-巰基乙醇、0.5mg/ml G418的RPMI 1640中培養(yǎng)如先前所述(Schwall等人，1996，J.Cell Biol.，133709-718)經(jīng)人cMet轉(zhuǎn)染的BaF3-cMet細(xì)胞和經(jīng)載體轉(zhuǎn)染的BaF3-neo細(xì)胞。在含有10％ FCS的RPMI 1640中培養(yǎng)U87和U118成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞、786-0腎癌細(xì)胞。
HGF-cMet結(jié)合在固相系統(tǒng)中使用生物素-HGF進(jìn)行HGF結(jié)合研究，其中經(jīng)由IgG結(jié)構(gòu)域?qū)-Met-IgG捕捉到微量滴定板上。通過與20倍摩爾過量的NHS-X-生物素在0.1M NaHCO3pH 8.5中一起保溫將HGF生物素化。將NHS-X-生物素分成4個(gè)增量，間隔15分鐘添加，并于室溫?cái)噭?dòng)。通過透析清除未綴合的生物素，并將經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)保存于4℃。將微量滴定板用2μg/ml AffiniPure兔抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch)在包被緩沖液(0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽pH 9.6)中于4℃包被過夜。將板用含有0.5％ BSA的PBS pH 7.4于室溫(RT)封閉1小時(shí)，然后與2μg/ml cMet-IgG一起保溫2小時(shí)。然后加入53ng/ml生物素標(biāo)記的HGF，加入或不加0.01-1,000nM競(jìng)爭(zhēng)物即冷的HGF、抗c-Met 5D5 mAb、Fab或單臂抗體，于室溫放置1小時(shí)。向板中加入辣根過氧化物酶(HRP)-鏈霉親和素(1∶10,000稀釋，Amersham)，于室溫放置1小時(shí)，然后是磷酸酶底物CP-磷酸硝基苯酯(Kirkegaard & PerryLaboratories)，并測(cè)量405nm吸光度。
結(jié)果顯示于圖5。在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法中，單臂抗c-met 5D5抗體的表現(xiàn)與抗c-met Fab相似。
KIRA對(duì)c-Met的酪氨酸磷酸化根據(jù)Sadick等人的方法，其中將溶解的受體捕捉到用抗受體抗體包被的板上并用抗P-Tyr檢測(cè)(Sadick等人，1996，Anal.Biochem.，235207-214)，通過三明治ELISA測(cè)量c-Met的酪氨酸磷酸化。將U87細(xì)胞以106/ml分配到96孔板中并于37℃培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)基換成含有HGF和/或抗體的MEM、0.1％ FBS，放置10分鐘。然后將細(xì)胞用100μl細(xì)胞裂解緩沖液(20mMTris pH 7.5，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1nM EGTA，1％ Triton，1x蛋白酶抑制劑雞尾酒樣混合物(Sigma)，1x磷酸酶抑制劑雞尾酒樣混合物II(Sigma))在搖板機(jī)上于室溫抽提30分鐘，并保存在冰上或-70℃。將裂解物加到經(jīng)抗c-Met mAb 1949(Genentech)包被過夜的板上。用1∶4000稀釋的生物素化抗磷酸酪氨酸(4G10，Upstate)及后續(xù)HRP-鏈霉親和素和TMB顯色來檢測(cè)磷酸-酪氨酸c-Met。使用1∶10,000抗c-Met抗體類似地測(cè)量總c-Met。
結(jié)果顯示于圖6。
細(xì)胞增殖、遷移測(cè)定法BaF3是正常情況下不表達(dá)c-Met且不應(yīng)答HGF的鼠IL-3依賴性淋巴樣細(xì)胞。然而，在通過用人c-Met的正常全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)染衍生的BaF3-hMet(Schwall等人，1996，J.Cell Biol.，133709-718)中，HGF在缺乏IL-3時(shí)刺激增殖和存活。將BaF3-hMet和BaF3-neo細(xì)胞在RPMI 1640，5％胎牛血清，4μl/L β-ME，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸鏈霉素，2mM L-谷氨酸鹽，和作為IL-3來源的5％ WEHI條件培養(yǎng)基中常規(guī)傳代。為了測(cè)量HGF依賴性增殖，通過添加25μl Alarma藍(lán)(Trek Diagnostic Systems)并測(cè)量4小時(shí)后的熒光強(qiáng)度來量化處理3天后的細(xì)胞數(shù)目。作為特異性的對(duì)照，單臂5D5也在用IL-3刺激的BaF3-hMet細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)試。
結(jié)果顯示于圖7。
使用經(jīng)過改良的Boyden室測(cè)定法評(píng)估MDAMB-435-PGL細(xì)胞和U87細(xì)胞的遷移。將細(xì)胞分配到安有用10μg/ml纖連蛋白包被的5μm孔聚碳酸酯濾器的上層室(2×104/孔)中。向下層室的培養(yǎng)基中加入100ng/ml HGF，加入或不加指定數(shù)量的5D5 Fab或單臂抗體。將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。使用專用海綿刷刮下濾膜頂面的細(xì)胞，并用YO-PRO-3碘化物(Molecular Probes)固定和染色遷移到濾器底表面的細(xì)胞，然后通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。
結(jié)果顯示于圖8。
藥物動(dòng)力學(xué)將OA-5D5或5D5 Fab(5mg/kg)靜脈內(nèi)注射到裸鼠中。在指定時(shí)間點(diǎn)，由4只小鼠采集血清樣品并通過三明治ELISA進(jìn)行測(cè)定，其中將它捕捉到用cMet-IgG包被的板上，然后用輕鏈特異性二抗檢測(cè)。
結(jié)果顯示于圖9A。單臂5D5抗體的半衰期與其Fab對(duì)應(yīng)物相比顯著延長(zhǎng)。
為了測(cè)定OA-5D5在體內(nèi)是否降解，將根據(jù)ELISA相當(dāng)于40ng OA-5D5的來自第7天樣品的一定體積血清在還原或非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上并通過HRP綴合的抗人Fc(1∶5,000，對(duì)人特異的，Jackson Labs)顯示印跡。平行運(yùn)行等體積的來自未處理小鼠的血清作為對(duì)照。
結(jié)果顯示于圖9B。血清單臂5D5抗體在施用后第7天是完整的。
體內(nèi)腫瘤功效研究使用皮下接種2.5×106個(gè)A549(人肺癌)或U87MG細(xì)胞(分泌自分泌HGF且表達(dá)c-Met的人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)的4-6周齡雌性無胸腺裸鼠進(jìn)行功效研究。在接種腫瘤細(xì)胞時(shí)(即輔助治療)或容許腫瘤生長(zhǎng)至～150mm3時(shí)開始使用單臂5D5抗體、5D5 Fab抗體或?qū)φ湛贵w(抗gp120)的治療。所有抗體腹膜內(nèi)施用，每周一次，持續(xù)4周。注意，只對(duì)單臂5D5抗體測(cè)試輔助治療方案(抗gp120作為對(duì)照)。
圖10顯示了通過接種U87 MG細(xì)胞生成的腫瘤的結(jié)果。如圖10A(輔助治療)和圖10B(腫瘤建立后治療)所示，單臂5D5抗體能夠抑制或引起腫瘤衰退。如圖10B所示，與其Fab對(duì)應(yīng)物相比，單臂5D5抗體具有上佳的治療功效。(有趣的是，單臂5D5抗體在100nM時(shí)在體外展示對(duì)U87細(xì)胞數(shù)目的最低功效。)對(duì)于由接種A549細(xì)胞生成的腫瘤的治療結(jié)果是陰性的，這提供了特異性對(duì)照，證實(shí)單臂5D5抗-c-met抗體針對(duì)U87腫瘤的效果不是由于非特異細(xì)胞毒性作用。
使用其它本領(lǐng)域已建立的體內(nèi)腫瘤模型，例如美國(guó)專利6,271,342中描述的Oncotest模型，還對(duì)單臂5D5抗c-met抗體測(cè)試了調(diào)控腫瘤發(fā)展的能力。與MRC-5成纖維細(xì)胞(ATCC CCL-171)共接種的BxPC-3(胰腺)(ATCCCRL-1687)細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)在每周兩次以30mg/kg施用單臂5D5抗體后顯示抑制50％。其它例示性數(shù)據(jù)列于下文●在Oncotest RXF1220(腎)，以10mg/kg q7d(即每7天一次)施用單臂5D5抗體中，抑制腫瘤生長(zhǎng)～30％；●在(i)Oncotest PAXF736(胰腺)、10mg/kg、q7d；(ii)Oncotest GXF97(胃)、10mg/kg、q7d；(iii)Oncotest LXFA526(肺)、30mg/kg、q7d；(iv)Oncotest LSFA297(肺)、30mg/kg、q7d中，抑制腫瘤生長(zhǎng)＜20％；●在A549異種移植物中，用10mg/kg、q7d單臂5D5抗體沒有觀察到活性；●在Oncotest LXFA650(肺)中，30mg/kg、q7d沒有觀察到活性。
權(quán)利要求
1.包含單個(gè)抗原結(jié)合臂和Fc區(qū)的抗體片段，與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比，所述Fc區(qū)提高所述抗體片段的穩(wěn)定性，其中Fc區(qū)包含第一和第二Fc多肽的復(fù)合體，其中所述的Fc多肽之一而不是二者是N端截短的重鏈。
2.權(quán)利要求1的抗體片段，其中所述抗體片段未糖基化。
3.權(quán)利要求1或2的抗體片段，其中所述抗體片段沒有或具有少許免疫抑制特性。
4.權(quán)利要求3的抗體片段，其中所述免疫抑制特性包括招致T細(xì)胞耗損的能力。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的抗體片段，它不具有FcRn結(jié)合以外的實(shí)質(zhì)性效應(yīng)物功能。
6.權(quán)利要求5的抗體片段，其中所述效應(yīng)物功能指補(bǔ)體裂解。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述抗體片段結(jié)合FcRn。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體片段，它不特異結(jié)合T細(xì)胞表面抗原。
9.權(quán)利要求8的抗體片段，其中所述T細(xì)胞表面抗原指CD3或CD4。
10.權(quán)利要求9的抗體片段，其中所述T細(xì)胞表面抗原指CD3。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗體片段，它特異結(jié)合腫瘤抗原。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的抗體片段，它特異結(jié)合在受體二聚化后活化的細(xì)胞表面受體。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述抗體片段包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，第二多肽包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和所述第一Fc多肽，而第三多肽包含所述第二Fc多肽。
14.權(quán)利要求13的抗體片段，其中所述第一多肽包含與人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合的非人輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
15.權(quán)利要求13的抗體片段，其中所述第一多肽包含與人源化或人框架序列融合的來自非人物種的CDR。
16.權(quán)利要求13的抗體片段，其中所述第二多肽包含與人重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合的非人重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
17.權(quán)利要求13的抗體片段，其中所述第二多肽包含與人源化或人框架序列融合的來自非人物種的CDR。
18.權(quán)利要求13的抗體片段，其中所述第三多肽包含N端截短的重鏈，該重鏈在N端包含至少部分鉸鏈序列。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述兩種Fc多肽共價(jià)連接。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述兩種Fc多肽在鉸鏈區(qū)經(jīng)由分子間二硫鍵連接。
21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述抗體片段在與靶分子結(jié)合后抑制靶分子多聚化。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述抗體片段在與靶分子結(jié)合后抑制相關(guān)結(jié)合配偶體結(jié)合靶分子。
23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面相遇，且第二Fc多肽的界面包含突起，該突起可位于第一Fc多肽的界面的腔中。
24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述第二Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼所述突起或所述第一Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼所述腔，或者二者兼之。
25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述第二Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼所述突起且所述第一Fc多肽已經(jīng)由模板/原始多肽改變以編碼所述腔，或者二者兼之。
26.權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面相遇，其中第二Fc多肽的界面包含突起，該突起可位于第一Fc多肽的界面的腔中，且其中所述腔或突起或者二者已經(jīng)分別導(dǎo)入第一和第二Fc多肽的界面。
27.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述突起和腔已經(jīng)導(dǎo)入各自Fc多肽的界面。
28.權(quán)利要求24-27任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述突起和腔各自包含天然存在的氨基酸殘基。
29.權(quán)利要求24-28任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含突起的Fc多肽是通過用具有比原始?xì)埢髠?cè)鏈體積的輸入殘基替代來自模板/原始多肽界面的原始?xì)埢傻摹?br> 30.權(quán)利要求24-29任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含突起的Fc多肽是通過包括如下步驟的方法生成的，其中用編碼具有比原始?xì)埢髠?cè)鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始?xì)埢暮怂帷?br> 31.權(quán)利要求29或30的抗體片段，其中所述原始?xì)埢翘K氨酸。
32.權(quán)利要求29-31任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是精氨酸(R)。
33.權(quán)利要求29-31任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是苯丙氨酸(F)。
34.權(quán)利要求29-31任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是酪氨酸(Y)。
35.權(quán)利要求29-31任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是色氨酸(W)。
36.權(quán)利要求23-28任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽是通過用具有比原始?xì)埢?cè)鏈體積的輸入殘基替代模板/原始多肽界面中的原始?xì)埢傻摹?br> 37.權(quán)利要求23-28和36任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽是通過包括如下步驟的方法生成的，其中用編碼具有比原始?xì)埢?cè)鏈體積的輸入殘基的核酸替代編碼來自所述多肽界面的原始?xì)埢暮怂帷?br> 38.權(quán)利要求36或37的抗體片段，其中所述原始?xì)埢翘K氨酸。
39.權(quán)利要求36或37的抗體片段，其中所述原始?xì)埢橇涟彼帷?br> 40.權(quán)利要求36或37的抗體片段，其中所述原始?xì)埢抢野彼帷?br> 41.權(quán)利要求36-40任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基不是半胱氨酸(C)。
42.權(quán)利要求36-40任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是丙氨酸(A)。
43.權(quán)利要求36-40任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是絲氨酸(S)。
44.權(quán)利要求36-40任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是蘇氨酸(T)。
45.權(quán)利要求36-40任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述輸入殘基是纈氨酸(V)。
46.權(quán)利要求36-45任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的原始氨基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸。
47.權(quán)利要求36-46任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的輸入殘基丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。
48.權(quán)利要求36-47任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的原始氨基酸的替代蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中所述原始氨基酸用選自下組的輸入殘基替代丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。
49.權(quán)利要求23-48任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽在第366位包含用絲氨酸替代蘇氨酸，氨基酸編號(hào)依照Katat的EU編號(hào)方案。
50.權(quán)利要求23-48任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽在第368位亮氨酸處包含丙氨酸替代，氨基酸編號(hào)依照Katat的EU編號(hào)方案。
51.權(quán)利要求23-50任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含纈氨酸替代酪氨酸。
52.權(quán)利要求23-51任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含腔的Fc多肽包含兩個(gè)或多個(gè)選自下組的氨基酸替代T366S、L368A和Y407V。
53.權(quán)利要求23-52任一項(xiàng)的抗體片段，其中包含突起的Fc多肽在第366位蘇氨酸處包含色氨酸替代，氨基酸編號(hào)依照Katat的EU編號(hào)方案。
54.權(quán)利要求1-53任一項(xiàng)的抗體片段，其中所述第一和第二Fc多肽各自包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域。
55.權(quán)利要求54的抗體片段，其中所述抗體恒定結(jié)構(gòu)域指CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。
56.權(quán)利要求54或55的抗體片段，其中所述抗體恒定結(jié)構(gòu)域來自IgG。
57.權(quán)利要求56的抗體片段，其中所述IgG指人IgG1。
58.權(quán)利要求1-57任一項(xiàng)的抗體片段，它具有單特異性。
59.權(quán)利要求1-58任一項(xiàng)的抗體片段，它是單特異性免疫粘附素。
60.權(quán)利要求1-59任一項(xiàng)的抗體片段，它是抗體-免疫粘附素嵌合體。
61.包含免疫球蛋白群的組合物，其中至少75％的免疫球蛋白是權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段。
62.制備權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段的方法，包括如下步驟(a)培養(yǎng)包含編碼抗體片段的核酸的宿主細(xì)胞；并(b)由宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收抗體片段。
63.權(quán)利要求62的方法，其中包含抗體片段的多肽以這樣的比率表達(dá)，該比例導(dǎo)致由此產(chǎn)生的免疫球蛋白群中至少50％的免疫球蛋白是權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述多肽以近似等摩爾量表達(dá)。
65.權(quán)利要求64的方法，其中編碼多肽的核酸與近似相等長(zhǎng)度的翻譯起始區(qū)(TIR)可操作連接。
66.權(quán)利要求62-65任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核的。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述大腸桿菌是內(nèi)源蛋白酶活性缺陷的菌株。
69.權(quán)利要求62-65任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核的。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述宿主細(xì)胞是CHO。
71.權(quán)利要求62-70任一項(xiàng)的方法，其中由培養(yǎng)物的培養(yǎng)液回收抗體片段。
72.權(quán)利要求62-70任一項(xiàng)的方法，其中由細(xì)胞裂解物回收抗體片段。
73.制備權(quán)利要求23-60任一項(xiàng)的抗體片段的方法，包括如下步驟(a)培養(yǎng)包含編碼抗體片段的核酸的宿主細(xì)胞，其中編碼第二Fc多肽的界面的核酸已經(jīng)由編碼第二Fc多肽的原始界面的核酸改變以編碼突起或編碼第一Fc多肽的界面的核酸已經(jīng)由編碼第一Fc多肽的原始界面的核酸改變以編碼腔，或者二者兼之；并(b)由宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收抗體片段。
74.權(quán)利要求73的方法，其中編碼第二Fc多肽的核酸已經(jīng)由原始核酸改變以編碼突起且編碼第一Fc多肽的核酸已經(jīng)由原始核酸改變以編碼腔。
75.權(quán)利要求73的方法，其中步驟(a)之前還有步驟，其中編碼來自第二Fc多肽界面的原始氨基酸殘基的核酸用編碼具有比原始氨基酸殘基更大側(cè)鏈體積的輸入氨基酸殘基的核酸替代，其中具有更大側(cè)鏈體積的輸入殘基包含突起。
76.權(quán)利要求73的方法，其中步驟(a)之前還有步驟，其中編碼第一Fc多肽界面中的原始氨基酸殘基的核酸用編碼具有比原始氨基酸殘基更小側(cè)鏈體積的輸入氨基酸殘基的核酸替代以形成腔。
77.權(quán)利要求73的方法，其中步驟(a)之前還有步驟，其中將編碼第一和第二Fc多肽的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
78.制備權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段的方法，包括如下步驟(a)制備形成抗體片段的多肽；并(b)容許發(fā)生異多聚化，由此形成抗體片段。
79.權(quán)利要求62-78任一項(xiàng)的方法，其中至少50％所形成的免疫球蛋白多肽復(fù)合體是權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段。
80.權(quán)利要求62-78任一項(xiàng)的方法，其中至少50％所形成的免疫球蛋白多肽復(fù)合體是異三聚體。
81.權(quán)利要求62-78任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)包括將第一Fc多肽和第二Fc多肽在體外偶聯(lián)。
82.權(quán)利要求62-78任一項(xiàng)的方法，其中原始界面的氨基酸序列已經(jīng)改變，從而在改造后界面中生成突起和腔。
83.編碼權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段的分離核酸。
84.包含兩種或多種集體編碼權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段的重組核酸的組合物。
85.包含權(quán)利要求83或84的核酸的宿主細(xì)胞。
86.權(quán)利要求85的宿主細(xì)胞，其中編碼抗原結(jié)合臂的核酸存在單個(gè)載體中。
87.權(quán)利要求85的宿主細(xì)胞，其中編碼抗原結(jié)合臂的核酸存在于不同載體中。
88.權(quán)利要求85的宿主細(xì)胞，其中編碼抗原結(jié)合臂和N端截短的重鏈的核酸存在于單個(gè)載體中。
89.制備權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段的方法，包括培養(yǎng)包含權(quán)利要求83或84的核酸的宿主細(xì)胞使得多肽表達(dá)，并由細(xì)胞培養(yǎng)物回收抗體片段。
90.權(quán)利要求89的方法，其中由細(xì)胞裂解物回收抗體片段。
91.權(quán)利要求89的方法，其中由細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)液回收抗體片段。
92.權(quán)利要求89的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
93.權(quán)利要求89的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
94.權(quán)利要求89的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物的。
95.包含權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的抗體片段和載體的組合物。
96.生成包含單個(gè)抗原結(jié)合臂和Fc區(qū)的抗體片段的方法，與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比，所述Fc區(qū)提高所述抗體片段的穩(wěn)定性，所述方法包括在容許抗原結(jié)合臂形成和第一和第二Fc多肽二聚化而形成所述Fc區(qū)的條件下在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼抗原結(jié)合臂和第一和第二Fc多肽的核酸，其中所述的Fc多肽之一而不是二者是N端截短的重鏈。
97.權(quán)利要求96的方法，其中所述方法生成異質(zhì)免疫球蛋白群，且其中至少50％的免疫球蛋白包含單個(gè)抗原結(jié)合臂和Fc區(qū)，與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比，所述Fc區(qū)提高所述抗體片段的穩(wěn)定性。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定化單價(jià)抗體片段的方法和組合物，所述片段由單個(gè)抗原結(jié)合臂和Fc區(qū)組成，所述Fc區(qū)提高穩(wěn)定性但不誘導(dǎo)二聚化，且包含第一和第二Fc多肽的復(fù)合體，其中只有Fc多肽之一是N端截短的重鏈。
文檔編號(hào)C12N15/13GK1922210SQ200480041905
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者阿瑟·J－Y·黃, 拉爾夫·H·施瓦爾, 丹尼爾·G·揚(yáng)薩拉 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司