專利名稱：人的抗人白細胞介素－6抗體以及所述抗體的片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合人IL-6從而抑制1L-6與其受體之間的結(jié)合的人抗人白細胞介素-6(以下稱作“IL-6”)抗體，所述抗體的片段，和編碼它們的基因片段?？梢灶A(yù)期根據(jù)本發(fā)明的抗體及其片段可作為治療由IL-6引起的炎癥和免疫性疾病的藥物。
背景技術(shù)：
IL-6是分子量為21,000的糖蛋白，其可由受到促分裂素、病毒感染或IL-1刺激的T細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、肌細胞等生成。人IL-6由184個氨基酸組成，其基因位于第7染色體。IL-6具有多種生物活性，包括(1)誘導(dǎo)細胞增殖(雜交瘤、T細胞、角質(zhì)形成細胞、腎小球系膜細胞)，(2)抑制細胞增殖(骨髓性白血病細胞系、惡性黑素瘤細胞系)，和(3)誘導(dǎo)細胞分化和誘導(dǎo)細胞特殊蛋白質(zhì)的生成(黑素細胞瘤細胞系的神經(jīng)分化、殺傷T細胞的分化、巨核細胞的成熟、骨髓性白血病細胞分化成巨噬細胞、B細胞生成抗體、肝細胞中的急性期蛋白質(zhì)生成)。由于其具有多種生物活性，已經(jīng)表明IL-6與一些疾病有關(guān)。近年來，人們已知IL-6與疾病發(fā)作相關(guān)，包括(1)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心房粘液腫、Castleman病、高γ-球蛋白血癥或艾滋病中的自身免疫癥，(2)腎小球系膜腎炎，(3)牛皮癬，和(4)艾滋病中Kaposi肉瘤。最近，還已知在運動后，在骨骼肌中立即產(chǎn)生大量的IL-6，其刺激下丘腦分泌多種神經(jīng)激素，從而影響免疫系統(tǒng)(免疫學(xué)詞典，第一版，第49頁，1993年)。
在涉及IL-6的疾病中，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)折磨著全日本約70萬人，該數(shù)目還逐步地增加，連同老年患者數(shù)目的增加，正成為社會問題(Ogata A.等，Rinsho Byori(臨床病理學(xué))，1999年四月；47(4)321-326[白細胞介素-6治療的進展])。
RA的起因不為人所知。RA是一種在關(guān)節(jié)腔里持續(xù)發(fā)生自身免疫反應(yīng)并且變成慢性的自身免疫性疾病，被定義為一種頑固性特殊病。對RA與IL-6的關(guān)聯(lián)性的研究表明在RA患者的關(guān)節(jié)液中存在大量的IL-6，以及IL-6不僅涉及誘導(dǎo)炎癥而且參與滑膜中的成纖維細胞的增殖。IL-6也有可能促進自身抗體的生成(Nishimoto N.等，白細胞介素-6受體抗體的臨床應(yīng)用，日本免疫學(xué)學(xué)會學(xué)報，1997，2087-94)。
因此，抑制IL-6生物活性的抗-IL-6抗體將成為用于治療一些包括RA的免疫性疾病的候選抗病藥物，事實上其已在研究之中(Mihara M.等，Br.J.Rheumatol。1985年4月；34(4)；321-325；Mihara M.等，Clin.Immunol。2001年，98；319-326)。

發(fā)明內(nèi)容
(本發(fā)明解決的技術(shù)問題)已經(jīng)對RA患者應(yīng)用了各種治療方法，根據(jù)患者的疾病階段包括用非甾族抗炎藥、鎮(zhèn)痛劑、甾族劑、免疫抑制劑或代謝拮抗劑的藥物療法，和外科療法例如人造關(guān)節(jié)。然而，這些療法不能根除RA，而且由于所述應(yīng)用的療法時間長、藥物劑量大而存在不利的副作用的問題。IL-6在炎癥加重中發(fā)揮作用，因此是RA患者所遭受的疼痛的主要原因。因此表明抑制IL-6的活性將緩解疼痛。作為候選物，已經(jīng)對人源化的抗-IL-6抗體進行研究(Montero-Julian F.A.等，Blood，1995年2月15日；85(4)917-924；Monier S.等，Clin.Exp.Rheumatcl.，1994年11月-12月；12(6)；595-602；Wendling D.等，J.Rheumatcl，1993年2月；20(2)259-262)。
另一方面，IL-6對骨髓瘤細胞有生長因子的活性(免疫學(xué)詞典，第一版，第49頁，1993年；同前)，由此帶來的問題是即使獲得了可生成高親和力地結(jié)合IL-6的抗體的雜交瘤，由于所生成的抗體與培養(yǎng)基中IL-6的中和作用阻礙了雜交瘤的增殖，結(jié)果很難獲得具有高親合力的抗-IL-6抗體。Sato等報道了從小鼠中獲得的抗人IL-6抗體顯示出11nM的高親合力，但也具有3×10-2秒的高離解率。(Sato K等Hum.Antibodies Hybridomas。1996；7(4)；175-183)。由于通過現(xiàn)有技術(shù)獲得所述抗體具有高離解率，需要保持高濃度的抗體來抑制IL-6活性。更不用說具有此活性的完全的人類抗體了。
此外，不同于完全人的抗體，不能否定的可能性是將心源化抗體施用于患者將導(dǎo)致患者體內(nèi)生成抑制抗-IL-6抗體活性的抗體(封閉性抗體)。
(解決問題的方法)在此情況下，發(fā)明者設(shè)計了應(yīng)用噬菌體抗體技術(shù)的篩選系統(tǒng)，從而獲得完全人的抗人-IL-6抗體的單鏈Fv(scFV)分子并闡明了所述抗體的VH和VL鏈。發(fā)明者進一步分析了所述scFv的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)與那些從多種動物中獲得的抗人IL-6的常規(guī)抗體相比，所述scFv顯示極低的締合速率(約為10-3秒；離解率低于常規(guī)抗體的離解率約40倍)，與同常規(guī)抗體相比具有相等的或更高的對IL-6的親和力，以及以濃度依賴性方式抑制IL-6依賴細胞系的增殖。
(比現(xiàn)有技術(shù)更有效的作用)可以預(yù)計通過利用完全來源于人的和對IL-6有高親和力的所述的抗體，以低于嵌合抗體或人源化抗體的抗體濃度來發(fā)揮療效，僅僅生成極低水平的抗所述抗體的抗獨特型抗體，因此提供作為抗-IL-6拮抗劑的、療效顯著的抗-人IL-6抗體藥物，來治療例如IL-6依賴性白血病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫性疾病。也可預(yù)期將根據(jù)本發(fā)明的抗體用作副作用降低和具有有效活性的治療急性炎癥的藥物。
附圖簡述

圖1顯示測量來自IL-6gk系列的IL6gk3-2scFv和重組IL-6、人血清蛋白(HSA)、AB血型血清、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和MIP-1α(巨嗜細胞炎性蛋白-1α)反應(yīng)的ELISA結(jié)果圖。
圖2顯示測量IL6gk3-2scFv與IL-6的結(jié)合親和性的BIA CORE的結(jié)果圖。
圖3顯示IL6gk3-2 scFv抑制IL-6依賴性細胞株KT-3的IL-6依賴性增殖應(yīng)答的結(jié)果圖。
實施發(fā)明的最佳方式從20位健康供體中取樣的外周B淋巴細胞中，通過RT-PCR擴增每條免疫球蛋白重鏈(H和輕鏈(L)的cDNA，并用接頭DNA連接來制備單鏈Fv(scFv)DNA，其中隨機結(jié)合來自健康供體的淋巴細胞的VH鏈和VL鏈的DNA。
將scFv DNA插入噬菌粒載體pCANTAB5E來制備scFV噬菌體展示文庫，其由來自健康供體的109個克隆組成。然后將該文庫與固定在固相的人IL-6連接，并回收、濃縮和篩選抗-人IL-6 Fv展示噬菌體克隆。結(jié)果，所篩選的scFv克隆(IL6gk3-2)生成可結(jié)合人IL-6的scFv抗體。
盡管是單鏈，通過IL6gk3-2克隆而生成的scFv抗體，以與常規(guī)的完全抗體相等的親和力特異性結(jié)合配體(IL-6)。
當(dāng)被添加到以人IL-6依賴性方式增殖的KT-3細胞系時，由IL6gk3-2克隆生成的scFv抗體，以濃度依賴性方式抑制所述細胞系的IL-6依賴性增殖應(yīng)答。
SEQ ID NO1和2(VH鏈)和SEQ ID NO3和4(VL鏈)分別表示具有抑制活性的上述scFv克隆的VH和VL鏈的氨基酸序列及其編碼核酸序列。
此外，包含于上述氨基酸序列的VH和VL鏈的互補決定區(qū)(CDR1至CDR3)的氨基酸序列如下[VH鏈]CDR1Lys Tyr Tyr Met Ala(SEQ ID NO5)CDR2Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly(SEQ ID NO6)CDR3Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val(SEQ ID NO7)[VL鏈]CDR1Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp Val Ala(SEQ ID NO8)CDR2Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser(SEQ ID NO9)CDR3Gln Gln Ser Asp Ser Thr Pro Ile Thr Phe(SEQ ID NO10)具有上述的VH鏈或VL鏈的可變區(qū)，或具有上述VH鏈和VL鏈的可變區(qū)的抗體片段，具有人的抗-人IL-6抗體的可變區(qū)，強烈作用于人IL-6，從而對在IL-6和IL-6之間的結(jié)合發(fā)揮抑制活性。
盡管描述的人的抗-人IL-6抗體的VH鏈和/或VL鏈是通過噬菌體抗體技術(shù)以scFv的形式而獲得，本發(fā)明也包括所述的VH鏈和/或VL鏈結(jié)合于人免疫球蛋白的恒定區(qū)的完整分子的形式人的抗-人IL-6抗體；所述的VH鏈和/或VL鏈與人免疫球蛋白的部分恒定區(qū)結(jié)合的人的抗-人IL-6抗體片段，例如Fab、Fab’或F(ab’)2；以及其中的scFv與人免疫球蛋白的恒定區(qū)結(jié)合的其他的人的抗-人IL-6抗體片段，例如人抗-人IL-6單鏈抗體(scAb)；以及編碼這些抗體和抗體片段的基因片段。本發(fā)明進一步包括修飾過的蛋白質(zhì)分子，其中將高分子量改性劑結(jié)合到這些抗體和抗體片段蛋白質(zhì)分子上。
工業(yè)實用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的人的抗人IL-6抗體和所述抗體的片段分子可抑制多種由IL-6和IL-6受體的結(jié)合誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，因此可用作抗炎、鎮(zhèn)痛劑或治療和預(yù)防自身免疫性疾病的藥物。
此外，根據(jù)本發(fā)明的人的抗人IL-6抗體和所述抗體的片段分子，鑒于它們的性質(zhì)，可以提供免疫學(xué)測量法來檢測或測量人外周血或肌肉中的IL-6表達細胞。
此外，根據(jù)本發(fā)明的人的抗人IL-6抗體和所述抗體的片段分子，當(dāng)其與由免疫惰性吸附物質(zhì)組成的免疫吸附劑復(fù)合時，可進一步提供許多其他應(yīng)用。例如，可通過免疫親合層析法來純化存在于人外周血的IL-6。所述的免疫吸附劑復(fù)合物也可用于純化通過培養(yǎng)遺傳重組轉(zhuǎn)化的細胞而生成的培養(yǎng)上清液中的IL-6。
此外，本發(fā)明的人的抗人IL-6抗體的可變區(qū)的肽和所述肽的衍生物，可提供從文庫中分離識別本發(fā)明的人的抗人IL-6抗體的肽或抗獨特型的新方法?？梢灶A(yù)期所獲得肽和抗獨特型及其衍生物，能有效治療由IL-6的中和作用或自身免疫性疾病引起的急性炎癥(Vreugdenhil G.等，Rheumatol.Int.1990；10(3)127-130；Hirano T.等，Ric.Clin.Lab.1989年1-3月；19(1)1-10)。
通過以下實施例對本發(fā)明作更詳細地描述，但本發(fā)明不應(yīng)被解釋為限制于所述實施例。
實施例1構(gòu)建來自健康供體的噬菌體文庫根據(jù)J.D.Marks等(J.Mol.Biol.，222；581-591，1991)的報道作一些修改，來構(gòu)建噬菌體文庫。
通過菲可沉淀離心法，從取自20位健康供體的外周血中分離淋巴細胞，用PBS徹底洗滌，然后用ISOGEN(NIPPO GENE CO.，LTD)處理來制備總RNA。所獲得的總RNA分為四份，使用第一鏈cDNA合成試劑盒(Pharmaciabiotech)，以人的IgM、IgM、к鏈或λ鏈中任一項的恒定區(qū)的特異性引物，來從每份樣品中制備cDNA。將獲得的每份cDNA作為模板，如Marks等所描述，使用VH(γ或μ)和JH、VK和JK、或Vλ和Jλ中任一組合的特異性引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增各個抗體V區(qū)基因。
然后，用接頭DNA通過裝配PCR將VH(γ或μ)和VK、VH(γ或μ)和Vλ相互連接(McCafferty，J.等。Antibody.Engineering.A practical ApproachIRL出版社，牛津大學(xué)，1996)，來制備單鏈scFv DNA。所獲得的scFv DNA通過PCR來引入Not I和Sfi I酶切位點，經(jīng)瓊脂糖電泳，然后純化。用限制性酶Not I(Takara)和Sfi I(Takara)酶切所純化的scFv DNA，然后克隆至噬菌粒pCANTAB5E(Pharmacia)。對于VH(γ)-VK、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-VK和VH(μ)-Vλ中的每一個，通過電穿孔，將獲得的、結(jié)合了scFv DNA的噬菌粒pCANTAB5E導(dǎo)入大腸桿菌TG1細胞。對于被轉(zhuǎn)化的TG1細胞的數(shù)量，可評定出VH(γ)-VK、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-VK和VH(μ)-Vλ分別顯示1.1×108、2.1×108、8.4×107和5.3×107克隆的多樣性。通過M13KO7輔助噬菌體，在被轉(zhuǎn)化的TG1細胞表達噬菌體抗體，從而制備源自健康供體的scFv展示噬菌體文庫。
實施例2淘選以1mL 0.1M NaHCO3溶解人IL-6，將溶液置于35mm培養(yǎng)皿(Iwaki)中，4℃過夜溫育來固定IL-6。往培養(yǎng)皿中加入用于封閉的0.5％明膠/PBS，置于20℃中2小時，然后用0.1％Tween20-PBS將培養(yǎng)皿洗滌六次。然后，往培養(yǎng)皿中加入0.9mL的單鏈抗體展示噬菌體溶液(源自健康供體的、1×1012tu/mL的抗體噬菌體文庫)進行反應(yīng)。
以0.1％Tween20-PBS洗滌培養(yǎng)皿十次后，加入1.0mL甘氨酸緩沖液(pH2.2)來洗脫結(jié)合到IL-6上的單鏈抗體展示噬菌體。通過加入1M pH9.1的Tris(羥甲基)-氨基甲烷-HCl來調(diào)整pH，然后將洗脫的噬菌體侵染處于對數(shù)生長期的大腸桿菌TG1細胞。將被侵染的TG1細胞以3,000×g離心10分鐘。除去上清液，用200uL 2×YT培養(yǎng)基懸浮，在SOBAG平板(SOB平板含有2％葡萄糖、100ug/mL氨芐青霉素)上鋪板，然后在恒溫箱中30℃過夜溫育。懸浮所得到的克隆，并用刮刀(Coastor)回收于適宜量的2×YT培養(yǎng)基。
將獲得的TG1溶液(50μL)接種于30mL的2×YT培養(yǎng)基上，篩選之后用輔助噬菌體進行恢復(fù)(rescue)來制備噬菌體文庫。
對于每個源自健康供體的VH(γ)-VK、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-VK和VH(μ)-Vλ的噬菌體文庫，用固定有IL-6的平板實施總數(shù)四次淘選。第四次淘選后，從SOBAG平板任意提取任何克隆。確定scFv的表達，通過IL-6的ELISA確定特異性及分析核酸序列。
實施例3IL-6的ELISA篩選為篩選分離的克隆，按以下實施ELISA將人IL-6和對照蛋白質(zhì)固定在ELISA篩選平板上。將每個40uL/孔的人重組IL-6(1.25ug/mL)、人血清蛋白(HAS；2.5ug/mL)、人單核細胞趨化蛋白1(MCP-1；1.25ug/mL)、人MIP-1α(巨噬細胞炎癥蛋白1-α；1.25ug/mL)或人AB血型血清(1.25ug/mL)置入于ELISA平板(Nunc)中，平板在4℃靜置16小時來固定。將含有0.5％的BSA、0.5％的明膠和5％的脫脂乳的PBS溶液，以400ul/孔加到固定化平板中，并于4℃保持2小時來封閉。
將含有用于反應(yīng)的scFv展示噬菌體的樣品溶液以40ul/孔加到平板中。棄去樣品溶液，并用洗液洗滌平板五次。將平板和生物素標(biāo)記的抗-M13單克隆抗體(Pharmacia biotech)反應(yīng)，然后和堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗-鼠IgG抗體反應(yīng)。用洗液洗滌五次后，將底物顯影液，即含有1g/mL的p-硝基苯磷酸鹽(Wako)和10％的二乙醇胺(Wako)的PBS溶液，以50ul/孔加到平板中，屏蔽光，并于室溫至37℃下顯影5至10分鐘。使用多盤自動讀數(shù)計(Multiplate Autoreader)NJ-2001(Inter Med)測量405nm下的吸光度。結(jié)果，確定所有被評定的克隆都是IL-6特異性的(圖1)。
實施例4克隆的序列分析通過染料終止循環(huán)測序FS簡便反應(yīng)試劑盒(Ready Reaction kit)(AppliedBiosystems)，測定分離的克隆中的scFv基因VH和VL的DNA核酸序列。作為ELISA和序列分析的結(jié)果，將分離的克隆分為四類。這些之中，克隆IL6gk3-2具有分別如SEQ ID NOs1和3所示的VH和VL的核酸序列。
實施例5scFv的表達和回收以大腸桿菌HB2151表達、從大腸桿菌細胞質(zhì)組分回收并粗純化可溶性scFv。如果需要進一步純化，用RAPAS純化模塊(Purification Module)(PharmaciaBiotech)進行親合純化。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和以在scFv蛋白的C-末端的Etag抗原決定簇帶為靶的Western雜交來確定純化的scFv蛋白的純度。使用蛋白質(zhì)分析試劑盒(Protein Assay kit)(BIO-RAD)，來確定純化的scFv蛋白產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度。
實施例6通過SPR測量純化的scFv的親和力使用BIAcore(BIAcore)，通過SPR測量純化的scFv的親和力。結(jié)果測定出，作為在分離的克隆中有最高親和力的克隆IL6gk3-2，具有13×10-9M的解離常數(shù)(圖2)。
實施例7對IL-6依賴性細胞系的增殖應(yīng)答的影響對于純化的scFv，評定其對細胞系KT-3的IL-6依賴性增殖應(yīng)答的抑制活性，細胞系KT-3以IL-6依賴性方式進行增殖。在1.25至20ug/ml、來自克隆IL6gk3-2的純化scFv和IL-6(80pg/ml)的存在下，將以2×104細胞/200ul/孔制備的KT-3細胞培養(yǎng)四天，以通過胸腺嘧啶攝入來評估其DNA合成。結(jié)果顯示來自克隆IL6gk3-2的scFv，以濃度依賴性方式抑制KT-3細胞的增殖應(yīng)答(圖3)。
序列表<110>Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute<120>人的抗人白細胞介素-6抗體以及所述抗體的片段<130>663984<150>JP 2002-253036<151>2002-08-30<160>10<210>1<211>251<212>DNA<213>人源<400>1cag gtc aac tta agg gag tct ggg gga gac ttg gtc aag ccc gga ggg 48Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly5 10 15tcc cta aga ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc aga aag tat96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr20 25 30tac atg gcc tgg atc cgc cag gct cca ggg aag ggg ccg gag tgg ctt144Tyr Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu35 40 45tca acc att agt aac agc ggt gat ate ata gac tat gca gac tct gtg192Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60agg ggc cgg ttc tcc atc tcc agg gac aat gcc cag aag tca ctg tat240Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Lys Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg acc tcc ctg aga ccc gac gac tcg gcc atc tat tac tgt288Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Pro Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95gcg agg gaa tat ttc ttt tct ttt gat gtg tgg ggc cga ggg aca atg336Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met100 105 110gtc acc gtc tcc tea351Val Thr Val Ser Ser115
<210>2<211>117<212>PRT<213>人源<400>2Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr20 25 30Tyr Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu35 40 45Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ash Ala Gln Lys Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Glu Met Thr Ser Leu Arg Pro Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met100 105 110Val Thr Val Ser Ser115<10>3<211>324<212>DNA<213>人源<400>3gac atc gtg atg acc cag tct cca tct tct gtg tct gea teg gtg gga48Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly5 10 15gac aga gtc acc atc ttt tgt cgg gcg agt cag gat att agg aat tgg96Asp Arg Val Thr Ile Phe Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp20 25 30gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggt gag gcc cct aaa tta ttg atc 144Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tat gat gga tcg agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192
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<223>CDR1相應(yīng)于SEQ ID NO2中的31-35位氨基酸
<400>5Lys Tyr Tyr Met Ala1 5<210>6<211>17<212>PRT<213>人源<220>
<223>CDR2相應(yīng)于SEQ ID NO2中的50-66位氨基酸<400>6Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly1 5 10 15<210>7<211>8<212>PRT<213>人源<220>
<223>CDR3相應(yīng)于SEQ ID NO2中的99-106位氨基酸<400>7Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val1 5<210>8<211>11<212>PRT<213>人源<220>
<223>CDR1相應(yīng)于SEQ ID NO4中的24-34位氨基酸<400>8Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp Val Ala1 5 10<210>9<211>7<212>PRT<213>人源
<220>
<223>CDR2相應(yīng)于SEQ ID NO4中的50-56位氨基酸<400>9Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>人源<220>
<223>CDR3相應(yīng)于SEQ ID NO4中的89-98位氨基酸<400>10Gln Glu Ser Asp Ser Thr Pro Ile Thr Phe1 5 10
權(quán)利要求
1.結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗-人白細胞介素-6(以下稱作“IL-6”)抗體，或所述抗體的片段。
2.權(quán)利要求1的人的抗-人IL-6抗體或所述抗體的片段，其具有1.0×10-8或更低的解離常數(shù)。
3.編碼結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗-人IL-6抗體VH鏈的基因片段。
4.權(quán)利要求3的基因片段，其中所述VH鏈的互補決定區(qū)(CDR1至CDR3)具有以下氨基酸序列CDR1Lys Tyr Tyr Met Ala(SEQ ID NO5)CDR2Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly(SEQ ID NO6)CDR3Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val(SEQ ID NO7)
5.權(quán)利要求3或4的基因片段，其中所述VH鏈具有SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求4或5的基因片段，其中在所述VH鏈的氨基酸序列上，缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸。
7.編碼結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗體VL鏈的基因片段。
8.權(quán)利要求7的基因片段，其中所述VL鏈的互補決定區(qū)(CDR1至CDR3)具有以下氨基酸序列CDR1Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp Val Ala(SEQ ID NO8)CDR2Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser(SEQ ID NO9)CDR3Gln Gln Ser Asp Ser Thr Pro Ile Thr Phe(SEQ ID NO10)
9.權(quán)利要求7或8的基因片段，其中所述VL鏈具有SEQ ID NO4所述的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求8或9的基因片段，其中在所述VL鏈的氨基酸序列上，缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸。
11.編碼結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗體單鏈Fv(以下稱作“scFv”)的基因片段，所述的基因片段由與編碼權(quán)利要求7至10任一項的VL鏈的基因片段結(jié)合的編碼權(quán)利要求3至6任一項的VH鏈的基因片段組成。
12.編碼結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗體的基因片段，所述的基因片段由與人抗體CH鏈基因結(jié)合的編碼權(quán)利要求3至6任一項的VH鏈的基因片段，及與人抗體CL鏈基因結(jié)合的編碼權(quán)利要求7至10任一項的VL鏈的基因片段組成。
13.編碼結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗體的基因片段，所述的基因片段由與部分人抗體CH鏈基因結(jié)合的編碼權(quán)利要求3至6任一項的VH鏈的基因片段，及與部分人抗體CL鏈基因結(jié)合的編碼權(quán)利要求7至10任一項的VL鏈的基因片段組成。
14.權(quán)利要求13的基因片段，其中所述抗體片段選自Fab、Fab’或F(ab’)2。
15.編碼結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗體的基因片段，所述的基因片段由與部分人抗體CH鏈基因或部分人抗體CL鏈基因結(jié)合的編碼權(quán)利要求11的scFv的基因片段組成。
16.結(jié)合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗體或所述抗體的片段，其通過遺傳重組技術(shù)由表達載體表達，所述表達載體中插入了權(quán)利要求3至15任一項的基因片段。
17.權(quán)利要求16的人的抗人IL-6抗體或所述抗體的片段，其具有1.0×10-8M或更低的解離常數(shù)。
18.用于抑制IL-6和IL-6受體之間的結(jié)合的試劑，所述試劑包括作為活性成分的權(quán)利要求1至17任一項的人的抗人IL-6抗體或所述抗體的片段。
19.用于預(yù)防或治療由人IL-6與人IL-6受體之間的結(jié)合引起的炎癥或免疫性疾病的藥物，所述藥物利用權(quán)利要求18的抑制結(jié)合的試劑。
全文摘要
提供治療涉及白細胞介素－6(IL－6)的免疫性疾病的活性物質(zhì)。使用噬菌體抗體技術(shù)，可獲得對人IL－6高度親合的人的抗人IL－6抗體和人的抗人IL－6抗體的片段?？梢灶A(yù)期所述抗體和抗體片段可作為治療由IL－6引起的炎癥和免疫性疾病的藥物。
文檔編號C07K16/24GK1678744SQ0382033
公開日2005年10月5日 申請日期2003年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者杉村和久, 吉崎和幸, 中島敏博, 佐佐木巧 申請人:財團法人化學(xué)及血清療法研究所