專利名稱：組織工程食用肉及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)和獲得食用肉產(chǎn)品。更具體地，本發(fā)明是關(guān)于組織工禾呈食用肉(tissue engineered meat for consumption )。
技術(shù)背景肉產(chǎn)品如牛肉、豬肉、羊肉、家禽或魚，是食品消費中受歡迎的產(chǎn)品。 目前，肉產(chǎn)品都是取自動物，這種生產(chǎn)方法非常低效，因為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中全 部糧食的很大一部分被用于飼養(yǎng)動物，而不是被人類食用。例如，在美國， 家畜祠料約占全部的小麥、玉米以及其它糧食生產(chǎn)的70%。此外，為了生 產(chǎn)一磅牛肉，動物飲用和種植家畜飼料需要數(shù)千磅的水。同時，據(jù)統(tǒng)計， 全世界超過八億人營養(yǎng)不良，并且每天有五萬人被餓死。目前的肉類生產(chǎn)方法還會危害環(huán)境。熱帶雨林正在以培育一磅牛肉大 約需要消耗500平方英尺熱帶雨林的速度減少。同樣地，用于捕撈海洋生 物的現(xiàn)代化技術(shù)非常有效，以致于海洋和湖泊都被過度捕撈。曾經(jīng)很普通 的物種現(xiàn)在已經(jīng)頻臨滅絕或者已經(jīng)滅絕。為解決這些問題，目前科研工作的重點是集中在提高繁殖或培育家畜 的效率上。例如，使用生長激素來加快家畜生長，這樣可以消耗較少的糧 食和水。生長激素通常被注入家畜，但也已開發(fā)出了新的生長激素引入方 法，其采用基因工程技術(shù)如轉(zhuǎn)基因動物或克隆動物。然而，目前的肉類生 產(chǎn)方法仍需要水、糧食以及土地來飼養(yǎng)家畜。目前的肉類生產(chǎn)方法的另一個問題是食品污染問題。平均起來，每年 因為攝入的某些東西而導致美國人均生病一次并且有9000人死亡。為了控 制食品污染，政府目前的策略是在加工過程中檢驗肉。然而，美國農(nóng)業(yè)部 和美國食品藥物管理局很少調(diào)控產(chǎn)生此類病原體的農(nóng)場，因為它們?nèi)鄙僬{(diào) 控農(nóng)場的權(quán)力。然而，除了埃布氏菌(￡. co/W/56 ://7)之外，其它危險 細菌被合法地認為是生肉中"固有的"。然而，"固有細菌"中的其中兩種—— 弧形桿菌和沙門氏菌——占由食用肉和家禽導致的所有疾病的80%和所有 死亡的75%。例如據(jù)報道，在家禽業(yè)的沙門氏菌檢驗中，大約25%的肉用仔雞和45% 的庭院雞只呈陽性。疾病控制中心估計，所有雞只的70-90%感染了弧形桿 菌?；⌒螚U菌感染導致抽筋、血痢疾以及發(fā)燒。在美國，每年弧形桿菌感 染造成大約800人死亡?；⌒螚U菌的感染還可能導致格林-巴利綜合癥，這 種疾病需要特護治療幾個星期。隨著更多的抗生素抗藥性菌林的產(chǎn)生，由 這些細菌引起的嚴重疾病和死亡的發(fā)生頻率將更加增多。這使許多科學家 開始對繼續(xù)使用抗生素作為家畜伺料添加劑產(chǎn)生疑問。因此，需要提供一種比現(xiàn)有生產(chǎn)方法更有效、更安全、更健康的食用 肉產(chǎn)品生產(chǎn)方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是關(guān)于組織工程食用肉產(chǎn)品以及用于生產(chǎn)這種肉產(chǎn)品的方法。 在一種具體實施方式
中，本發(fā)明的肉產(chǎn)品包括體外(exvivo)培育的肌肉 細胞。這些肌肉細胞可以4皮培育和附著到一個支撐結(jié)構(gòu)上，而且肌細胞可 以源自任何的非人類細胞。在一種優(yōu)選的具體實施方式
中，本發(fā)明的肉產(chǎn) 品充分地遠離任何有害孩i生物或寄生物污染。本發(fā)明的另 一種具體實施方 式涉及一種包括肌肉細胞和其它細胞如脂肪細胞和/或軟骨細胞的肉產(chǎn)品， 這些其它細胞與肌肉細胞一起在體外培育。在又一種具體實施方式
中，本
發(fā)明的肉產(chǎn)品包括曾經(jīng);波暴露于電流或振蕩電流(electric or oscillating current)的月幾肉細月包。
具體實施方式
通常，肉產(chǎn)品取自動物的肌肉。屠夫相應地切割牛肉、家禽、羊肉、 魚或豬肉以便作為牛排、雞胸脯、羊肉片、魚柳、豬排等出售。肉產(chǎn)品還 包括肉產(chǎn)品的派生物，如可以加工成肉丸、漢堡肉餅、魚丸、香腸、意大 利臘腸(salami)、大紅腸(bologna)、火腿等。肉產(chǎn)品還可以包括肌肉組 織或者被風干或干縮的肉，如牛肉干。本發(fā)明的一種具體實施方式
包括一種生產(chǎn)可食用的肉產(chǎn)品的方法。該 方法可以包括在體外(in vitro)培養(yǎng)肌肉干細胞，并在體外(ex vivo )將 這些細胞分化成具體的肌肉細胞類型，如骨骼肌肉細胞或平滑肌肉細胞。肌 肉細胞可以來源于任何被人類食用的非人類動物，如哺乳動物(例如牛、 水牛、豬、羊、鹿等)、鳥類(例如雞、鴨、駝鳥、火雞、雉雞等)、魚 類(例如旗魚、鮭魚、金槍魚、海妒、鱒魚、鯰魚等)、無脊推動物(例 如龍奸、螃蟹、壞、蛤、牡蠣、貽貝、海膽等)、爬行動物(例如蛇、聘 魚、海龜?shù)?以及兩棲動物(例如青蛙)。優(yōu)選地，肌肉細胞來源于可以 生出肌肉細胞、脂肪細胞、骨細胞以及軟骨細胞的多能胚胎間充質(zhì)干細胞 (pluri-potent embryonic mesenchymal stem cells)。月幾肉細月包還可以來源于 全能胚胎干細胞(loti-potent embryonic stem cells ),如來自這些動物的胚 球(blastocyte stage)、受精卵、胎盤或臍帶的細胞。肌肉細胞可以在培養(yǎng)基中被培育成附著在一個支撐結(jié)構(gòu)上的肌肉組 織，如二維或三維的腳手架(scaffold)或支撐結(jié)構(gòu)。肌肉細胞可以在二維支 撐結(jié)構(gòu)上如皮氏培養(yǎng)皿中形成多層培育的細胞，這些多層細胞可以被剝下 并加工食用。二維支撐結(jié)構(gòu)的其它例子可以包括多孔隔膜，多孔隔膜允許
養(yǎng)分從隔膜一側(cè)的培養(yǎng)基擴散到附著細胞的另 一側(cè)。在這類培養(yǎng)條件中， 將細胞暴露于隔膜兩側(cè)的培養(yǎng)基可以獲得更多的細胞層，也就是，細胞既 接受從隔膜的一側(cè)擴散來的養(yǎng)分，也接受覆蓋著隔膜上培育的細胞的培養(yǎng) 基中的養(yǎng)分。肌肉細胞還可以被培育在三維的支撐結(jié)構(gòu)上或者繞著三維的支撐結(jié) 構(gòu)培育或者培育在三維的支撐結(jié)構(gòu)內(nèi)部。根據(jù)需要，這類支撐結(jié)構(gòu)可以設 計成不同的大小、外形和形態(tài)，如果需要，可以使被培育的肌肉細胞形成 與不同類型的肌肉組織相應的外形和形態(tài)，如牛排、(牛、羊等的)腰部 嫩肉、脛、雞胸脯、雞腿、羊肉片、魚柳、龍蚱仁等。支撐結(jié)構(gòu)可以由天 然的或者合成的生物材料制成，優(yōu)選選用無毒的材料，以便即使它們被吃 下的時候也不會帶來危害。例如，天然生物材料可以包括膠原蛋白、纖連蛋白(fibronectin)、昆布氨酸(laminin)或其它的細胞外基質(zhì)。例如，合成 生物材料可以包括羥基磷灰石、藻酸鹽、聚乙二醇酸(polyglycolicacid)、 聚交酯酸(polylactic acid)或它們的共聚物。本發(fā)明的支撐結(jié)構(gòu)可以被設計 成固體或半固體支撐。為了獲得最佳的細胞和組織培育，優(yōu)選地，本發(fā)明的支撐結(jié)構(gòu)具有較 高的孔隙率，以便為細胞附著提供最大的表面區(qū)域。在一種三維的支撐結(jié) 構(gòu)中，可以將其模鑄成包括一個分枝脈管網(wǎng)絡(branched vascular network )， 以便向肉產(chǎn)品內(nèi)部的細胞遞送養(yǎng)分以及將這些細胞的新陳代謝產(chǎn)物排出。 在這種具體實施方式
中，采用上述無毒的天然或合成生物材料制成的分枝 脈管網(wǎng)絡是可以食用的。此外，該支撐結(jié)構(gòu)還可能包括粘附的肽(adhesion p印lides)、細胞附著分子或者與該支撐結(jié)構(gòu)以共價或非共價聯(lián)結(jié)的其它生 長因子。肽的例子包括如Ai'g-Gly-Asp或Arg-Glu-Asp-Val的氨基酸序列。請 參閱Niklason， L等人在移植免疫學5(4):303-306 (1997)中發(fā)表的J&f^4', 趟逸歡/^逾歡工擺迷#,.此處將該文獻的全文作為參考。
另一方面，這些肌肉細胞的培養(yǎng)條件可以包括靜態(tài)的、攪動的或動態(tài) 流動的培養(yǎng)條件。為了大幅度地提高產(chǎn)量，優(yōu)選的方法是采用生物反應器， 其可以生產(chǎn)大量的細胞，并可以較好地控制養(yǎng)分、氣體、新陳代謝產(chǎn)物以 及調(diào)節(jié)分子的流動。此外，生物反應器可以提供物理的和機械的信號，如壓縮，以便于刺激細胞而產(chǎn)生特定的生物分子。見Vacanti, J等人在Lancet 354S叩pl. 1，pSI32-34(1999)中發(fā)表的逸歡工趕..手術(shù)'fi^^移控W W沒^";^^道。此處將該文獻的全文作為參考。在本發(fā)明的另 一種實施方式中，肉產(chǎn)品來源于體外培育的肌肉細胞， 其可以包括來源于任何非人類動物的脂肪細胞。較肥的肉通?？谖侗容^ 好，但其具有較高的脂肪含量，而對健康的威脅較大，如心臟病。因此， 肌肉細胞與脂肪細胞的比例可以在器皿中調(diào)節(jié)，以便生產(chǎn)出具有最佳口味 和健康效果的肉產(chǎn)品。這種調(diào)節(jié)可以通過控制最初種植(seeded)在培養(yǎng) 基內(nèi)的肌肉細胞與脂肪細胞的比率來完成，和/或根據(jù)需要通過改變對肌肉 細胞或脂肪細胞起作用的生長因子或分化因子(differentiation factors)的 濃度和比率改變來完成。在本發(fā)明的另一種實施方式中，來源于軟骨細胞的軟骨可以首先形成 與支撐結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起的底支撐層或結(jié)構(gòu)。然后，肌肉細胞和/或脂肪細胞， 可以被種植在軟骨細胞層上。肌肉細胞與軟骨細胞的相互作用可以進一步 提供組織形成所需的必要調(diào)節(jié)信號。具有肌肉細胞和軟骨細胞的肉產(chǎn)品的 例子包括雞胸脯或豬排骨。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，可以采用無菌^L術(shù)來培養(yǎng)最終形成 肉產(chǎn)品的肌肉細胞，以使肉產(chǎn)品基本上不含有害的微生物，如細菌、真菌、 病毒、朊病毒、原生動物或它們的組合。有害的微生物可包括致病型微生 物，如沙門氏菌、弧形桿菌、埃布氏菌E.co/L0/56:l/7等。此外，在培養(yǎng)基 中培育的肌肉細胞可以基本上不含寄生蟲，比如絳蟲，其可以感染所有動物的肌肉，并在人類食用未充分煮熟的肉時而轉(zhuǎn)移給人類。在當肉產(chǎn)品離 開生物生產(chǎn)線時進行包裝時，也可以無菌技術(shù)。這樣的質(zhì)量保證可以采用 現(xiàn)有技術(shù)中已知的針對微生物或化學物的標準檢驗方法進行監(jiān)控。"基本上 不含"是指微生物或寄生蟲的濃度低于污染物臨床意義水平，也就是，低于 即使一旦攝入將導致疾病或危害健康的水平。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，來源于體外培育的肌肉細胞的肉 產(chǎn)品可以被暴露于電流或者振蕩電流。不同于來自動物身體上的肌肉組 織，體外或器皿培育的肌肉組織可能從來沒有運動過(例如從來未被用于 移動腿)。因而，將器皿中的肌肉細胞、肌肉組織或肉產(chǎn)品暴露于電流或 振蕩電流，可以模仿運動，使得體外培育的肉與動物身體上的肉在質(zhì)地上 更加相似。電流或振蕩電流還可以提高肌肉細胞體外生長速度。電流或振 蕩電流可以被施加于肌肉干細胞或者從干細胞分化出的肌肉細胞。在本發(fā)明的另一種實施方式中，可以添加源于動物身體的肉產(chǎn)品所缺 少的其它養(yǎng)分如維生素等，以提高本發(fā)明肉產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。這既可以通 過直接向培育基中增加養(yǎng)分來實現(xiàn)，也可以通過遺傳基因工程技術(shù)實現(xiàn)。例如，可以在培養(yǎng)的肌肉細胞中轉(zhuǎn)染用于合成特定維生素(如維生素D、 A 或者不同的維生素B復合物)的酶基因，以生成特定維生素。在本發(fā)明的另一種實施方式中，調(diào)節(jié)因子、生長因子或其它基因產(chǎn)品 也可以通過基因技術(shù)51入到肌肉細胞中。已知這些被稱為肌原性調(diào)節(jié)因子 (myogenic regulatory factors,簡稱MRFs )的因子，可以刺激和調(diào)節(jié)生物 體內(nèi)肌肉的生長，但通常情況下，生物體內(nèi)或器皿中的肌肉細胞并不產(chǎn)生 這些因子。因此，通過在培養(yǎng)的肌肉細胞中表達肌原性調(diào)節(jié)因子，可以提 高器皿中肌肉細胞的產(chǎn)量。在本發(fā)明的另 一種實施方式中，來源于器皿中肌肉細胞的肉產(chǎn)品包括 不同的肉產(chǎn)品衍生物。例如，這些衍生物可以通過將器皿中培育的肌肉組混合適當?shù)恼{(diào)味品，制成肉丸、魚丸、漢堡肉餅等。 例如，該衍生物還可以通過將肌肉細胞切割成層并加上香料，制成牛肉干、 火腿、大紅腸、意大利臘腸等。因此，本發(fā)明的肉產(chǎn)品可以用來加工形成 動物肉可制成的任何類型的食品。下列的實施例揭示了本領域的技術(shù)人員如何使用本發(fā)明在器皿中生 產(chǎn)肉產(chǎn)品。細胞生物學、細胞培養(yǎng)以及免疫組織化學技術(shù)在本文中沒有明 確地描述，因為它們已經(jīng)在科技文獻中被充分地報道過了 。實施例l本實施例描述了如何分離多能間充質(zhì)干細胞，以用于在器亞中生產(chǎn)肉 產(chǎn)品。間充質(zhì)干細胞可以產(chǎn)生出肌肉細胞、脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞。 間充質(zhì)千細胞可以從任何非人類的動物胚胎的胚胎組織的切片中分離出 來。例如，在牛身上，富有多能肌肉干細胞的胚胎間葉組織優(yōu)選地是在第30天至40天或者更早地從胚胎分離出來。分割或切片后，胚胎組織可以在 PH值為7.45的磷酸緩沖鹽(簡稱PBS)中切碎成尺寸大約為lmmx lmm的 小片。五到十片被切碎的組織在含0.25%胰島素和0.1% EDTA的300pl PBS 中，于37"C下平緩"^貨動孵育三十分鐘。然后，該組織可以通過重力或者輕 微的離心分離而沉積在試管的底部。然后，抽走包含胰島素/EDTA溶液的 上清液，并置換為含0.1免膠原酶的300nlPBS,再在37()C處理10到3()分鐘。 根據(jù)需要，膠原酶消化可以被重復幾次循環(huán)。取決于溶液的粘性(源自被 破壞的細胞釋放的DNA),在兩次循環(huán)之間，可以在膠原酶溶液中添加4()pl 含l mg/ml DNase (脫氧核糖核酸酶)的PBS。這種反應可以通過添加介質(zhì)來停止，如DMEM或者Ham's F-12,或者 兩者l:l的混合物(購自生命技術(shù)公司，羅克維爾，馬里蘭州)，并補充IO mM的Hepes、 2 mM的L-谷氨酰胺(Sigma - Aldrich ) 、 10-20%熱滅活的牛 胎血清或牛血清(Hyclone實驗室，洛根，猶它州)、100單位/ml的青霉素1
以及100嗎/ml的鏈霉素("完全介質(zhì)，，)。輕輕地上下吸移(pipetting)這些 組織，然后采用離心分離機在完全介質(zhì)中洗滌這些細胞一次或兩次，使細 胞可以完全被解離。然后細胞可以被安置到適當大小的、可以涂敷天然生 物材料(例如膠原質(zhì)、纖連蛋白、昆布氨酸或其它的細胞外基質(zhì))或者合 成生物材料(例如羥基磷灰石、藻酸鹽、聚乙二醇酸、聚交酯酸或它們的 共聚物)或者兩者的皮氏培養(yǎng)皿中，在37^培育并用5%的(:02進行平衡。實施例2在間充質(zhì)干細胞被分離后，為了獲得成肌肉細胞(myoblasts)或肌肉 干細胞，它們可以在培養(yǎng)基中進行富集。最初，在如實施例l所述的解離 和洗滌之后，細胞可以分別承載在不同的皮氏培養(yǎng)皿中。采用60毫米的皮 氏培養(yǎng)皿，細胞可以首先在完全介質(zhì)中被賻育二到四個小時。在這個過程中，上皮細胞將往往傾向于快速地附著到皮氏培養(yǎng)亞上，而成肌細胞仍保 留在上清液中。然后收集上清液，成肌細胞可以被承載在涂敷著天然或合 成生物材料的不同的皮氏培養(yǎng)皿上，如實施例l提到的那些生物材料。成 肌細胞可以通過補充具有生長因子如骨骼肌生長因子、前列腺素F2。(簡稱 PCiF2l,)以及胰島素類生長因子I (簡稱1GF-1)的培養(yǎng)介質(zhì)而被富集。進一步地，成肌細胞可以通過在完全介質(zhì)中培養(yǎng)或者在較小介質(zhì)中 (如比完全介質(zhì)缺少胎兒牛血清)培養(yǎng)并補充肌肉特定的生長或分化因 子，如濃度范圍為24 pg/ml到28 1%/1^1的？。？2"以及10-6 M到1(T5 M的胰島 素，而被分化成特定的肌肉細胞。為了最接近地模仿動物體內(nèi)的肌肉細胞， 其通常被神經(jīng)細胞支配，培養(yǎng)介質(zhì)中還可以補充適當?shù)纳窠?jīng)傳遞素，如乙 酰膽堿。實施例3或者，成肌細胞可以從全能胚胎干細胞中進行富集。全能細胞可以取 自器皿中采用體外受精技術(shù)的動物受精卵、臍帶或胎盤中的干細胞、或者 取自從胚泡期細胞中分離出來的胚胎干細胞(ES)。例如，收集ES細胞， 用胰島素溫和地解離，并且用重組細胞白血病抑制因子(Chemicon,圣地 亞哥，力口州)以及飼養(yǎng)細胞如生長滯留胚胎纖維原細胞(growth arrested embryonic fibroblasts cell's )在器皿中培養(yǎng)。這些全能細胞可以用生長因子 處理，如PGF^或IGF-I，以便誘使這些細胞分化成不同的成肌細胞。實施例4釆用標準的免疫組織化學或原位(in-situ)雜交4支術(shù)，識別成肌細胞 或肌肉細胞。簡單地講，在培養(yǎng)基中培育的成肌細胞或肌肉細胞被轉(zhuǎn)移到 涂敷著適當?shù)那懊嫠龅募毎饣|(zhì)的載玻片上。采用前面所述的條件， 這些細胞被培育成所需的數(shù)量并進行分化。在充分生長和分化階段以后， 這些細胞可以混合4%的曱醛。若釆用細胞內(nèi)抗體標記或者核香酸探針，該 細胞隔膜可以滲透1%的三硝基苯酚-40 (NP-40)或三硝基曱苯-X (Tritoii-X)。成肌細胞或肌肉細胞特異性標記的抗體，如可以從Sigma⑧ 獲得的肌漿球蛋白、titin、阿爾法-輔肌動蛋白，可以通過采用標準的熒光 免疫組織化學技術(shù)用于識別這些細胞?？蛇x擇地，用于這些標記的單鏈的 RNA或DNA探針也可以被用在原位雜交中。此外，當肌肉細胞已經(jīng)附著到后面所述的三維支撐結(jié)構(gòu)上時，它們可 以被冷凍、分割以及采用抗體標記進行識別，如可以從51811^@獲得的針對 肌漿球蛋白、titin、 12101、肌釣蛋白T、阿爾法-輔肌動蛋白的抗體。實施例5二維或三維腳手架或支撐可以由天然的生物材料(例如>9交原質(zhì)、纖連 蛋白、昆布氨酸或其它的細胞外基質(zhì))或者合成的生物材料(例如羥基磷 灰石、藻酸鹽、聚乙醇酸、聚交酯酸以及它們的共聚物)制造，或者由天 然生物材料與合成生物材料一起制造。優(yōu)選地，三維腳手架被制造成具有 分支路徑，以用于使養(yǎng)分和培養(yǎng)基到達該形成的肌肉組織內(nèi)部。這些腳手
架的原料和構(gòu)造方法的示例由以下美國專利揭示第5，686，091號，名稱為"用于細胞移植的可生物降解的泡沫材料"；第5，863,984號，名稱為"包括復合生物高聚物的生物穩(wěn)定的多孔滲水材料"；第5，770,417號，名稱為"用于 在動物體上生產(chǎn)脈管組織的包含附著細胞的三維纖維腳手架"；以及第5，916,265號，名稱為"用作細胞種植腳手架和植入器的生物學細胞外基質(zhì)的 生產(chǎn)方法"。這些專利在這里被全文引用以作參考。支撐結(jié)構(gòu)優(yōu)選地被制造成不同的大小、形態(tài)和格式以便使肌肉組織的 生長對應于不同類型的肉產(chǎn)品，比如牛排、(牛、羊等的)腰部嫩肉、脛、 雞胸脯、雞腿、羊肉片、魚柳、龍奸仁等。實施例6脂肪細胞、軟骨細胞和造骨細胞都能夠從多能間充質(zhì)干細胞或全能胚 胎干細胞中分化出來。這些干細胞可以如實施例1或3所述被分離。這些干 細胞可以在DMEM或Ham's F 12或上述兩者1:1混合物中培養(yǎng)。培養(yǎng)介質(zhì)可 以補充曱狀腺激素、鐵傳遞蛋白、胰島素以及其它生長因子，如類胰島素 生長因子(簡稱GF)、基本纖維原細胞生長因子以及培育激素。對于脂肪細胞，分化可以通過使用骨形態(tài)生成蛋白(簡稱BMP)處理 干細胞來實現(xiàn)，如BMP-4和BMP-2，已知它們用于誘發(fā)脂肪細胞系 (lineages)。見Ahrens爭人在DNA細胞生物學12:871-880 (1993)中發(fā)表的: 人類矛并成形素奢^U4'蛋^資一在薦邦河葉趟源C^/( 77/2細應^的 乂這/鄉(xiāng)效-.顯不^W河Y^f/入為V6'; Wang等人在生長因子9:57 (1W3)中發(fā)表的#興成在C //^77/2和3"勿應*諸發(fā)乂 # 在這里引用這些文獻的全文作參考。除了BMP之外，脂肪細胞的分化還可以采用過氧物酶體活性多育曲菌 素受體伽馬的佶才元齊ij (agonist of peroxisome proliferator-activated receptor gamma,簡稱PPAR gamma)如BRL 49653 (rosiglitazone)來加強。見Sottile
和S函en在FEBS Lett 475(3):201-204 (2000)中發(fā)表的與B/ L邦653 (VoA7'g"tozone ，錄^的矛并A形素蛋^ j-2刺淡河pf豚體勿應的腐嚴差藥 "f〃/w^"Z(: J為VA。此處將該文獻的全文作為參考。在某些情形下，通過采用長鏈脂肪酸(簡稱LCFA )或者 "iiaz"lidinedionc或者兩者一起處理成肌細胞或月幾肉衛(wèi)星細胞，成肌細胞 甚至可以被誘導而轉(zhuǎn)分化(trans-differentiate )成成脂細胞(脂肪細胞前體)。 Grimaldi等人，成應勿應^^^poWas" ^#為、化；^^^"凝^^/azo/W/"e^owej 邦^f發(fā)'效果，前列腺素Leukot Essent脂肪酸57(1):71-75 (1997); Teb()ul等人， 771/a加/Wwe^ow^和^^"邀^戲炎齊^勿應脊換4'類 嚴#取敏，J. Biol. Chcm. 27()(47):28183- 28187 (1995)。在這里引用這些文獻的全文作參考因此，通過以某一比例種植和共同培養(yǎng)肌肉細胞及脂肪細胞，可以生 產(chǎn)出具有所需脂肪含量的肉產(chǎn)品?？蛇x擇地，干細胞允許最初被分化成成 肌細胞，稍后，LCFA或thiadoIidinediones以不同濃度和不同暴露時間被添 加，以便按照所需方式將成肌細胞轉(zhuǎn)分化成脂肪細胞。此外，肌肉細胞和 脂肪細胞的生長可以通過控制生長濃度和分化因子進行調(diào)節(jié)。例如，若最 終肉產(chǎn)品中需要較少的脂肪細胞，可以向培養(yǎng)介質(zhì)中添加較小的BMP因子 濃度，同時可以添加較高濃度的PGF加和/或胰島素以促進肌肉細胞生長。實施例7軟骨細胞還可以從動物膝蓋或者胸廓分離得到。采用與實施例l類似 的技術(shù)，從膝蓋或者胸廓分割的組織可以被切碎、被膠原酶消化以及被完 全介質(zhì)洗滌。然后這些細胞被分別地承載，以便增加軟骨細胞的純度。已知軟骨細胞會響應機械應力而進行分化。因此，優(yōu)選地，這些細胞 可以接受剪切流壓力的作用，如美國專利第5,928，945號所述，其名稱為"向 軟骨細胞或軟骨干細胞施加剪切流壓力以生產(chǎn)軟骨"，在這里引用該專利 全之作為參考。
軟骨細胞可以在三維腳手架中最初形成第一層支撐細胞。然后，成肌 細胞和/或脂肪細胞可以被種植到軟骨細胞層上，并被培育成所需的尺寸。 這樣，軟骨細胞層可以向肌肉細胞提供額外的支持或生長因子。實施例8器皿中培育的肌肉細胞不同于動物體內(nèi)成長的肌肉細胞，因為動物體 內(nèi)的肌肉細胞在活動或者肢體運動的過程中被使用。由于動物體的肌肉被 使用，肌肉細胞，例如四肢中的肌肉細胞，依照四肢的運動被收縮和放松。 因此，為了更近似地模仿動物體上的肌肉細胞的生長，在器皿中培育的細 胞可以被暴露于電流或振蕩電流，或者電流或振蕩電流的脈沖，以便收縮 肌肉細胞。電子探針可以被浸入培養(yǎng)介質(zhì)中，以便遞送輕緩電流?？蛇x擇 地，支撐結(jié)構(gòu)可以被涂敷導電材料。導電材料及其向支撐結(jié)構(gòu)上的涂敷方 法的示例由美國專利第5,843,741號揭示，其名稱為"在導電聚合體上改變支 撐依附細胞分化的方法"，在這里引用該專利的全文作為參考。前述的實施例描述了在體外生產(chǎn)肉產(chǎn)品的方法。這些實施例只是用于 舉例說明，而不是對本發(fā)明的限制?？梢岳斫?，在這些實施例的基礎上進 行的修改和結(jié)合，都沒有偏離本發(fā)明的精神。
權(quán)利要求
1、一種可食用的非人類的肉產(chǎn)品，其包括體外培育的非人類的肌肉細胞。
2、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其進一步包括一支撐結(jié)構(gòu)， 其中，所述的非人類的肌肉細胞附著在該支撐結(jié)構(gòu)上。
3、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的肌 肉細胞是骨骼肌肉細胞。
4、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的肌 肉細胞來源于選自如下一組中的動物哺乳動物、禽類、魚類、無脊推動 物、爬行動物以及兩棲動物。
5、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的肉 產(chǎn)品基本上不含有害微生物污染物。
6、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的肌 肉細胞來源于多能細胞或全能細胞。
7、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的肌 肉細胞被暴露于電流中處理過。
8、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其進一步包括體外培育的 非人類的脂肪細胞。
9、 如權(quán)利要求8所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的脂 肪細胞是從非人類的成肌細胞中轉(zhuǎn)分化而得到的。
10、 如權(quán)利要求8所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的脂 肪細胞來源于多能或全能非人類的干細胞。
11、 如權(quán)利要求1所述的非人類的肉產(chǎn)品，其進一步包括體外培育的 非人類的軟骨細胞。
12、 如權(quán)利要求10所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的 軟骨細胞位于一支撐結(jié)構(gòu)與所述的非人類的肌肉細胞之間。
13、 如權(quán)利要求10所述的非人類的肉產(chǎn)品，其中，所述的非人類的 軟骨細胞被暴露于機械應力中處理過。
14、 一種生產(chǎn)可食用的非人類的肉產(chǎn)品的方法，其包括如下步驟 體外培養(yǎng)非人類的肌肉干細胞；將所述的非人類的肌肉干細胞種植到一支撐結(jié)構(gòu)上；以及 培育所述的非人類的肌肉干細胞，以生產(chǎn)非人類的肉產(chǎn)品。
15、 如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述培育非人類的肌肉干細 胞的步驟包括將所述非人類的肌肉干細胞分化成不同類型的非人類的肌肉細胞。
16、 如權(quán)利要求14所述的方法，其進一步包括 將所述的非人類的肌肉細胞暴露于電流或振蕩電流中進行處理。
17、 如權(quán)利要求13所述的方法，其進一步包括 添加養(yǎng)分，以便其被結(jié)合到所述非人類的肉產(chǎn)品中。
18、 如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述的非人類的肌肉細胞來 源于選自于如下一組的動物中哺乳動物、禽類、魚類、無脊推動物、爬 4亍動物以及兩棲動物。
19、 如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述的非人類的肉產(chǎn)品基本 上不含有害微生物污染物。
20、 一種生產(chǎn)可食用的非人類的肉產(chǎn)品的方法，其包括如下步驟 體外共同培養(yǎng)非人類的肌肉細胞和非人類的脂肪細胞； 將所述的非人類的肌肉細胞和所述的非人類的脂肪細胞種植到一支撐結(jié)構(gòu)上；以及培育所述的非人類的肌肉細胞和所述的非人類的脂肪細胞，以生產(chǎn)非 人類的肉產(chǎn)品。
21、 一種生產(chǎn)可食用的非人類的肉產(chǎn)品的方法，其包括如下步驟 體外培養(yǎng)非人類的肌肉干細胞；將所述的非人類的肌肉干細胞種植到一支撐結(jié)構(gòu)上； 采用脂肪酸處理所述的非人類的肌肉干細胞，以便將所述的非人類的 肌肉干細胞轉(zhuǎn)分化成脂肪細胞；以及培育所述的脂肪細胞，以生產(chǎn)非人類的肉產(chǎn)品,
22、 一種生產(chǎn)可食用的非人類的肉產(chǎn)品的方法，其包括如下步驟 體外培養(yǎng)非人類的軟骨細胞； 將所述的非人類的軟骨細胞種植到一支撐結(jié)構(gòu)上； 在所述支撐結(jié)構(gòu)上或其周圍，將非人類的肌肉細胞與所述的非人類的軟骨細胞一起培養(yǎng)；以及培育所述的非人類的肌肉細胞，以生產(chǎn)非人類的肉產(chǎn)品。
23、 如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述的非人類的軟骨細胞被 暴露于機械應力中處理過。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非人類的組織工程肉產(chǎn)品以及用于生產(chǎn)這種肉產(chǎn)品的方法。該肉產(chǎn)品包括可食用的體外培育的肌肉細胞。這些肌肉細胞可以被培育和附著到一個支撐結(jié)構(gòu)上，其可以來源于任何的非人類細胞。該肉產(chǎn)品還可以包括其它細胞，如脂肪細胞和/或軟骨細胞，它們與肌肉細胞一起體外培育。
文檔編號A23B4/00GK101132803SQ200480044017
公開日2008年2月27日 申請日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者喬恩·維恩 申請人:喬恩·維恩