專利名稱：血清淀粉酶試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于測量體內(nèi)血液特性的制劑及方法特別是涉及血清淀粉酶試劑盒及制備方法背景技術(shù)早在1929年，Elman就確立了血清淀粉酶(Amy)在急性胰腺炎診斷上的價值。測定總活性的方法分四類，第一類測定底物淀粉的消耗量由粘度法、濁度法、碘-淀粉法，此類方法準確度差，敏感度低；第二類為生糖法，測定產(chǎn)物葡萄糖；第三類為色原底物分解法，染料與不溶性淀粉結(jié)合成色原底物(俗稱染色淀粉)，在Amy催化下隨著淀粉的降解游離出染料，測染料的含量，此類方法需特殊儀器，應(yīng)用不廣。第四類為酶偶聯(lián)法用組成確定的淀粉酶底物及輔助酶與指示酶系統(tǒng)檢測淀粉酶，可改進反應(yīng)的化學計量關(guān)系，有利于實現(xiàn)連續(xù)檢測及應(yīng)用國際單位。α-Amy水解小分子寡糖所得產(chǎn)物比水解淀粉更為確定。國內(nèi)倪星忠等報道了采用NaN3為激活劑的直接測定法。發(fā)表在1996年臨床檢驗雜志第六期上，此方法以氯硝基苯麥芽糖為底物，因其交叉污染等原因，使假陽性增多。1998年國際臨床化學學會(IFCC)批準了以4-硝基酚-α-D-麥芽三糖為底物檢測α-Amy方法，該法具有良好的準確度、精密度。IFCC參考方法中A底物為4-硝基酚-α-D-砒喃葡萄糖苷酶，wako公司試劑盒，溫度T為30℃，PH為7.1。BBoehringer Manheim公司產(chǎn)品α-Amy試劑盒、底物為亞乙基-[4-硝基酚(G1]-α-D-麥芽七糖苷，輔酶，α-葡萄糖苷酶，溫度T為30℃，PH為7.1。
另外Klaus Lorentz建立的應(yīng)用保護的亞乙基-4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷(EPS_-G7)檢測α-Amy的方法中溫度T為30℃，PH為7.0，酶工作液含酶6.2mmol/L。
因4-硝基酚(4-NP)的解離隨溫度升高而升高，但現(xiàn)在測試溫度為30℃，較低，故而影響α-Amy的催化降解反應(yīng)，延滯時間長，線形范圍窄，不適應(yīng)常規(guī)分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題而提供一種血清淀粉酶試劑盒及其制備方法。
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是一種血清淀粉酶試劑盒，其包括緩沖液、底物液及酶貯存液，其緩沖液中NaCl含量為70mmol/L，Cacl2含量為1.0mmol/L，N-2羥乙基哌嗪-N’-乙基磺酸(HEPES)含量為50mmol/L，底物液中底物為亞乙基-4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷(EPS-G7)含量為3.5mmol/L、酶貯存液中α-葡萄糖苷酶含量為60U/ml，人血清白蛋白含量為20g/L。
所述的血清淀粉酶試劑盒，其試劑盒測試時溫度為37℃，緩沖液PH為7.15，酶工作液中酶含量為7.1U/ml。
所述血清淀粉酶試劑盒中試劑的制備方法a.緩沖液的制備方法將1.02gNaCl、2.98gN-2羥乙基呱嗪-N-乙基磺酸(HEPES)溶于約220ml蒸餾水中，加入0.07ml 258mmol/L CaCl2，37℃下用約24ml 0.2mmol/L NaOH調(diào)節(jié)PH值到7.15，準確加水至250ml；b.底物液的制備方法將157mgEPS-G7溶于1液中，準確加至100ml；c.酶貯存液的制備方法將含量25U/mg，37℃的α-葡萄糖苷酶10mg和80mg人血清白蛋白用50mmol/L PH 7.15 HEPES緩沖液溶解至4.2ml；d.酶工作液的制備方法取酶貯存液2.4ml加到17.6ml PH7.15 HEPES緩沖液中。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面通過實驗及結(jié)果來進行說明。
實驗原理EPS-G7和α-葡萄糖苷酶均勻地分解所有的反應(yīng)，生成4-硝基酚和葡萄糖。
實驗儀器SPS-100全自動生化分析儀(荷蘭Vital公司，6～1795)；pH-3B型數(shù)字式酸度計(江蘇電分析儀器廠，B-42)；分析天平(萬分之一，上海長江科學儀器廠，TG328A)。
試劑EPS-G7(德國CENTRONIC)批號為U0150；α-葡萄糖苷酶來自酵母菌，比活性為25U/mg，批號為B-174207(Boehringer)；N-2羥乙基哌嗪-N’-乙基磺酸(HEPES)，胰腺淀粉酶標準品，批號為P 9903，(由美國國家生物化學標準和質(zhì)控委員會認證的參考物476)，以及高于參考值上限15倍的人血清淀粉酶，批號P 196561(Roch)，膽紅素(分析純SIGMAGRADE)批號57F 0111；Boehringer公司α-Amy試劑盒，批號為B 1125。4-硝基酚(4-NP)經(jīng)過三次結(jié)晶以滿足Bower等規(guī)定的純凈標準，其它化學試劑均為分析純試劑。
實驗參數(shù)波長405nm，溫度37℃，酶工作液500μL，標本量血20μL或尿10μL，底物液100μL，延遲時間120s，測量時間120s。
計算公式U/L＝ΔA/min×VT/ε/L/VS尿U/L＝ΔA/min×1200.5血U/L＝ΔA/min×1120實驗結(jié)果1.4-NP摩爾吸光系數(shù)的確定 按照Lorentz方法，在1.0cm光徑，波長405nm處，pH分別為7.00，7.05，7.10，7.15，7.20時測定100μmol/L4-NP的吸光度，并計算出ε分別為1051.6，1101.9，1151.8，1200.5，1245.3mol/L，本法選用pH7.15時ε1200.5mol/L。
2.緩沖液的選擇 在PH、底物濃度恒定時，選取HEPES、磷酸鹽和羥乙基甲烷(BTP)三種緩沖液分別檢測濃度為49.3U/L的胰淀粉酶標準品，n＝20，結(jié)果見表1。由表中看出，酶在BTP緩沖液中活性減少14％，在磷酸鹽緩沖液中活性下降6％，而HEPES緩沖液并無影響。因此選用HEPES緩沖液作為本實驗的緩沖體系。
3.選擇最適底物濃度 在其它實驗條件恒定時，在405nm處，檢測不同濃度的底物對反應(yīng)速率的影響，繪制底物濃度與酶反應(yīng)速率曲線。見圖1。繪制Linewear-Burk圖，見圖2。根據(jù)數(shù)據(jù)得回歸方程為y＝24.39+4.37x，得出以ESP-G7為底物的α-AMY的Km＝0.179mmol/L據(jù)此本法選用底物濃度為3.5mmol/L。
4.最適PH的選擇 用PH分別為6.9，7.0，7.1，7.15，7.2，7.3的HEPES緩沖液配制3.5mmol/L的ESP-G7底物液，405nm處測定α-Amy活性，結(jié)果見圖3，從圖3得知淀粉酶最適宜的PH為6.9-7.0，在PH7.15時AMY活性保持最大活性的98％，由于在活性PH高于最適宜時，4-NP的吸光率增加，補償了AMY活性的損失，因此選擇了7.15，以使檢測更完善。
5.線性反應(yīng)時間和線性范圍的確定 取胰淀粉酶標準品活性為49.3U/L在SPS-100上，將反應(yīng)時間設(shè)定在12min，得反應(yīng)時間曲線。見圖4。將高活力的人血淀粉酶稀釋成200、400、800、1200、1400、1600U/L，分別測酶活力，得酶的線性范圍。見圖5。從圖中得知檢測的范圍擴大了，從1000-1500U/L都可以一次檢測出來，并保證精密度，超過1500U/L標本用生理鹽水稀釋后再測。
6.精密度實驗 取高、中、低值分別為398、118、49.3U/L的標準品，連續(xù)測20次，求出批內(nèi)精密度。每份血清測一次，連續(xù)測20d，得批間精密度。結(jié)果見表2。其批內(nèi)CV為1.4-2.6％，批間CV為1.9-2.8％7.回收實驗 在活性為49.3U/L的酶原液中，分別加入活力為5.1，3.1，2.5U/L的標準液后檢測酶活力，結(jié)果見表3。
8.最佳反應(yīng)溫度的選擇 在其它條件恒定時，在反應(yīng)溫度分別為25℃、30℃、35℃、37℃、40℃時測定酶反應(yīng)速度ΔA/min，結(jié)果見圖6，由于色原的電離隨溫度的升高而增加，4-NP的摩爾吸光系數(shù)在37℃時比在30℃時高8％左右，故而選37℃反應(yīng)體系。
9.干擾實驗 分別將濃度不同的血紅蛋白、膽紅素、葡萄糖、蛋白質(zhì)加入到活性為49.3U/L的胰淀粉酶標準品中，結(jié)果見表4、表5、表6、表7。安照100±3％的回收試驗標準，我們發(fā)現(xiàn)29.5g/L血紅蛋白、610mmol/L，100mmol/L葡萄糖、70mmol/L蛋白質(zhì)對反應(yīng)無干擾。
10.相關(guān)性實驗 用本法和IFCC批準Boehringer公司試劑盒(底物為4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽三糖苷)分別測定胰淀粉酶標準品。測得相關(guān)方程為y＝10.9+1.445x，γ＝0.994，n＝20。由于相關(guān)系數(shù)＜0.975，因此本方法與IFCC推薦的方法具有良好的相關(guān)性。
11.試劑穩(wěn)定性觀察 工作試劑配制后，立即測定405nm時A＝0.187；5℃4周后A＝0.206；5周后A＝0.396；實驗證明A＞0.40時，測定結(jié)果偏低。所以5℃不含添加劑的底物限定貯存期為3周，酶溶液限定貯存期為5周。
初步臨床應(yīng)用情況研究對象在我院健康查體成人80名，男女各40名，平均年齡41.4歲，符合下列條件，B超檢查肝、膽、胰、脾、腎均正常。血液檢查總蛋白為62～75g/L，空腹GLU＜6.1mmol/L，Cr＜96mmol/L，γ-GT＜20U/L，ALT＜40U/L，將他們分為五組，每8名男性、8名女性為一組，在20～69歲之間，每10歲為一個年齡組，均在清晨空腹留尿、采血。急性胰腺炎42例，慢性胰腺炎4例，腮腺炎1例。
測定結(jié)果正常人對于男性和女性無明顯差別，在不同年齡組，在所有對比實驗中，P≥0.9也無明顯差別，因此，通過對80例健康成人的檢測，結(jié)果符合正態(tài)分布，建立0.95可信區(qū)間的參考范圍血33.9～96.2U/L，尿65.4～187.6U/L；42例急性胰腺炎檢測血296-1252U/L，尿506.3～1954.7U/L；慢性胰腺炎較急性偏低血138-504U/L，尿238.5～429.6U/L；腮腺炎血269U/L，尿197.6U/L。
本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是所有的連續(xù)檢測α-Amy檢測方法，應(yīng)用亞乙基封閉的4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷為底物和新的酵母菌的α-葡萄糖苷酶，均勻地分解所有的反應(yīng)，生成4-硝基酚和葡萄糖，不需要復(fù)雜的預(yù)處理及特殊儀器，試劑具有足夠的穩(wěn)定性以及易于操作等優(yōu)點，使常規(guī)測試程序所需樣品體積減少，縮短了延遲時間，減少了基質(zhì)某些狀況的干擾，同樣改變了IFCC推薦方法的反應(yīng)條件，將測試溫度由30℃改為37℃，PH由6.9-7.0改為7.15。酶濃度由6.2mmol/L改為7.1mmol/L，以使還原100％解離，增加了釋放性，延長了相關(guān)線性范圍，通過對這些結(jié)果的評價分析，此檢測方法是一種更趨完善的檢測α-Amy的方法。


圖1是底物濃度與酶反應(yīng)速率曲線圖；
圖2是Linewear-Burk圖；圖3是PH對酶活性的影響圖；圖4是酶促反應(yīng)時間曲線圖；圖5是酶的線形范圍圖；圖6是溫度對反應(yīng)速度的影響圖。
具體實施例方式
1.緩沖液將1.02gNaCl、2.98gHEPES溶于約220ml蒸餾水中，加入0.07ml258mmol/L CaCl2，37℃下用約24ml 0.2mmol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至7.15，準確加水至250ml。
2.底物液將157mgEPS-G7溶于1液中，準確加至100ml。
3.酶貯存液將含量25U/mg，37℃的α-葡萄糖苷酶10mg和80mg人血清白蛋白用50mmol/L PH 7.15 HEPES緩沖液溶解至4.2ml。
4.酶工作液取酶貯存液2.4ml加到17.6ml PH7.15 HEPES緩沖液中，讓其含酶7.1U/ml。
5.4-硝基酚(4-NP)用分析天平稱取1.38mg 4-NP至容量瓶中，準確定容100ml。
表1.緩沖液的選擇

表2.精密度實驗結(jié)果n＝20

表3.回收實驗結(jié)果

表4.加入血紅蛋白后α-Amy活性比較

表5.加入膽紅素后α-Amy活性比較

表6.加入葡萄糖后α-Amy活性比較

表7.加入蛋白質(zhì)后α-Amy活性比較

權(quán)利要求
1.一種血清淀粉酶試劑盒，其包括緩沖液、底物液及酶貯存液，其特征是緩沖液中NaCl含量為70mmol/L，Cacl2含量為1.0mmol/L，N-2羥乙基哌嗪-N’-乙基磺酸(HEPES)含量為50mmol/L；底物液中底物為亞乙基-4-硝基酚-1，4-α-D-麥芽七糖苷(EPS-G7)含量為3.5mmol/L；酶貯存液中α-葡萄糖苷酶(a-AMY)含量為60U/ml，人血清白蛋白含量為20g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清淀粉酶試劑盒，其特征是此試劑盒測試時溫度為37℃，緩沖液PH為7.15，酶工作液中酶含量為7.1U/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清淀粉酶試劑盒中試劑的制備方法，其特征是a.緩沖液的制備方法將1.02gNaCl、2.98gHEPES溶于約220ml蒸餾水中，加入0.07ml 258mmol/L CaCl2，37℃下用約24ml 0.2mmol/L NaOH調(diào)節(jié)PH值到7.15，準確加水至250ml；b.底物液的制備方法將157mgEPS-G7溶于1液中，準確加1液至100ml；c.酶貯存液的制備方法將含量25U/mg，37℃的α-葡萄糖苷酶10mg和80mg人血清白蛋白用50mmol/L PH7.15 HEPES緩沖液溶解至4.2ml；d.酶工作液的制備方法取酶貯存液2.4ml加到17.6ml PH7.15 HEPES緩沖液中。
全文摘要
一種血清淀粉酶試劑盒，其包括緩沖液、底物液及酶貯存液，其緩沖液中NaCl含量70mmol/L，CaCl
文檔編號C12Q1/40GK1912580SQ20051001472
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月8日
發(fā)明者蘇作軍, 徐心 申請人:蘇作軍, 徐心