專(zhuān)利名稱(chēng)：一種卡介苗表達(dá)載體及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及表達(dá)載體，特征是涉及卡介苗表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
卡介苗(Mycobacterium bovis bacilli Calmette Geurin，BCG)是世界衛(wèi)生組織推薦的結(jié)核病預(yù)防用減毒活疫苗，其生產(chǎn)、制備和在臨床應(yīng)用的技術(shù)已相當(dāng)成熟。從1921年發(fā)明到目前，全世界已有35億人接種卡介苗，并證明是安全的?？ń槊缑庖邫C(jī)體后，既刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，又可以誘導(dǎo)以CD4T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答。已有上100種的外源蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子在卡介苗中得以表達(dá)(Ohara N，et al.Vaccine，2001，194089-4098)，并將表達(dá)外源基因的重組卡介苗用于多種類(lèi)型感染性疾病、腫瘤、變態(tài)反應(yīng)性疾病等的預(yù)防和治療，具有極為廣闊的應(yīng)用前景。
卡介苗表達(dá)系統(tǒng)包括胞內(nèi)表達(dá)、胞膜表達(dá)和分泌表達(dá)三種方式。由于卡介苗是胞內(nèi)寄生菌，其被巨噬細(xì)胞吞噬后，形成吞噬體，并在其中生長(zhǎng)繁殖。卡介苗分泌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)抗原，被認(rèn)為是經(jīng)MHCI類(lèi)分子途徑，遞呈給CD8T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生CD8T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)；卡介苗胞膜或胞內(nèi)的抗原，是經(jīng)MHCII類(lèi)分子途徑，遞呈給CD4T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此將外源基因在卡介苗中分泌表達(dá)建立的重組卡介苗菌株，既可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，更重要的是，可同時(shí)產(chǎn)生CD4和CD8T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，可特異性用于針對(duì)需要上述保護(hù)性免疫反應(yīng)的傳染病如結(jié)核病、AIDS(Aldovini A，etal.Nature(London)1991，351479-482)以及腫瘤(Yamada H，et al.J.Urol.2000，16452-531)等的防治，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。蛋白質(zhì)的分泌需要有信號(hào)肽的參與。分枝桿菌種屬特異性的限制，僅分枝桿菌自身蛋白的信號(hào)肽才能被卡介苗識(shí)別，已有M.kansasii或卡介苗α抗原(Lagranderie M，et al.J.Virol.1997，712303-2309；Gheorghiu M，et al.InfectImmun.1994，624287-4295.)、結(jié)核分枝桿菌抗原85A(Kremer L，et al.InfectImmun.1998，665669-5676.)、M.fortuitum β-lactamse(Langermann S，et al.Nature(London)1994，372552-555)、結(jié)核分枝桿菌抗原19kDa(Edelmana R，et al.Vaccine 1999，171272-1281)等成功用于引導(dǎo)外源基因的分泌表達(dá)。由于結(jié)核分枝桿菌在體外培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的培養(yǎng)濾液蛋白，其主要的成分是抗原85B(Ag85B)(Belisle JT，et al.Science 1997，2761420-1422；)，并且Ag85B的信號(hào)肽序列已被克隆和證實(shí)(Harth G，etal.Infect Immun.1997，652321-2328)，相對(duì)于其他基因的信號(hào)肽具有明顯優(yōu)勢(shì)，更能正確引導(dǎo)外源基因的分泌。分枝桿菌表達(dá)載體的種類(lèi)很多，其中pSMT3是國(guó)內(nèi)外廣泛使用并被證實(shí)可靠的一種大腸桿菌-分枝桿菌穿梭細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體(Harth G，etal.InfectImmun.1997，652321-2328；Golanska E，et al.Acta Microbiol Pol.1998；47335-343；He A，et al.Protein Expr.Purif.2004，35171-180)，其篩選標(biāo)志為潮霉素(Hygromycin)抗性，可避免通常使用的氨芐青霉素或卡那霉素抗性在人體應(yīng)用時(shí)可能出現(xiàn)的副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠使外源基因在卡介苗中正確分泌表達(dá)的卡介苗表達(dá)載體，它是以大腸桿菌-分枝桿菌穿梭細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體pSMT3為基礎(chǔ)，利用結(jié)核分枝桿菌主要分泌抗原Ag85B的信號(hào)肽序列引導(dǎo)外源基因的分泌表達(dá)。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達(dá)載體，本專(zhuān)利申請(qǐng)將其稱(chēng)為pDAF。
pDAF包括大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)(Col E1 origin)、潮霉素(Hygromycin)抗性基因、分枝桿菌復(fù)制起始點(diǎn)(pAL5000 origin)、多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)、結(jié)核分枝桿菌主要分泌抗原Ag85B的信號(hào)肽和卡介苗熱休克蛋白Hsp60的啟動(dòng)子。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達(dá)載體，含有大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)(Col E1origin)、分枝桿菌復(fù)制起始點(diǎn)(pAL5000origin，來(lái)源于M.fortuitum)和潮霉素(Hygromycin)抗性基因(來(lái)源于Streptomyces hygroscopicus)。Col E1 origin可使載體在大腸桿菌中復(fù)制、增殖、表達(dá)載體構(gòu)建和保存；pAL5000origin可使載體在卡介苗中復(fù)制、增殖，以及外源基因在卡介苗中表達(dá)；潮霉素抗性基因可使該載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌或卡介苗對(duì)潮霉素產(chǎn)生抗性，用于重組轉(zhuǎn)化菌的篩選。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達(dá)載體，以卡介苗熱休克蛋白Hsp60的啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受溫度控制，溫度在37℃或42到45℃誘導(dǎo)后才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，翻譯。37℃非常適合于外源基因在體內(nèi)的表達(dá)；42-45℃適合于外源基因在體外的表達(dá)。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)包括BamHI、PstI、EcoRV、HindIII和ClaI酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達(dá)載體包含有序列表中序列1的核苷酸序列，該核苷酸序列為本發(fā)明卡介苗表達(dá)載體在構(gòu)建中插入的片段，該插入片段包括Hsp60啟動(dòng)子(pHsp60)、抗原85B的信號(hào)肽序列(ag85B sp)和多克隆位點(diǎn)區(qū)，該該插入片段的核苷酸序列如下TCT AGA CGG TGA CCA CAA CGC GCC CGC TTT GAT CGG GGA CGT CTG CGG CCGACC ATT TAC GGG TCT TGT TGT CGT TGG CGG TCA TGG GCC GAA CAT ACT CACCCG GAT CGG AGG GCC GAG GAC AAG GTC GAA CGA GGG GCA TGA CCC GGT GCG
GGG CTT CTT GCA CTC GGC ATA GGC GAG TGC TAA GAA TAA CGT TGG CAC TCGCGA CCG GTG AGT GCT AGG TCG GGA CGG TGA GGC CAG GCC CGT CGT CGC AGCGAG TGG CAG CGA GGA CAA CTT GAG CCG TCC GTC GCG GGC ACT GCG CCC GGCCAG CGT AAG TAG CGG GGT TGC CGT CAC CCG GTG ACC CCC GTT TCA TCC CCGATC CGG AGG AAT CAC TTC GCA ATG GCC ACA GAC GTG AGC CGA AAG ATT CGA GCT TGGGGA CGC CGA TTG ATG ATC GGC ACG GCA GCG GCT GTA GTC CTT CCG GGC CTG GTG GGG CTTGCC GGC GGA GCG GCA ACT GCG GGC GCG GGA TCC CCC GGG CTG CAG GAT TCG ATA TCA AGCTTA以上序列中加粗的黑體區(qū)域表示Ag85sp所在區(qū)域，從379位A起始，到501位G，全長(zhǎng)123bp，可引導(dǎo)外源基因的分泌表達(dá)。在表達(dá)的過(guò)程中，該信號(hào)肽段被從表達(dá)產(chǎn)物的N端切除。
本發(fā)明所提供的卡介苗表達(dá)載體的構(gòu)建一、材料和方法載體pUC19和大腸桿菌DH5α，按標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)方法保存。
大腸桿菌分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pSMT3由英國(guó)Imperial College School ofMedicine，Dr.Young DB提供，按標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，常規(guī)方法保存。
人工合成結(jié)核分枝桿菌H37Rv的抗原Ag85B的信號(hào)肽序列以及酶切位點(diǎn)讀框并克隆于載體pMD18-T-85Bsp由上海生物工程公司合成。
結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株購(gòu)自北京中國(guó)生物制品檢定所，保存于改良羅氏培養(yǎng)基。
分泌表達(dá)外源基因人細(xì)胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白的卡介苗表達(dá)質(zhì)粒pDIE由發(fā)明人構(gòu)建(Fan X，et al.Chin.Med.J(Engl.).2005，118762-765)。
膠回收和質(zhì)粒純化試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶和DNAMarker等購(gòu)自大連寶生物公司。
7H9、7H10和ADC營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)購(gòu)自Difico公司。
潮霉素購(gòu)自Invitrogen公司。BCG購(gòu)自成都生物制品所產(chǎn)品。
其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
序列測(cè)定由上?；倒就瓿伞?br> 載體的構(gòu)建和表達(dá)證實(shí)等具體操作方法采用標(biāo)準(zhǔn)方法，參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》(2002，科學(xué)出版社出版)，具體方法如下。
二、本發(fā)明載體構(gòu)建包括以下步驟(1)人工合成結(jié)核分枝桿菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信號(hào)肽序列以及酶切位點(diǎn)讀框并克隆于載體pMD18-T(即pMD18-T-85Bsp)。由上海生物工程公司合成。
(2)HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用膠回收試劑盒按照說(shuō)明書(shū)回收約150bp的小片段(見(jiàn)圖1第2電泳道)，與同樣酶切消化后的載體pSMT3的膠回收，按3∶1分子比，16度連接12-16h，低溫CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布普通LB瓊脂平板(含潮霉素50μg/ml)，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，大小在5.8kb，陽(yáng)性命名為pDAF(見(jiàn)圖4)。
驗(yàn)證以XbaI和HindIII酶切pDAF，酶切產(chǎn)生約5.1kb和540bp的小片段，酶切鑒定正確(見(jiàn)圖4)?；厥占s540bp的小片段(見(jiàn)圖4)，與同樣酶切的載體pUC19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并命名為pUCXH。pUCXH用XbaI和HindIII酶切，酶切鑒定正確(見(jiàn)圖1第1電泳道)后，由上?；倒緶y(cè)序，序列測(cè)定也表明序列是正確的。序列測(cè)定圖見(jiàn)圖2和圖3，圖2為正向測(cè)序圖，圖3為反向測(cè)序圖。
所構(gòu)建的表達(dá)載體pDAF的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖5。
本發(fā)明載體分泌表達(dá)外源基因人細(xì)胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白采用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程技術(shù)，利用本發(fā)明的載體，將IL-2和ESAT-6融合蛋白編碼克隆入pDAF對(duì)應(yīng)的讀框，建立表達(dá)載體pDIE。將卡介苗在7H9中大量培養(yǎng)2w后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至21d時(shí)，加入2M的甘氨酸(V/V＝10％)，繼續(xù)培養(yǎng)2d，冰浴1h，10,000轉(zhuǎn)離心5min，收集細(xì)菌，用10％的甘油洗滌三次后，分裝置-70℃保存作為卡介苗感受態(tài)。將pDIE電穿孔法導(dǎo)入用冰冷的10％(v/v)甘油制備的5×106個(gè)卡介苗感受態(tài)細(xì)胞，卡介苗中進(jìn)行分泌表達(dá)，電穿參數(shù)為0.4cm的電穿孔杯，電壓2.5KV，電容25μF，電阻1000Ω。37℃培養(yǎng)24h后涂布于含ADC和潮霉素的7H10平板中，設(shè)空白質(zhì)粒作為對(duì)照，37℃培養(yǎng)28～30d。結(jié)果在培養(yǎng)上清中利用SDS-PAGE和Western blotting證實(shí)有融合蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖6。


圖1為本發(fā)明涉及的載體pMD18-T-85Bsp和pUCXH的酶切鑒定，圖中數(shù)字1對(duì)應(yīng)的部分為質(zhì)粒pUCXH用XbaI+HindIII酶切產(chǎn)生預(yù)期大約3000bp和540bp的兩個(gè)片段；圖中數(shù)字2對(duì)應(yīng)的部分為質(zhì)粒pMD18-T-85Bsp用BalI+HindIII酶切產(chǎn)生預(yù)期大約2500bp和150bp的兩個(gè)片段。
圖2為本發(fā)明的表達(dá)載體特征區(qū)的正向測(cè)序圖。
圖3為本發(fā)明的表達(dá)載體特征區(qū)的反向測(cè)序圖。
圖4為本發(fā)明的表達(dá)載體pDAF的酶切鑒定圖，圖中M表示的是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1表示的本發(fā)明表達(dá)載體pDAF，泳道2表示的是本發(fā)明表達(dá)載體pDAF用XbaI和HindIII酶切后，產(chǎn)生預(yù)期大小為5.1kbp和540bp兩個(gè)片段。
圖5為本發(fā)明的表達(dá)載體pDAF的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6為建立在本發(fā)明表達(dá)載體pDAF的外源基因IL-2和ESAT-6的表達(dá)質(zhì)粒pDIE在卡介苗中分泌表達(dá)融合蛋白的鑒定，證實(shí)了表達(dá)的融合蛋白并分泌，主要存在于卡介苗的培養(yǎng)上清中。圖中A所示部分表示融合蛋白在BCG中表達(dá)，42度誘導(dǎo)2小時(shí)，收集培養(yǎng)濾液蛋白的上清，進(jìn)行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，結(jié)果為泳道1表示的pDIE轉(zhuǎn)化的BCG的表達(dá)上清，泳道2表示的是原始BCG的上清，M表示蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，箭頭表示泳道1出現(xiàn)了預(yù)期的21kDa融合蛋白的表達(dá)。圖中B部分表示融合蛋白在BCG中表達(dá)，收集培養(yǎng)濾液蛋白的上清，進(jìn)行SDS-PAGE后，用ESAT-6或抗人IL-2抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)。泳道3表示pDIE轉(zhuǎn)化的BCG的表達(dá)上清，在相應(yīng)21kDa部位出現(xiàn)了條帶，見(jiàn)箭頭所示；泳道4表示原始BCG的上清，在相應(yīng)部位未見(jiàn)該條帶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)載體材料和方法載體pUC19和大腸桿菌DH5α，按標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)方法保存。大腸桿菌分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pSMT3由英國(guó)Imperial College School of Medicine，Dr.YoungDB提供，按標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，常規(guī)方法保存。人工合成結(jié)核分枝桿菌H37Rv的抗原Ag85B的信號(hào)肽序列以及酶切位點(diǎn)讀框并克隆于載體pMD18-T-85Bsp由上海生物工程公司合成。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株購(gòu)自北京中國(guó)生物制品檢定所，保存于改良羅氏培養(yǎng)基。分泌表達(dá)外源基因人細(xì)胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白的卡介苗表達(dá)質(zhì)粒pDIE由發(fā)明人構(gòu)建(Fan X，et al.Chin.Med.J(Engl.).2005，118762-765)。膠回收和質(zhì)粒純化試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶和DNA Marker等購(gòu)自大連寶生物公司。7H9、7H10和ADC營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)購(gòu)自Difico公司。潮霉素購(gòu)自Invitrogen公司。BCG購(gòu)自成都生物制品所產(chǎn)品。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。序列測(cè)定由上?；倒就瓿伞］d體的構(gòu)建和表達(dá)證實(shí)等具體操作方法采用標(biāo)準(zhǔn)方法，參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》(2002，科學(xué)出版社出版)。具體方法和實(shí)施例如下構(gòu)建步驟(1)人工合成結(jié)核分枝桿菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信號(hào)肽序列以及酶切位點(diǎn)讀框并克隆于載體pMD18-T，即pMD18-T-85Bsp。由由上海生物工程公司合成。
(2)HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用膠回收試劑盒按照說(shuō)明書(shū)回收約150bp的小片段，見(jiàn)圖1第2電泳道，與同樣酶切消化后的載體pSMT3的膠回收，按3∶1分子比，16度連接12-16h，低溫CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布普通LB瓊脂平板，含潮霉素50μg/ml，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，大小在5.8kb，陽(yáng)性命名為pDAF，見(jiàn)圖4。
(3)以XbaI和HindIII酶切pDAF，酶切產(chǎn)生約5.1kb和540bp的小片段，酶切鑒定正確(見(jiàn)圖3)?；厥占s540bp的小片段，見(jiàn)圖4，與同樣酶切的載體pUC19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并命名為pUCXH。
(4)pUCXH用XbaI和HindIII酶切，酶切鑒定正確(見(jiàn)圖1第1電泳道)后，由上?；倒緶y(cè)序，序列測(cè)定也表明序列是正確的。序列測(cè)定圖見(jiàn)圖2和圖3，圖2為正向測(cè)序圖，圖3為反向測(cè)序圖。
所構(gòu)建的表達(dá)載體pDAF的結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示。
實(shí)施例2本發(fā)明載體分泌表達(dá)外源基因人細(xì)胞因子IL-2和ESAT-6融合蛋白采用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程技術(shù)，利用本發(fā)明的載體，將IL-2和ESAT-6融合蛋白編碼克隆入pDAF對(duì)應(yīng)的讀框，建立表達(dá)載體pDIE。將卡介苗在7H9中大量培養(yǎng)2w后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至21d時(shí)，加入2M的甘氨酸(V/V＝10％)，繼續(xù)培養(yǎng)2d，冰浴1h，10,000轉(zhuǎn)離心5min，收集細(xì)菌，用10％的甘油洗滌三次后，分裝置-70℃保存作為卡介苗感受態(tài)。將pDIE電穿孔法導(dǎo)入用冰冷的10％(v/v)甘油制備的5×106個(gè)卡介苗感受態(tài)細(xì)胞，卡介苗中進(jìn)行分泌表達(dá)，電穿參數(shù)為0.4cm的電穿孔杯，電壓2.5KV，電容25μF，電阻1000Ω。37℃培養(yǎng)24h后涂布于含ADC和潮霉素的7H10平板中，設(shè)空白質(zhì)粒作為對(duì)照，37℃培養(yǎng)28～30d。結(jié)果在培養(yǎng)上清中利用SDS-PAGE和Western blotting證實(shí)有融合蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖6。
以下為序列表。
序列表<110>華中科技大學(xué)<120>一種卡介苗表達(dá)載體及其構(gòu)建<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>537<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(379)..(501)<223>
<400>1tctagacggt gaccacaacg cgcccgcttt gatcggggac gtctgcggcc gaccatttac60gggtcttgtt gtcgttggcg gtcatgggcc gaacatactc acccggatcg gagggccgag120gacaaggtcg aacgaggggc atgacccggt gcggggcttc ttgcactcgg cataggcgag180tgctaagaat aacgttggca ctcgcgaccg gtgagtgcta ggtcgggacg gtgaggccag240gcccgtcgtc gcagcgagtg gcagcgagga caacttgagc cgtccgtcgc gggcactgcg300cccggccagc gtaagtagcg gggttgccgt cacccggtga cccccgtttc atccccgatc360cggaggaatc acttcgca atg gcc aca gac gtg agc cga aag att cga gct 411Met Ala Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala1 5 10tgg gga cgc cga ttg atg atc ggc acg gca gcg gct gta gtc ctt ccg 459Trp Gly Arg Arg Leu Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro15 20 25ggc ctg gtg ggg ctt gcc ggc gga gcg gca act gcg ggc gcg 501Gly Leu Val Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala30 35 40ggatcccccg ggctgcagga ttcgatatca agctta 537<210>2<211>41<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Ala Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu1 5 10 15
Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu20 25 30Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala35 40
權(quán)利要求
1.一種卡介苗表達(dá)載體，包括宿主復(fù)制起始點(diǎn)、抗性基因和分枝桿菌復(fù)制起始點(diǎn)pAL5000 origin，其特征在于包含有由卡介苗熱休克蛋白Hsp60啟動(dòng)子、結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85B的信號(hào)肽和多克隆位點(diǎn)區(qū)MCS組成的卡介苗內(nèi)表達(dá)區(qū)，該卡介苗內(nèi)表達(dá)區(qū)具有序列表中序列1的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗表達(dá)載體，其特征在于所述的宿主復(fù)制起點(diǎn)為大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)Col E1 origin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗表達(dá)載體，其特征在于所述的抗性基因?yàn)槌泵顾豀ygromycin抗性基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介苗表達(dá)載體，其特征在于多克隆位點(diǎn)區(qū)MCS包括BamHI、PstI、EcoRV、HindIII和/或ClaI酶切位點(diǎn)。
5.一種卡介苗表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟a.人工合成結(jié)核分枝桿菌H37Rv的主要分泌抗原Ag85B的信號(hào)肽序列以及酶切位點(diǎn)讀框并克隆于載體pMD18-T，得pMD18-T-85Bsp；b.HindIII和BalI酶切消化pMD18-T-85Bsp后，用膠回收試劑盒按照說(shuō)明書(shū)回收約150bp的小片段，與同樣酶切消化后的載體pSMT3的膠回收，按3∶1分子比，16度連接12-16h，低溫CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布普通LB瓊脂平板，含潮霉素50μg/ml，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，大小在5.8kb，得本發(fā)明卡介苗表達(dá)載體pDAF。
6.權(quán)利要求1所述的卡介苗表達(dá)載體在生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的卡介苗表達(dá)載體在制藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種卡介苗表達(dá)載體，由大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)Col E1 origin、潮霉素Hygromycin抗性基因和分枝桿菌復(fù)制起始點(diǎn)pAL5000 origin、卡介苗熱休克蛋白Hsp60啟動(dòng)子、結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85B的信號(hào)肽和多克隆位點(diǎn)區(qū)MCS構(gòu)成，它能夠使外源基因在卡介苗中正確分泌表達(dá)，利用本發(fā)明載體，能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)肟ń槊缰蟹置诒磉_(dá)，用于生產(chǎn)制備重組卡介苗或表達(dá)外源蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1966689SQ20051001980
公開(kāi)日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者范雄林, 高倩 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)