專利名稱：黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物及其構(gòu)建制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類基因工程，尤其是具有抗菌活性的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體的構(gòu)建及其制備方法。
背景技術(shù)：
Hepcidin是一個在C端保守位點上富含半胱氨酸殘基的抗菌肽家族。它們的C末端都保留了半胱氨酸形成的富集區(qū)，CD(circular dichroism，圓二色)光譜學(xué)特性研究證實，在磷酸緩沖液中hepcidin具有兩個穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)與抗菌多肽的胱氨酸(cystin-eknot)結(jié)構(gòu)非常相似。富含半胱氨酸的抗菌肽已在昆蟲的脂肪體、軟體動物和甲殼動物的血淋巴、哺乳動物的上皮細胞和循環(huán)細胞如嗜中性粒細胞、巨噬細胞中分離出來。此類抗菌肽有抗真菌和革蘭氏陽性、陰性菌的活性。2000年，Krause et al(Krause A，Neitz S，MagertHJ，Schulz A，F(xiàn)orssmann WG，Knappe PS，Adermann K.LEAP-1，a novel highly disulfide-bonded human peptide，exhibits antimicrobial activity[J].FEBS Lett.，2000，480147-150)最早從人類血漿中首先發(fā)現(xiàn)了LEAP-1(后稱為hepcidin)，曾用化學(xué)合成該多肽檢測了hepcidin的抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hepcidin能夠劑量依賴性(Dose-dependent)的抑制革蘭氏陽性菌藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和革蘭氏陰性菌灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)的生長，但是對大腸桿菌(E.coli BL21 G-)和螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens G-)沒有活性，此hepcidin對枯草芽孢桿菌的半數(shù)抑制濃度(half-maximal inhibitoryactivity，IC50)為40μg/ml(14.4μM)。而Park et al(ParkCB，Lee JH，Park IY，Kim MS，Kim SC.A noval antimicrobial peptide from the loach，Misgurnus anguillicaudatus[J].FEBS Lett.，1997，411173-178.)從人類尿液中分離的Hep20和Hepc25天然產(chǎn)物，在30μM濃度下對大腸桿菌(E.coli ML35P G-)的生長則具有較強的抑制作用，對金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的生長抑制作用較弱，對綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa G+)沒有抑制作用。
魚類抗菌肽的研究加深了人們對低等脊椎動物免疫防御機制的認識，為日益嚴重的魚類病害防治開辟了嶄新的途徑?？咕乃幬镌诤ＫB(yǎng)殖魚類的疾病防治上將是一種應(yīng)用前景廣闊的抗菌和治療藥物，因而獲得高產(chǎn)量的抗菌肽是其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)推廣應(yīng)用的前提，但直接從魚類提取或利用化學(xué)方法人工合成天然的抗菌肽，受動物來源和化學(xué)合成方法的局限，很難獲得足夠量的抗菌肽，且費用昂貴。利用分子生物學(xué)技術(shù)可以克隆獲得海水養(yǎng)殖魚類的抗菌肽基因，通過建立海水養(yǎng)殖魚類抗菌肽基因表達工程菌，可以在體外產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)抗菌肽；而用抗菌肽產(chǎn)品替代抗生素添加到飼料，飼喂海水養(yǎng)殖魚類，不僅可以提高魚體的免疫抗病力，增加其產(chǎn)量，同時還可以避免抗生素在魚體中的蓄積，提高水產(chǎn)品質(zhì)量，從而解決目前困擾我國海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中的細菌耐藥性及水環(huán)境和水產(chǎn)品抗生素污染等問題。
由于hepcidin多肽含有8個半胱氨酸，具有特殊的4個二硫鍵結(jié)構(gòu)，通過化學(xué)合成該多肽技術(shù)難度很大、費用昂貴，因而不能滿足產(chǎn)業(yè)化要求，可行有效的途徑是在體外通過基因工程菌表達該抗菌肽，但技術(shù)上也存在難度和風(fēng)險，因此目前關(guān)于這方面的研究報道很少。Zhang et al(Zhang H，Yuan QP，Zhu YP，Ma RY.Expression and preparation of recombinanthepcidin in Escherichia coli[J].Protein.Expr.Purif.，2005，41409-416.)曾經(jīng)利用合成的人類hepcidin核酸片段重組到pGEX-hpc表達載體，在大腸桿菌中表達融合蛋白，但其表達產(chǎn)物是以包涵體形式存在，需要經(jīng)過復(fù)性過程才能獲得有生物活性的hepcidin，因而利用pGEX-hpc這一類表達載體制備hepcidin的工藝相對復(fù)雜，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在通過構(gòu)建一種含有黑鯛hepcidin(eDNA)的pTrc-CKS/hepcidin表達載體(原核表達載體pTrc-CKS購自晶美生物有限公司)以及在E.coli TOP10F′中的誘導(dǎo)表達可溶性產(chǎn)物和高效純化可溶性表達產(chǎn)物的方法，從而可大量地體外獲得抗菌肽hepcidin的表達產(chǎn)品。
本發(fā)明所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體是在含有E.coli Trc啟動子、蛋白質(zhì)工程改造過的CKS基因及組氨酸標簽(His-Tag)的原核表達載體pTrc-CKS(購自晶美生物有限公司)上連接黑鯛Hepcidin基因(Genbank登錄號AY669377)所構(gòu)建成的pTrc-CKS/hepcidin表達質(zhì)粒，具有P3C酶切割位點，C末端融合6個組氨酸。其可溶性融合表達產(chǎn)物CKS-hepcidin可通過C末端His-Tag親和層析純化，純化的融合產(chǎn)物可用P3C酶將融合蛋白中的CKS切除，從而獲得純化的Hepcidin。通過計算得知，pTrc-CKS空載體誘導(dǎo)表達的蛋白為268aa，理論分子量為29.0kDa；pTrc-CKS/hepcidin重組載體誘導(dǎo)表達的蛋白為328aa，理論分子量為36.3kDa。pTrc-CKS/hepcidin表達質(zhì)粒的堿基序列如下agcatgccag actctctcga agttctgttt cagggtccag caggatctgg ctcattcact780gaggtgcaag agccggagga gccaatgaac aatgagagtc cagttgctgc acatgaagag840
aagtcagagg agtcctggaa gatgccgtat aacaacagac acaagcgcag ccccgctggt900tgtcgctttt gctgcggttg ctgtcctaac atgagaggat gtggtgtctg ctgcaggttc960tctagccacc atcatcatca tcat 984氨基酸序列如下↓P3C切點Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser Gly Ser PheThr Glu Val Gln Glu Pro Glu Pro Met Asn Asn Glu Ser Pro Val Ala Ala His GluGlu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser ProAla Gly Cys Arg Phe Cys Cys Gly Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys CysArg Phe Ser Ser 所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達產(chǎn)物為含有pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒的E.coliTOP10F′表達菌株。
所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法如下1.重組表達載體pTrc-CKS/hepcidin的構(gòu)建1)根據(jù)黑鯛Hepcidin基因(Genbank登錄號AY669377)合成上游引物S1(起始密碼子ATG前段序列26個bp(含ATG))CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，然后3′RACE擴增黑鯛hepcidin基因，回收PCR擴增目的片段，將目的片段與pMD18-T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)連接，最后將連接產(chǎn)物用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER1647(購自寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)細胞，得到含有黑鯛hepcidin(cDNA)的重組pPMD18-T陽性質(zhì)粒。
2)根據(jù)pTrc-CKS載體多克隆位點，設(shè)計目的基因的上游引物H-H1-63U和下游引物H-H2-D，在上游引物5′端加上Bgl II酶切位點，與BamH I為同裂酶，上游引物H-H1-63U為5′GCCGAGATCTGGCTCATTCACTGAGGTG 3′在下游引物5′端加上Xba I酶切位點，與Nhe I為同裂酶，下游引物H-H2-D為5′GCGTCTAGAGAACCTGCAGCAGACACCAC 3′3)以包含黑鯛hepcidin(cDNA)重組pMD18-T質(zhì)粒為擴增模板，以H-H1-63U，H-H2-D為上、下游引物，用pfu高保真Taq酶擴增hepcidin表達序列，得到PCR產(chǎn)物，長度為211bp。
4)將pTrc-CKS原核表達載體轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F′(購自晶美生物有限公司)，得到具有BamH I和Nhe I的粘性末端的載體。
5)將回收的PCR產(chǎn)物用Bgl II和Xba I進行雙酶切，得到具有與處理好的pTrc-CKS線性載體相互配對的粘性末端的預(yù)連接cDNA片段。
6)將具有相同粘性末端的pTrc-CKS原核表達載體與含有黑鯛hepcidin基因的預(yù)連接DNA片段連接，得到pTrc-CKS/hepcidin重組表達質(zhì)粒。該表達載體采用E.coli Trc啟動子和蛋白質(zhì)工程改造過CKS基因融合表達，同時選用P3C酶切割位點可將融合蛋白部分切除，并在C端添加6個組氨酸便于采用親和層析純化目標蛋白。通過計算得知，pTrc-CKS空載體誘導(dǎo)表達的蛋白為268aa，理論分子量為29.0kDa；pTrc-CKS/hepcidin重組載體誘導(dǎo)表達的蛋白為328aa，理論分子量為36.3kDa。
2.pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達用熱擊法將pTrc-CKS空質(zhì)粒和pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10F′感受態(tài)細胞中誘導(dǎo)表達。以pTrc-CKS空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli TOP10F′為對照，以pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli TOP10F′為實驗組，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測融合蛋白表達量，結(jié)果顯示pTrc-CKS空質(zhì)粒與pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在誘導(dǎo)后較誘導(dǎo)前都具有明顯的表達蛋白帶；并且重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒相比，具有明顯不同分子量的表達蛋白帶，空質(zhì)粒表達蛋白分子量在31.0kDa左右，重組質(zhì)粒在43.0kDa左右，與計算的理論分子量相似。
3.pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒融合表達產(chǎn)物的純化1)hepcidin融合表達產(chǎn)物的可溶性分析將pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物離心收集菌體，用PBS懸浮菌體，超聲破碎，加溶菌酶；離心超聲液取上清進行SDS-PAGE電泳，確認表達產(chǎn)物的可溶性。
2)親和層析法純化hepcidin融合表達產(chǎn)物將具有較高可溶性表達hepcidin的菌株大量誘導(dǎo)表達后收集菌體，采用金屬鏊合層析柱進行親和層析，金屬鏊合層析填料為Super Chelating Resin(購自晶美生物有限公司)，所用層析試劑為溶液A200mM硫酸鎳；溶液B25mM NaH2PO4+500mM NaCl pH4.0(用磷酸調(diào))；溶液C50mM磷酸緩沖液+200mM NaCl+40mM咪唑pH 8.0；溶液D50mM磷酸緩沖液+150mM NaCl+400mM咪唑pH 8.0；溶液A鏊合Ni2+金屬離子，溶液B洗去多余的Ni2+，溶液C平衡層析柱，將過濾后的可溶性上清液全部上柱，溶液C過柱洗去未結(jié)合的蛋白，溶液D過柱洗脫目標蛋白，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定即為hepcidin融合表達產(chǎn)物，通過凝膠掃描計算得知，掃描凝純化后的融合表達產(chǎn)物具有90％的純度。
3)洗脫蛋白的脫鹽及酶切反應(yīng)以脫鹽層析緩沖液為平衡液，將親和層析洗脫下的hepcidin融合蛋白上脫鹽柱，收集先通過層析柱的蛋白峰，抽真空冷凍干燥。以PBS(磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)溶解融合表達蛋白，加入EDTA(乙二胺四乙酸，pH 8.0)和DTT(二硫蘇糖醇，終濃度為1mM)，再加入少量P3C蛋白酶進行酶切反應(yīng)。所述的脫鹽緩沖液為50mM Tris-Cl，0.15mM NaCl(pH8.0)。
4)Hepcidin重組蛋白抗菌活性的測定通過測定融合表達產(chǎn)物酶切反應(yīng)前和經(jīng)過P3C酶切后得到的蛋白產(chǎn)物對4種革蘭氏陽性菌(G+)和2種革蘭氏陰性菌(G-)的殺傷指數(shù)。受試菌有大腸桿菌鑒定株(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemeolyticus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(均購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)。結(jié)果顯示，原核表達的黑鯛hepcidin蛋白產(chǎn)物能夠選擇性的對部分革蘭氏陽性菌和陰性菌產(chǎn)生殺傷作用。在融合蛋白酶切反應(yīng)前，該融合表達產(chǎn)物在0.2mg/ml濃度下只能抑制2種細菌的生長；但是經(jīng)過P3C酶切后，得到的蛋白產(chǎn)物在0.2mg/ml的濃度下能夠抑制5種細菌的生長。
本發(fā)明借助基因工程技術(shù)，應(yīng)用pTrc-CKS融合表達載體，成功地高效表達出有抗菌活性的可溶性黑鯛hepcidin，從而使抗菌肽hepcidin的藥用價值得到開發(fā)，以符合產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的要求。其優(yōu)點如下1.Hepcidin多肽的分子量較小，利用大腸桿菌表達的產(chǎn)物太小很可能被自身酶解，而采用融合表達方式，可以增大表達產(chǎn)物分子量，與之相比則會更加穩(wěn)定；其次，Hepcidin是一種抗菌多肽，其表達產(chǎn)物對宿主菌(大腸桿菌)存在殺傷作用，采用融合表達方式可以消除其對宿主的毒性；另外，Hepcidin具有較復(fù)雜的二硫鍵結(jié)構(gòu)，其表達產(chǎn)物可能不能正確的折疊形成天然空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致重組產(chǎn)物形成包涵體，而pTrc-CKS表達載體中融合表達經(jīng)過改造過的CKS蛋白，它是一個非常穩(wěn)定且高度可溶的理想融合伴侶。
2.pTrc-CKS融合表達載體，采用E.coli Trc啟動子，受IPTG誘導(dǎo)表達插入目的基因；由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始由正常的大腸桿菌序列所控制，因而融合蛋白得到高效表達，且外源序列與大腸桿菌的融合使其融合表達產(chǎn)物比單獨表達外源蛋白更穩(wěn)定。另外，選擇低溫(28℃)、低濃度誘導(dǎo)劑(IPTG終濃度為100μg/ml)的誘導(dǎo)條件，可增加可溶型重組蛋白的表達。
3.pTrc-CKS載體表達產(chǎn)物C末端融合6×His-tag蛋白，由于空間位阻關(guān)系可與Ni2+特異性的結(jié)合，因此應(yīng)用金屬鏊合層析可純化表達的融合蛋白。在上親和層析柱純化可溶性產(chǎn)物中的融合蛋白時，在樣品中添加40mM左右的咪唑上柱，可以大大降低非6×His-tag蛋白如3個His或4個His等雜蛋白吸附填料，在40mM左右的咪唑條件下這些雜蛋白就掛不上柱，這樣可大大提高了吸附6His-tag蛋白載量和提高純化效果。由于hepcidin中富含半胱氨酸，導(dǎo)致與金屬的吸附作用增強而難以洗脫，通過對咪唑的洗脫濃度(濃度大于400mM)進行了優(yōu)化，從而有效洗脫下hepcidin融合蛋白。
4.所構(gòu)建的hepcidin的原核表達產(chǎn)物在0.2mg/ml(5.5μM)濃度下能夠抑制包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、副溶血弧菌和溶壁微球菌5種細菌的生長，對其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和溶壁微球菌4種細菌的殺傷指數(shù)都超過50％。并且，該表達蛋白在稀釋后(濃度為50μg/ml)對副溶血弧菌和溶壁微球菌的生長抑制作用也很強，甚至在25μg/ml的濃度下對溶壁微球菌的生長仍然有抑制作用。黑鯛hepcidin表達蛋白與國外報道的人hepcidin選擇性的發(fā)揮抗菌活性的現(xiàn)象一致，發(fā)揮抗菌作用的濃度也基本相當。
5.由于利用直接從黑鯛中獲得的基因編碼序列(cDNA序列)，經(jīng)過引物末端加接頭改造后連接到pTrc-CKS融合表達載體，并在大腸桿菌中表達出可溶性融合產(chǎn)物。與包涵體蛋白的活性需要復(fù)性過程相比，可溶性蛋白經(jīng)表達后即表現(xiàn)生物活性，因此更便于制備和純化hepcidin可溶性表達產(chǎn)物，利于產(chǎn)業(yè)化。


圖1為黑鯛3′RACE產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。在圖1中M為DL2000 Marker；1為黑鯛3′RACE產(chǎn)物；2000、1000、750、500、250、100代表DL2000 Marker中各核酸片段的堿基數(shù)目，數(shù)目單位為bp，即堿基數(shù)。
圖2為黑鯛Hepcidin全長cDNA及由此推導(dǎo)出的氨基酸序列示意圖。在圖2中，小寫字母代表5’和3’UTR；大寫字母代表編碼區(qū)；星號顯示起始密碼子和終止密碼子；實心豎直箭頭標出SacI酶切位點；空心豎直箭頭標出預(yù)測的信號肽、優(yōu)勢域和成熟肽的分割位點；橫箭頭標出引物序列，箭頭方向即為引物結(jié)合方向；3′非編碼區(qū)的多腺苷酸化信號用下劃線標明；基序(RX(K/R)R用方框標出。
圖3中A圖為預(yù)連接的Hepcidin片段的瓊脂糖電泳圖。圖中M為100bp ladder Marker；1為黑鯛Hepcidin-prodomain回收產(chǎn)物；500、400、300、200、100代表DL2000 Marker中各核酸片段的堿基數(shù)目，核酸數(shù)目單位為bp，即堿基數(shù)。B圖為pTrc-CKS載體的瓊脂糖電泳圖。圖中M為λHindIII DNA Marker；2為pTrc-CKS載體；23,130、9,416、6,557、4,361、2,322、2,037代表λHindIII DNA Marker中各核酸片段的堿基數(shù)目；bp是核酸數(shù)目單位，即堿基數(shù)。
圖4為陽性單克隆測序結(jié)果示意圖。在圖4中，阿拉伯數(shù)目代表核酸堿基數(shù)目，核苷酸的開放閱讀框(ORF)編碼連續(xù)；小寫字母代表測序獲得的核苷酸序列；大寫字母代表編碼的氨基酸序列；下劃線標出目的基因與載體連接處；方框標志出Hepcidin的prodomain片段；橢圓框標出6個串聯(lián)的組氨酸標簽。
圖5為構(gòu)建的pTrc-CKS/Hepcidin融合表達載體結(jié)構(gòu)示意圖。在圖5中，PTrc代表E.coli Trc啟動子；RBS代表核糖體結(jié)合位點；ATG代表起始密碼子；CKSmut代表CKS的編碼序列；5.2Kb代表載體大小為5.2Kb；p3C cut site代表p3C酶切位點；MCS代表多克隆位點；hepcidin代表連接插入的hepcidin序列；6His代表6個組氨酸標簽序列；stop代表終止密碼子；Amp代表氨芐抗性基因位點；Ori代表復(fù)制起始位點。
圖6為將pTrc-CKS空質(zhì)粒與pTrc-CKS/Hepcidin重組質(zhì)粒在同樣的誘導(dǎo)表達條件下，取總菌體進行的SDS-PAGE電泳圖。在圖6中，M為SDS-PAGE低分子量標準蛋白質(zhì)Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量標準蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；1為pTrc-CKS空載體IPTG誘導(dǎo)3h菌體總蛋白；2為pTrc-CKS空載體未誘導(dǎo)菌體總蛋白；3和5為pTrc-CKS/Hepcidin重組表達載體IPTG誘導(dǎo)3h菌體總蛋白；4和6為pTrc-CKS/Hepcidin重組表達載體未誘導(dǎo)菌體總蛋白；CKS-hepcidin代表融合表達的hepcidin蛋白。
圖7為取表達菌體超聲波破碎并離心后的上清和沉淀，進行的SDS-PAGE電泳，對誘導(dǎo)表達產(chǎn)物進行可溶性分析圖。在圖7中，M為SDS-PAGE低分子量標準蛋白質(zhì)Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量標準蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；1為pTrc-CKS/Hepcidin未誘導(dǎo)菌體總蛋白；2為pTrc-CKS/Hepcidin誘導(dǎo)菌體總蛋白；3和4為pTrc-CKS/Hepcidin誘導(dǎo)菌體超聲破碎后上清；5和6為pTrc-CKS/Hepcidin誘導(dǎo)菌體超聲破碎后上清沉淀；CKS-hepcidin代表融合表達的hepcidin蛋白。
圖8為親和層析柱(IMAC)純化可溶性的目的蛋白圖。在圖8中，橫坐標為流經(jīng)層析柱的溶液的保留體積，單位為ml；縱坐標為280nm紫外吸收光密度值，單位為mAU；UV1_280nm代表280nm紫外吸收光密度值曲線；conc代表洗脫溶液的濃度百分比例，圖中洗脫溶液的濃度從0％瞬間增加到100％；流穿蛋白峰代表未與層析柱結(jié)合的蛋白；洗脫蛋白峰代表與層析柱合后又被洗脫下的蛋白峰。
圖9為收集洗脫組分進行的SDS-PAGE電泳圖。在圖9中，M為低分子量標準蛋白質(zhì)Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量標準蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；1為未經(jīng)過純化的菌體表達蛋白；2和3為IMAC柱純化后得到的洗脫蛋白；目的蛋白是指融合表達的hepcidin蛋白。
圖10為以6-His tag單克隆抗體做Western blot圖。在圖10中，M為低分子量標準蛋白質(zhì)Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量標準蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；1為IMAC柱洗脫蛋白電泳；2為硝酸纖維素雜交膜印跡；目的蛋白是指融合表達的hepcidin蛋白。
圖11為IMAC柱洗脫蛋白凝膠電泳圖譜以SynGene GeneTools系統(tǒng)光密度掃描所得定量分析圖。在圖11中，橫坐標為蛋白電泳泳道相對感應(yīng)距離(Rf distance down track)；縱坐標為相對剖面高度(Profile height)；實體部分代表純化的融合蛋白峰；目的蛋白是指融合表達的hepcidin蛋白。
圖12為表達產(chǎn)物的脫鹽層析圖譜。在圖12中，橫坐標為保留時間，單位為分鐘(min)；縱坐標為280nm紫外吸收光密度值，單位為mAU；UV1_280nm代表280nm紫外吸收光密度值曲線；UV1_215nm代表215nm紫外吸收光密度值曲線；Cond％代表電導(dǎo)值曲線；目標蛋白是指融合表達的hepcidin蛋白洗脫峰；咪唑是指脫鹽過程中脫去咪唑的峰圖13為P3C酶切蛋白后SDS-PAGE電泳圖。在圖13中，M為低分子量標準蛋白質(zhì)Marker；97.4、66.2、43.0、31.0、20.1代表低分子量標準蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；M2為超低分子量標準蛋白質(zhì)Marker；16.949、14.404KD、10.700DK、8.159KD、6.214KD代表超低標準蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片段的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；1為酶切后蛋白；融合蛋白代表融合表達的hepcidin蛋白，CKS代表CKS蛋白，hepcidin代表hepcidin蛋白。
圖14為Bradford法蛋白濃度測定標準曲線。在圖14中，橫坐標為BSA(蛋白)濃度，單位為mg/ml；縱坐標為595nm可見吸收光密度值A(chǔ)595，單位為A595；標準曲線的回歸方程為Y＝1.2375X+0.5816，R2＝0.9985。
圖15為Hepcidin原核表達蛋白對六種菌的殺傷指數(shù)圖，測試菌株有大腸桿菌鑒定株(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemeolyticus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。在圖15中，橫坐標為樣品，Sample1(樣品1)為表達的融合蛋白，濃度為0.2mg/ml；Sample2(樣品2)為酶切后的融合蛋白，濃度為0.2mg/ml；Sample3(樣品3)為酶切產(chǎn)物4倍稀釋，濃度為50μg/ml；Sample4(樣品4)為酶切產(chǎn)物8倍稀釋，濃度為25μg/ml；縱坐標為殺傷指數(shù)KI，單位為百分比。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1.重組表達載體pTrc-CKS/hepcidin的構(gòu)建1)含有黑鯛hepcidin(cDNA)的重組pPMD18-T陽性質(zhì)粒的獲得(1)利用Trizol試劑盒(購自Invitrogen公司)提取黑鯛幼魚肝總RNA。，(2)根據(jù)黑鯛Hepcidin基因(Genbank登錄號AY669377)合成特異引物S1(上游引物起始密碼子ATG前段序列26個bp(含ATG))TGAAGCAGTGGAAGCCTCCTAAGATG。
(3)3′RACE擴增黑鯛hepcidin基因按照TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set說明書進行cDNA第一鏈合成取1μl RNA(1～3μg)加入0.2ml薄壁管，70℃溫育10min，立即置于冰上。按照順序依次加入下列試劑配置反應(yīng)液10×RNA PCR Buffer 2μl，MgCl2(25mM)4μl，RNAasin(40U/μl)0.5μl，dNTPs(10mM each)2μl，Oligo dT-3sitesAdaptor Primer，(2.5μM)1.5μl 1.5μl，無RNA酶水9μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10U/μl)1μl，總反應(yīng)體積20μl，混合均勻，放置于PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30℃ 10min退火，42℃ 50min延伸，95℃ 5min滅活酶，4℃停止，反應(yīng)結(jié)束后，放置于-20℃保存。取1μl第一鏈反應(yīng)液作為模板，再依次加入反應(yīng)組分無菌MiliQ水73.2μl，10×反應(yīng)緩沖液(無Mg2+)10μl，MgCl2(25mmol/L)8μl，dNTPs(10mM each)1μl，上游引物S1(20pmol/μl)1μl，3sites Adaptor Primer(10pmol/μl)2μl，Taq酶(5U/μl)0.8μl，總反應(yīng)體積100μl，混合均勻，在熱循環(huán)儀上按照以下程序進行PCR反應(yīng)94℃ 2min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 5min，4℃ Pause。
(4)第三步PCR擴增目的片段的回收PCR擴增產(chǎn)物用2％(W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳分離后，無菌切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，按照Qiaquick Gel Extraction Kit(購自QIAGEN)說明書操作回收DNA片斷。黑鯛3′RACE產(chǎn)物的電泳圖見圖1。
(5)目的片段與pMD18-T載體的連接按照pMD18-T載體試劑盒說明書將純化后的PCR產(chǎn)物與載體連接，反應(yīng)體系如下pMD18-T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)0.5～1μl，DNA片段4～4.5μl，Ligation Solution I 5μl，總反應(yīng)體積10μl，16℃孵育過夜。
(6)將連接產(chǎn)物用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER1647(購自寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的平板中挑取生長良好的單克隆菌落，接種于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm搖床培養(yǎng)過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。用EcoR I和Hind III雙限制性內(nèi)切酶酶切pMD18-T載體多克隆位點和Sac I單限制性內(nèi)切酶酶切擬插入hepcidin基因片段以鑒定陽性重組質(zhì)粒。反應(yīng)體系為質(zhì)粒10μl，10×酶反應(yīng)緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶1～2μl，無菌MiliQ水Xμl，總反應(yīng)體積20μl，于37℃水浴反應(yīng)2h；取3μl反應(yīng)液進行2％(W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳鑒定。將能夠被酶切的重組陽性克隆送上海博亞生物技術(shù)有限公司(現(xiàn)并入Invitrogen公司)進行DNA核苷酸序列測定。結(jié)果表明黑鯛hepcidin(cDNA)已經(jīng)連接到pPMD18-T載體上，得到含有黑鯛hepcidin(cDNA)的重組pPMD18-T陽性質(zhì)粒(黑鯛hepcidin全長cDNA及由此推導(dǎo)出的氨基酸序列見圖2)。
2)根據(jù)pTrc-CKS載體多克隆位點，設(shè)計目的基因的上游引物H-H1-63U和下游引物H-H2-D。
GGA TCCGCAGAA TTCAGCGCT AGCCAC(TAA)CAT CAT CAT CAT CATTAA GCTTBamHI EcoRI NheIHisHis His His His His HindIII在上游引物5′端加上Bgl II酶切位點，與BamH I為同裂酶H-H1-63U5′GCCGAGATCTGGCTCATTCACTGAGGTG 3′在下游引物5′端加上Xba I酶切位點，與Nhe I為同裂酶H-H2-D5′GCGTCTAGAGAACCTGCAGCAGACACCAC 3′3)以黑鯛hepcidin(cDNA)重組pPMD18-T陽性質(zhì)粒為擴增模板，以H-H1-63U，H-H2-D為上、下游引物，用pfu高保真Taq酶擴增目的片段，反應(yīng)體系為無菌MiliQ水85.1μl10×反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)10μldNTPs(10mM each) 2μlpPMD18-T/hepcidin質(zhì)粒 4μlH-H1-63U(20pmol/μl) 4μlH-H2-D(20pmol/μl) 4μlpfu高保真Taq酶(5U/μl) 0.8μl總反應(yīng)體積 100μl混合均勻，在熱循環(huán)儀上按照以下程序進行PCR反應(yīng)
①94℃ 2min②30個循環(huán)94℃ 30sec60℃ 45sec72℃ 1min③72℃ 10min④4℃ Pause反應(yīng)結(jié)束后，將所有反應(yīng)液進行2％(W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收特異性片段，得到PCR產(chǎn)物長度為211bp。
4)預(yù)連接DNA片段的制備將上步中回收的PCR產(chǎn)物，用Bgl II和Xba I進行雙酶切，反應(yīng)液置于37℃水浴中反應(yīng)5h。酶切體系具體為PCR回收產(chǎn)物 20μl10×T酶反應(yīng)緩沖液5μl10×BSA 5μlBgl II和Xba I限制性內(nèi)切酶各2.5μl無菌MiliQ水 15μl總反應(yīng)體積 50μl反應(yīng)結(jié)束后，用2％(W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳檢查酶切效率；再用Qiagen凝膠回收試劑盒回收特異性片段，得到具有與處理好的pTrc-CKS線性載體相互配對的粘性末端的預(yù)連接cDNA片段(圖3-A)。
5)載體的處理將pTrc-CKS原核表達載體轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F′(購自晶美生物有限公司)，大量提取質(zhì)粒，具體操作方法為(1)菌體收集取1μl pTrc-CKS空載體轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F′，涂布在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落，并擴大到200ml大量搖床培養(yǎng)；(2)用堿裂解法大量提取質(zhì)粒DNA及聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒。
(3)載體的酶切和去磷酸化處理取15μl上述純化的pET-CKS質(zhì)粒，用Nhe I限制性酶(30U)，37℃孵育5h；反應(yīng)結(jié)束后，用U-gene酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒除去酶及核苷酸碎片；1％(W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳檢測酶切效率；用BamH I限制性內(nèi)切酶(30U)，37℃酶切回收過的質(zhì)粒5h；反應(yīng)結(jié)束后加入堿性磷酸酶(30U)，37℃反應(yīng)0.5h使線性的載體去磷酸化；將反應(yīng)液進行1％(W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳后，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收特異性片段，處理好的載體具有BamH I和Nhe I的粘性末端，存于-20℃待用。大量純化的pTrc-CKS質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切及回收處理后線性化成為單一的清晰條帶(圖3-B)。
6)表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和鑒定將經(jīng)一系列處理后具有相同粘性末端的pTrc-CKS原核表達載體與含有黑鯛hepcidin基因的預(yù)連接DNA片段連接，反應(yīng)體系如下pTrc-CKS載體 1μlHepcidin片段 4μlLigation Solution I5μl總反應(yīng)體積 10μl16℃孵育過夜；次日，取5μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化至50μl E.coli TOP10F′感受態(tài)細胞中，涂布在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落，以H-H1-63U，H-H2-D為引物，如前所述用PCR法鑒定陽性克隆菌，由上海英俊(Invitrogen)公司進行DNA核苷酸序列測定，結(jié)果顯示連接正確，核苷酸的開放閱讀框(ORF)編碼連續(xù)(圖4)，得到pTrc-CKS/hepcidin重組表達質(zhì)粒(圖5)。該表達載體采用E.coli Trc啟動子和蛋白質(zhì)工程改造過CKS基因融合表達，同時選用P3C酶切割位點可將融合蛋白部分切除，并在C端添加6個組氨酸便于采用親和層析純化目標蛋白。通過計算得知，pTrc-CKS空載體誘導(dǎo)表達的蛋白為268aa，理論分子量為29.0kDa；pTrc-CKS/hepcidin重組載體誘導(dǎo)表達的蛋白為328aa，理論分子量為36.3kDa。
2.pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達1)誘導(dǎo)表達用U-gene質(zhì)粒小量提取試劑盒(購自U-gene公司)提取經(jīng)鑒定正確的pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒，用熱擊法將pTrc-CKS空質(zhì)粒和pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coli TOP10F′感受態(tài)細胞中，涂布于表達用LB瓊脂平板(含0.2％葡萄糖，120μg/ml Amp)，37℃培養(yǎng)過夜；在菌落較小時，挑取若干pTrc-CKS空質(zhì)粒和pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板生長的單菌落，分別接種于20ml LB表達用培養(yǎng)基中(含0.2％葡萄糖，120μg/ml Amp)，90～120rpm/min，30℃培養(yǎng)過夜至OD600約為0.5，然后加入IPTG至終濃度為100μg/ml，在37℃下180～200rpm/min搖床培養(yǎng)3h誘導(dǎo)表達。
2)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測融合蛋白表達量以pTrc-CKS空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli TOP10F′為對照，以pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli TOP10F′為實驗組，取若干份對照組及實驗組IPTG誘導(dǎo)前后的1ml菌液，分別離心收集菌體；用16μl無菌水溶解，加20μl 2×SDS加樣緩沖液和4μl β-巰基乙醇，沸水浴10min后，12000rpm離心1～3min，取上清進行SDS-PAGE電泳。配置SDS-PAGE凝膠。采用5％積層膠和12％分離膠，以8V/cm電壓電泳，當溴酚藍前沿進入分離膠(12％分離膠)后，以12V/cm電壓電泳，溴酚藍電泳至分離膠底部后，取出凝膠，考馬斯亮藍染色、脫色后掃描分析?？梢妏Trc-CKS空質(zhì)粒與pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在誘導(dǎo)后較誘導(dǎo)前都具有明顯的表達蛋白帶；并且重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒相比，具有明顯不同分子量的表達蛋白帶，空質(zhì)粒表達蛋白分子量在31.0kDa左右，重組質(zhì)粒在43.0kDa左右，與計算的理論分子量相似(圖6)。
3.pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達產(chǎn)物的可溶性分析1)按如上所述方法轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)20ml過夜種子液，取5ml種子液加至200ml LB中(含0.2％葡萄糖，120μg/mlAmp)，35℃下180～200rpm/min，搖床培養(yǎng)2～3h至OD600＝0.6，加入IPTG至濃度為100μg/ml，28℃誘導(dǎo)3h；2)離心收集菌體，用PBS約20ml懸浮菌體，超聲破碎，適當加少量溶菌酶；3)12000g，15min離心超聲液，取上清，如上所述進行SDS-PAGE電泳，可見菌體上清中可溶性的表達產(chǎn)物(圖7)。
4.親和層析法純化hepcidin融合表達產(chǎn)物1)上柱樣品的制備將具有較高可溶性表達hepcidin的菌株，大量誘導(dǎo)表達2～3升，離心收集菌體；用預(yù)冷的PBS(15ml/g濕菌)懸浮菌體，添加10mg溶菌酶，冰浴放置30min，不時攪拌；冰浴下超聲破碎菌體至菌液較清無粘性(功率360～400W，5秒間隔10秒，約90次)；12,000rpm高速冷凍離心20min，上清用0.45μm膜過濾后，添加1/10樣品體積的溶液D，至此準備好了上柱樣品。
2)準備金屬鏊合層析柱金屬鏊合層析填料為Super Chelating Resin(購自晶美生物有限公司)，親和層析介質(zhì)裝柱后，先過5ml溶液A鏊合Ni2+金屬離子，用5～10個柱體積MiliQ水洗柱；再過5～10個柱體積的溶液B洗去多余的Ni2+，并用5～10個柱體積MiliQ水洗柱；接著過5～10個柱體積溶液C平衡層析柱，等待上樣。
層析試劑為溶液A200mM硫酸鎳；
溶液B25mM NaH2PO4+500mM NaCl pH 4.0(用磷酸調(diào))；溶液C50mM磷酸緩沖液+200mM NaCl+40mM咪唑pH 8.0；溶液D50mM磷酸緩沖液+150mM NaCl+400mM咪唑pH 8.0；全部溶液用0.45μm濾膜過濾。
3)上柱純化將過濾后的可溶性上清液全部上柱，同時用5～10個柱體積的溶液C過柱，洗去未結(jié)合的蛋白；再用5個柱體積的溶液D過柱洗脫目標蛋白；收集洗脫峰，可見到明顯的洗脫蛋白峰(圖8)，取少量進行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果見圖9，通過凝膠掃描計算得知，掃描凝純化后的融合表達產(chǎn)物具有90％的純度(圖11)。
4、蛋白免疫印跡(Western-blot)鑒定融合表達產(chǎn)物取純化的融合表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，300～400mA下，轉(zhuǎn)移1.5h，將蛋白印跡至NC膜上，一抗(2uL His·Tag單抗稀釋至20ml，約200ng)室溫結(jié)合1～2h；二抗(2uL羊抗鼠IgG-AP稀釋至20ml)室溫結(jié)合1～2h；加入BCIP/NBT底物反應(yīng)液，顯色至出現(xiàn)顏色深度適宜的條帶，結(jié)果顯示為陽性條帶(圖10)。
5.洗脫蛋白的脫鹽及酶切反應(yīng)以脫鹽層析緩沖液(50mM Tris-Cl，0.15mM NaCl，pH 8.0)為平衡液，將親和層析洗脫下的hepcidin融合蛋白上脫鹽柱，檢測UV280nm、UV215nm和系統(tǒng)電導(dǎo)(cond％)曲線的變化，收集先通過層析柱的蛋白峰。經(jīng)過脫鹽層析后，可觀察在UV280nm、UV215nm和cond％曲線上蛋白峰和咪唑峰已經(jīng)完全分開(圖12)。抽真空冷凍干燥純凈的黑鯛hepcidin融合蛋白，以PBS(pH7.4)溶解，加入EDTA(pH 8.0)和DTT(終濃度為1mM)，再加入少量P3C蛋白酶，室溫下放置5h，置于4℃下繼續(xù)反應(yīng)48h，取少量進行SDS-PAGE電泳鑒定，可見融合蛋白部分CKS和hepcidin-prodomain已經(jīng)大部分分開，形成大小不同的兩條蛋白帶(圖13)。
6.Hepcidin重組蛋白抗菌活性的測定1)應(yīng)用Bradford法測定重組蛋白的濃度①取BSA儲液用1×PBS或0.9％生理鹽水稀釋10倍，終濃度為0.5mg/ml；②將0.5mg/ml BSA標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μl梯度加到96孔細胞培養(yǎng)板中，用1×PBS分別補足至20μl，每個濃度梯度設(shè)置3個平行樣；③分別加20μl、10μl、5μl待測樣品到96孔板的樣品孔中，用1×PBS分別補足至20μl，每個濃度梯度設(shè)置3個平行樣；
④每孔加入200μl G250染色液，室溫放置3～5min；⑤用酶標儀測定A595nm波長的吸光度；⑥根據(jù)標準曲線計算待測樣品的蛋白濃度。
應(yīng)用Bradford法測定BSA標準品得到蛋白濃度標準曲線(圖14)。根據(jù)公式可計算出hepcidin融合表達蛋白的濃度。
2)Hepcidin重組蛋白抗菌活性的測定(1)取被測細菌，在MH平板上劃線，倒置培養(yǎng)12～16h；挑取單克隆接種于MH斜面，繼續(xù)培養(yǎng)12～16h；用溶菌buffer清洗斜面培養(yǎng)物，調(diào)整稀釋至OD600＝0.1備用。其中大腸桿菌鑒定株、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)溫度為37℃，副溶血弧菌、溶壁微球菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為28～30℃。
(2)參照Genthner FJ等(1999)的方法，在96孔細胞培養(yǎng)板上進行，每種被測細菌按照以下操作設(shè)置空白對照組、陰性對照組和待測樣品實驗組，每組設(shè)置2個平行樣①空白對照組加25μl樣品和25μl溶菌buffer；②陰性對照組加25μl菌懸液和25μl溶菌buffer；③樣品實驗組加25μl待測蛋白樣品和25μl菌懸液；(3)28℃培養(yǎng)3h后，每孔加入50μl MH液體培養(yǎng)基；(4)28℃培養(yǎng)2h后，每孔加入10μl MTS-PMS混合液；(5)28℃培養(yǎng)1～12h后，用酶標儀測定A492nm波長的吸光度。
(6)按下列公式計算殺傷指數(shù)(KI)殺傷指數(shù)(％)＝[1-(實驗組A492-空白對照A492)/(陰性對照A492-空白對照A492)]×100分別測定兩種蛋白對4種革蘭氏陽性菌(G+)和2種革蘭氏陰性菌(G-)的殺傷指數(shù)。結(jié)果顯示，原核表達的黑鯛hepcidin蛋白產(chǎn)物能夠選擇性的對部分革蘭氏陽性菌和陰性菌產(chǎn)生殺傷作用。在融合蛋白酶切反應(yīng)前，該融合表達產(chǎn)物在0.2mg/ml濃度下只能抑制2種細菌的生長；但是經(jīng)過P3C酶切后，得到的蛋白產(chǎn)物在0.2mg/ml的濃度下能夠抑制5種細菌的生長；經(jīng)過稀釋后，酶切后蛋白在50μg/ml的濃度下能夠抑制其中3種細菌的生長，但在25μg/ml濃度下只能抑制1種細菌的生長?？梢娒盖泻蟮鞍椎目咕钚暂^融合蛋白的抗菌活性明顯增強，酶切后蛋白對所測4種細菌的殺傷指數(shù)都超過50％，但是隨濃度降低，殺傷指數(shù)普遍下降(副溶血弧菌除外)，甚至沒有殺傷能力(圖15)。
序列表<110>廈門大學(xué)境科學(xué)研究中心近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室State Key Laboratory for Marine EnvironmentalScience，Environmental Science Research Center，Xiamen University王，克堅楊，明蔡，晶晶<120>黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物及其構(gòu)建制備方法<130>
<150>Genbank AY669377<151>2005-08-15<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>28<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<400>1gccgagatct ggctcattca ctgaggtg 28<210>2<211>29<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(29)<400>2
gcgtctagag aacctgcagc agacaccac29<210>3<211>264<212>DNA<213>pTrc-CKS/hepcidin表達載體<220>
<221>CDS<222>(1)..(264)<400>3agc atg cca gac tct ctc gaa gtt ctg ttt cag ggt cca gca gga tct48Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser1 5 10 15ggc tca ttc act gag gtg caa gag ccg gag gag cca atg aac aat gag96Gly Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Glu Pro Met Asn Asn Glu20 25 30agt cca gtt gct gca cat gaa gag aag tca gag gag tcc tgg aag atg144Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met35 40 45ccg tat aac aac aga cac aag cgc agc ccc gct ggt tgt cgc ttt tgc192Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly Cys Arg Phe Cys50 55 60tgc ggt tgc tgt cct aac atg aga gga tgt ggt gtc tgc tgc agg ttc240Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe65 70 75 80tct agc cac cat cat cat cat cat264Ser Ser His His His His His His85<210>4<211>88
<212>PRT<213>pTrc-CKS/hepcidin表達載體<400>4Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser1 5 10 15Gly Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Glu Pro Met Asn Asn Glu20 25 30Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met35 40 45Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly Cys Arg Phe Cys50 55 60Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe65 70 75 80Ser Ser His His His His His His85<210>5<211>88<212>PRT<213>Hepcidin融合表達蛋白<400>5Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser1 5 10 15Gly Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Glu Pro Met Asn Asn Glu20 25 30Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met35 40 45
Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly Cys Arg Phe Cys50 55 60Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe65 70 75 80Ser Ser His His His His His His8權(quán)利要求
1.黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體，其特征在于所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體是在含有E.coli Trc啟動子、蛋白質(zhì)工程改造過的CKS基因及組氨酸標簽的原核表達載體pTrc-CKS上連接黑鯛Hepcidin基因所構(gòu)建成的pTrc-CKS/hepcidin表達質(zhì)粒，具有P3C酶切割位點，C末端融合6個組氨酸，pTrc-CKS/hepcidin重組載體誘導(dǎo)表達的蛋白為328aa；其堿基序列如下agcatgccag actctctcga agttctgttt cagggtccag caggatctgg ctcattcact 780gaggtgcaag agccggagga gccaatgaac aatgagagtc cagttgctgc acatgaagag 840aagtcagagg agtcctggaa gatgccgtat aacaacagac acaagcgcag ccccgctggt 900tgtcgctttt gctgcggttg ctgtcctaac atgagaggat gtggtgtctg ctgcaggttc 960tctagccacc atcatcatca tcat 984氨基酸序列如下↓P3C切點Ser Met Pro Asp Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Gly Ser Gly Ser PheThr Glu Val Gln Glu Pro Glu Pro Met Asn Asn Glu Ser Pro Val Ala Ala His GluGlu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser ProAla Gly Cys Arg Phe Cys Cys Gly Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys CysArg Phe Ser Ser
2.黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達產(chǎn)物，其特征在于所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達產(chǎn)物為含有pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒的E.coli TOP10F′表達菌株。
3.黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于所述的構(gòu)建制備方法如下(1)重組表達載體pTrc-CKS/hepcidin的構(gòu)建1)根據(jù)黑鯛Hepcidin基因合成上游引物S1CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，起始密碼子ATG前段序列26個bp，然后3′RACE擴增黑鯛hepcidin基因，回收PCR擴增目的片段，將目的片段與pMD18-T載體連接，最后將連接產(chǎn)物用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER1647感受態(tài)細胞，得到含有黑鯛hepcidin(cDNA)的重組pPMD18-T陽性質(zhì)粒；2)根據(jù)pTrc-CKS載體多克隆位點，設(shè)計目的基因的上游引物H-H1-63U和下游引物H-H2-D，在上游引物5′端加上Bgl II酶切位點，與BamH I為同裂酶，上游引物H-H1-63U為5′GCCGAGATCTGGCTCATTCACTGAGGTG 3′在下游引物5′端加上Xba I酶切位點，與Nhe I為同裂酶，下游引物H-H2-D為5′GCGTCTAGAGAACCTGCAGCAGACACCAC 3′3)以包含黑鯛hepcidin(cDNA)重組pMD18-T質(zhì)粒為擴增模板，以H-H1-63U，H-H2-D為上、下游引物，用pfu高保真Taq酶擴增hepcidin表達序列，得到PCR產(chǎn)物長度為211bp；4)將pTrc-CKS原核表達載體轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F′，得到具有BamH I和Nhe I的粘性末端的載體；5)將回收的PCR產(chǎn)物用Bgl II和Xba I進行雙酶切，得到具有與處理好的pTrc-CKS線性載體相互配對的粘性末端的預(yù)連接cDNA片段；6)將具有相同粘性末端的pTrc-CKS原核表達載體與含有黑鯛hepcidin基因的預(yù)連接DNA片段連接，得到pTrc-CKS/hepcidin重組表達質(zhì)粒；該表達載體采用E.coli Trc啟動子和蛋白質(zhì)工程改造過CKS基因融合表達，具有P3C酶切割位點，C末端融合6個組氨酸；(2)pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達用熱擊法將pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli TOP10F′感受態(tài)細胞中誘導(dǎo)表達；(3)pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒融合表達產(chǎn)物的純化1)將pTrc-CKS/hepcidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物離心收集菌體，用PBS懸浮菌體，超聲破碎，加溶菌酶；離心超聲液，取上清進行SDS-PAGE電泳，確認表達產(chǎn)物的可溶性；2)親和層析法純化hepcidin融合表達產(chǎn)物將具有可溶性表達hepcidin的菌株大量誘導(dǎo)表達后收集菌體，采用金屬鏊合層析柱進行親和層析；3)洗脫蛋白的脫鹽及酶切反應(yīng)以脫鹽層析緩沖液為平衡液，將親和層析洗脫下的hepcidin融合蛋白上脫鹽柱，收集先通過層析柱的蛋白峰，抽真空冷凍干燥。以磷酸鹽緩沖液溶解融合表達蛋白，加入乙二胺四乙酸和二硫蘇糖醇，再加入P3C蛋白酶進行酶切反應(yīng)；4)Hepcidin重組蛋白抗菌活性的測定測定融合表達產(chǎn)物酶切反應(yīng)前和經(jīng)過P3C酶切后得到的蛋白產(chǎn)物對大腸桿菌鑒定株、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、枯草芽孢桿菌的殺傷指數(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于親和層析法純化hepcidin融合表達產(chǎn)物中金屬鏊合層析柱所用的填料為SuperChelating Resin。
5.如權(quán)利要求3所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于親和層析法純化hepcidin融合表達產(chǎn)物中親和層析采用的試劑為溶液A200mM硫酸鎳；溶液B25mM NaH2PO4+500mM NaCl pH 4.0；溶液C50mM磷酸緩沖液+200mM NaCl+40mM咪唑pH 8.0；溶液D50mM磷酸緩沖液+150mM NaCl+400mM咪唑pH 8.0；溶液A鏊合Ni2+金屬離子，溶液B洗去多余的Ni2+，溶液C平衡層析柱及洗去未結(jié)合的蛋白，溶液D過柱洗脫目標蛋白。
6.如權(quán)利要求3所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于所述的脫鹽層析緩沖液為50mM Tris-Cl，0.15mM NaCl。
7.如權(quán)利要求6所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于所述的脫鹽層析緩沖液pH 8.0。
8.如權(quán)利要求3所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于洗脫蛋白的脫鹽及酶切反應(yīng)中磷酸鹽緩沖液的pH為7.4。
9.如權(quán)利要求3所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于洗脫蛋白的脫鹽及酶切反應(yīng)中乙二胺四乙酸的pH為8.0。
10.如權(quán)利要求3所述的黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物的構(gòu)建制備方法，其特征在于洗脫蛋白的脫鹽及酶切反應(yīng)中二硫蘇糖醇終濃度為1mM。
全文摘要
黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體和表達產(chǎn)物及其構(gòu)建制備方法，涉及一種可高效表達黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體的構(gòu)建與表達。黑鯛抗菌肽Hepcidin的表達載體是在含有E.coliTrc啟動子、蛋白質(zhì)工程改造過的CKS基因及組氨酸標簽(His－Tag)的原核表達載體pTrc－CKS上連接黑鯛Hepcidin基因所構(gòu)建成的pTrc－CKS/hepcidin表達質(zhì)粒，具有P3C酶切割位點，C術(shù)端融合6個組氨酸。其融合表達產(chǎn)物CKS－h(huán)epcidin可通過C末端His－Tag親和層析純化，純化的融合產(chǎn)物可用P3C酶將融合蛋白中的CKS切除，獲得純化的Hepcidin。
文檔編號C07K14/46GK101063145SQ20071000886
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者王克堅, 楊明, 蔡晶晶 申請人:廈門大學(xué)