本發(fā)明涉及動物分子遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種zfy基因的RNA干擾片段、表達(dá)載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在自然條件下，幾乎所有哺乳動物的性別比例都接近1:1，從而實現(xiàn)了無間斷地進(jìn)行穩(wěn)定地繁衍后代，在自然的條件下達(dá)到生態(tài)平衡。對于畜牧生產(chǎn)實際而言，理想的性別比例具有十分重要的意義。利用泌乳、產(chǎn)蛋性狀進(jìn)行生產(chǎn)的生產(chǎn)企業(yè)希望得到更多的雌性個體，而產(chǎn)肉、產(chǎn)毛性狀的在雄性個體上表現(xiàn)得優(yōu)勢性更加明顯。一直以來，人類對控制動物后代的性別就有著極大的興趣。目前性別控制主要從受精前和受精后兩個方面進(jìn)行，前者應(yīng)用精子分離后再進(jìn)行受精，使得在受精時就決定了后代的性別；后者采用早期胚胎性別鑒定，進(jìn)行胚胎的性別篩選的方法來控制后代的性別。
哺乳動物性別決定理論認(rèn)為，性染色體為“XX”的受精卵就能夠發(fā)育成雌性個體，而性染色體為“XY”的就會發(fā)育成雄性。那么從根本上講，控制家畜性別最理想的方法是先分離X、Y精子，然后再進(jìn)行受精，就能人為地控制后代的性別，理論上這是在性別控制中最簡單、最經(jīng)濟(jì)的途徑。自20世紀(jì)50年代后，關(guān)于精子分離的研究報告很多，這些研究都試圖利用X精子和Y精子不同的物理特性(體積、密度、電荷、運(yùn)動性))，采用離心法、電泳法、離子交換法、細(xì)胞表面抗原法等不同的方法來實現(xiàn)精子的分離，但是都有一個共同的問題——可重復(fù)性差。而且這些差異隨著環(huán)境條件的不同而發(fā)生變化，因此，許多研究結(jié)果常常不一致，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)論，致使兩類精子某些差異性研究存在爭議。到目前為止，除了X、Y精子DNA含量具有差異可以肯定之外，其他方面的差異表現(xiàn)很小，甚至難以確定。但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及研究工作的繼續(xù)深入，新的研究成果將會不斷涌現(xiàn)。
目前根據(jù)哺乳動物X、Y精子DNA含量存在差異的原理，利用流動細(xì)胞檢索儀進(jìn)行分離X、Y精子，分離效果最好，純度可達(dá)90％以上，但是由于設(shè)備昂貴，分離速度慢，用于受精的精子數(shù)量少、活力差等原因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上對性控精液的大量需求。相比之下，如果能夠找到兩種精子發(fā)育或受精過程中，甚至胚胎發(fā)育時關(guān)鍵性的X、Y染色體特異mRNA，結(jié)合當(dāng)代新興的分子生物學(xué)技術(shù)利用RNA干擾(RNA Interference，RNAi)的方法則有望以較低的成本，簡便、快速地實現(xiàn)對動物的性別控制。
RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS)現(xiàn)象，通過體外人工合成或體內(nèi)產(chǎn)生的雙鏈RNA(Dubble-stranded RNA.dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異性地降解其同源的mRNA，使得相應(yīng)的基因干擾，實現(xiàn)阻止目標(biāo)基因的表達(dá)。RNAi方法能夠快速、簡便、有效、特異地下調(diào)細(xì)胞中的基因表達(dá)，它不但是研究基因功能的一種有力工具，而且也為特異性基因治療提供了新的技術(shù)手段，其應(yīng)用前景十分廣闊。
在基因組、mRNA和蛋白水平的研究都證明，X、Y精子基因表達(dá)的確存在差異。基因表達(dá)檢測研究表明，在精子形成的減數(shù)分裂粗線期，為防止一些酶類與性染色體發(fā)生作用，兩條性染色體高度濃縮形成性體。性體的形成保護(hù)了性染色體，性染色體上特殊基因的表達(dá)被關(guān)閉。因此，哺乳動物成熟精子中沒有mRNA的轉(zhuǎn)錄，然而哺乳動物成熟精子中卻含有mRNA，這種差異來自精子發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄，其翻譯遠(yuǎn)落后于轉(zhuǎn)錄。這些mRNA是精子成熟后指導(dǎo)合成一些必須的蛋白，或者是受精后對卵母細(xì)胞mRNA庫的補(bǔ)充，或作為RNAi對生育和胎兒生長發(fā)育起著關(guān)鍵的作用。
Hendriksen等對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂過程中，除Xist基因表達(dá)外，幾乎所有的性染色體基因都沒有表達(dá)，然而減數(shù)分裂后期，一些性染色體特異基因開始表達(dá)。減數(shù)分裂后，檢測到Y(jié)染色體上Ubely 和Sry基因具有較高的mRNA水平；在X精子中也檢測到Ubelx基因mRNA高水平表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)X染色體特異基因Mhr6A的表達(dá)產(chǎn)物。另外還有人發(fā)現(xiàn)X、Y染色體其他特異基因的表達(dá)，如X染色體特異基因Akap82(精子尾部的骨架蛋白)及Nap-X(編碼一種核相關(guān)蛋白)，Y染色體特異基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。
其中Zfx/Zfy基因是染色體上編碼鋅指蛋白的一對等位基因，從減數(shù)分裂期開始表達(dá)，在圓形精子細(xì)胞中的含量最高。Zfx基因是ZFY(zinc finger-Y)基因家族中的一員，ZFY家族包括Zfx，Zfy和Zfa基因，他們在分子結(jié)構(gòu)上非常相似。一般哺乳動物有Zfx和Zfy基因,Zfx基因位于X性染色體上,是雌、雄性哺乳動物X染色體必含的基因,Zfy基因位于Y性染色體上，兩個基因位于性染色體的末端，但并不位于同源區(qū)域。Zfx基因包括一個酸性的轉(zhuǎn)錄激動區(qū)域，一個核定位序列和一個DNA連接區(qū)，具有13個C2H2[Cys(2)His(2)]型鋅指結(jié)構(gòu)。在哺乳動物細(xì)胞中，C2H2鋅指結(jié)構(gòu)是最常見的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之一。目前已發(fā)現(xiàn)800多種具有這種鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，具有重要的生理功能。Zfx/Zfy編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，在精子形成過程中具有一些功能并與精子的發(fā)生有關(guān)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明實施例提供一種zfy基因的RNA干擾片段，主要目的是通過對雄性犬的生殖細(xì)胞Y精子生成的相關(guān)基因進(jìn)行沉默，阻礙或者破壞Y精子的正常發(fā)育和功能。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術(shù)方案：
一方面，本發(fā)明實施例提供了一種zfy基因的RNA干擾片段，其序列為GCAAGAACTTTCCTCATAT、GACAGCTGAACAAGGCTTA、GAAGTCATCAAGGTATACA或GGATGAAGATGAACTTGCA。
另一方面，本發(fā)明實施例提供了一種上述實施例所述的zfy基因的RNA干擾片段在控制犬子代性別中的應(yīng)用。
作為優(yōu)選，上述的應(yīng)用中，以zfy基因的RNA干擾片段對犬精子細(xì)胞中的Y精子生成相關(guān)基因進(jìn)行沉默，產(chǎn)生特定類型的精子細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明實施例提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體克隆有上述實施例所述的zfy基因的RNA干擾片段。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明實施例提供的zfy基因的RNA干擾片段通過對雄性犬的生殖細(xì)胞Y精子生成的相關(guān)基因進(jìn)行沉默，阻礙或者破壞Y精子的正常發(fā)育和功能。在與雌性犬交配時給與了X精子更多的受精機(jī)會，在受精前有效的控制了犬的性別從而使子一代犬產(chǎn)生的雌犬率大大升高。本方法對所需精子細(xì)胞不會造成損傷或者降低其活力，而且成本低廉。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。在下述說明中，不同的“一實施例”或“實施例”指的不一定是同一實施例。此外，一或多個實施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)、或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。
構(gòu)建zfy基因的RNAi干擾載體：
所使用的zfy基因序列來自于NCBI基因庫，根據(jù)RNAi設(shè)計原則和在NCBI上的比對分析結(jié)果篩選出4個siRNA片段，如表1所示，為siRNA體外轉(zhuǎn)錄的zfy cDNA模板。分別在每個siRNA片段的5’和3’添加Hpa I和Xhol I酶切位點(diǎn)，參見表3所示，然后送生物公司合成siRNA片段。正、反義鏈通過退火合為雙鏈連接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen Vector(Clontech，美國)載體上，然后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中(Tiangen,中國)進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒-20℃保存。
表1 siRNA的zfy cDNA模板
zfy基因的體外干擾試驗：
選取5月齡的健康雄性當(dāng)?shù)赝练N犬3只，通過手術(shù)在無菌條件下取出每只犬的雙側(cè)睪丸，采用兩步酶消化法分離出睪丸支持細(xì)胞和生精細(xì)胞。將這些分離出的細(xì)胞放入含10％胎牛血清的HamF12/DMEM培養(yǎng)液中，內(nèi)添加HEPES(15mol/L)、100kU/L青霉素以及0.1g/L鏈霉素、1ug/ml表皮生長因子、100ul ITS(胰島素,轉(zhuǎn)鐵蛋白,硒酸鈉){胰島素(10μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(10μg/ml)}、3.3×10-7mol/L視黃酸、維生素A(3.3×10-7mo/L)、10μg/ml維生素E、10-4mol/L維生素C、10-3mol/L丙酮酸、10-7mol/L睪酮、25U/L rFSH。約按1×106CELL/cm2的密度接種于放有蓋玻片的六孔板中，在32℃、5％CO2、濕度為95％的條件下培養(yǎng)24小時，用鈣離子作為轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到生精細(xì)胞中，每組重復(fù)三次。轉(zhuǎn)染48小時候提取生精細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR檢測zfy基因的mRNA表達(dá)水平(相關(guān)目的基因、內(nèi)參基因引物、PCR條件見表2)。挑選出干擾效果較好的干擾片段進(jìn)行下一步的實驗，如表3所示，以下簡稱pzq1(Zfy1904)、pzq2(zfy1857)、pzq3(Zfy1018)和pzq4(Zfy291)，表3為zfy基因RNAi寡核苷酸序列的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。
表2.熒光實時定量目的基因和內(nèi)參基因引物序列及PCR條件
表3.帶有Hpa I和Xhol I酶切位點(diǎn)的zfyRNAi序列
zfy基因的動物體內(nèi)干擾試驗：
選取12只成年健康雄性當(dāng)?shù)赝练N犬，隨機(jī)平均分為3組，每組4只；27只經(jīng)產(chǎn)健康母犬隨機(jī)分為3組，每組9只。每組雄犬分別睪丸注射干擾載體Pqz1、Pqz2和等體積的生理鹽水，每只睪丸注射相同體積的干擾載體0.3mg。間隔10天注射一次連續(xù)注射3次。最后一次注射5天后隨機(jī)挑選27只2歲齡的經(jīng)產(chǎn)健康當(dāng)?shù)赝练N雌性犬腹腔注射PMSG 5U，42-48h后注射5U HCG，然后與每組其中3只雄犬按雌雄比例3:1合籠(此時距最后一次注射質(zhì)粒7d)。每日早晨，觀察陰道分泌物判斷雌犬是否受孕，直至受孕，然后將雌犬與雄犬分開進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，觀察產(chǎn)出后代的性別比例。合籠同時將每組剩余的1只雄犬處死，取雙側(cè)睪丸提取總RNA,用RT-PCR檢測各組zfy基因的mRNA表達(dá)水平，如表2所示為目的基因的引物和PCR的條件。
本發(fā)明實施例應(yīng)用PLL3.7慢病毒骨架質(zhì)粒載體的特異性酶切位點(diǎn)Hpa I和Xhol I，來優(yōu)化RNAi干擾載體，只保證載體侵染活力，不進(jìn)行病毒包裝，確保性控試劑的生物安全性。
實驗結(jié)果：
1、RT-PCR檢測生精細(xì)胞中zfy基因mRNA的表達(dá)水平：
選擇構(gòu)建好的干擾載體pzq1、pzq2、pzq3和pzq4，轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的犬睪丸生精細(xì)胞，通過RT-PCR，以表2所示的熒光實時定量目的基因和內(nèi)參基因引物序列及PCR條件，檢測體外條件下，犬生精細(xì)胞zfy基因mRNA表達(dá)量。與正常對照組相比，干擾載體pzq3和pzq4對zfy基因的mRNA無干擾抑制作用。而干擾載體pzq1、pzq2均可降低犬生精細(xì)胞中zfy基因mRNA表達(dá)量。其中干擾組pzq1的生精細(xì)胞中zfy基因mRNA表達(dá)量降低98.7％，差異極顯著(P＜0.01)。
2、RT-PCR檢測注射干擾試劑的睪丸組織中zfy基因mRNA的表達(dá)水平：
將體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞水平篩選的有效干擾載體pzq1、pzq2注射入犬活體睪丸，采集睪丸組織，通過RT-PCR，以表2所示的熒光實時定量目的基因和內(nèi)參基因引物序列及PCR條件，檢測體內(nèi)條件下，犬睪丸組織zfy基因mRNA表達(dá)量。與對照組相比，pzq2組zfy基因mRNA表達(dá)量下降了8％，差異不顯著。而pzq1組zfy基因mRNA表達(dá)量下降了97％，差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)果顯示實驗組pzq1、pzq2中zfy基因mRNA的表達(dá)水平均低于對照組(生理鹽水組)，pzq1差異極顯著(P＜0.01)。
3、犬體內(nèi)干擾試驗結(jié)果：
如表4，將體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞水平篩選的有效干擾載體pzq1、pzq2，作為性控試劑，注射入犬活體睪丸，自然交配，統(tǒng)計子一代犬的雌雄數(shù)量。對照組注射生理鹽水，子一代雌犬率為56.52％；注射pzq2載體，子一代雌犬率為52.38％，性別偏移不顯著(P＞0.05)；注射pzq1載體，子一代雌犬率為79.17％，性別偏移差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)果顯示實驗組pzq2子一代犬的雌犬率與對照組沒有差異(P＞0.05)，而實驗組pzq1的子一代雌犬率高達(dá)79.17％，差異極顯著(P＜0.01)。表4顯示各組后代(子一代)雌雄犬?dāng)?shù)量。
表4犬睪丸注射干擾試驗子一代性別統(tǒng)計表
注：兩組之間有任一字母相同者為差異不顯著，大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著。
表5體內(nèi)外性控效果最好的干擾載體寡核苷酸序列
以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。