專利名稱：檢測白血病急變的主效基因之一gat a－2突變基因的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學、細胞生物學、白血病學領域。具體地說，本發(fā)明涉及檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的方法及其應用背景技術慢性粒細胞性白血病(CML)是造血干細胞增殖紊亂性疾病，以染色體易位t(9；22)(q34；q11)產生費城染色體為主要特征。易位產生的BCR-ABL融合蛋白具有持續(xù)的酪氨酸激酶活性，可以使細胞發(fā)生轉化，導致腫瘤發(fā)生。轉基因小鼠實驗已經證實BCR-ABL融合蛋白可以導致慢性粒細胞性白血病的發(fā)生，使細胞獲得生存和增殖優(yōu)勢，但是，慢性粒細胞性白血病急變時細胞還會發(fā)生分化阻滯。所以，臨床上CML患者從相對良性的慢性期轉化到加速期和急變期需要“二次打擊”，即除BCR-ABL融合蛋白以外再發(fā)生一次遺傳學改變，使已經獲得生存和增殖優(yōu)勢的白血病細胞發(fā)生分化阻滯，后者被認為是促進因素。然而，目前只有很少的患者由CML-CP轉化到BC的相關遺傳學事件被發(fā)現p53和p16/ARF突變發(fā)生在10-20％的急變患者中；少數患者有Rb和Ras突變；少數患者有染色體易位產生的融合蛋白NUP98-HOXA9和AML-1-EVI，但是p53、p16/4RF、Rb和Ras等主要還是使細胞獲得生存和增殖優(yōu)勢，白血病細胞在急變時發(fā)生分化阻滯的原因仍未明。
AML-1(runt相關轉錄因子1或急性髓細胞性白血病因子1)是一種已知的基因(genebank登錄號RNA gi49574545；DNA gi51475294)，位于21q22.3，在各系血細胞中廣泛表達，AML-1和CBFβ結合成異二聚體調控許多造血分化相關基因的表達，現已證實AML-1轉錄調控的靶基因有MPO、GM-CSFR、M-CSFR、中性粒細胞酯醇、IL3、IL5、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、明膠酶β、TCRs和B-細胞受體等。AML-1-/-小鼠胎肝造血障礙，造血干細胞不能向下階段分化成熟，各系血細胞生成障礙，導致貧血及中樞神經系統(tǒng)出血使小鼠死于胚胎發(fā)育期。AML-1和CBFβ上調促進巨核細胞的分化，而下調促進紅細胞的分化。AML-1和CBFβ是人類白血病染色體易位經常累及的基因，易位產生的融合蛋白主要以顯性負形式抑制正常AML-1的功能而致白血病。AML-1也是人類白血病中最常發(fā)生突變的基因之一，在散發(fā)性白血病例如AML(M0，MI，M2，M3，M4，M5，M7主要是M0)、MDS轉化的AML、繼發(fā)性(治療相關)MDS/AML、伴隨21三體的髓性惡性疾病、DOWN氏綜合癥相關的血液疾病、伴隨7q-的骨髓異常增殖性疾病等都發(fā)現了AML-1的點突變。迄今為止，只有兩篇文章涉及在慢性粒細胞性白血病急變患者中篩查AML-1突變，總共篩查84例患者只發(fā)現一例R80C突變，作者認為AML-1突變在慢性粒細胞性白血病急變患者中罕見。
GATA-2(GATA轉錄因子2)是一種已知的基因(genebank登錄號RNA GI31982886；DNA gi37550867)，位于3q21.3，主要表達于造血干細胞早期階段并隨著造血細胞的分化、發(fā)育成熟表達下調.GATA-2的缺失可導致造血的嚴重缺陷和胚胎死亡。GATA-2下調出現于造血干細胞向祖細胞的演變過程中，從而邁出了造血分化的關鍵一步。GATA-2的表達下調對于紅系分化是必需的，且過度表達GATA-2還可使細胞向巨核細胞分化。GATA-2調節(jié)的靶基因可能參與了急性早幼粒細胞白血病的發(fā)病機制，并在誘導分化治療中被激活轉錄。GATA-2與ROG，TZFP，PML-RARA，PLZF-RARA之間存在交互作用。MITF聯合GATA-1或GATA-2使嗜堿前體細胞分化成熟。到目前為止國內外報道GATA-2基因突變的發(fā)生率并不高，國內國人李發(fā)現1例M1型和1例M2型病人出現點突變。目前對GATA-2的研究主要集中在其生物學特性和功能方面，而對其在白血病中的作用的報道不多，未見GATA-2突變與慢性粒細胞性白血病急變相關的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于(1)公開檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的方法；(2)公開檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因方法的應用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方法來實現的發(fā)明人以造血相關轉錄因子為候選基因，在85例中國人群慢性粒細胞性白血病急變患者(其中急髓系變患者51例，急淋系變患者6例，加速期患者28例)中篩查可能的突變。經過大量的實驗，用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增-直接測序技術在兩例加速期患者和九例急變期患者中發(fā)現有AML-1突變(突變頻率為12.9％)，其中有兩例患者具有相同的點突變。九例發(fā)生在runt同源盒結構域；一例發(fā)生在AML-1的輔助抑制因子Ear-2的結合位點；一例發(fā)生在轉錄激活結構域；一例發(fā)生在轉錄抑制結構域。在一例加速期患者和八例急變期患者中發(fā)現有GATA-2突變(突變頻率為10.6％)，其中一例患者是缺失突變，發(fā)生在第一鋅指結構域；八例患者具有相同的點突變，發(fā)生在第二鋅指結構域。我們對上述患者的慢性期骨髓標本以及200例正常對照外周血標本采用同樣的直接測序法，均未檢測到上述突變。伴AML-1基因突變的其中1例患者在急變后還獲得了一次完全緩解，完全緩解時沒有檢測到該突變。說明這些突變是與慢性粒細胞性白血病急變相關的，而且在加速期就已經能檢測到。從而本發(fā)明找到了兩個慢性粒細胞性白血病急變二次打擊的遺傳學事件。
本發(fā)明提供了檢測慢性粒細胞性白血病急變相關基因GATA-2突變基因的方法，所述方法為直接測序法。
第一種方法A提取DNA，對GATA-2基因外顯子設計引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
第二種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
第三種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然后轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
本發(fā)明提供了一種檢測慢性粒細胞性白血病急變相關基因AML-1突變基因的方法，所述方法為直接測序法。
第一種方法A提取DNA，對AML-1基因外顯子設計引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
第二種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；
BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
第三種方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然后轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
本發(fā)明優(yōu)選突變位點位于AML-1的RUNT結構域和GATA-2的第一、第二鋅指結構域。更優(yōu)選突變位點至少一個位于AML-1 1788delC(氨基酸突變L71fs-ter94)、C1812A(氨基酸突變H78Q)、G1815C(氨基酸突變W79C)、C1993G(氨基酸突變R139G)、A2090G(氨基酸突變D171G)、G2099A(氨基酸突變R174Q)、C2455T(氨基酸突變R293X)、2356-2357insCAAT(氨基酸突變Y260fs-ter573)、1849delG(氨基酸突變V91fs-ter94)、2718-2722delCGGCG(氨基酸突變G381fs-ter570)和GATA-2基因的T1075G(氨基酸突變L359V)、1021-1038del(氨基酸突變A341-G346del)。
本發(fā)明提供檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一AML-1和
GATA-2突變基因的試劑盒試劑盒含有1)擴增引物引物名稱 上游引物序列 下游引物序列AML-1-C1 5’CCCCGCAGTAATAAAGG3’ 5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C2 5’ATGGCTGGCAATGATGAA3’ 5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C3 5’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’ 5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C4 5’CCAGCGGCATGACAACC3’ 5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E2 5’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’ 5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E3 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’ 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E4 5’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’ 5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E5 5’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E6 5’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’ 5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E7 5’CTCACTTCCGCTCCGTT3’ 5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’ 5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GATA-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’ 5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’ 5’TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’ 5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩沖液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩沖液。10×反應緩沖液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl 200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4dNTP(10mM/L)本發(fā)明提供了AML-1和GATA-2突變基因的檢測方法在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用以及突變的AML-1和GATA-2基因在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用。例如，由于本發(fā)明證實AML-1和GATA-2基因是慢性粒細胞性白血病急變相關基因中的兩個，尤其是突變集中在AML-1的RUNT結構域和GATA-2的第一、第二鋅指結構域，從而將AML-1和GATA-2基因與慢性粒細胞性白血病急變患者的藥物治療聯系起來，可以發(fā)明作用于這些靶點的藥物來治療慢性粒細胞性白血病急變患者，為慢性粒細胞性白血病急變患者的新藥研發(fā)提供理論依據。


圖1Kaplan-Meier生存曲線用SPSS統(tǒng)計軟件，曲線示兩組患者間由慢性期到急變期所需時間有顯著差別有AML-1突變的患者疾病進程相對緩慢；有GATA-2突變的患者疾病進程相對兇險。
圖211號患者測序圖。箭頭所示為AML-1突變位點C1812A(氨基酸突變H78Q)?；颊咴诼云诤屯耆徑馄诰鶠橐吧?。
圖318號患者測序圖。箭頭所示為AML-1突變位點2356_2357InsCAAT(氨基酸突變Y260fsTer573)。患者在慢性期為野生型，克隆后測序發(fā)現患者急變時插入CAAT，所以PCR產物直接測序時，該處序列為雙峰。
圖4GATA-2點突變A1075C(氨基酸突變L359V)測序圖。箭頭所示為點突變位點?；颊咴诼云跒橐吧?。
圖5GATA-2缺失突變測序圖。箭頭所示為GATA-2缺失突變位點1021-1038del(氨基酸突變A341-G346del)后的第一個核苷酸A，與野生型相比其前缺失18bp即GCCGCCAGAAGAGCCGGC?；颊咴诼云跒橐吧?，所以PCR產物直接測序時，該處序列為雙峰。
圖6GATA-23號患者骨髓細胞形態(tài)觀察，主要向粒單系方向急變。(a)慢性期骨髓涂片瑞氏染色，中性中幼粒、晚幼粒和桿狀核粒細胞比例增加；(b)-(g)急變期骨髓涂片(b)瑞氏染色，原始粒細胞、原始單核細胞和早幼粒細胞占78％；(c)髓過氧化物酶(MPO)染色，是粒系標志性染色，圖中強陽性，陰性和弱陽性共存，表明患者向粒-單方向急變。(d)過碘酸希夫氏堿(PAS)染色；(e)氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶(NAS-DCE)染色，是粒系特異性標記；(f)乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)染色，是單核系特異性標記；(g)NaF抑制NAS-DAE染色，是單核細胞特征性檢驗，能被NaF抑制說明患者向單核系急變。(h)GATA-26號患者急變期骨髓瑞氏染色涂片，原始粒細胞25％，嗜酸細胞占26.5％。
圖7AML-1 16號患者骨髓細胞形態(tài)觀察，主要向粒系方向急變。(a)慢性期骨髓涂片瑞氏染色，中性中幼粒、晚幼粒和桿狀核粒細胞比例增加；(b)-(e)急變期骨髓涂片(b)瑞氏染色，原始粒細胞72％；(c)髓過氧化物酶(MPO)染色陽性，說明患者向粒系急變；(d)過碘酸希夫氏堿(PAS)染色；(e)乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)染色。
圖8GATA-2野生型和兩個突變型L359V，Δ341-346的轉錄活性比較。a轉染實驗，用含GATA-2-RE的熒光素酶報告系統(tǒng)，將野生型GATA-2，L359V和Δ341-346分別和報告質粒一起轉染293-T細胞，用SV-40質粒作內參，pcDNA3.1空載作對照。結果顯示與野生型GATA-2比較L359V突變體有明顯的轉錄激活作用而Δ341-346轉錄抑制作用。b-d用實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測UPN2、UPN3、UPN6(即2號、3號和6號)三個患者GATA-2的三個靶基因在慢性期和急變期的表達水平，數據為平均值±標準誤，是三次獨立實驗的結果，緊靠在一起的成對柱狀圖左邊為慢性期測量值右邊為急變期測量值。
圖9體外蛋白吸附實驗(GST pull-down拉下試驗)，比較野生型GATA-2，L359V和Δ341-346與CBP或HDAC1之間的結合活性。與野生型相比L359V與CBP結合能力增強，Δ341-346無明顯變化；三者與HDAC1的結合能力幾乎相同，GST為陰性對照。提示突變型L359V轉錄激活能力增強可能和其與CBP結合能力增強有關。
圖10DNA結合蛋白凝膠阻滯分析實驗，比較野生型GATA-2，L359V和Δ341-346與DNA的結合活性；以及冷探針(未用同位素標記的探針)和抗GATA-2抗體作用后的結果。+加GATA-2抗體；-不加冷探針或抗GATA-2抗體。圖中可看出突變型L359V蛋白較野生型GATA-2蛋白DNA結合能力明顯增強(見1、5泳道)，5倍冷探針使突變型L359V和野生型GATA-2信號均明顯減弱(見2、6泳道)，而20倍冷探針則使二者信號幾乎消失(見3、7泳道)，這說明所用實驗系統(tǒng)的特異性。在Supershift實驗中加入抗pcDNA3.1載體His-tag抗體亦顯示突變型L359V蛋白較野生型GATA-2蛋白DNA結合能力明顯增強(見4、8泳道)。與熒光素酶報告系統(tǒng)轉染實驗結果一致，Δ341-346突變型較野生型GATA-2蛋白DNA結合能力減弱(見9-12泳道)。
圖11AML-1和GATA-2蛋白結構示意圖，箭頭所示為突變位點。RHDrunt同源盒結構域；ECAML-1的輔助抑制因子Ear-2的結合位點；TAD轉錄激活結構域；TRD轉錄抑制結構域；ZF鋅指結構域。
圖12PCR純化產物測序的流程圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1GATA-2基因各外顯子的PCR擴增1、患者樣品采集及處理在治療開始前采集患者的骨髓5-10ml，肝素抗凝，于當天用密度梯度離心法分離出單個核細胞，加適量白細胞裂解液及蛋白酶K，待白細胞充分裂解后用酚-氯仿法抽提基因組DNA，置-20℃?zhèn)溆谩？俁NA抽提和cDNA合成總RNA抽提和逆轉錄反應按試劑盒(GIBCO BRL公司)標準操作步驟進行。正常對照瑞金醫(yī)院職工年度體檢各項指標均正常者的外周血5ml，共200份。按前述方法制備DNA。
2、引物設計采用的軟件Primer premier 5，引物參數設定為片斷長度為300-700bp，引物最佳長度為20bp，最佳退火溫度為60℃，引物濃度為0.3μM。引物設計時應注意設計的引物也作為測序引物，因此上下游引物包括的序列盡可能地避免多聚體(重復數N應小于或等于4)；引物離外顯子起始或終止端至少50bp。AML-1和GATA-2PCR擴增引物見表1，其中C表示以cDNA為模板，E表示以DNA為模板。AML-1用四對引物擴全長cDNA；GATA-2用二對引物擴全長cDNA。E后面的數字表示相應的外顯子編號。
3、樣本DNA的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)尋找突變位點采用小樣本(24例AML患者)PCR擴增目的基因，采用申友公司的Taq酶，反應體系(25μl)為10×Buffer 2.5μl，引物(20μM)0.4μl×2，dNTPmix(10mM)0.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，Taq酶0.25μl，ddH2o18.65μl，DNA模板25ng.PCR反應程序94℃5min，94℃30sec，56℃40sec，72℃40sec，35cycles；72℃10min；4℃ forver.若有非特異條帶，且提高退火溫度也不能去除雜帶，則采用Touch-down的PCR反應程序94℃ 5min；94℃ 30sec，65℃ 40se -1℃/cycle，72℃40sec，10cycles；94℃30sec，56℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 10min；4℃ forver。
表1 AML-1和GATA-2PCR擴增引物引物名稱 上游引物序列 下游引物序列AML-1-C1 5’CCCCGCAGTAATAAAGG3’ 5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C2 5’ATGGCTGGCAATGATGAA3’ 5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C3 5’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’ 5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C4 5’CCAGCGGCATGACAACC3’ 5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E2 5’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’ 5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E3 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’ 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E4 5’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’ 5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E5 5’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E6 5’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’ 5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E7 5’CTCACTTCCGCTCCGTT3’ 5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’ 5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GATA-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’ 5’ACGTCCATCTGITCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’ 5’TITTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’ 5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’實施例2PCR產物純化測序1、PCR產物純化采用蝦堿酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)和外切酶(Exonuclease I)純化PCR產物，反應體系為SAP 0.16μl，Exonuclease I 0.25μl，PCR產物50ng，加水補至總體積7μl；純化反應程序37℃60min，80℃15min，4℃ forver。
2、PCR純化產物測序采用ABI 3700 Automatic Sequencer(PEBiosystems)。對PCR片段進行測序
1)-20℃冰箱中取出PCR純化產物、MIX、0.8uM引物2)取96孔反應板，標上模板名(即PCR純化產物名)、日期，用連續(xù)加樣器逐一加入引物2ul，然后用12孔排槍加入模板2ul，最后用連續(xù)加樣器逐一加入mix 2ul于離心機上甩一下，達1300轉/分左右即停。
3)PCR擴增(9700 of PE biosystem)見附圖12。
4)擴增結束后，用連續(xù)加樣器加入70％乙醇(加入量與反應體系之比為9∶1)即50ul左右于室溫進行沉淀，時間15分鐘以上，不得超過24小時。
5)4000轉/分，4℃離心30分鐘。
6)輕輕倒去上清液，將96孔板倒置離心，達800轉/分即停。
7)每孔加入10ul的loading buffer，2000轉/分1min離心。
8)90℃變性2分鐘，立即置冰上，待上樣。
9)在ABI3700Automatic Sequencer上進行電泳，3小時后機器自動分析輸出結果。
實施例3突變位點的搜尋采用Polyphred軟件搜尋突變位點。Polyphred軟件會用各種顏色標示出可疑突變位點，不同顏色代表不同的可信程度，最終的確認需打開圖形用肉眼來評定。對于豐度高的突變位點，軟件識別的可靠性非常高，但對于低豐度的突變位點，如只有一個樣本顯示雜合的圖形，就需要用肉眼根據評判標準來確定，去除由于測序不好造成的干擾。判斷一個位點是否為突變位點，至少應滿足下列一些條件1)顯示雜合堿基兩側序列是可辨別的單峰，背景比較低；2)正反方向測序需一致，均為雜合子；3)將雜合個體與純合個體測序圖進行比較，在雜合個體的圖中，堿基峰有明顯的下降趨勢。將含突變的序列與genebank上的序列比對，進一步確定突變位點。對于有插入或缺失的片斷，有很特征的測序圖——在雜合個體里，測序峰形會從插入或缺失位置開始變得很亂。此時可將PCR產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然后轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序。將所得序列與genebank上的序列比對，就可以得到具體的插入或缺失的序列。
實施例4突變型GATA-2功能研究1、質粒構建Flag-GATA-2/pCMV真核表達載體，CD34×2/Luc報告基因載體均由Tariq Enver教授惠贈。以Xho I和EcoR I為兩端酶切位點，Flag-GATA-2/pCMV為模板，采用定向克隆方法和定點突變技術構建野生型GATA-2/pcDNA3.1和GATA-2L359V/pcDNA3.1突變真核表達載體。
2、細胞培養(yǎng)及細胞轉染COS-7、293細胞以DMEM(GIBCO BRL)培養(yǎng)基加10％胎牛血清培養(yǎng)，K562細胞以1640培養(yǎng)基加10％胎牛血清培養(yǎng)。用Superfect(Qiagen)按廠家推薦的方法轉染細胞。轉染前一天，將2×104/ml細胞接種到六孔板上，待細胞達到70-80％貼壁后進行轉染。轉染前293細胞用PBS洗1次。先以SV40內對照(50nn/孔)加入無血清DMEM培養(yǎng)液660μl中，再加入報告基因載體CD34×2/Luc(100ng/孔)，最后分別加入野生型和突變型GATA-2真核表達載體(2μg/孔)和Superfect(2.5μl/孔)，充分混勻離心后靜置15min，使復合物充分形成后再分別加入各培養(yǎng)孔。加入500μl培養(yǎng)液，5％CO2，37℃孵育2-3小時后加含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基1ml繼續(xù)培養(yǎng)24小時進行報告基因的檢測。電轉K562細胞參照BIO-RAD公司操作手冊進行。
3、熒光素酶(Luciferase)檢測采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Promega)，按照推薦的方法，在熒光檢測儀(Lumat LB 9507)上測量熒光素酶活性。
4、GST融合蛋白表達及純化將相應的GST-CBP、GST-HDAC1等融合蛋白表達質粒轉化大腸桿菌BL-21菌株，挑取單克隆菌落接種于5ml含有氨芐青霉素(50mg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃ 300rpm培養(yǎng)過夜。1∶100稀釋到含有氨芐青霉素(50mg/ml)的2×YT中，30℃ 300rpm培養(yǎng)至OD600達到0.6-0.8。加入0.1M異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使終濃度達到0.4-0.8mM，30℃誘導GST融合蛋白表達3小時。5000rpm離心5min，去上清，收集菌體，加入預冷的PBS混懸菌體。加入1M二硫蘇糖醇(DTT)至最終濃度為5mM，加入10mg/ml的苯甲磺酰氟(PMSF)至最終濃度為100μg/ml。冰浴中超聲裂解細胞成勻漿。然后加20％TritonX-100至終濃度1％，冰浴30min。最后4℃12000rpm離心10min，轉移上清，4℃再13000rpm離心10min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。如需純化，直接按每一毫升上清中加?0μl 50％谷胱甘肽瓊脂糖凝膠顆粒，4℃慢搖孵育過夜，用預冷的PBS洗6次，加入洗脫液(10mM還原谷胱甘肽，50mMTris(pH8.0))，4℃慢搖孵育4小時，離心取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 5、GST pull-down拉下試驗蛋白體外翻譯分別以野生型GATA-2/pcDNA3.1和GATA-2L359V/pcDNA3.1突變真核表達載體為模板，采用體外轉錄翻譯試劑盒(TNT_ Quick Coupled Transcription and TranslationKit，Progema)進行體外翻譯，并用[35S]-蛋氨酸(1175Ci/mmol)對翻譯產物進行標記，-80℃保存?zhèn)溆?。取保存?zhèn)溆玫暮蠫ST融合蛋白的上清，解凍后按每一毫升上清中加入20μl 50％谷胱甘肽瓊脂糖凝膠顆粒，4℃慢搖孵育60min。然后用500μl預冷的PBS洗滌3次，即得到純化的GST融合蛋白。將結合了GST融合蛋白的瓊脂糖凝膠顆粒重懸于200μl結合液中(0.5％NP40，20mM Tris(pH8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA)，再加入一定量體外翻譯產物，4℃孵育2小時后用400μl結合液洗滌3次，加蛋白上樣緩沖液后煮沸變性。10％SDS-PAGE電泳，抽干膠后放射自顯影。
6、Gel shift蛋白體外翻譯同上。翻譯同時以S35標蛋氨酸為陽性對照。按Santa Cruz公司提供的序列合成了用于Gel shift實驗的GATA探針。探針序列為sense 5’--CAC TTG ATA ACA GAA AGT GAT AAC TCT--3’antisense 5’--AGA GTT ATC ACT TTC TGT TAT CAA GTG--3’使用-P32ATP進行末端核苷酸標記，復性后用MicroSpinG-25(Armersham Pharmacia)純化探針。未標記探針經復性直接得到。體外翻譯蛋白和探針室溫孵育30分鐘，6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳液為0.5×TBE。在競爭反應中分別加入10倍和100倍未標記探針；Supershift試驗加入pcDNA3.1載體His-tag抗體。
實施例5檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)擴增引物引物名稱 上游引物序列 下游引物序列AML-1-C1 5’CCCCGCAGTAATAAAGG3’ 5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C2 5’ATGGCTGGCAATGATGAA3’5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C3 5’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C4 5’CCAGCGGCATGACAACC3’ 5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E2 5’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E3 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E4 5’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E5 5’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E6 5’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E7 5’CTCACTTCCGCTCCGTT3’ 5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GAT4-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’ 5’TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩沖液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩沖液。10×反應緩沖液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-1001％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM[/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
實施例6檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一AML-1突變基因的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)擴增引物引物名稱 上游引物序列 下游引物序列AML-1-C1 5’CCCCGCAGTAATAAAGG3’ 5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C2 5’ATGGCTGGCAATGATGAA3’ 5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C3 5’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’ 5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C4 5’CCAGCGGCATGACAACC3’ 5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E2 5’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’ 5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E3 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’ 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E4 5’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’ 5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E5 5’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E6 5’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’ 5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E7 5’CTCACTTCCGCTCCGTT 3’ 5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA 3’ 5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GATA-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’ 5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’ 5’TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’ 5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩沖液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩沖液。10×反應緩沖液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-1001％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法
A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
實施例7檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變位點L359V的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)GATA-2-C1上游引物序列5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA 3’下游引物序列5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG 3’。
2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩沖液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩沖液。10×反應緩沖液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-1001％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；
BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
實施例8檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變位點A341-G346del的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)GATA-2-C2上游引物序列5’CACCTACCCCTCCTATGTGC 3’下游引物序列5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC 3’。
2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩沖液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩沖液。10×反應緩沖液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-1001％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然后轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
實施例9檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一AML-1突變位點C1812A的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)AML-1-C1上游引物序列5’CCCCGCAGTAATAAAGG3’下游引物序列5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩沖液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩沖液。10×反應緩沖液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-1001％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟
C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
實施例10檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一AML-1突變位點R293X的試劑盒及其應用。
1、試劑盒含有1)AML-1-C3上游引物序列5’ACAGCCATGAGGGTCAGC 3’下游引物序列5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG 3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶儲存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl緩沖液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反應緩沖液。10×反應緩沖液組成成分為KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-1001％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定AML-1基因的突變位點。
實施例11
含GATA-2或AML-1突變的慢性粒細胞性白血病加速期或急變期患者的臨床資料。見表2AP加速期；del缺失；ins插入；fs移碼突變；ter終止.My原始粒細胞；Mo原始單核細胞；Promo幼單核細胞；Promy早幼粒細胞；E嗜酸細胞.所有患者都有BCR-ABL融合基因。有GATA-2突變的患者疾病進程相對兇險，主要向粒單系方向急變；含AML-1突變的患者疾病進程相對緩慢，主要向粒系方向急變。大部分患者急變前后沒有染色體的改變。
表2

權利要求
1.一種檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA-2突變基因的方法，其中該方法為直接測序法。
2.根據權利要求1所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其中所述的GATA-2突變基因的至少一個突變位點位于T1075G、1021-1038del。
3.根據權利要求1所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其中所述的GATA-2突變基因，其編碼氨基酸至少一個突變位點位于第一、第二鋅指結構域。
4.根據權利要求1-3任一權利要求所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其特征在于包括如下步驟A提取DNA，對GATA-2基因外顯子設計引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
5.根據權利要求4所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其特征在于進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
6.根據權利要求1-3任一權利要求所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其特征在于包括如下步驟A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物經直接純化后直接測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
7.根據權利要求6所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其特征在于進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
8.根據權利要求1-3任一權利要求所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其特征在于包括如下步驟A提取總RNA，逆轉錄成cDNA，在突變位點附近設計PCR引物，進行PCR擴增；BPCR反應產物可隆到p-GEMT-easy載體中，然后轉化大腸桿菌菌株JM109，挑單克隆測序，將所得序列于genebank上的序列比對，確定突變位點。
9.根據權利要求8所述的GATA-2突變基因的檢測方法，其特征在于進一步包括如下步驟C按正常讀碼框架進行翻譯以確定GATA-2基因的突變位點。
10.根據權利要求1-9任一權利要求所述的GATA-2突變基因的檢測方法在慢性粒細胞性白血病急變的早期檢測和/或治療方法中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA－2突變基因的方法，所述方法為直接測序法；本發(fā)明同時涉及檢測慢性粒細胞性白血病急變的主效基因之一GATA－2突變基因方法的應用。本發(fā)明將GATA－2基因與慢性粒細胞性白血病急變患者的藥物治療聯系起來，可以發(fā)明作用于這些靶點的藥物來治療慢性粒細胞性白血病急變患者，為慢性粒細胞性白血病急變患者的新藥研發(fā)提供理論依據。
文檔編號C12Q1/68GK1782094SQ200510023839
公開日2006年6月7日 申請日期2005年2月4日 優(yōu)先權日2005年2月4日
發(fā)明者陳竺, 張?zhí)K江, 陳賽娟, 顧柏煒, 施靜藝, 李國 , 高曉東 申請人:上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院