專利名稱：白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及白血病相關(guān)的多種融合基因的液相 芯片聯(lián)合檢測方法及其診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
白血病是由于造血干細胞分化異常和惡性增生而引起的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是我 國最常見的惡性腫瘤之一。隨著白血病研究的不斷進展，發(fā)現(xiàn)許多白血病患者具有特異性 的染色體易位，導(dǎo)致新的融合基因產(chǎn)生，這些異?；蛞殉蔀椴煌愋桶籽〉姆肿由?學(xué)特異性標(biāo)志。2000年WHO關(guān)于白血病分型的標(biāo)準中更是將一些常見異?；驓w納為白血 病基本診斷的標(biāo)準。因此，在分子基因水平對白血病相關(guān)的融合基因進行檢測，不僅可以為 白血病診斷、分型、臨床治療選擇和預(yù)后判斷提供重要依據(jù)，同時也為白血病微小殘留病變 提供檢測基礎(chǔ)。白血病中常見的融合基因有慢性粒細胞白血病(CML)中的BCR-ABL (b2a2)、 BCR-ABL(b3a2)；急性淋巴細胞性白血病(ALL)中的 BCR-ABL(ela2)、E2A-PBX1、TEL-AML1、 MLL-AF4(elO/e4, e9/e5, e9/e4)；急性粒細胞白血病(AML)中的 CBFB-MYH11 (type A, type D)、AMLl-ETO ；急性早幼粒細胞白血病(APL)中的 PML-RARA (Lform)、PML-RARA (S form) ；T 細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)中的SIL-TALl (typell，type III)。目前，白血病主要是依靠細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等檢測方 法來進行診斷和檢測分型。細胞形態(tài)學(xué)受主觀因素影響，臨床診斷的一致率僅為70%左 右。核型分析和顯帶技術(shù)等細胞遺傳學(xué)方法是在全基因組水平篩查染色體易位，容易漏檢 許多染色體的微小異常。免疫學(xué)方法具有較高的假陽性率和假陰性率，并且無法做到早期 診斷。當(dāng)前國內(nèi)外廣泛使用的分子生物學(xué)檢測白血病融合基因的方法中，熒光原位雜交技 術(shù)(FISH)只能進行定性檢測、操作復(fù)雜；焚光定量PCR存在著檢測通量的局限性，所以都還 不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片(Biochip)技術(shù)存在著可重復(fù)性 差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點。因此臨床上需要有一種檢測方法，能夠迅速、 穩(wěn)定、準確地對白血病的多種融合基因進行聯(lián)合并行檢測，液相芯片技術(shù)(xMAP)正是這樣 一種新型檢測技術(shù)。液相芯片能夠?qū)ι倭繕颖具M行定性、定量檢測，具有高通量、操作簡便、重復(fù)性好、 靈敏度高、線性范圍寬等突出優(yōu)點。該系統(tǒng)是由許多微球為主要基質(zhì)構(gòu)成的，在微球的制造 過程當(dāng)中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例不同，把球形基質(zhì)分為 100種，可以標(biāo)記上100種不同的探針分子，能同時對一個樣品中多達100種不同的目標(biāo)分 子進行檢測。根據(jù)檢測物的不同，微球表面可以共價結(jié)合各種各樣的核酸檢測探針，在雜交 反應(yīng)進行時再加上熒光標(biāo)記。在同一反應(yīng)體系中可以同時加入不同的檢測微球，這樣就可 以利用少量的樣本進行快速、高通量的檢測。反應(yīng)結(jié)束后，通過微流體技術(shù)將微球排成單列 快速流經(jīng)液相芯片檢測儀，每個微球可同時被兩束激光檢測到，紅色激光激發(fā)微球上的紅 色分類熒光，將各個不同的反應(yīng)區(qū)分開來而定性；綠色激光則激發(fā)結(jié)合在待測樣本上的熒
4光標(biāo)記進行定量。當(dāng)標(biāo)記好的待測樣本與特定微球上的探針結(jié)合在一起時，兩束激光所激 發(fā)的光均可被檢測到。最后，通過計算機的高速數(shù)字信號處理器，可以自動統(tǒng)計分析得出特 定微球上的平均熒光強度，從而確定檢測物的種類和數(shù)量。本發(fā)明基于液相芯片技術(shù)的高通量、操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高、線性范圍寬 等突出優(yōu)點，對白血病的多種融合基因進行聯(lián)合并行檢測，能夠在臨床檢測上得到更好的 應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種白血病相關(guān)融合基因的聯(lián)合檢測方法及 診斷試劑盒。該方法及試劑盒包含對SIL-TALl (type II, type III)、MLL-AF4 (e9/e5， e9/e4), CBFB-MYHlKtype D)多種融合基因聯(lián)合檢測，可以對T細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性粒細胞白血病(AML)進行臨床分型，同時對患 者進行療效觀察、預(yù)后及微小殘留疾病進行動態(tài)監(jiān)測。本檢測方法及診斷試劑盒具有高靈 敏度、高特異性、高準確度、檢測迅速等優(yōu)點。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下在本發(fā)明的一方面，提供一種白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法，包括以下 步驟(1)包含3種不同熒光編碼的羧基微球beads，編號分別為11、15、17 ；每種微球上 分別共價結(jié)合針對白血病中染色體易位形成的3種融合基因的mRNA所設(shè)計的特異性核酸 探針；(2)針對不同白血病類型中染色體易位所形成的3種融合基因的mRNA，分別設(shè)計 上下游引物，對不同的融合基因mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增出相應(yīng)的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與融合基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物雜交后，加入 鏈霉親和素_藻紅蛋白(Str印tavidin-PE)，通過液相芯片法xMAP檢測熒光信號；(4)將檢測到的熒光信號與內(nèi)參基因的熒光信號進行比較，從而確定檢測樣品中 是否含有白血病相關(guān)的融合基因，和/或樣品中融合基因的表達狀況。以上檢測方法中所述的微球是平均直徑為5. 6 μ m，結(jié)合了不同熒光染料的聚苯烯 微球，即色彩編碼微球(color-coded beads)；白血病中染色體易位形成的融合基因是針對 以下多種可以自由組合的融合基因=SIL-TALl (type II，type III)、MLL-AF4(e9/e5，e9/ e4),CBFB-MYHll(type D)。所述的共價結(jié)合于微球上的3條特異性核酸探針，包括如下序列(其中5’端含氨 基修飾)SIL-TALl(type II，type III) 5' -AminolinkerC12 AGTTACGCTGCGGTGTGGTC-3，， 如 SEQ ID NO. 1 所示；MLL-AF4(e9/e5，e9/e4) :5，_AminolinkerC12 TATTGCTGTCAAAGGAGGCGG-3，，如SEQ ID NO. 2 所示；CBFB-MYHll(type D) 5' -AminolinkerC12 TGTCCTTCTCCGAGCCTCTTCA-3，，如 SEQ ID N0. 3 所示；或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列；
或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的針對不同融合基因的mRNA所設(shè)計的上下游引物，包括如下序列(其中上游 引物5’端含生物素標(biāo)簽)SIL-TALl (type II， type III)上游 弓| 物 5，_biotin CCTGCAAACAGACCTCAGCTC-3 ‘,如 SEQ ID NO. 4 所示；下游弓 I 物 5，-CGAGGAAGAGGATGCACAC-3，，如 SEQ IDN0. 5 所示；MLL-AF4(e9/e5, e9/e4)上游引物 5，-biotin TCCAGAGCAGAGCAAACAG-3，，如 SEQ ID NO. 6 所示；下游引物 5，-CCTTGCTGAGAATTTGAGTG-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；CBFB-MYHll(type D)上游引物 5，-biotin GAGGATGCATTAGCACAACAG-3，，如 SEQ ID N0. 8 所示；下游引物 5，-GAAGCAACTCCTGGGTGTC-3，，如 SEQ ID N0. 9 所示；或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的內(nèi)參基因Abelson基因的引物和探針序列如下上游引物5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示；探針5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID N0. 12 所示；或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測白血病相關(guān)的多種融合基因的診斷試劑盒， 包含共價結(jié)合了白血病融合基因mRNA特異性探針的微球混合物、結(jié)合了 Abelson基因探針 的微球、白血病融合基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、鏈霉親和素-藻 紅蛋白Str印tavidin-PE、質(zhì)控品(陰性對照和陽性對照)。以上試劑盒中所述的質(zhì)控品包含陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為含有各種 融合基因質(zhì)粒的混合液(包括含Abelson基因的質(zhì)粒)，陰性對照品為不含有融合基因及 Abelson基因的質(zhì)粒溶液；所述的微球混合物，根據(jù)不同檢測樣品的需要自由組合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測白血病相關(guān)的多種融合基因的診斷試劑盒在 檢測體外樣品，對白血病進行分型，早期診斷，療效觀察，預(yù)后與微小殘留疾病的動態(tài)監(jiān)測 中的應(yīng)用。由于本發(fā)明利用了液相芯片技術(shù)，使檢測方法及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、 高通量、穩(wěn)定性好、檢測迅速、準確等突出優(yōu)點，能夠?qū)Π籽∪诤匣蜻M行定性和定量檢 測，能在臨床檢測上得到更好的應(yīng)用。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例詳細說明本發(fā)明，但并不能理解為對本發(fā)明的限制。所述的 實施例只提供闡明核酸探針、試劑盒及其制作和應(yīng)用方法而不為其所限制。期間各種變化 形式在本發(fā)明和所述的權(quán)項的范圍內(nèi)是可預(yù)期的。1.實驗材料引物和探針均由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成試劑盒、PCR試劑購自Fermentas公司；不同編號的微球(表面羧基修飾)、鏈 霉親和素_藻紅蛋白均購置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二 亞胺鹽酸鹽(EDC)購置于Pierce公司；2-(N-嗎啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂?；彼徕c (Sarkosyl)、四甲基氯化銨(TMAC)均購置于sigma公司。緩沖液和雜交液的配置偶聯(lián)緩沖液，PH4.5250mlMES4. 88g ；1.5 X TMAC 雜交溶液250ml5M TMAC225ml20% Sarkosyl1.88mlIM Tris-HCl, ΡΗ8. O18.75ml0. 5Μ EDTA, ΡΗ8. 03. OmlH2O1. 37ml ；1.5 X TMAC 雜交溶液250ml5M TMAC150ml20% Sarkosyl1.25mlIM Tris-HCl, ΡΗ8. 012.5ml0. 5Μ EDTA, ΡΗ8. 02. OmlH2O84. 25ml ；TE 緩沖液，PH8.0500mlIM Tris-HCl, PH8. 05ml0. 5M EDTA, ΡΗ8. 0ImlH2O444ml實施例1 :3種白血病相關(guān)的多種融合基因的液相芯片聯(lián)合并行檢測方法具體的檢測方法包括如下步驟一.檢測 SIL-TALl (type II, type II I)、MLL-AF4 (e9/e5，e9/e4)、 CBFB-MYH11 (typeD)融合基因的微球混合液的制備1.按照以下序列合成寡核苷酸探針SIL-TALl(type II，type III) 5' -AminolinkerC12 AGTTACGCTGCGGTGTGGTC-3，， 如 SEQ ID NO. 1 所示；MLL-AF4(e9/e5, e9/e4) 5' -AminolinkerC12 TATTGCTGTCAAAGGAGGCGG-3，，如 SEQID NO. 2 所示；CBFB-MYHll(type D) 5' -AminolinkerC12 TGTCCTTCTCCGAGCCTCTTCA-3，，如 SEQIDN0. 3 所示；Abelson 基因:5，_AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示；2.將以上含有氨基修飾的寡核苷酸探針分別與編號為11、15、17、21號的4種羧基 微球偶聯(lián)2. 1取出一小份_20°C保存的新鮮干粉狀EDC平衡到室溫；2. 2 用 dH20 分別溶解 SIL-TALl (type II，type III)、MLL-AF4(e9/e5，e9/e4)、 CBFB-MYHll(type D)、Abelson 的寡核苷酸探針，濃度為 lmM(lnmol/y 1)；2. 3分別全速渦旋編號為11、15、17、21號的4種羧基微球儲存懸液至少3min，產(chǎn) 生均一的微球懸液；2. 4分別取2. 5 X IO6微球儲存懸液到4個離心管中；2. 510，OOOg，離心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶聯(lián)緩沖液，重懸微球，渦旋震蕩20秒；2. 7將3種濃度為ImM寡核苷酸探針分別用dH20以1 10的比例稀釋，使其濃度 為 0. Inmol/μ 1 ； 2. 8每種探針各加入2 μ 1 (濃度為0. Inmol/μ 1)到混勻的相應(yīng)的微球里，渦旋混 合；2. 9用dH20配置10mg/ml的新鮮EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步 EDC的使用)；2. 10加入2. 5 μ 1 10mg/ml EDC的的新鮮EDC溶液分別到4種微球中(25 μ g終濃 度約為0. 5 μ g/ μ 1)渦旋混勻；2. 11室溫避光孵育30min ；2. 12用dH20配置第二份10mg/ml的EDC新鮮溶液(注意EDC粉末如果潮解，則 應(yīng)丟棄，建議每一步偶聯(lián)過程都使用新鮮的EDC粉末)；2. 134種微球中各加入2. 5 μ 1 10mg/ml的EDC新鮮溶液，渦旋混勻；2. 14室溫避光孵育30min ；2. 154 種偶聯(lián)微球中各加入 Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 16 10，000g,離心，l_2min ；2. 17移除上清，分別用Iml 0. 1 % SDS重懸4種偶聯(lián)微球，振蕩混勻；2. 18 10，000g，離心，l_2min ；2. 19移除上清，分別加入100 μ 1 TE, ΡΗ8. 0，渦旋混合20s,重懸微球；2. 20用細胞計數(shù)器計數(shù)4種偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球；a.用dH20將偶聯(lián)微球以1 100稀釋；b.渦旋震蕩充分混勻；c.取10 μ 1到細胞計數(shù)器上；d.數(shù)細胞計數(shù)器上4個角大格的微球總量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球總量)X 2. 5 X 100 (稀釋倍數(shù))。3.微球混合液的配置將上述偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球，如下列SIL-TAL1 (type II，type III)探針微球 ll、MLL-AF4(e9/e5，e9/e4)探針微球 15、CBFB-MYH11 (type D)探針微球 17，Abelson 探針微球21，等比例混合，各種微球的終濃度為1500個/μ 1，2-8°C避光保存。二.樣本的制備1-15號白血病患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提取RNA 1.淋巴細胞提取取新鮮全血2ml加Iml 3%檸檬酸鈉，混勻后3000r/min離心， 10min，4°C，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細胞；2.取1個離心管(經(jīng)DEPC水處理)加入淋巴細胞液150 μ 1.然后加Iml TRIZ0L， 室溫放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 離心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ；5. 4"C 12，OOOg 離心 15min ；6.吸取上層水相，至另一離心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5-lOmin ；8. 4°C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；10. 4"C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清；11.室溫晾干或真空干燥5-lOmin ；12.可用 50ul H2OjTE buffer 或 0. 5% SDS 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin (H20、 TE或0.5% SDS均須用DEPC處理并高壓)；13.測OD值定量RNA濃度。三.多重RT-PCR按照如下方法對上述的1-15號樣本的mRNA進行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增l.cDNA第一鏈的合成①取一經(jīng)DEPC處理過的微量離心管，置于冰上，建立下列反應(yīng)體系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1Oligo (dT) 18 Primer (0. 5 μ g/μ 1) 1 μ 1EDPC-treated waterforword to 12 μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機稍微離 心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應(yīng)液；5Xreaction buffer4μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1)1 μ 1IOmMdNTPsMix2μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；④離心管于37°C溫育5分鐘；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ；⑥離心管于42°C反應(yīng)60分鐘；⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應(yīng)，之后迅速取出置于冰中冷卻；
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2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物SIL-TALl (type II， type III)上游 弓| 物 5，_biotin CCTGCAAACAGACCTCAGCTC-3 ‘,如 SEQ ID NO. 4 所示；下游弓 I 物 5，-CGAGGAAGAGGATGCACAC-3，，如 SEQ IDN0. 5 所示；MLL-AF4(e9/e5, e9/e4)上游引物 5，-biotin TCCAGAGCAGAGCAAACAG-3，，如 SEQ ID NO. 6 所示；下游引物 5，-CCTTGCTGAGAATTTGAGTG-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；CBFB-MYHll(type D)上游引物 5，-biotin GAGGATGCATTAGCACAACAG-3，，如 SEQ ID N0. 8 所示；下游引物 5，-GAAGCAACTCCTGGGTGTC-3，，如 SEQ ID N0. 9 所示；Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID NO. 11 所示。2. 2PCR反應(yīng)體系如下
cDNA10 μ 1
10XPCR Buffer10 μ 1
MgC12(25mmol/L)4μ 1
dNTPs(IOmM)0. 5μ 1
Taq Polymerase(5u/μ 1)0. 5μ 1
Primer mix11 μ 1
dd H2O14 μ 1
終體積為50 μ 1
PCR 擴增程序:95°C IOmin ；95°C 30s, 64-50°C lmin，72°C 30min ；前 14 個循環(huán)，每循環(huán)一-次，退火溫度降低1°C，后21個循環(huán)，退火溫度保持在50°C中進行；72°C 7min ；4°C保四.寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物的雜交1.選取步驟一中配置的寡核苷酸探針微球混合物；2.渦旋震蕩20s，混勻微球；3.制備微球工作液，用1. 5 X TMAC雜交溶液稀釋偶聯(lián)微球至濃度為150個微球/ μ 1。(注每個反應(yīng)需要33 μ 1的微球工作液)；4.渦旋震蕩20s，混勻微球工作液；5.向樣本孔、陽性對照孔、陰性對照孔內(nèi)分別加入33μ 1微球工作液；6.向每個樣品孔內(nèi)分別加入1-15號患者樣本的PCR擴增產(chǎn)物和TE溶液(PH為 8. 0)，總體積為17 μ 1 ；7.用排槍上下吸打，溫柔混勻反應(yīng)液；8.蓋上反應(yīng)蓋避免蒸發(fā)，在95-100°C下孵育l_3min，使樣品中的寡核苷酸去掉二 級結(jié)構(gòu)；9.在雜交溫度下孵育反應(yīng)板15min ；10.制備新鮮的檢測混合液，用IXTMAC雜交溶液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白溶液 至10 μ g/ml (每個反應(yīng)需要25 μ 1的檢測混合液)；11.向每孔加入25 μ 1的檢測混合液，用排槍上下吸打，溫柔混勻；
12.在雜交溫度下孵育5min ；上述步驟可以通過PCR儀按以下方案編程將其合并95°C，l_3min;雜交溫度，forever；13.在液相芯片儀(LiquiChip 200，QIAGEN公司)上，保持雜交溫度，對各反應(yīng)孔 進行檢測分析，測定熒光MFI值。五·檢測結(jié)果及分析檢測結(jié)果(熒光MFI值)如下
\基 患\因 者\MLL-AF4(e9/e5, e9/e4)CBFB-MYH11(type D)SIL-TALl (type II ， type III)Abelson 內(nèi)參 基因183243710425622179370591953313692315928474648822082316511235167527906679624352628120854861 ‘187483439126983181986274872250910792960852437112674102682351127651214720631363185246212514192654691842152891801173076陽性對照2503338429562619陰性對照57957184結(jié)果分析:
權(quán)利要求
一種白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法，其特征在于(1)包含3種不同熒光編碼的羧基微球Beads，每種微球上分別共價結(jié)合針對白血病中染色體易位形成的多種融合基因的mRNA所設(shè)計的特異性核酸探針；(2)針對不同白血病類型中染色體易位所形成的多種融合基因的mRNA，分別設(shè)計上下游引物，對不同的融合基因mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增出相應(yīng)的產(chǎn)物；所述的白血病中染色體易位形成的融合基因是針對以下多種可以自由組合的融合基因SIL TAL1(type II，type III)、MLL AF4(e9/e5，e9/e4)、CBFB MYH11(type D)；(3)含有特異性核酸探針的微球與融合基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴增產(chǎn)物混合雜交，加入鏈霉親和素 藻紅蛋白Streptavidin PE后，通過液相芯片法xMAP檢測熒光信號；(4)將檢測到的熒光信號與內(nèi)參基因的熒光信號進行比較，從而確定檢測樣品中是否存在白血病融合基因，以及樣品中融合基因的表達狀況。
2.如權(quán)利要求1所述的白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，所 述的微球是平均直徑為5. 6 μ m，結(jié)合了不同熒光染料的聚苯烯微球，即色彩編碼微球 Color-coded beads0
3.如權(quán)利要求1所述的白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，所述的 共價結(jié)合于微球上的3條特異性核酸探針，包括如下序列，其中5’端含氨基修飾SIL-TALl(type II，type III) :5，-AminolinkerC12AGTTACGCTGCGGTGTGGTC_3，，如SEQ ID NO. 1 所示；MLL-AF4(e9/e5,e9/e4) :5， -Aminol inkerC12TATTGCTGTCAAAGGAGGCGG_3，，如 SEQ ID NO. 2所示；CBFB-MYHll(type D) :5， -AminolinkerC12TGTCCTTCTCCGAGCCTCTTCA_3，，如 SEQ ID NO. 3所示；或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
4.如權(quán)利要求1所述的白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，所述的 針對不同融合基因的mRNA所設(shè)計的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’端含生物 素標(biāo)簽SIL-TALl (type II, type III)上游引物 5，-biotin CCTGCAAACAGACCTCAGCTC-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示；下游引物 5，-CGAGGAAGAGGATGCACAC-3，，如 SEQ IDN0. 5 所示；MLL-AF4(e9/e5, e9/e4)上游引物 5，_b i ot i η TCCAGAGCAGAGCAAACAG-3，，如 SEQ ID NO. 6 所示；下游引物 5，-CCTTGCTGAGAATTTGAGTG-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；CBFB-MYHll(type D)上游引物 5，-biotin GAGGATGCATTAGCACAACAG-3，，如 SEQ ID NO. 8 所示；下游引物 5，-GAAGCAACTCCTGGGTGTC-3，，如 SEQ ID NO. 9 所示； 或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
5.如權(quán)利要求1所述的白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法，其特征在于，所述的 內(nèi)參基因為Abelson基因，其引物和探針序列如下上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示； 下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示； 探針 5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示； 或者包含有上述序列(含互補序列)的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列(含互補序列)同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
6.一種檢測白血病相關(guān)的融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，包含了權(quán)利要求1中 所述的共價結(jié)合了白血病融合基因特異性探針的微球混合物及結(jié)合了 Abelson基因探針 的微球、權(quán)利要求1中所述的白血病融合基因mRNA的上下游引物及Abelson基因的上下游 引物、鏈霉親和素-藻紅蛋白、質(zhì)控品。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測白血病相關(guān)的融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，所述 的微球混合物，根據(jù)不同檢測樣品的需要自由組合。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測白血病相關(guān)的融合基因的診斷試劑盒，其特征在于，所述 的質(zhì)控品包含陽性對照和陰性對照，其中陽性對照為含有各種融合基因質(zhì)粒的混合液，包 括含Abelson基因的質(zhì)粒；陰性對照為不含有融合基因及Abelson基因的質(zhì)粒溶液。
9.一種如權(quán)利要求6所述的檢測白血病相關(guān)的融合基因的診斷試劑盒在檢測體外樣 品，對白血病進行分型、早期診斷、療效觀察、預(yù)后與微小殘留疾病的動態(tài)監(jiān)測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白血病相關(guān)的融合基因的聯(lián)合檢測方法及診斷試劑盒，通過對白血病相關(guān)的融合基因mRNA(該白血病相關(guān)的融合基因是SIL-TAL1(type II，type III)、MLL-AF4(e9/e5，e9/e4)、CBFB-MYH11(type D))設(shè)計引物和探針，將探針與微球共價結(jié)合形成的探針微球混合物，與逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增產(chǎn)物雜交，加入鏈霉親和素藻紅蛋白后，可檢測出不同微球的熒光信號，從而確定待檢測樣品中是否含有白血病融合基因及融合基因的表達狀況。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高靈敏度、高通量性、檢測快速、準確等優(yōu)點，能夠?qū)Χ喾N白血病融合基因同時進行定性和定量檢測。
文檔編號G01N21/64GK101955991SQ20101013745
公開日2011年1月26日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者徐春雷, 邵棠 申請人:江蘇邁迪基因生物科技有限公司