專利名稱：一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6－羥基－3－琥珀酰－吡啶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法。具體的說，涉及一種以微生物的完整細(xì)胞為催化劑，以廉價的尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備高價值的6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法。
背景技術(shù)：
尼古丁(nicotine)，俗稱煙堿，是許多煙草品種中的主要生物堿。煙葉和卷煙工業(yè)的下腳料中含有大量的尼古丁，人們已經(jīng)開發(fā)出從這些材料中提取尼古丁的成熟技術(shù)。6-羥基-3-琥珀酰-吡啶(6-hydroxy-3-succinoyl-pyrdine，HSP)，是尼古丁的一種衍生物，也是假單胞菌等細(xì)菌代謝尼古丁的一種產(chǎn)物，由于它的吡啶環(huán)6位被羥基化，所以很容易通過化學(xué)修飾合成2，5-或2，3，5-取代的吡啶化合物，這些化合物通常是具有商業(yè)價值的藥物和農(nóng)藥或其前體。
目前，有關(guān)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生產(chǎn)的研究還不是很多，這與其重要用途不相適應(yīng)。1954年和1955年，Wada和Yamasaki以及Tabuchi首先報道了在假單胞菌屬細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶為該類細(xì)菌代謝尼古丁的一個產(chǎn)物，這為利用微生物生產(chǎn)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶提供了重要的前提。
1997年，Roduit等報道了采用假單胞菌(Pseudomonas sp.)DSM 8653和爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)DSM 8244以流加的方式發(fā)酵生產(chǎn)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶，但是該技術(shù)反應(yīng)時間長；采用復(fù)雜的發(fā)酵體系，不利于反應(yīng)控制；培養(yǎng)液成分復(fù)雜也給6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的分離純化造成了極大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有方法中，反應(yīng)相對復(fù)雜不易控制的不足。本發(fā)明要解決的問題是，提供一種以廉價的尼古丁為底物，以微生物的完整細(xì)胞為生物催化劑，生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法。該方法具有反應(yīng)時間短，操作簡單，反應(yīng)體系簡單易于產(chǎn)物分離純化的特點。
本發(fā)明的方法由如下步驟組成(1)微生物菌種選擇惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8062、纖維單胞菌(Cellulomonas sp.)NRRL B-8063、假單胞菌(Pseudomonas sp.)DSM 8653、爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)DSM 8244和假單胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922之一；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量體積比為1.5～2.0％的瓊脂并加有質(zhì)量體積比為0.2～5％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，25℃～37℃培養(yǎng)12～24小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于20～100mL含有質(zhì)量體積比為0.2～5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～24小時，制得一級種子；
(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接一級種子于200～1000mL含有質(zhì)量體積比為0.2～5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～24小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接二級種子于2～20L含有質(zhì)量體積比為0.5～5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下培養(yǎng)，期間測定細(xì)胞濃度，當(dāng)620nm下的光密度達(dá)到0.6～3.7，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細(xì)胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10～15分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞，并用pH 7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集細(xì)胞沉淀，此細(xì)胞沉淀即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于蒸餾水中，再加入尼古丁，混勻，使混合物中生物催化劑的終濃度為620nm下1～10個光密度，尼古丁的終濃度為1～7g/L；調(diào)pH至6.0～9.0，在20℃～40℃、180～350轉(zhuǎn)/分鐘條件下振蕩，使生物催化劑、尼古丁與空氣充分混合；反應(yīng)期間取樣，用HPLC檢測6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成情況，當(dāng)反應(yīng)混合物中6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成量達(dá)到0.6g/L～4.7g/L時，終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(8)生物催化劑的去除將步驟(7)終止反應(yīng)后的反應(yīng)混合物，以6,000～12,000轉(zhuǎn)/分10～30分鐘離心，去除步驟(7)中所加入的生物催化劑，得到含有6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；(9)濃縮將步驟(8)制得的上清液，在真空度0.08～0.1MPa，50℃～70℃的條件下蒸餾濃縮至原體積的1/20～1/5；(10)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集將步驟(9)制得的濃縮液以鹽酸溶液調(diào)pH為2～3.5，然后在4℃下靜置2～5小時，使6-羥基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；將得到的沉淀用抽濾的方法去除上清溶液，再用體積比為3～6倍的鹽酸溶液洗滌；然后將所得的沉淀在40℃～60℃，真空度為0.08～0.1MPa的條件下，干燥2～8小時，最后得到的粉末即為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶；(11)樣品檢測將步驟(10)制得的6-羥基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC、ESI-MS、13C NMR和1H NMR檢測純度和結(jié)構(gòu)。
上述步驟(1)所述的菌種為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061。
上述步驟(3)、(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金屬離子混合液0.5mL/L；調(diào)節(jié)pH 7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步驟(2)所述的固體斜面基本培養(yǎng)基的配方是向所述的液體基本培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積比為1.7～2.0％的瓊脂。
上述步驟(2)、(3)、(4)(5)所述的菌體培養(yǎng)溫度為29～32℃。
上述步驟(2)所述的菌體培養(yǎng)時間為16～20小時。
上述步驟(3)、(4)所述的菌體培養(yǎng)時間為12～15小時。
上述步驟(2)、(3)、(4)(5)所述的尼古丁濃度為2～3％。
上述步驟(6)所述的磷酸緩沖液的濃度為50mmol/L。
上述步驟(7)所述的生物催化劑是指惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRLB-8061的完整細(xì)胞。
上述步驟(7)所述的生物催化劑的終濃度為620nm下5～7個光密度。
上述步驟(7)所述的尼古丁的終濃度為2.5～4g/L。
上述步驟(7)所述的pH為6.5～7.5。
上述步驟(7)所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為28℃～32℃。
上述步驟(7)所述的HPLC方法采用Agilent1100高壓液相色譜儀，色譜柱為KR100-5C18柱(150×4.6mm，填料顆粒5よm，瑞典Kromasil公司)，流動相為0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速為0.5mL/min，紫外檢測器波長為210nm，柱溫為30℃。
上述步驟(10)所述的pH為2.5，以6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)。
上述步驟(11)所述的ESI-MS用API 4000質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystem公司)分析，溶劑為甲醇。
上述步驟(11)所述的13C NMR和1H NMR用AVANCE 600核磁共振儀(瑞士Bruker公司)分析，溶劑為氘代二甲基亞砜。
本發(fā)明是一種利用廉價的尼古丁為底物以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061的完整細(xì)胞作為生物催化劑生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶，并且利用簡單的沉淀技術(shù)分離純化6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法。
本發(fā)明涉及的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8062、纖維單胞菌(Cellulomonas sp.)NRRL B-8063、假單胞菌(Pseudomonas sp.)DSM 8653、爭論貪噬菌(Variovorax paradoxus)DSM 8244和假單胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922轉(zhuǎn)化尼古丁生成6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法的原理可用下述化學(xué)反應(yīng)式表示 本發(fā)明涉及的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法具有以下特點
(1)用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061的完整細(xì)胞作為生物催化劑合成6-羥基-3-琥珀酰-吡啶，反應(yīng)快，節(jié)約時間和能源。
(2)制備生物催化劑采用的菌株所需的培養(yǎng)基簡單、成本低。
(3)該菌株的細(xì)胞通透性好，不需破碎，可直接用完整細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，操作方便。
(4)生物催化劑可以用過濾法或離心法去除，并且可以回收重復(fù)使用2～3次。
(5)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系成分簡單，條件溫和，易控制。
(6)反應(yīng)副產(chǎn)物很少，后續(xù)分離提取易操作，費用低廉。


圖1轉(zhuǎn)化反應(yīng)起始時轉(zhuǎn)化液的HPLC圖譜。
其中，2.594分鐘處的峰為尼古丁。
圖2轉(zhuǎn)化反應(yīng)終止時轉(zhuǎn)化液的HPLC圖譜。
其中，11.126分鐘處的峰為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶。
圖36-羥基-3-琥珀酰-吡啶的ESI-MS圖譜。
圖46-羥基-3-琥珀酰-吡啶的13C NMR圖譜。
圖56-羥基-3-琥珀酰-吡啶的1H NMR圖譜。
具體實施例方式
實施例1(1)微生物菌種惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量體積比為1.7％的瓊脂并加有質(zhì)量體積比為2.5％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)18小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL含有質(zhì)量體積比為2.5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)14小時，制得一級種子；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接一級種子于600mL含有質(zhì)量體積比為2.5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)14小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接二級種子于10L含有質(zhì)量體積比為3％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)，期間測定細(xì)胞濃度，當(dāng)620nm下的光密度達(dá)到2.4，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細(xì)胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心12分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞，并用50mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集細(xì)胞沉淀，此細(xì)胞沉淀即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于4L蒸餾水中，再加入尼古丁，混勻，使混合物中生物催化劑的終濃度為620nm下6個光密度，尼古丁的終濃度為3g/L；調(diào)pH至7.0，在30℃、200轉(zhuǎn)/分鐘條件下振蕩，使生物催化劑、尼古丁與空氣充分混合；反應(yīng)期間取樣，用HPLC檢測6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成情況，當(dāng)反應(yīng)混合物中6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成量達(dá)到1.5g/L時，終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(8)生物催化劑的去除將步驟(7)終止反應(yīng)后的反應(yīng)混合物，以10,000轉(zhuǎn)/分20分鐘離心，去除步驟(7)中所加入的生物催化劑，得到含有6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；(9)濃縮將步驟(8)制得的上清液，在真空度0.1MPa，60℃的條件下蒸餾濃縮至原體積的1/10；(10)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集將步驟(9)制得的濃縮液以6mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH為2.5，然后在4℃下靜置4小時，使6-羥基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；將得到的沉淀用抽濾的方法去除上清溶液，再用體積比為4倍的鹽酸溶液洗滌；然后將所得的沉淀在50℃，真空度為0.1MPa的條件下，干燥5小時，最后得到5.7g粉末即為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶提取率達(dá)到94％；(11)樣品檢測將步驟(10)制得的6-羥基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC檢測純度達(dá)98％，用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鑒定其結(jié)構(gòu)確為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶。
上述步驟(3)、(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金屬離子混合液0.5mL/L；調(diào)節(jié)pH 7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步驟(7)所述的HPLC方法采用Agilent1100高壓液相色譜儀，色譜柱為KR100-5C18柱(150×4.6mm，填料顆粒5よm，瑞典Kromasil公司)，流動相為0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速為0.5mL/min，紫外檢測器波長為210nm，柱溫為30℃。
上述步驟(11)所述的ESI-MS用API 4000質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystem公司)分析，溶劑為甲醇。
上述步驟(11)所述的13C NMR和1H NMR用AVANCE 600核磁共振儀(瑞士Bruker公司)分析，溶劑為氘代二甲基亞砜。
實施例2(1)微生物菌種假單胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂并加有質(zhì)量體積比為0.2％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)12小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1環(huán)于20mL含有質(zhì)量體積比為0.2％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6小時，制得一級種子；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接一級種子于200mL含有質(zhì)量體積比為0.2％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接二級種子于2L含有質(zhì)量體積比為0.5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃條件下培養(yǎng)，期間測定細(xì)胞濃度，當(dāng)620nm下的光密度達(dá)到0.6，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細(xì)胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞，并用50mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集細(xì)胞沉淀，此細(xì)胞沉淀即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于1L蒸餾水中，再加入尼古丁，混勻，使混合物中生物催化劑的終濃度為620nm下1個光密度，尼古丁的終濃度為1g/L；調(diào)pH至6.0，在20℃、180轉(zhuǎn)/分鐘條件下振蕩，使生物催化劑、尼古丁與空氣充分混合；反應(yīng)期間取樣，用HPLC檢測6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成情況，當(dāng)反應(yīng)混合物中6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成量達(dá)到0.4g/L時，終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(8)生物催化劑的去除將步驟(7)終止反應(yīng)后的反應(yīng)混合物，以6,000轉(zhuǎn)/分30分鐘離心，去除步驟(7)中所加入的生物催化劑，得到含有6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；(9)濃縮將步驟(8)制得的上清液，在真空度0.09MPa，50℃的條件下蒸餾濃縮至原體積的1/5；(10)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集將步驟(9)制得的濃縮液以6mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH為3.5，然后在4℃下靜置2小時，使6-羥基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；將得到的沉淀用抽濾的方法去除上清溶液，再用體積比為3倍的鹽酸溶液洗滌；然后將所得的沉淀在40℃，真空度為0.09MPa的條件下，干燥2小時，最后得到0.36g粉末即為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶提取率達(dá)到92％；(11)樣品檢測將步驟(10)制得的6-羥基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC檢測純度達(dá)97％，用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鑒定其結(jié)構(gòu)確為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶。
上述步驟(3)、(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金屬離子混合液0.5mL/L；調(diào)節(jié)pH 7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步驟(7)所述的HPLC方法采用Agilent1100高壓液相色譜儀，色譜柱為KR100-5C18柱(150×4.6mm，填料顆粒5よm，瑞典Kromasil公司)，流動相為0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速為0.5mL/min，紫外檢測器波長為210nm，柱溫為30℃。
上述步驟(11)所述的ESI-MS用API 4000質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystem公司)分析，溶劑為甲醇。
上述步驟(11)所述的13C NMR和1H NMR用AVANCE 600核磁共振儀(瑞士Bruker公司)分析，溶劑為氘代二甲基亞砜。
實施例3(1)微生物菌種爭論貪噬菌(Variovorax paradoxus)DSM 8244；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量體積比為2.0％瓊脂并加有質(zhì)量體積比為5％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于100mL含有質(zhì)量體積比為5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得一級種子；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5％體積比的接種量，接一級種子于1000mL含有質(zhì)量體積比為5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得二級種子(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5％體積比的接種量，接二級種子于20L含有質(zhì)量體積比為5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，期間測定細(xì)胞濃度，當(dāng)620nm下的光密度達(dá)到3.7，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細(xì)胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞，并用50mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集細(xì)胞沉淀，此細(xì)胞沉淀即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于7.5L蒸餾水中，再加入尼古丁，混勻，使混合物中生物催化劑的終濃度為620nm下10個光密度，尼古丁的終濃度為7g/L；調(diào)pH至9.0，在40℃、350轉(zhuǎn)/分鐘條件下振蕩，使生物催化劑、尼古丁與空氣充分混合；反應(yīng)期間取樣，用HPLC檢測6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成情況，當(dāng)反應(yīng)混合物中6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成量達(dá)到3.1g/L時，終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(8)生物催化劑的去除將步驟(7)終止反應(yīng)后的反應(yīng)混合物，以12,000轉(zhuǎn)/分10分鐘離心，去除步驟(7)中所加入的生物催化劑，得到含有6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；(9)濃縮將步驟(8)制得的上清液，在真空度0.08MPa，70℃的條件下蒸餾濃縮至原體積的1/20；(10)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集將步驟(9)制得的濃縮液以6mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH為2，然后在4℃下靜置5小時，使6-羥基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；將得到的沉淀用抽濾的方法去除上清溶液，再用體積比為6倍的鹽酸溶液洗滌；然后將所得的沉淀在60℃，真空度為0.08MPa的條件下，干燥8小時，最后得到22.3g粉末即為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶提取率達(dá)到96％；(11)樣品檢測將步驟(10)制得的6-羥基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC檢測純度達(dá)96％，用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鑒定其結(jié)構(gòu)確為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶。
實施例4與實施例1相同，所不同的是步驟(1)所選用的微生物菌種為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)NRRL B-8062。
實施例5與實施例1相同，所不同的是步驟(1)所選用的微生物菌種為纖維單胞菌(Cellulomonassp.)NRRL B-8063。
實施例6與實施例2相同，所不同的是步驟(1)所選用的微生物菌種為假單胞菌(Pseudomonassp.)DSM 8653。
權(quán)利要求
1.一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，由如下步驟組成(1)微生物菌種選擇惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8062、纖維單胞菌(Cellulomonas sp.)NRRL B-8063、假單胞菌(Pseudomonas sp.)DSM8653、爭論貪噬菌(Variovorax paradoxus)DSM 8244和假單胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922之一；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量體積比為1.5～2.0％的瓊脂并加有質(zhì)量體積比為0.2～5％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，25℃～37℃培養(yǎng)12～24小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于20～100mL含有質(zhì)量體積比為0.2～5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～24小時，制得一級種子；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接一級種子于200～1000mL含有質(zhì)量體積比為0.2～5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～24小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5％的體積比的接種量，接二級種子于2～20L含有質(zhì)量體積比為0.5～5％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下培養(yǎng)，期間測定細(xì)胞濃度，當(dāng)620nm下的光密度達(dá)到0.6～3.7，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細(xì)胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10～15分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞，并用pH 7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集細(xì)胞沉淀，此細(xì)胞沉淀即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于蒸餾水中，再加入尼古丁，混勻，使混合物中生物催化劑的終濃度為620nm下1～10個光密度，尼古丁的終濃度為1～7g/L；調(diào)pH至6.0～9.0，在20℃～40℃、180～350轉(zhuǎn)/分鐘條件下振蕩，使生物催化劑、尼古丁與空氣充分混合；反應(yīng)期間取樣，用HPLC檢測6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成情況，當(dāng)反應(yīng)混合物中6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的生成量達(dá)到0.6g/L～4.7g/L時，終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；(8)生物催化劑的去除將步驟(7)終止反應(yīng)后的反應(yīng)混合物，以6,000～12,000轉(zhuǎn)/分10～30分鐘離心，去除步驟(7)中所加入的生物催化劑，得到含有6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；(9)濃縮將步驟(8)制得的上清液，在真空度0.08～0.1MPa，50℃～70℃的條件下蒸餾濃縮至原體積的1/20～1/5；(10)6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集將步驟(9)制得的濃縮液以鹽酸溶液調(diào)pH為2～3.5，然后在4℃下靜置2～5小時，使6-羥基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；將得到的沉淀用抽濾的方法去除上清溶液，再用體積比為3～6倍的鹽酸溶液洗滌；然后將所得的沉淀在40℃～60℃，真空度為0.08～0.1MPa的條件下，干燥2～8小時，最后得到的粉末即為6-羥基-3-琥珀酰-吡啶；(11)樣品檢測將步驟(10)制得的6-羥基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC、ESI-MS、13C NMR和1H NMR檢測純度和結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(1)所述的微生物菌種為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061。
3.如權(quán)利要求1所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(3)(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金屬離子混合液0.5mL/L，其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O 0.008g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O 0.05g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；步驟(2)所述的固體斜面基本培養(yǎng)基的配方是向所述的液體基本培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積比為1.7～2.0％的瓊脂。
4.如權(quán)利要求1所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(6)所述的磷酸緩沖液的濃度是50mmol/L。
5.如權(quán)利要求1所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(7)所述的生物催化劑是指惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061的完整細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1、2、5所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(7)所述的生物催化劑的終濃度為620nm下5～7個光密度。
7.如權(quán)利要求1、2、5所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(7)所述的尼古丁的終濃度為2.5～4g/L。
8.如權(quán)利要求1、2、5所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(7)所述的pH調(diào)為6.5～7.5。
9.如權(quán)利要求1、2、5所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(7)所述的HPLC的檢測條件是色譜柱為瑞典Kromasil公司的KR100-5C18柱，流動相為0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速為0.5mL/min，紫外檢測器的波長為210nm，柱溫為30℃。
10.如權(quán)利要求1、2、5所述的一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6-羥基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步驟(10)所述的pH為2.5，以6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化制備6－羥基－3－琥珀酰－吡啶的方法。該方法包括微生物菌株的培養(yǎng)、以微生物的完整細(xì)胞作為生物催化劑，以尼古丁為底物生物轉(zhuǎn)化合成6－羥基－3－琥珀酰－吡啶以及用沉淀的方法分離純化6－羥基－3－琥珀酰－吡啶等步驟。本發(fā)明的方法具有操作簡單，容易控制，轉(zhuǎn)化條件要求寬泛，產(chǎn)物分離純化簡單等特點。為生物轉(zhuǎn)化法大規(guī)模生產(chǎn)6－羥基－3－琥珀酰－吡啶提供了可能。
文檔編號C12R1/40GK1854302SQ200510025598
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者許平, 王書寧, 馬翠卿, 唐鴻志, 杜毅 申請人:上海愛普香料有限公司