專利名稱：純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系的建立及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系、及其建立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類的各種疾病的發(fā)生和發(fā)展是十分復(fù)雜的，要深入的探討各種疾病的發(fā)病機(jī)理及其療效機(jī)制不能在患者身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是可以遵循動(dòng)物保護(hù)法，通過動(dòng)物對(duì)各種疾病和生命現(xiàn)象進(jìn)行研究，進(jìn)而推繹到人類探索人類生命的奧秘，探索人類疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，以控制人類疾病的發(fā)生、發(fā)展，治愈疾病和減輕人類患病痛苦，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)人類的壽命。
長(zhǎng)期以來人們發(fā)現(xiàn)，以人本身作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來推動(dòng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展是困難的，臨床上所積累的經(jīng)驗(yàn)不僅在時(shí)間和空間上存在著局限性，而且許多實(shí)驗(yàn)還在倫理道德和方法學(xué)上存在著各種限制。
人類疾病的動(dòng)物模型(Animal model of human diseases)是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料。使用動(dòng)物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)極為重要的實(shí)驗(yàn)方法和手段，有助于更方便、更有效地認(rèn)識(shí)人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施(邱蔚六，郭偉等，我國(guó)口腔頜面腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展《中國(guó)腫瘤》1999，8(6)271-2)。
目前，許多生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展依賴于使用動(dòng)物模型作為實(shí)驗(yàn)假說和臨床假說。而動(dòng)物模型頁(yè)越來越得到科技工作者的重視。
腫瘤細(xì)胞系在腫瘤的基礎(chǔ)研究中具有重要地位，體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞是較困難的，尤其建立能夠長(zhǎng)期生長(zhǎng)、傳代，又具有一定特征的大動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系。
Fjelde等對(duì)133例不同腫瘤組織的培養(yǎng)，僅成功建立了2株細(xì)胞系，建株率為1.5％；國(guó)內(nèi)何榮根等試培養(yǎng)了50多例口腔癌細(xì)胞，僅建立了一株口腔癌細(xì)胞系。上述細(xì)胞系無疑為腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究提供了一定的方便，但是僅能建立裸鼠和SCID鼠移植瘤模型，由于動(dòng)物比較小，建立的口腔癌原位移植瘤模型，荷瘤鼠存活時(shí)間相對(duì)較短，常因進(jìn)食困難，達(dá)不到觀察時(shí)間，衰竭而死亡，不利做動(dòng)態(tài)和長(zhǎng)期性研究。
為了致力于口腔癌的研究，人們一直在尋找穩(wěn)定、重復(fù)性好、近似于人類口腔癌的大動(dòng)物模型。1954年Sally等用二甲基苯芘蒽(DMBA)誘發(fā)了金黃地鼠頰囊癌，嗣后有人用同樣的方法誘導(dǎo)出舌、腭癌。盡管化學(xué)致癌劑可成功的誘發(fā)金黃地鼠頰囊癌，但很少發(fā)生轉(zhuǎn)移。
大動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系較其它小動(dòng)物更難以建成。迄今為止，至今沒有建立穩(wěn)定的大動(dòng)物口腔癌細(xì)胞系。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)有效的適用于大動(dòng)物的各種腫瘤細(xì)胞系，尤其是適用于大動(dòng)物的口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種適用于大動(dòng)物的口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一目的是提供所述的適用于大動(dòng)物的口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系的制備方法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞，所述的細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOC200504。
本發(fā)明還提供了一種上述的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞的子代細(xì)胞，所述子代細(xì)胞能夠?qū)е滦挛魈m白兔產(chǎn)生頜面部鱗癌。
在本發(fā)明的第二方面，提供了上述新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞(包括其子代)的用途，它用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生頜面部鱗癌。
在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物選自兔、羊、狗、猴子。
在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物是新西蘭白兔。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種建立頜面部鱗癌動(dòng)物模型的方法，包括步驟(a)將1×104-1×1011(較佳地1×105-1×1010更佳地1×106-1×109)上述的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物的口腔黏膜(如兔的口腔黏膜)、皮下(如裸鼠的皮下)部位；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物14-100天，獲得頜面部鱗癌動(dòng)物模型。
在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物選自兔、羊、狗、猴子。
在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物是新西蘭白兔。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種篩選治療鱗癌的候選藥物的方法，它包括步驟(a)將1×104-1×1011(較佳地1×105-1×1010更佳地1×106-1×109)上述的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物的口腔黏膜或皮下部位；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物14-100天，獲得頜面部鱗癌動(dòng)物模型；(c)將測(cè)試化合物施用于步驟(b)的頜面部鱗癌動(dòng)物模型，并與未施用測(cè)試化合物的步驟(b)的頜面部鱗癌動(dòng)物模型進(jìn)行比較，其中施用后導(dǎo)致鱗癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療鱗癌的候選化合物。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，將測(cè)試化合物的施用方式選自下組局部施用于鱗癌病灶處、靜脈給藥、口服給藥。


圖1顯示了純種新西蘭白兔。
圖2顯示了誘發(fā)性舌癌。
圖3顯示了在倒置顯微鏡(100X)下觀察，兔頜面部鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形，鑲嵌狀排列，密集生長(zhǎng)，部分區(qū)域可見重疊生長(zhǎng)。
圖4顯示了誘發(fā)性舌癌光鏡像顯微鏡下，呈低分化的鱗狀細(xì)胞癌(HE染色)。
圖5顯示了轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。其中癌細(xì)胞大小不等，呈散在分布，并有異常核分裂(HE染色)。
圖6顯示了培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞角蛋白免疫組化染色結(jié)果，其中黃褐色(高分子量)表示角蛋白陽(yáng)性，說明腫瘤細(xì)胞來源于鱗狀上皮。
圖7顯示了接種裸鼠后成瘤。
圖8顯示了建立純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系的技術(shù)路線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，對(duì)上百只純種新西蘭白兔上各原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶腫瘤標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)，最后建成純種新西蘭白兔頜面部鱗癌無限細(xì)胞系。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
具體而言，本發(fā)明人使用誘癌劑和致癌病毒建立各種純種新西蘭白兔頜面部鱗癌模型，然后手術(shù)切除標(biāo)本移植于同種兔同位粘膜下。經(jīng)生長(zhǎng)后，進(jìn)行兔間連續(xù)傳代。再取腫瘤組織行體外培養(yǎng)，建立相應(yīng)的體外細(xì)胞系。對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)檢測(cè)。終于篩選得到一種純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系。該細(xì)胞系生長(zhǎng)穩(wěn)定(已穩(wěn)定傳代26代)，并且在光鏡、電鏡下的形態(tài)學(xué)特征與誘發(fā)腫瘤組織一致。電鏡下顯示，具有典型的橋粒和張力原纖維結(jié)構(gòu)和兔誘發(fā)腫瘤異常染色體特征。免疫組化分析顯示，細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物及癌基因蛋白產(chǎn)物呈高表達(dá)。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)胞系接種裸鼠后導(dǎo)致裸鼠生產(chǎn)腫瘤，其組織病理形態(tài)與兔誘發(fā)腫瘤組織一致。
本發(fā)明的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞不僅可以制備鱗癌模型動(dòng)物，還可用于篩選治療鱗癌的候選藥物的方法，一種優(yōu)選的篩選治療藥物的方法包括步驟(a)將1×104-1×1011(較佳地1×105-1×1010更佳地1×106-1×109)上述的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物的口腔黏膜或皮下部位；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物14-100天，獲得頜面部鱗癌動(dòng)物模型；(c)將測(cè)試化合物施用于步驟(b)的頜面部鱗癌動(dòng)物模型，并與未施用測(cè)試化合物的步驟(b)的頜面部鱗癌動(dòng)物模型進(jìn)行比較，其中施用后導(dǎo)致鱗癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療鱗癌的候選化合物。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明的純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系的性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代；(b)本發(fā)明的純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系是罕見的適用于大動(dòng)物的頜面部鱗癌細(xì)胞系，是口腔頜面部鱗癌的基礎(chǔ)和臨床前期應(yīng)用研究的理想細(xì)胞系。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系的建立(a)、材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純種新西蘭白兔購(gòu)自上海陳行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育廠，體重2-3千克，雌雄不限，在清潔動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。
裸鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，鼠齡為4～5周，雌雄兼用，其實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)均在SPF條件下的超凈層流架中進(jìn)行，滅菌處理的水和飼料供動(dòng)物自由攝取。
2.腫瘤來源先用致癌劑(DMBA)、誘癌病毒(兔乳頭狀瘤病毒)誘發(fā)純種新西蘭白兔產(chǎn)生口腔頜面部鱗癌，然后從產(chǎn)生口腔頜面部鱗癌的動(dòng)物上手術(shù)獲取腫瘤組織。術(shù)前未接受任何抗癌治療?；罱M織檢查及術(shù)后病理檢查結(jié)果均為低分化鱗癌，用于腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)的腫瘤組織均取自原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶。
3.細(xì)胞培養(yǎng)材料細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI 1640，內(nèi)含20％兔血清，青霉素100IU/ml，鏈霉素50μg/ml，pH7.0～7.3消化液為0.25％胰酶，0.02％EDTA，pH7.3。
(b)、方法純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系的建立的技術(shù)路線如圖8所示。簡(jiǎn)而言之，即手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本移植于同種兔同位粘膜下。經(jīng)生長(zhǎng)后，進(jìn)行兔間連續(xù)傳代。再取腫瘤組織行體外培養(yǎng)，建立相應(yīng)的體外細(xì)胞系。具體方法如下1.腫瘤的同種移植誘發(fā)性純種新西蘭白兔舌癌切除標(biāo)本用生理鹽水沖洗后剪碎形成1mm3大小的瘤塊，注入3只純種新西蘭白兔同一舌部，行原代移植，共6點(diǎn)，每側(cè)含瘤塊1～2塊。待移植瘤生長(zhǎng)至5～15mm，呈半球狀隆起時(shí)，取瘤的邊緣部分切成1mm3瘤塊，同位同種兔移植傳代，每次傳代用兔2～4只。注意觀察移植瘤的轉(zhuǎn)移情況。
2.移植瘤轉(zhuǎn)移灶組織培養(yǎng)取兔鱗癌移植動(dòng)物模型轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織，剪切制成約1mm組織塊貼壁培養(yǎng)，置入5％CO2培箱中，37℃，每隔3～5天換2/3量培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)并鋪滿瓶底后，用生理鹽水沖洗2次，以消化液室溫下作用10～15分鐘后終止消化，以吹打的方法收獲細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分種率1∶2，第6代后隔2～3天傳代1次。
(c)結(jié)果1.移植瘤的生長(zhǎng)傳代原代瘤生長(zhǎng)潛伏期最長(zhǎng)為30天，15代以后各代均為7～11天，平均10.6天。繼續(xù)移植傳代，自15代開始，傳代后移植成活率為95.9％，生長(zhǎng)穩(wěn)定，兔荷瘤最長(zhǎng)可生存4個(gè)月。歷時(shí)22個(gè)月，共用102只純種新西蘭白兔(圖1)傳代50代，建立了純種新西蘭白兔口腔頜面部移植瘤(圖2)。
2.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)傳代貼壁腫瘤組織塊第6天長(zhǎng)出細(xì)胞暈或島，第12天生長(zhǎng)加速，至15天鋪滿瓶底，未見有成纖維細(xì)胞出現(xiàn)。原代至第5代分別間隔12、5、3、3天，第5代后細(xì)胞生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。在傳22代之后，在眾多培養(yǎng)的細(xì)胞系中，獲得了一株純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系(圖3)。該細(xì)胞系生長(zhǎng)穩(wěn)定(已穩(wěn)定傳代26代)，并且在光鏡、電鏡下的形態(tài)學(xué)特征與誘發(fā)腫瘤組織一致(見實(shí)施例2)。
獲得的該株純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系于2005年3月30日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(武漢，中國(guó))，保藏號(hào)為CCTCC NOC200504。
實(shí)施例2純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系的生物學(xué)特性在本實(shí)施例中，用常規(guī)方法對(duì)保藏號(hào)為CCTCC NOC200504的純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)特性的檢測(cè)。方法如下(a)實(shí)驗(yàn)方法1.形態(tài)學(xué)(1)大體形態(tài)觀測(cè)移植瘤的表面形態(tài)、活動(dòng)度并剖視，當(dāng)荷移植瘤兔瀕死時(shí)行尸體檢查。培養(yǎng)細(xì)胞傳代2～3天后，觀察群體細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)。
(2)光鏡
對(duì)誘發(fā)瘤、移植瘤腫瘤及每代移植瘤均行常規(guī)組織病理學(xué)檢查。在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其生長(zhǎng)特點(diǎn)或于HE染色后進(jìn)行觀察。
(3)電鏡取第10代瘤邊緣部分組織進(jìn)行觀察；同時(shí)取第10、18代細(xì)胞并離心，制備細(xì)胞丸，按常規(guī)方法制作超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后，于透射電鏡下觀察。
2.細(xì)胞動(dòng)力學(xué)腫瘤移植于同種新西蘭白兔的原位黏膜下，成瘤后即用卡尺測(cè)量其長(zhǎng)(a)、寬(b)、高(c)徑線，每隔6天測(cè)量并記錄，按體積(V)＝abcπ/6求每個(gè)瘤的近似體積，取各瘤體積的均值繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)細(xì)胞取第21代單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，密度為2.0×105/ml，分別取50μl，總1.00×104細(xì)胞量接種24孔培養(yǎng)版，共接種48孔，分別加入培養(yǎng)液1ml，繼續(xù)放置在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種后每隔24小時(shí)取其中三孔細(xì)胞進(jìn)行消化、收集，血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，每空計(jì)數(shù)兩次，取平均值。Excel軟件繪制生長(zhǎng)曲線。收集48小時(shí)細(xì)胞，PBS洗滌一次，制成細(xì)胞懸液，CycleTESTTMPLUSDNA試劑盒(BD公司生產(chǎn)，USA)染色，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司，USA)測(cè)定細(xì)胞周期，采用CellQuest軟件獲取資料，ModFIT軟件進(jìn)行分析，計(jì)算倍增時(shí)間。
3.染色體分析移植瘤第10代接種后20天，取2只荷瘤并已發(fā)生轉(zhuǎn)移的純種新西蘭白兔，每只腹腔內(nèi)注射0.01％秋水仙素10ml，4小時(shí)后取瘤，經(jīng)胰酶-EDTA消化制備單細(xì)胞懸液，按常規(guī)方法制備標(biāo)本。培養(yǎng)細(xì)胞傳代第3天加入終濃度0.05μg/ml的秋水仙素再培養(yǎng)3小時(shí)，收獲細(xì)胞制備染色體標(biāo)本，從原代開始每隔4代制備1次至60代。計(jì)數(shù)分析100個(gè)中期分裂細(xì)胞。
4.免疫組化檢測(cè)采用常規(guī)的LAB法檢測(cè)誘發(fā)腫瘤、第8代移植瘤、第18、24、29、39代培養(yǎng)細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)。
5.培養(yǎng)細(xì)胞的其它檢測(cè)
消化、離心收集培養(yǎng)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以每皿100個(gè)細(xì)胞接種至3只25cm2底面積培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)到細(xì)胞集落形成，集落肉眼可見時(shí)終止培養(yǎng)。PBS洗滌三次，甲醛∶冰醋酸＝3∶1(新鮮配置)固定15min，PBS洗3次，晾干；姬姆薩染色20min，自來水沖洗，晾干，計(jì)數(shù)集落數(shù)。取第20代細(xì)胞懸液(24.5×106個(gè)/ml)，分別與不同濃度(0～128μg/ml)的菜豆凝集素(PHA)等量混合，靜置20分鐘后光鏡下觀察凝集情況。以正常兔白細(xì)胞作陰性對(duì)照。DNA熒光染色倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察檢查支原體污染情況。培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)成片，加入熒光染料甲基橙(AO)+溴乙啶(EB)終濃度為5μg/ml，染色15min。倒去染液，滴加數(shù)滴甘油在倒置熒光顯微鏡下觀察。取第6、24代細(xì)胞采用蓋玻片法，用PBS沖洗培養(yǎng)細(xì)胞爬片，0.2％甲醛-戊二醛電鏡固定液固定，送上海第二醫(yī)科大學(xué)電鏡室按常規(guī)制成掃描電鏡標(biāo)本，掃描電鏡觀察進(jìn)行支原體污染檢測(cè)[1-3]。
6.凍存與復(fù)蘇將培養(yǎng)的純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞加凍存液(含10％DMSO培養(yǎng)液)，逐級(jí)降溫入液氮罐凍存，復(fù)蘇時(shí)取出凍存管迅速入42℃水浴中解凍。洗去凍存液后移植裸鼠，培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)活細(xì)胞數(shù)后繼續(xù)培養(yǎng)。
7.異體成瘤將培養(yǎng)細(xì)胞6代、15代細(xì)胞消化、收集、計(jì)數(shù)，以2×109細(xì)胞數(shù)量接種在裸鼠后肢臀部皮下。
(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.形態(tài)學(xué)(1)大體形態(tài)移植瘤潛伏期后呈半球狀膨脹性快速生長(zhǎng)，覆蓋其上的粘膜變紅。瘤體直徑＞2cm時(shí)中央壞死，潰破，形成癌性潰瘍。移植部位若出現(xiàn)浸潤(rùn)其舌活動(dòng)度減少或固定，切除瘤包膜不完整，瘤體周圍常見生芽狀瘤結(jié)節(jié)，質(zhì)地硬，剖面早期魚肉樣的灰白色，呈砂粒樣或干酪樣改變。在100只實(shí)驗(yàn)兔中有60只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。其中肺轉(zhuǎn)移34只(包括23只既有淋巴轉(zhuǎn)移又有肺轉(zhuǎn)移，余者只有肺轉(zhuǎn)移)，淋巴結(jié)(包括頸淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié))24只。荷瘤均≥3個(gè)月。培養(yǎng)細(xì)胞傳代后在瓶底上形成一層半透明不均質(zhì)的乳白色膜。
(2)光鏡各代移植瘤與誘發(fā)腫瘤一致，均為低分化鱗癌。培養(yǎng)活細(xì)胞半透明貼壁生長(zhǎng)，大小不等，以不規(guī)則的多邊形為主，含少量卵圓形、梭形、空泡樣細(xì)胞呈上皮樣鑲嵌狀排列，界線清晰，間橋多而明顯，核大卵圓、不均質(zhì)，多為單核、雙核、巨核，核分裂相常見，核仁大，胞漿少，內(nèi)含顆粒，核漿比值增大。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底后，出現(xiàn)重疊和堆積性生長(zhǎng)，失去接觸性抑制。(圖3)。
(3)電鏡移植瘤和培養(yǎng)細(xì)胞的透射電鏡大致相同，細(xì)胞排列緊密，外形不規(guī)則，有較多的微絨毛；核大不規(guī)則，畸形核常見，染色質(zhì)不均質(zhì)；胞漿少，內(nèi)含張力原纖維，細(xì)胞間橋粒明顯，呈現(xiàn)鱗癌的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
2.細(xì)胞動(dòng)力學(xué)培養(yǎng)細(xì)胞的指數(shù)增殖期在傳代后第3～8天，最大增殖倍數(shù)在第8天達(dá)24.7倍；群體倍增時(shí)間均值為37.64小時(shí)；有絲分裂指數(shù)第4天達(dá)高峰，為17.04‰。
3.免疫組化檢測(cè)免疫組化結(jié)果表明，誘發(fā)腫瘤的Cytokeratin(高分子量角蛋白)及培養(yǎng)的細(xì)胞Cytokeratin均呈高表達(dá)(圖6)。
4.培養(yǎng)細(xì)胞的其它檢測(cè)集落形成率排除最大和最小集落，計(jì)數(shù)直徑5±2mm大小集落數(shù)，求得3瓶培養(yǎng)細(xì)胞的平均集落形成率63.6％。培養(yǎng)細(xì)胞在PHA濃度為1μg/ml時(shí)即出現(xiàn)凝集反應(yīng)。
DNA熒光染色熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核著綠色熒光，細(xì)胞漿周圍未見到支原體顆粒。掃描電鏡下也未見到支原體顆粒附著。
5.凍存與復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇后活細(xì)胞存活率為62％，接種動(dòng)物仍可致瘤，但潛伏期延長(zhǎng)至15～20天，病理檢查仍為低分化鱗癌。培養(yǎng)狀況生長(zhǎng)良好。
6.異種動(dòng)物成瘤接種培養(yǎng)細(xì)胞后25-38d不等8只裸鼠6只形成腫瘤，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)同誘發(fā)、移植性腫瘤相同均為低分化的鱗狀細(xì)胞癌[4](圖7)。
實(shí)施例3用純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系建立口腔頜面部鱗癌的新西蘭白兔模型取實(shí)施例1中獲得的純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系CCTCC C200504，經(jīng)消化液(0.25％胰酶，0.02％EDTA，pH7.3)消化后，收集并計(jì)數(shù)，以1×108或1×109細(xì)胞數(shù)量接種在4只2-3月齡的新西蘭白兔的口腔黏膜下。
接種后24-36天之間，4只新西蘭白兔口腔內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)腫瘤。用實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，證實(shí)在動(dòng)物模型上誘發(fā)了低分化的頜面部鱗狀細(xì)胞癌[5]。
菌種保藏本發(fā)明的純種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞系，于2005年3月30日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(武漢，中國(guó))，保藏號(hào)為CCTCC NOC200504。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
參考文獻(xiàn)1.何榮根，徐秀祺，周曉健等。人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性。腫瘤，1983，3972.廖小宜，李凡，溫玉明等.人頰粘膜鱗狀細(xì)胞癌BCaCD885細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特征。華西口腔西學(xué)雜志，1990，82383.鄂征主編。組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)，第一版，北京北京出版社，19794.Fidler IJ，Poste G.The pathogenesis of cancermetastasis.Nature，1980，2831395.Sacks PG，Parnes SM，Gallick CE，et al.Establishment andcharacterization of two new squamous cell carcinomacell line derivedfrom tumor of the head and neck.Cancer Res，1988，482858
權(quán)利要求
1.一種新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞，其特征在于，它保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOC200504。
2.如權(quán)利要求1所述的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞的子代細(xì)胞，其特征在于，所述子代細(xì)胞能夠?qū)е滦挛魈m白兔產(chǎn)生頜面部鱗癌。
3.如權(quán)利要求1所述的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞的用途，其特征在于，用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生頜面部鱗癌。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物選自兔、羊、狗、猴子。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是新西蘭白兔。
6.一種建立頜面部鱗癌動(dòng)物模型的方法，其特征在于，包括步驟(a)將1×104-1×1011的權(quán)利要求1的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物的口腔黏膜、或皮下部位；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物14-100天，獲得頜面部鱗癌動(dòng)物模型。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物選自兔、羊、狗、猴子。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是新西蘭白兔。
9.一種篩選治療鱗癌的候選藥物的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將1×104-1×1011的權(quán)利要求1的新西蘭白兔頜面部鱗癌細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物的口腔黏膜、或皮下部位；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物14-100天，獲得頜面部鱗癌動(dòng)物模型；(c)將測(cè)試化合物施用于步驟(b)的頜面部鱗癌動(dòng)物模型，并與未施用測(cè)試化合物的步驟(b)的頜面部鱗癌動(dòng)物模型進(jìn)行比較，其中施用后導(dǎo)致鱗癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療鱗癌的候選化合物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，將測(cè)試化合物的施用方式選自下組局部施用于鱗癌病灶處、靜脈給藥、口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種純種新西蘭白兔口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系、及其建立方法和應(yīng)用。所述的口腔頜面部鱗癌細(xì)胞系的性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，并且適用于建立的頜面部鱗癌大動(dòng)物模型，是口腔頜面部鱗癌的基礎(chǔ)和臨床前期應(yīng)用研究的理想細(xì)胞系。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1861786SQ200510025748
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者郭偉, 金武龍, 周曉健, 任國(guó)欣, 張志愿, 陳萬濤, 邱蔚六 申請(qǐng)人:郭偉