專利名稱：牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測技術(shù)，尤其涉及一種牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒。
背景技術(shù)：
牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛型結(jié)核桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種人畜共患的慢性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。牛結(jié)核桿菌是牛結(jié)核病的致病菌。牛結(jié)核桿菌的細菌學檢查是確診牛結(jié)核病的重要依據(jù)。
目前，牛結(jié)核桿菌的傳統(tǒng)檢查方法是采用抗酸桿菌涂片和牛結(jié)核桿菌培養(yǎng)?？顾釛U菌涂片檢查敏感性低、特異性差，無法確定細菌死活。牛結(jié)核桿菌的培養(yǎng)通常是將待檢標本接種至改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20-60天，待細菌生長后再依據(jù)生物學特征及生化反應多項指標綜合判斷。這種牛結(jié)核桿菌的培養(yǎng)方法耗費時間長，而且操作煩瑣，無法滿足快速確診牛結(jié)核病的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒，以滿足快速確診牛結(jié)核病的需要。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，包括樣品處理液、增菌液、分枝桿菌噬菌體、中止液和菌落培養(yǎng)皿。
所述的樣品處理液為2-4％的氫氧化鈉溶液；所述的增菌液由米氏7H9培養(yǎng)基5-7重量份、氯化鈣1-2重量份、氨芐青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和過氧化氫酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的純水中制備而成；所述的中止液為5-8％的硫酸亞鐵氨溶液；所述的菌落培養(yǎng)皿由1.5-3％的熔化瓊脂6-8體積份、增菌液6-8體積份和指示菌1-2體積份混勻凝聚于無菌平皿中形成。
所述的指示菌為恥垢分枝桿菌或草分枝桿菌。
牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定方法，采用牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑，按以下步驟進行a、取10-50毫升待檢樣品置于樣品管中，加入等量的樣品處理液，室溫作用20-30分鐘，然后離心分離；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1-2毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.1-0.2毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.1-0.2毫升，室溫作用10分鐘；e、取步驟d所得液體10-20微升，滴于菌落培養(yǎng)皿上，在35-38℃下培養(yǎng)15-20小時，觀察結(jié)果，如在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結(jié)核桿菌菌體，反之則不存在。
上述步驟a中所述的待檢樣品包括牛的鼻汁、乳汁、糞便、痰液、穿刺液。
本發(fā)明的方法原理是通過制備感受態(tài)細菌的方式，將待檢菌株置于易感狀態(tài)，并被分枝桿菌噬菌體感染，噬菌體在感染菌中增殖，并將感染菌裂解，釋放出的噬菌體立即感染菌落培養(yǎng)皿中的指示菌并使其裂解，在菌落培養(yǎng)皿上出現(xiàn)肉眼可見的透亮圈。如待檢樣品中不含活的牛結(jié)核桿菌，則噬菌體未能進入感染細胞而被隨后加入的中止液所滅活，因此不會造成指示菌被噬菌體感染，菌落培養(yǎng)皿不會出現(xiàn)透明圈。由于處于感受態(tài)的牛結(jié)核桿菌極易被相應的噬菌體感染，而且噬菌體在感染菌體內(nèi)繁殖迅速，加上菌落培養(yǎng)皿中的指示菌生長快速，所以，本發(fā)明的試劑盒特異性強、敏感度高、操作簡便、結(jié)果明晰，可用于各種待檢樣品中活的牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及其對藥物的敏感性試驗。非常適合飼養(yǎng)奶牛畜牧場、生產(chǎn)牛奶的企業(yè)以及各級獸醫(yī)基層單位應用。又因噬菌體只能感染活加藥管菌，而且感染結(jié)果是將菌體裂解，因此，本發(fā)明的試劑和方法既可檢測待檢標本中是否存在活的牛結(jié)核桿菌菌體，又可保護實驗人員免受感染。
具體實施例方式
實施例1一、試劑配制樣品處理液取3克固體氫氧化鈉溶于純水并稀釋至100毫升，配制成氫氧化鈉溶液；增菌液取米氏7H9培養(yǎng)基6克、氯化鈣2克、氨芐青霉素28克、二性霉素B30克、牛血清白蛋白150克、葡萄糖12克、油酸2克和過氧化氫酶0.1克溶于1000毫升純水中，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；中止液取固體硫酸亞鐵氨7克，溶于純水并稀釋至100毫升，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；菌落培養(yǎng)皿取濃度為2％的熔化瓊脂7毫升，加入到市售的一次性無菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液7毫升和1毫升快速生長的恥垢分枝桿菌，混勻，凝聚成型。
二、牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定a、取50毫升牛的穿刺液置于樣品管中，加入等量的氫氧化鈉溶液，室溫作用25分鐘，然后在每分鐘8000轉(zhuǎn)下離心8分鐘；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.1毫升，室溫下作用10分鐘；e、取步驟d所得液體10微升，滴于菌落培養(yǎng)皿上，在37℃下培養(yǎng)18小時，觀察結(jié)果，如在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結(jié)核桿菌菌體，反之則不存在。
三、牛結(jié)核桿菌菌體的藥敏試驗a、將待檢菌株以標準比濁法制備成濃度為1毫克/毫升的懸液；b、取步驟a所得懸液1毫升稀釋至1000毫升，制備成濃度為1微克/毫升的懸液；c、取兩試驗管1和2作為加藥管，各加入1毫克/毫升懸液0.5毫升；d、取兩試驗管3和4作為對照管，各加入1微克/毫升懸液0.5毫升；e、在試驗管1和3中各加入0.1毫升試驗藥物，在試驗管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下溫育30小時；f、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；g、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升中止液，室溫作用5分鐘；h、取步驟g中所得各加藥管和對照管中的溶液各15微升，分別滴于菌落培養(yǎng)皿上，在37℃下溫育18小時，觀察結(jié)果。如對照管樣品在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈、加藥管無透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為耐藥株；如對照管和加藥管樣品在滴樣區(qū)域均出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為敏感株。
實施例2一、試劑配制樣品處理液取2克固體氫氧化鈉溶于純水并稀釋至100毫升，配制成氫氧化鈉溶液；增菌液取米氏7H9培養(yǎng)基5克、氯化鈣2克、氨芐青霉素25克、二性霉素B50克、牛血清白蛋白100克、葡萄糖15克、油酸1克和過氧化氫酶0.2克溶于1000毫升純水中，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；中止液取固體硫酸亞鐵氨5克，溶于純水并稀釋至100毫升，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；菌落培養(yǎng)皿取濃度為1.5％的熔化瓊脂6毫升，加入到市售的一次性無菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液6毫升和1.5毫升快速生長的草分枝桿菌，混勻，凝聚成型。
二、牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定a、取25毫升牛的乳汁置于樣品管中，加入等量的氫氧化鈉溶液，室溫作用20分鐘，然后在每分鐘8000轉(zhuǎn)下離心5分鐘；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1.5毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.15毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.15毫升，室溫下作用10分鐘；e、取步驟d所得液體15微升，滴于菌落培養(yǎng)皿上，在37℃下培養(yǎng)15小時，觀察結(jié)果，如在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結(jié)核桿菌菌體，反之則不存在。
三、牛結(jié)核桿菌菌體的藥敏試驗a、將待檢菌株以標準比濁法制備成濃度為1毫克/毫升的懸液；b、取步驟a所得懸液1毫升稀釋至1000毫升，制備成濃度為1微克/毫升的懸液；c、取兩試驗管1和2作為加藥管，各加入1毫克/毫升懸液0.5毫升；d、取兩試驗管3和4作為對照管，各加入1微克/毫升懸液0.5毫升；e、在試驗管1和3中各加入0.1毫升試驗藥物，在試驗管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下溫育24小時；f、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；g、向各加藥管和對照管中各加入0.15毫升中止液，室溫作用5分鐘；h、取步驟g中所得各加藥管和對照管中的溶液各10微升，分別滴于菌落培養(yǎng)皿上，在37℃下溫育15小時，觀察結(jié)果。如對照管樣品在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈、加藥管無透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為耐藥株；如對照管和加藥管樣品在滴樣區(qū)域均出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為敏感株。
實施例3一、試劑配制樣品處理液取4克固體氫氧化鈉溶于純水并稀釋至100毫升，配制成氫氧化鈉溶液；增菌液取米氏7H9培養(yǎng)基7克、氯化鈣1.5克、氨芐青霉素50克、二性霉素B25克、牛血清白蛋白200克、葡萄糖10克、油酸1.5克和過氧化氫酶0.2克溶于1000毫升純水中，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；中止液取固體硫酸亞鐵氨8克，溶于純水并稀釋至100毫升，溶解完全后用無菌濾膜過濾備用；菌落培養(yǎng)皿取濃度為3％的熔化瓊脂8毫升，加入到市售的一次性無菌平皿中，再加入上述配制好的增菌液8毫升和1.5毫升快速生長的恥垢分枝桿菌，混勻，凝聚成型。
二、牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定a、取10毫升牛的鼻汁置于樣品管中，加入等量的氫氧化鈉溶液，室溫作用25分鐘，然后在每分鐘8000轉(zhuǎn)下離心10分鐘；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入2毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.2毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.2毫升，室溫下作用10分鐘；e、取步驟d所得液體20微升，滴于菌落培養(yǎng)皿上，在37℃下培養(yǎng)20小時，觀察結(jié)果，如在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結(jié)核桿菌菌體，反之則不存在。
三、牛結(jié)核桿菌菌體的藥敏試驗a、將待檢菌株以標準比濁法制備成濃度為1毫克/毫升的懸液；b、取步驟a所得懸液1毫升稀釋至1000毫升，制備成濃度為1微克/毫升的懸液；c、取兩試驗管1和2作為加藥管，各加入1毫克/毫升懸液0.5毫升；d、取兩試驗管3和4作為對照管，各加入1微克/毫升懸液0.5毫升；e、在試驗管1和3中各加入0.1毫升試驗藥物，在試驗管2和4中各加入0.1毫升增菌液，37℃下溫育30小時；f、向各加藥管和對照管中各加入0.1毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；g、向各加藥管和對照管中各加入0.2毫升中止液，室溫作用10分鐘；h、取步驟g中所得各加藥管和對照管中的溶液各20微升，分別滴于菌落培養(yǎng)皿上，在37℃下溫育20小時，觀察結(jié)果。如對照管樣品在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈、加藥管無透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為耐藥株；如對照管和加藥管樣品在滴樣區(qū)域均出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢菌株對試驗藥物為敏感株。
權(quán)利要求
1.一種牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，其特征在于包括樣品處理液、增菌液、分枝桿菌噬菌體、中止液和菌落培養(yǎng)皿。
2.如權(quán)利要求1所述的牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，其特征在于所述的樣品處理液為2-4％的氫氧化鈉溶液；所述的增菌液由米氏7H9培養(yǎng)基5-7重量份、氯化鈣1-2重量份、氨芐青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和過氧化氫酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的純水中制備而成；所述的中止液為5-8％的硫酸亞鐵氨溶液；所述的菌落培養(yǎng)皿由1.5-3％的熔化瓊脂6-8體積份、增菌液6-8體積份和指示菌1-2體積份混勻凝聚于無菌平皿中形成。
3.如權(quán)利要求2所述的牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，其特征在于所述的指示菌為恥垢分枝桿菌或草分枝桿菌。
4.一種牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于采用牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及藥敏試驗試劑盒，按以下步驟進行a、取10-50毫升待檢樣品置于樣品管中，加入等量的樣品處理液，室溫作用20-30分鐘，然后離心分離；b、棄去樣品管中的上清液，于沉淀中加入1-2毫升增菌液，37℃下溫育24小時；c、向樣品管中加入0.1-0.2毫升分枝桿菌噬菌體，37℃下溫育60分鐘；d、向樣品管中加入中止液0.1-0.2毫升，室溫作用10分鐘；e、取步驟d所得液體10-20微升，滴于菌落培養(yǎng)皿上，在35-38℃下培養(yǎng)15-20小時，觀察結(jié)果，如在滴樣區(qū)域出現(xiàn)全透亮或半透亮圈，表明待檢樣品中存在活的牛結(jié)核桿菌菌體，反之則不存在。
5.如權(quán)利要求4所述的牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于步驟a中所述的待檢樣品包括牛的鼻汁、乳汁、糞便、痰液、穿刺液。
6.如權(quán)利要求4所述的牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于步驟a中所述的樣品處理液為2-4％的氫氧化鈉溶液；步驟b中所述的增菌液由米氏7H9培養(yǎng)基5-7重量份、氯化鈣1-2重量份、氨芐青霉素25-50重量份、二性霉素B25-50重量份、牛血清白蛋白100-200重量份、葡萄糖10-15重量份、油酸1-2重量份和過氧化氫酶0.1-0.2重量份溶于1000重量份的純水中制備而成；步驟d中所述的中止液為5-8％的硫酸亞鐵氨溶液；步驟e中所述的菌落培養(yǎng)皿由1.5-3％的熔化瓊脂6-8體積份、增菌液6-8體積份和指示菌1-2體積份混勻凝聚于無菌平皿中形成。
7.如權(quán)利要求6所述的牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定方法，其特征在于所述的指示菌為恥垢分枝桿菌或草分枝桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定方法及藥敏試驗試劑盒，試劑盒包括樣品處理液、增菌液、分枝桿菌噬菌體、中止液和菌落培養(yǎng)皿。牛結(jié)核桿菌菌體的快速鑒定方法包括用樣品處理液處理待檢樣品、用增菌液增菌、使分枝桿菌菌體感染噬菌體、用中止液滅活噬菌體以中止感染、將待測液滴于菌落培養(yǎng)皿上溫育及根據(jù)菌落培養(yǎng)皿上噬菌斑的形成情況判定結(jié)果等步驟。本發(fā)明的試劑盒和鑒定方法特異性強、敏感度高、操作簡便、結(jié)果明晰，可用于各種待檢樣品中活的牛結(jié)核桿菌菌體快速鑒定及其對藥物的敏感性試驗。非常適合飼養(yǎng)奶牛畜牧場、生產(chǎn)牛奶的企業(yè)以及各級獸醫(yī)基層單位應用。
文檔編號C12Q1/04GK1888076SQ20051002723
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日
發(fā)明者李建林, 胡忠義 申請人:李建林, 胡忠義