專利名稱：一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學技術，特別是涉及定量聚合酶鏈式反應的方法及其應用。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(PCR)是一種高效體外擴增特定基因片段的方法，由于PCR平坡現(xiàn)象和DNA凝膠電泳后用核酸染色劑檢測定靈敏度較低，通常的終點法不能用于定量測定?；跓晒饽芰總鬟f技術(fluorescence-resonance-energy-transfer，F(xiàn)RET)的和SYBR錄I的各種實時熒光定量PCR方法使PCR技術出現(xiàn)了突破，但實時熒光定量PCR需要用昂貴的儀器，而且雖然熒光定量方法測定的范圍相當寬但不能在小范圍內作精確的測量。另一方面基礎研究表明微小的基因表達量差異可能導致細胞活動的異常和引起疾病，測定基因表達量差異的臨床診斷必然要求發(fā)展精確的基因定量方法，所以發(fā)展終點法定量PCR仍有重要的應用價值和廣闊的前途。終點定量PCR方法包括雙管外參照定量PCR、單管非競爭定量PCR和單管競爭定量PCR。外參照方法的引物和模板完全相同擴增效率相同又互不干擾，但二個反應管的背景核酸等截然不同使試驗結果往往不可靠。單管非競爭定量PCR參照模板與目標基因的引物和模板均不相同或僅僅模板相同，引物的不同必導致擴增效率不同影響測定的可靠性。單管競爭定量PCR不僅制備參照模板的過程復雜，而且參照模板和目標基因共享一對引物。競爭是否發(fā)生和競爭的程度與擴增的階段、二種模板的絕對濃度和相對濃度、引物的濃度、引物濃度與原始模板濃度比值等有關。這些因素的變化均會對定量測定結果的穩(wěn)定性和可靠性帶來負面影響。本發(fā)明是一種單管定量PCR，目標基因和參照模板的引物順序和模板順序均同源使擴增效率相同或非常接近，但目標基因和參照模板擴增應用各自的引物相互間不存在競爭，參照模板的制備過程也非常簡單。
發(fā)明構思準確、穩(wěn)定的單管終點法定量PCR要求目標基因和參照模板的擴增既要相似又必須不相同。單管非競爭定量PCR二者在引物上沒有相似性或者在引物和模板上均無相似性。單管競爭定量PCR二者的模板相似但引物完全相同必存在相互干擾。理想的方法需要要擴增效率一致必須使引物和模板均相似，又需要互不干擾平行擴增必須使引物和模板不相同，本發(fā)明的同源引物和同源模板的方法能同時滿足上述要求。擴增效率主要取決于引物的順序和特性也與模板的順序和特性有關。引物的擴增效率取決于引物的長度、3‘端堿基互補特性、引物發(fā)夾結構、引物GC％，引物解鏈溫度和引物與模板的結合強度。二個長度相同的引物如他們的3’端前10個左右的堿基順序完全相同，而其它部分堿基有G與C或A與T的相互置換就能滿足上述要求。由于上述二個引物之間內有多個堿基錯配，因而只能與自身匹配的模板退火而不會與對方不匹配的模板退火。

發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的技術問題本發(fā)明提出了一種應用同源參照引物和同源參照模板的單管定量PCR方法，克服了現(xiàn)有各種終點定量PCR方法參照模板和目標基因擴增效率不同、目標基因擴增和參照模板擴增相互干擾及參照模板制備困難等缺陷。
技術方案完成定量PCR包括幾個步驟，首先根據(jù)一般引物設計的原則用人工方法、引物設計軟件自動搜索方法或二者相結合的方法針對目標基因選定目標基因引物對。目標擴增產物長度以通常的PCR擴增長度范圍200至800堿基為宜。擴增產物太長不容易通過電泳將目標基因擴增產物與比他小幾十個堿基的參照模板擴增產物分開。如擴增產物太短目標基因擴增產物順序與比他小幾十個堿基的參照模板擴增產物的順序同源性相對減小、二種擴增產物特性的差別增大。擴增目標基因的引物確定后再設計制備參照模板的正反引物，該正反引物均由3‘端的基因專一部分和5’端延伸的非基因專一部分組成?；驅Ｒ徊糠值?’端的位置應距上述目標基因引物3‘端內側的20-100個堿基。如距目標基因引物太遠參照模板擴增產物與目標基因擴增產物的長度差別太大，使二種擴增產物順序的相對同源性降低、二種擴增產物特性區(qū)別增大。如距目標基因引物太近，則二種擴增產物的長度相差太小難以通過電泳將二者完全分開。在合適的制備參照模板的引物的位置范圍內，借助引物設計軟件確定制備參照模板引物的基因專一部分的順序。然后在正反引物的5‘端延伸一段寡核甙酸，延伸部分長度與擴增目標基因的正反引物的長度可以不同，但應以相同為原則和首選。然后對延伸部分的寡核甙酸的堿基進行變換，堿基變換方式可多樣，但以只進行G和C的互換或A和T的互換為原則和首選，以使目標基因引物和參照模板引物的GC％一致。變換的要點是不改動延伸部分3’端數(shù)起的1-5至1-15個堿基，優(yōu)選不改動1-8至1-12個堿基。如開始改動的堿基距3‘端太近會造成目標基因引物和參照模板引物之間的同源性太低、特性差異太大使擴增效率區(qū)別增大。如開始改動的堿基距3‘端太遠則造成目標基因引物和參照模板引物之間的同源性太高、特性差異太小使二種引物均可能和非匹配的模板退火造成干擾。變換另一要點是被改動的堿基數(shù)為3-15個，優(yōu)選5-10個堿基。合適的改動堿基數(shù)取決于第一個被改動堿基距3‘端的位置、被改動的堿基是連續(xù)還是間隔及被該動堿基的特性等。制備參照模板的引物確定后用通常的PCR試劑和方法以基因組DNA(PCR)或cDNA(RT-PCR)為模板進行擴增。PCR反應完成后進行凝膠電泳，切割目標擴增產物條帶使之與殘留的引物、原始模板DNA、引物二聚物和非專一擴增產物分開。測定目標擴增產物的濃度并調整、稀釋到指定濃度后作為參照模板。擴增參照模板的引物順序與制備參照模板引物的延伸部分的順序完全相同。定量PCR操作按傳統(tǒng)的單管非競爭定量PCR和單管競爭定量PCR方法，分5個左右反應管進行每個反應管加相同量的含目標基因的樣品DNA和不同稀釋度的已知量的參照模板DNA。PCR反應的程序、目標基因與參照模板擴增產物的分離、條帶強度的測定及目標基因原始模板數(shù)量的計算均為常規(guī)方法。
有益效果1.本發(fā)明目標基因模板和參照模板同源，二者的引物也同源，克服了傳統(tǒng)單管非競爭定量PCR目標基因和參照模板引物不同、擴增效率不一致的缺點。
2.本發(fā)明目標基因模板和參照模板的引物同源但不相同，各自平行擴增互不干擾，克服了傳統(tǒng)單管競爭定量PCR目標基因和參照模板共享一對引物，相互競爭干擾帶來的擴增不穩(wěn)定性。
3.通過一次PCR擴增即完成參照模板的制備簡單、方便、省時、省力。
具體實施例方式
實施例1實施例1以人神經激肽態(tài)2受體基因(TACR 2)(美國國家生物技術中心基因庫編號NM_001058)為目標基因。先在引物設計軟件Oligo6.0的輔助下選擇目標基因正反引物，其順序和特性示于表1和表3。目標基因引物順序中含下劃線堿基為與參照模板引物互為錯配的堿基表1.實施例1引物順序


目標基因引物確定后，在引物設計軟件0ligo 6.0的輔助下在目標基因引物的內側選擇制備參照模板的引物，其順序和特性示于表1和表2，制備參照模板引物順序中含下劃線和斜體部分為非基因專一順序，該順序與目標基因引物順序同源、與參照引物順序相同。擴增參照模板的引物順序和特性示于表1和表3。擴增參照模板引物順序中含下劃線的堿基為與目標基因引物互為錯配的堿基。實施例1中參照正引物與目標基因正引物的3‘端前11個堿基相同，引物中有7個G/C和A/T堿基置換；參照反引物與目標基因反引物的3’端前10個堿基相同，引物中有6個G/C和A/T堿基置換。
表2.實施例1制備參照模板引物的特性

表3.實施例1參照模板引物和目標基因引物特性比較

由表3可知目標基因引物和參照模板引物的各項特性幾乎完全相同。
實施例1目標基因和參照模板擴增產物的特性示于表4表4.實施例1參照模板擴增產物和目標模板擴增產物特性比較

由表4可見目標基因和參照模板的擴增產物的基本特性除長度外也幾乎完全相同。從表3可知正參照模板引物順序與目標基因模板順序之間及正目標引物順序與參照模板順序之間分別7個和6個堿基錯配；這使得非匹配引物與模板之間的結合強度均小于250，最大高允許退火溫度比匹配模板間的最高允許退火溫度低約20℃。實施例1反應所用的Advantage2-PCR試劑盒及反轉錄試劑盒合均為BD ClonTech公司產品。反應所需的cDNA由人組織總RNA(1.0ug/ul)以Oligo(dT)為引物合成。制備參照模板時每100微升PCR反應液加c-DNA5微升。反應液引物終濃度為0.4uM。每管反應體積20微升。PCR反應首次變性92℃1分鐘，循環(huán)變性92℃10秒，退火60-75℃30秒鐘，延伸75℃30秒鐘，反應35個循環(huán)。電泳證實在試驗的退火溫度60至75℃的范圍內都得到專一的目標擴增產物，純化擴增產物測定濃度并作一系列稀釋作為參照模板。按模板和引物的匹配性和數(shù)量分9個組進行試驗結果示于表5表5.實施例1試驗結果

+代表310堿基目標基因擴增產物，φ代表233堿基參照模板擴增產物結果在試驗的退火溫度60-75℃范圍內目標基因引物和參照模板引物均能和匹配模板退火形成專一的擴增產物，而與非匹配模板均不能完成擴增，說明在相當寬的退火溫度范圍內二者相互不干擾。據(jù)此可選擇變性變性92℃10秒，退火和延伸72℃60秒鐘條件完成定量檢測試驗實施例2實施例2以人beta肌動球蛋白基因(美國國家生物技術中心基因庫編號BC0016045)為目標基因。引物設計方法與實施例1相同。先選擇目標基因正反引物，其順序和特性示于表6和表8。目標基因引物順序中含下劃線堿基為與參照模板引物互為錯配的堿基表6.實施例2引物順序

然后在目標基因引物的內側選擇制備參照模板的引物，其順序和特性示于表6和表7，制備參照模板引物順序中含下劃線和斜體部分為非基因專一順序，該順序與目標基因引物順序同源、與參照引物順序相同。擴增參照模板的引物順序和特性示于表6和表8。擴增參照模板引物順序中含下劃線的堿基為與目標基因引物互為錯配的堿基。實施例2中參照正引物與目標基因正引物3‘端前6個堿基相同，引物中有4個G/C和A/T堿基置換；參照反引物與目標基因反引物3’端前5個堿基相同，引物中有4個G/C和A/T堿基置換。
表7.實施例2制備引物特性

表8.實施例2參照模板引物和目標基因引物特性比較

由表8可知目標基因引物和參照模板引物的各項特性幾乎完全相同。
目標基因和參照模板擴增產物的特性示于表9
表9.實施例2參照模板擴增產物和目標模板擴增產物特性比較

由表9可見目標基因和參照模板的擴增產物的基本特性除長度外也幾乎完全相同。表8表明正參照模板引物順序與目標基因模板順序之間及正目標引物順序與參照模板順序之間均有4個堿基錯配，這使得非匹配引物與模板之間的結合強度均小于250，最大高允許退火溫度比匹配模板間的最高允許退火溫度低約20℃。實施例2反應所用試劑和條件與實施例1相同。PCR反應首次變性87℃1分鐘，循環(huán)變性87℃10秒，退火62℃30秒鐘，延伸72℃30秒鐘或退火和延伸72℃60秒鐘，反應30個循環(huán)。結果目標基因和目標模板組合或參照引物和參照模板組合，均能在退火溫度為72℃的高溫下完成擴增有電泳條帶。反之，目標基因和參照模板組合或參照引物和目標模板組合即使退火溫度62℃也不能完成擴增沒有電泳條帶。據(jù)此可選擇變性87℃10秒，退火和延伸72℃60秒鐘的條件完成定量檢測試驗實施例3實施例3也以人beta肌動球蛋白基因為目標基因。引物設計方法與實施例1相同。先選擇目標基因正反引物，其順序和特性示于表10和表12。目標基因引物順序中含下劃線堿基為與參照模板引物互為錯配的堿基表10.實施例3引物順序

然后在目標基因引物的內側選擇制備參照模板引物，其順序和特性示于表10和表11，制備參照模板引物順序中含下劃線和斜體部分為非基因專一順序，該順序與目標基因引物順序同源、與參照引物順序相同。擴增參照模板的引物順序和特性示于表10和表12。擴增參照模板引物順序中含下劃線的堿基為與目標基因引物互為錯配的堿基。實施例3中參照正引物與目標基因正引物3‘端前11個堿基相同，引物中有9個G/C和A/T堿基置換；參照反引物與目標基因反引物3’端前14個堿基相問，引物中有14個G/C和A/T堿基置換。
表11.實施例3制備引物特性

表12.實施例3參照模板引物和目標基因引物特性比較

由表12可知目標基因引物和參照模板引物的各項特性幾乎完全相同。
目標基因和參照模板擴增產物的特性示于表13表13.實施例3參照模板擴增產物和目標模板擴增產物特性比較

由表13可見目標基因和參照模板的擴增產物的基本特性除長度外也幾乎完全相同。表12表明正參照模板引物順序與目標基因模板順序之間及正目標引物順序與參照模板順序之間分別有9個和14個堿基錯配，這使得非匹配引物與模板之間的結合強度均小于260，最大高允許退火溫度比匹配模板間的最高允許退火溫度低20℃以上。實施例3反應所用試劑和條件與實施例2相同，結果目標基因和目標模板組合或參照引物和參照模板組合，均能在退火溫度為72℃的高溫下完成擴增有電泳條帶。反之，目標基因和參照模板組合或參照引物和目標模板組合即使退火溫度62℃也不能完成擴增沒有電泳條帶。據(jù)此可選擇變性87℃10秒，退火和延伸72℃60秒鐘的條件完成定量檢測試驗。
權利要求
1.一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法，由若干個反應管組成一組反應，每個反應管含相同量的含基因組DNA或cDNA的樣品、不同稀釋度的參照模板DNA、目標基因引物和參照引物各一對，PCR反應依次包括如下步驟(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；按步驟(1)-(3)循環(huán)進行擴增反應；其特征在于參照模板與目標基因模板順序同源，目標基因引物和參照引物順序同源而且均不與對方模板退火。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的目標基因引物和參照模板引物長度相同。
3.根據(jù)權利要1所述的一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的目標基因引物和參照模板引物的GC％相同。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的目標基因引物和參照模板引物的3’端1-5至1-15個堿基完全相同。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的目標基因引物和參照模板引物的3’端1-8至1-12個堿基完全相同。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的目標基因引物和參照模板引物有3-15個堿基不同。
7.根據(jù)權利要求1至3所述的一種應用同源參照引物和同源參照模板的定量聚合酶鏈式反應方法，其特征在于所述的目標基因引物和參照模板引物有5-10個堿基不同。
全文摘要
一種單管內參照定量聚合酶鏈式反應和反轉錄聚合酶鏈式反應。目標基因模板順序和參照模板順序同源，前者擴增產物長度比后者略長。目標基因引物和參照模板引物順序也同源，他們的3“端堿基順序相同，引物3”端堿基互補特性相同，引物的長度相同，引物的GC％相同，引物的發(fā)夾結構相同或僅有微小差異，引物的解鏈溫度和與模板的結合強度也相同或僅有微小差異，所以目標基因模板和參照模板的擴增效率相同或非常接近。但是目標基因引物和參照模板引物之間有多個堿基錯配，在相當寬的退火溫度范圍內不與非匹配模板退火相互之間沒有干擾。發(fā)明克服了傳統(tǒng)單管非競爭定量PCR目標基因和參照模板擴增效率不同的缺點。又克服了傳統(tǒng)競爭定量PCR制備參照模板過程復雜，在不同階段引物競爭狀態(tài)不同所造成的測定不穩(wěn)定等缺點。
文檔編號C12P19/00GK1880468SQ20051002672
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月14日 優(yōu)先權日2005年6月14日
發(fā)明者徐定邦, 謝文凱 申請人:徐定邦, 徐文慧